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procédé de préparation d'un nouveau produit antibiotique à action antimycotique".
L'invention concerne un procédé de préparation d'un nouveau produit antibiotique à action antimycotique de la souche désignée comme Actionomyces hygroscopicus B-255.
L'antibiotique obtenu est désigné ci-après sous la dénomination conventionnelle. Niphymicin.
La souche productrice de la niphymicin, objet de la présente invention, est isolée à partir d'un sol en Bulgarie-
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Elle fait partie de l'espèce Actinomyces hygroscopicus, dont les particularités -essentielles ont été déterminées par 6ause= .
Vaksmann, Tresner et Beyken.
L'action antimicrobienne de la niphymicin sur nombre
EMI2.1
de microorganismes est établie à l'aide d'une série de dilutions.
Pour chaque espèce de mi-croorganisme on a déterminé une concen- traction mininè d'inhibition pour des conditicns définies dans - - un milieu approprié.
EMI2.2
Les résult.ats des différentes déterminations sont indi- quels dans le tableau ci-après- Dansce tableau les concentra- tions bactériostàtiques minimums sont exprimées en substance (y) gamma par millilitre de milieu nutritif- Action an tÎ1ricrobÍenne ëe:a nîphymicin
EMI2.3
<tb> Microbe <SEP> testé <SEP> Concentration <SEP> minimum
<tb>
EMI2.4
HJ.crobe teste d y inhii tion 1':
Iml Candida albicans VEEA- .... - ...... 1,3 Candida albicans 93¯ .. , ...... ¯ 1,8 Candida albicans 831........#. -.. -.--.# ---"3,>7 Candida albicans 85G................. 1,8 Candida tropicalis 968 .......... .... 3,7 Candida pseudotropicalis 973......... 3,3
EMI2.5
<tb> Candida <SEP> pseudotropicalis <SEP> 301......... <SEP> 1,8
<tb>
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> ............... <SEP> 3,3
<tb>
<tb> Candida <SEP> parakrusei.............. <SEP> 3,7
<tb>
<tb> Candida <SEP> intermedia. <SEP> - <SEP> ............ <SEP> 1,8
<tb>
EMI2.6
Candida guilliermond ¯ .. ¯ ..... ¯ ... 3,2 - Saccharomyces cervisiae pasa XII....... 7,4 Torul.a utilis - - - - - - - 7,4 Tri-2hophyton gypseum......... o,9 Trichophyton violaceus............ 0,9 Trichophyton mentaophytes .............. 1,2 Trichophyton rubÔÔ - .......
0,'9
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
Epidermophyton 1fW . ¯- ¯ . , , . ¯ -, ; - 0,3 .
Achorion schnleini.. , ¯ ..... r 0,3 Hycrospornm fer-rugineum 0,9 Trichotecium roseum ............... -... 0,9 Phycomyces p = --, . .#... < * < 0,3 aspegil3ts aaiger ...... ., ... 7* Peaicillinym scopolar.ops3.s 1-, .¯.#:-.-.#18¯¯ Penici11inU1!è -cosum:-- :............ 1,$ Staphylococus aurewL209 ........ -... - 6,1 Bac. subtilis 6633 - - - - - - - - - ---- ,2 Eac. nyboidas I3$ .. ¯ ¯ ,. ¯ ..... ¯ ,0 Mymanmu na ramse UF 2 - .............. -. 5,9- Mymanmu a rause UF 2 - - - - - - - - - 5,0 Aerobac4,er-aerogens .......... 5,0
EMI3.2
<tb> Bact. <SEP> tiphi <SEP> 901 <SEP> 1000
<tb>
EMI3.3
Bact. coli 111 .. - .. 1000 ¯¯
EMI3.4
<tb> Bact. <SEP> dys <SEP> Flexuer <SEP> ... <SEP> 1000
<tb>
EMI3.5
:
.'almonella sp . ........ 1000-
L'antibiotique freine-le développement des cellules du cancer de Erlich et provoque l'inactivité du virus lurpes.
La culture et la sauvegarde de la souche productrice
EMI3.6
de l'antibiotique est effectuée en milieu emmoniàcal d'amidon, agar-agar-à la pomme de terre, agar agar au-glucose-asparagine ayant un pH 7 à la température de 28-32 C, pendante a 10 jours.
La souche est conservée sur du millet et sol stérile.-
La niphymicin est obtenue par une double fermenta- tion lors de la culture de l'Actinomyces hygroscopicus B-25S dans des conditions de profondeur du milieu.nutritif, renfer- mant des hydrocarbures, des sources d'azote et de sels miné-
EMI3.7
raux avec un pH de 5,5 à 7,5 et à une eempé;atm* de 2S-32*C.
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Le processus de fermentatinn terminé, le liquide ren- fermant la culture, sans traitement supplémentaire, est récupéré et envoyé à la filtration pour séparer la micelle,
La substance antibiotique biosynthétisée étant inso- luble dans l'eau, se retrouve quantitativement dans la micelle.
Pour--obtenir un produit apte à être appliqué à des fine thérapeutiques, la substance antibiotique biosynthétisée doit être isolée et soumise à une purification chimique.
Le liquide renfermant la culture est filtre., Le fil- trat est rejeté, tandis que la micelle, possédant un pouvoir actif supérieur à 30 v/mg. est soumise à la dessiccation. La micelle desséchée est déshuilée à l'aide de solvants organiques.
Comme tels on peut utiliser : --le benzène, le chloroforme, le dichloréthane, le tétrachlorméthane, l'acétate de butyle, etc.
Il a été établi que le meilleur résultat est obtenu par double traitement ae la micelle séchée avec de l'acétate de butyle en rapport micelle-solvant égal à 1:3. La micelle déshuilée est séparée de la phase liquide par filtration, après quoi elle est séchée scus vide à la température de 30-50 C.
La séparation de l'antibiotique de la micelle séchée et deshuilée est réalisée-par excraxtion à l'aide d'Alcools à bas poids moléculaire telsque: méthanol, éthanol, propanol, alcool isocmylique etc. De préférence on emploie, comme moyen d'extraction, une solrtion de 65% d'éthanol dans l'ead. L"ex- traction est pratiquée deux fois durant 3 à 6 heures en rapport micelle-solvant égal 1:3. les extraits obtenus sont réunis et l'alcool éthylique est éliminé par distillation sous vide.
La suspension aqueuse chaude est déversée de l'appa- reil; on laisse refroidir éusqu'à la température ambiante et l'antibiotique se dépose. la produit obtenu est séparé, lavé à l'eau dessalée et sèche sous vide à 40 C jusqu'.} une teneur en humidité de lest.
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L'antibiotique isolé et purifié est obtenu sous - forme de poudre amorphe de coloration beige claire d'un pouvoir actif de 80c à 1000 y/mg. Il est insoluble dans l'eau, l'acé- tone sec, les éthers, les esters, le benzène, le tetrachlormé- thane, le chloroforme et autres solvants organiques, mais il est soluble en solution eau-acétone, dans les alcools à bas poids moléculaire, dans le diméthylformamide et dans 1. acide acétique. La dissolution alcoolique donne avec l'acide sulfu- rique concentre une coloration rouge-brune allant jusqu'au rouge-cerise. Avec l'acide chlorhydrique, la coloration est verte, allant au bleu. L'antibiotique présente un maximum d'absorption dans la région den rayons ultraviolets aux lon- gueurs d'ondes A-255-227-232-233 et 240 m.
EXEMPLE i
Préparation d'une matière d'ensemencement végétati- ve à partir de l'Act.hygroscopicus B-255.
La culture est effectuée dans des vases erlemeyers de 750 ml, contenant 100 ml de milieu nutritir d'une composi- tion : g/1
EMI5.1
<tb> extrait- <SEP> de <SEP> mais <SEP> -- <SEP> - <SEP> 20/poids <SEP> technique <SEP> / <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> amidon <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> k2HPO4 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MaCL <SEP> 5
<tb>
pH du mileu, après stérilisation 7, 0 à 7,2
Le milieu est ensemencé de spores d'une culture d'actinomyces hygroscopicu B-255.
La culture de la souche est etfectuée à la température de 25-28 Cdurant 48 à 72 heures.
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EXEMPLE II
Préparation de matière d'ensemencement en récipient de fermentation.
On utilise un récipient de fermentation de 300 I, d'un volume utile de 200 1. Le milieu d'ensemencement possède la composition suivante: g/1
EMI6.1
<tb> extrait <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10{poids <SEP> technique)
<tb>
<tb> glucose <SEP> 20
<tb>
<tb> amidon <SEP> 10
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 5
<tb>
<tb> NaCL <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb>
Comme antimousse on emploi l'huile de tournesol.
Le récipient de fermentation est ensemencé avec 0,8 à 11 de matière végétative d'ensemencement et de spores sur millet. La culture est poursuivie durant 48 à 55 heures.
EXEMPLE III préparation de niphymicin dans un récipient de fermentation de production, d'un volume total de 10.000 1 et d'un volume utile de 6.000 1, dans un milieu ayant la composi- tion suivante : ###### g/1
EMI6.2
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 20
<tb>
<tb> glucose <SEP> 30
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 3
<tb>
<tb> NaCL <SEP> 3
<tb>
pH 7, e à 7,2 @ @
Comme antimousse on utilise l'huile de tournesol.
Le milieu nutritif est stérilisé à 120 C ct 0,8 atm. La fer- mentation est effectuée à 26-30 C pendant 70 - 80 heures.
Durant ce temps, dans la micelle s'accumule de l'antitibtique en des limites comprises entre 30 et 70 v/mg de micelle fraïche
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séparatoin chimique et purification de l'antibiotique.
6.000 1 de liquide de culture obtenue par fermen- tation aérobie de la souche actinomyces hygroscopicus B-255, est filtrée sur filtre-presse à cadres. On obtient 203 kg
EMI7.1
de micelle à pouvoir actif 68 Y/mg qui -est -sécbée-dans én séchoir à calorifère à la tempêratura- x- '- 1a mlce-l1E' séchée (64 kg) est déshuilée à deux reprises avec deux fois 192 1 d'acétate de butile. L'acétate de butyle utilisé est recueilli, tandis que la micelle est soumise à une nouvelle .
EMI7.2
dessiccation à 50*'C suivie d'une extractiomdurant 5 heures par trois fois la quantité d'alcool éthylique à 651 (135 1). On extrait la micelle de la même maniêre-une-seconde ioie- et- on réunitles deux extraits.
L'alcool éthylique est distillé sous vide poussé à la température de 50 C La suspension aqueuse obtenue (98 1) est déversée chaude (à la température de la distillation) dans un récipient de décantation. La par- tie aqueuse est rejetée et le reste - la substance antibio- tique - est lavée à l'eau dessalée jusqu'à ce--que-- l'eau de lavage devient iimpide. Le produit lavé est étalé en¯ couche mince et est séché à la température de 40 c, sous vide poussée On obtient 7,3 kg d'antibiotique possédant un pouveir actif égal à 1.000 v/mg, rendement 52,38%.
- REVENDICATIONS.
1.- Procédé de préparation d'un nouveau produit anti-
EMI7.3
bic-tique à action antimycotique déno1#lé-T"èC<I:ra-et-éri5é en te qu'il est obtenu err cultivam en profondeur jonc souche- productrice ACt1nO7YCeS hygroscopicus B-255-Àu type isolé- d'un sol en Bulgarie.
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process for the preparation of a novel antibiotic product with antimycotic action ".
The invention relates to a process for preparing a novel antibiotic product with antimycotic action of the strain designated as Actionomyces hygroscopicus B-255.
The antibiotic obtained is referred to below under the conventional name. Niphymicin.
The strain producing niphymicin, object of the present invention, is isolated from a soil in Bulgaria-
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It is part of the species Actinomyces hygroscopicus, whose essential characteristics have been determined by 6ause =.
Vaksmann, Tresner and Beyken.
The antimicrobial action of niphymicin on many
EMI2.1
of microorganisms is established using a series of dilutions.
For each species of microorganism a minimum concentration of inhibition was determined for defined conditions in an appropriate medium.
EMI2.2
The results of the different determinations are shown in the table below - In this table the minimum bacteriostatic concentrations are expressed in substance (y) gamma per milliliter of nutrient medium - Antitrobial action: a nîphymicin
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<tb> Microbe <SEP> tested <SEP> Minimum <SEP> concentration
<tb>
EMI2.4
HJ.crobe tests d y inhii tion 1 ':
Iml Candida albicans VEEA- .... - ...... 1,3 Candida albicans 93¯ .., ...... ¯ 1,8 Candida albicans 831 ........ #. - .. -.--. # --- "3,> 7 Candida albicans 85G ................. 1,8 Candida tropicalis 968 ....... ... .... 3.7 Candida pseudotropicalis 973 ......... 3.3
EMI2.5
<tb> Candida <SEP> pseudotropicalis <SEP> 301 ......... <SEP> 1.8
<tb>
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> ............... <SEP> 3.3
<tb>
<tb> Candida <SEP> parakrusei .............. <SEP> 3.7
<tb>
<tb> Candida <SEP> intermedia. <SEP> - <SEP> ............ <SEP> 1.8
<tb>
EMI2.6
Candida guilliermond ¯ .. ¯ ..... ¯ ... 3.2 - Saccharomyces cervisiae pasa XII ....... 7.4 Torul.a utilis - - - - - - - 7.4 Tri-2hophyton gypseum ......... o, 9 Trichophyton violaceus ............ 0.9 Trichophyton mentaophytes .............. 1.2 Trichophyton rubÔÔ - .......
0, '9
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
Epidermophyton 1fW. ¯- ¯. ,,. ¯ -,; - 0.3.
Achorion schnleini .., ¯ ..... r 0.3 Hycrospornm fer-rugineum 0.9 Trichotecium roseum ............... -... 0.9 Phycomyces p = - -,. . # ... <* <0,3 aspegil3ts aaiger ......., ... 7 * Peaicillinym scopolar.ops3.s 1-, .¯. #: -.-. # 18¯¯ Penici11inU1! è -cosum: -: ............ 1, $ Staphylococus aurewL209 ........ -... - 6.1 Bac. subtilis 6633 - - - - - - - - - ----, 2 Eac. nyboidas I3 $ .. ¯ ¯,. ¯ ..... ¯, 0 Mymanmu na ramse UF 2 - .............. -. 5.9- Mymanmu a rause UF 2 - - - - - - - - - 5.0 Aerobac4, er-aerogens .......... 5.0
EMI3.2
<tb> Bact. <SEP> tiphi <SEP> 901 <SEP> 1000
<tb>
EMI3.3
Bact. coli 111 .. - .. 1000 ¯¯
EMI3.4
<tb> Bact. <SEP> dys <SEP> Flexuer <SEP> ... <SEP> 1000
<tb>
EMI3.5
:
almonella sp. ........ 1000-
The antibiotic slows down the development of Erlich's cancer cells and causes the lurpus virus to inactivity.
Cultivation and preservation of the producing strain
EMI3.6
of the antibiotic is carried out in an emmoniàcal medium of starch, potato-agar-agar, glucose-asparagine-agar agar having a pH 7 at a temperature of 28-32 C, for 10 days.
The strain is stored on millet and sterile soil.
Niphymicin is obtained by double fermentation when culturing Actinomyces hygroscopicus B-25S under deep conditions of the nutrient medium, containing hydrocarbons, sources of nitrogen and mineral salts.
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rals with a pH of 5.5-7.5 and a tempera; atm * of 2S-32 * C.
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When the fermentation process is finished, the liquid containing the culture, without additional treatment, is recovered and sent for filtration to separate the micelle,
The biosynthesized antibiotic substance, being insoluble in water, is found quantitatively in the micelle.
In order to obtain a product capable of being applied for therapeutic purposes, the biosynthesized antibiotic substance must be isolated and subjected to chemical purification.
The liquid containing the culture is filtered. The filtrate is rejected, while the micelle, having an active power greater than 30 v / mg. is subjected to desiccation. The dried micelle is de-oiled using organic solvents.
As such, it is possible to use: - benzene, chloroform, dichloroethane, tetrachlormethane, butyl acetate, etc.
It has been established that the best result is obtained by double treatment of the dried micelle with butyl acetate in a micelle-solvent ratio equal to 1: 3. The deoiled micelle is separated from the liquid phase by filtration, after which it is dried under vacuum at a temperature of 30-50 C.
The separation of the antibiotic from the dried and de-oiled micelle is carried out by excraxtion using low molecular weight alcohols such as: methanol, ethanol, propanol, isocmyl alcohol etc. Preferably, a solution of 65% ethanol in ead is used as the means of extraction. The extraction is carried out twice for 3 to 6 hours in a micelle-solvent ratio equal to 1: 3. The extracts obtained are combined and the ethyl alcohol is removed by distillation under vacuum.
The hot aqueous suspension is poured out of the apparatus; it is allowed to cool to room temperature and the antibiotic is deposited. the product obtained is separated, washed with desalinated water and dried under vacuum at 40 ° C. to a moisture content of ballast.
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The isolated and purified antibiotic is obtained in the form of an amorphous powder of light beige color with an active power of 80% at 1000 y / mg. It is insoluble in water, dry acetone, ethers, esters, benzene, tetrachlormethane, chloroform and other organic solvents, but it is soluble in water-acetone solution, in alcohols. low molecular weight, in dimethylformamide and in 1. acetic acid. Alcoholic dissolution gives with concentrated sulfuric acid a red-brown color going up to cherry red. With hydrochloric acid, the coloring is green, going blue. The antibiotic exhibits maximum absorption in the region of ultraviolet rays at wavelengths A-255-227-232-233 and 240 m.
EXAMPLE i
Preparation of vegetative seed material from Act.hygroscopicus B-255.
The culture is carried out in 750 ml Erlemeyers vases, containing 100 ml of nutrient medium of a composition: g / 1
EMI5.1
<tb> extract- <SEP> from <SEP> but <SEP> - <SEP> - <SEP> 20 / weight <SEP> technical <SEP> / <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> starch <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> k2HPO4 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MyCL <SEP> 5
<tb>
pH of the medium, after sterilization 7.0 to 7.2
The medium is seeded with spores of a culture of actinomyces hygroscopicu B-255.
The culture of the strain is carried out at a temperature of 25-28 C for 48 to 72 hours.
<Desc / Clms Page number 6>
EXAMPLE II
Preparation of seed material in fermentation vessel.
A 300 I fermentation vessel is used, with a useful volume of 200 1. The inoculation medium has the following composition: g / 1
EMI6.1
<tb> extract <SEP> from <SEP> but <SEP> 10 (technical <SEP> weight)
<tb>
<tb> glucose <SEP> 20
<tb>
<tb> starch <SEP> 10
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 5
<tb>
<tb> NaCL <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb>
As an antifoam, sunflower oil is used.
The fermentation vessel is seeded with 0.8-11 vegetative seed material and millet spores. The culture is continued for 48 to 55 hours.
EXAMPLE III Preparation of niphymicin in a production fermentation vessel, with a total volume of 10,000 L and a working volume of 6,000 L, in a medium having the following composition: ###### g / 1
EMI6.2
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> 20
<tb>
<tb> glucose <SEP> 30
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 3
<tb>
<tb> NaCL <SEP> 3
<tb>
pH 7, e at 7.2 @ @
As a defoamer, sunflower oil is used.
The nutrient medium is sterilized at 120 C ct 0.8 atm. Fermentation is carried out at 26-30 C for 70-80 hours.
During this time, in the micelle the antibiotic accumulates in limits between 30 and 70 v / mg of fresh micelle
<Desc / Clms Page number 7>
chemical separation and purification of the antibiotic.
6,000 l of culture liquid obtained by aerobic fermentation of the strain actinomyces hygroscopicus B-255 is filtered through a frame filter press. We obtain 203 kg
EMI7.1
of micelle with active power 68 Y / mg which -is -dried-in a caloriferous dryer at temperature- x- '- 1a mlce-l1E' dried (64 kg) is deoiled twice with twice 192 1 of ' butile acetate. The butyl acetate used is collected, while the micelle is subjected to a new one.
EMI7.2
drying at 50 ° C. followed by extraction for 5 hours with three times the amount of ethyl alcohol at 651 (135 l). The micelle is extracted in the same way - a second - and the two extracts are combined.
The ethyl alcohol is distilled off under high vacuum at a temperature of 50 ° C. The aqueous suspension obtained (98 l) is poured hot (at the temperature of the distillation) into a settling vessel. The aqueous part is discarded and the rest - the antibiotic substance - is washed with desalinated water until - the - the washing water becomes impid. The washed product is spread out in a thin layer and is dried at a temperature of 40 ° C., under high vacuum. 7.3 kg of antibiotic is obtained which has an active power equal to 1000 v / mg, yield 52.38%.
- CLAIMS.
1.- Process for preparing a new anti-
EMI7.3
bic-tick with antimycotic action deno1 # le-T "èC <I: ra-et-éri5é in that it is obtained err cultivam in deep rush strain- producing ACt1nO7YCeS hygroscopicus B-255-To type isolated- from a soil in Bulgaria.