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procédé de préparation d'un nouveau produit antibiotique à action antimycotique".
L'invention concerne un procédé de préparation d'un nouveau produit antibiotique à action antimycotique de la souche désignée comme Actionomyces hygroscopicus B-255.
L'antibiotique obtenu est désigné ci-après sous la dénomination conventionnelle. Niphymicin.
La souche productrice de la niphymicin, objet de la présente invention, est isolée à partir d'un sol en Bulgarie-
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Elle fait partie de l'espèce Actinomyces hygroscopicus, dont les particularités -essentielles ont été déterminées par 6ause= .
Vaksmann, Tresner et Beyken.
L'action antimicrobienne de la niphymicin sur nombre
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de microorganismes est établie à l'aide d'une série de dilutions.
Pour chaque espèce de mi-croorganisme on a déterminé une concen- traction mininè d'inhibition pour des conditicns définies dans - - un milieu approprié.
EMI2.2
Les résult.ats des différentes déterminations sont indi- quels dans le tableau ci-après- Dansce tableau les concentra- tions bactériostàtiques minimums sont exprimées en substance (y) gamma par millilitre de milieu nutritif- Action an tÎ1ricrobÍenne ëe:a nîphymicin
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<tb> Microbe <SEP> testé <SEP> Concentration <SEP> minimum
<tb>
EMI2.4
HJ.crobe teste d y inhii tion 1':
Iml Candida albicans VEEA- .... - ...... 1,3 Candida albicans 93¯ .. , ...... ¯ 1,8 Candida albicans 831........#. -.. -.--.# ---"3,>7 Candida albicans 85G................. 1,8 Candida tropicalis 968 .......... .... 3,7 Candida pseudotropicalis 973......... 3,3
EMI2.5
<tb> Candida <SEP> pseudotropicalis <SEP> 301......... <SEP> 1,8
<tb>
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> ............... <SEP> 3,3
<tb>
<tb> Candida <SEP> parakrusei.............. <SEP> 3,7
<tb>
<tb> Candida <SEP> intermedia. <SEP> - <SEP> ............ <SEP> 1,8
<tb>
EMI2.6
Candida guilliermond ¯ .. ¯ ..... ¯ ... 3,2 - Saccharomyces cervisiae pasa XII....... 7,4 Torul.a utilis - - - - - - - 7,4 Tri-2hophyton gypseum......... o,9 Trichophyton violaceus............ 0,9 Trichophyton mentaophytes .............. 1,2 Trichophyton rubÔÔ - .......
0,'9
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EMI3.1
Epidermophyton 1fW . ¯- ¯ . , , . ¯ -, ; - 0,3 .
Achorion schnleini.. , ¯ ..... r 0,3 Hycrospornm fer-rugineum 0,9 Trichotecium roseum ............... -... 0,9 Phycomyces p = --, . .#... < * < 0,3 aspegil3ts aaiger ...... ., ... 7* Peaicillinym scopolar.ops3.s 1-, .¯.#:-.-.#18¯¯ Penici11inU1!è -cosum:-- :............ 1,$ Staphylococus aurewL209 ........ -... - 6,1 Bac. subtilis 6633 - - - - - - - - - ---- ,2 Eac. nyboidas I3$ .. ¯ ¯ ,. ¯ ..... ¯ ,0 Mymanmu na ramse UF 2 - .............. -. 5,9- Mymanmu a rause UF 2 - - - - - - - - - 5,0 Aerobac4,er-aerogens .......... 5,0
EMI3.2
<tb> Bact. <SEP> tiphi <SEP> 901 <SEP> 1000
<tb>
EMI3.3
Bact. coli 111 .. - .. 1000 ¯¯
EMI3.4
<tb> Bact. <SEP> dys <SEP> Flexuer <SEP> ... <SEP> 1000
<tb>
EMI3.5
:
.'almonella sp . ........ 1000-
L'antibiotique freine-le développement des cellules du cancer de Erlich et provoque l'inactivité du virus lurpes.
La culture et la sauvegarde de la souche productrice
EMI3.6
de l'antibiotique est effectuée en milieu emmoniàcal d'amidon, agar-agar-à la pomme de terre, agar agar au-glucose-asparagine ayant un pH 7 à la température de 28-32 C, pendante a 10 jours.
La souche est conservée sur du millet et sol stérile.-
La niphymicin est obtenue par une double fermenta- tion lors de la culture de l'Actinomyces hygroscopicus B-25S dans des conditions de profondeur du milieu.nutritif, renfer- mant des hydrocarbures, des sources d'azote et de sels miné-
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raux avec un pH de 5,5 à 7,5 et à une eempé;atm* de 2S-32*C.
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Le processus de fermentatinn terminé, le liquide ren- fermant la culture, sans traitement supplémentaire, est récupéré et envoyé à la filtration pour séparer la micelle,
La substance antibiotique biosynthétisée étant inso- luble dans l'eau, se retrouve quantitativement dans la micelle.
Pour--obtenir un produit apte à être appliqué à des fine thérapeutiques, la substance antibiotique biosynthétisée doit être isolée et soumise à une purification chimique.
Le liquide renfermant la culture est filtre., Le fil- trat est rejeté, tandis que la micelle, possédant un pouvoir actif supérieur à 30 v/mg. est soumise à la dessiccation. La micelle desséchée est déshuilée à l'aide de solvants organiques.
Comme tels on peut utiliser : --le benzène, le chloroforme, le dichloréthane, le tétrachlorméthane, l'acétate de butyle, etc.
Il a été établi que le meilleur résultat est obtenu par double traitement ae la micelle séchée avec de l'acétate de butyle en rapport micelle-solvant égal à 1:3. La micelle déshuilée est séparée de la phase liquide par filtration, après quoi elle est séchée scus vide à la température de 30-50 C.
La séparation de l'antibiotique de la micelle séchée et deshuilée est réalisée-par excraxtion à l'aide d'Alcools à bas poids moléculaire telsque: méthanol, éthanol, propanol, alcool isocmylique etc. De préférence on emploie, comme moyen d'extraction, une solrtion de 65% d'éthanol dans l'ead. L"ex- traction est pratiquée deux fois durant 3 à 6 heures en rapport micelle-solvant égal 1:3. les extraits obtenus sont réunis et l'alcool éthylique est éliminé par distillation sous vide.
La suspension aqueuse chaude est déversée de l'appa- reil; on laisse refroidir éusqu'à la température ambiante et l'antibiotique se dépose. la produit obtenu est séparé, lavé à l'eau dessalée et sèche sous vide à 40 C jusqu'.} une teneur en humidité de lest.
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L'antibiotique isolé et purifié est obtenu sous - forme de poudre amorphe de coloration beige claire d'un pouvoir actif de 80c à 1000 y/mg. Il est insoluble dans l'eau, l'acé- tone sec, les éthers, les esters, le benzène, le tetrachlormé- thane, le chloroforme et autres solvants organiques, mais il est soluble en solution eau-acétone, dans les alcools à bas poids moléculaire, dans le diméthylformamide et dans 1. acide acétique. La dissolution alcoolique donne avec l'acide sulfu- rique concentre une coloration rouge-brune allant jusqu'au rouge-cerise. Avec l'acide chlorhydrique, la coloration est verte, allant au bleu. L'antibiotique présente un maximum d'absorption dans la région den rayons ultraviolets aux lon- gueurs d'ondes A-255-227-232-233 et 240 m.
EXEMPLE i
Préparation d'une matière d'ensemencement végétati- ve à partir de l'Act.hygroscopicus B-255.
La culture est effectuée dans des vases erlemeyers de 750 ml, contenant 100 ml de milieu nutritir d'une composi- tion : g/1
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<tb> extrait- <SEP> de <SEP> mais <SEP> -- <SEP> - <SEP> 20/poids <SEP> technique <SEP> / <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> amidon <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> k2HPO4 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MaCL <SEP> 5
<tb>
pH du mileu, après stérilisation 7, 0 à 7,2
Le milieu est ensemencé de spores d'une culture d'actinomyces hygroscopicu B-255.
La culture de la souche est etfectuée à la température de 25-28 Cdurant 48 à 72 heures.
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EXEMPLE II
Préparation de matière d'ensemencement en récipient de fermentation.
On utilise un récipient de fermentation de 300 I, d'un volume utile de 200 1. Le milieu d'ensemencement possède la composition suivante: g/1
EMI6.1
<tb> extrait <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10{poids <SEP> technique)
<tb>
<tb> glucose <SEP> 20
<tb>
<tb> amidon <SEP> 10
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 5
<tb>
<tb> NaCL <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb>
Comme antimousse on emploi l'huile de tournesol.
Le récipient de fermentation est ensemencé avec 0,8 à 11 de matière végétative d'ensemencement et de spores sur millet. La culture est poursuivie durant 48 à 55 heures.
EXEMPLE III préparation de niphymicin dans un récipient de fermentation de production, d'un volume total de 10.000 1 et d'un volume utile de 6.000 1, dans un milieu ayant la composi- tion suivante : ###### g/1
EMI6.2
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 20
<tb>
<tb> glucose <SEP> 30
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 3
<tb>
<tb> NaCL <SEP> 3
<tb>
pH 7, e à 7,2 @ @
Comme antimousse on utilise l'huile de tournesol.
Le milieu nutritif est stérilisé à 120 C ct 0,8 atm. La fer- mentation est effectuée à 26-30 C pendant 70 - 80 heures.
Durant ce temps, dans la micelle s'accumule de l'antitibtique en des limites comprises entre 30 et 70 v/mg de micelle fraïche
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séparatoin chimique et purification de l'antibiotique.
6.000 1 de liquide de culture obtenue par fermen- tation aérobie de la souche actinomyces hygroscopicus B-255, est filtrée sur filtre-presse à cadres. On obtient 203 kg
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de micelle à pouvoir actif 68 Y/mg qui -est -sécbée-dans én séchoir à calorifère à la tempêratura- x- '- 1a mlce-l1E' séchée (64 kg) est déshuilée à deux reprises avec deux fois 192 1 d'acétate de butile. L'acétate de butyle utilisé est recueilli, tandis que la micelle est soumise à une nouvelle .
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dessiccation à 50*'C suivie d'une extractiomdurant 5 heures par trois fois la quantité d'alcool éthylique à 651 (135 1). On extrait la micelle de la même maniêre-une-seconde ioie- et- on réunitles deux extraits.
L'alcool éthylique est distillé sous vide poussé à la température de 50 C La suspension aqueuse obtenue (98 1) est déversée chaude (à la température de la distillation) dans un récipient de décantation. La par- tie aqueuse est rejetée et le reste - la substance antibio- tique - est lavée à l'eau dessalée jusqu'à ce--que-- l'eau de lavage devient iimpide. Le produit lavé est étalé en¯ couche mince et est séché à la température de 40 c, sous vide poussée On obtient 7,3 kg d'antibiotique possédant un pouveir actif égal à 1.000 v/mg, rendement 52,38%.
- REVENDICATIONS.
1.- Procédé de préparation d'un nouveau produit anti-
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bic-tique à action antimycotique déno1#lé-T"èC<I:ra-et-éri5é en te qu'il est obtenu err cultivam en profondeur jonc souche- productrice ACt1nO7YCeS hygroscopicus B-255-Àu type isolé- d'un sol en Bulgarie.