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"Procédé de préparation de l' oxytétrtl 1011ne tt produits obtenue.
La présent; invention a pour objet un procédé de préparation de par fermentation submergé au
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moyen d'une variété autante du etpept9p lavig 1 La variété 14utant dont il s'aGit a été clposée à la collection du "Centraalbureau voor Schelculture5". à Besra,
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rays-Bas, sous lu dénomination "ôtrontom oos hiboflavus -108 - On connaît l'espèce Streptor-ycoB albofluvus qui, selon 1,0 IIbnuol of Doterminutive Baotoriology" de Beroy, 7èfi'G dédi- tion, l'ho Williams â;
Wilkins Compuny, I3ultiMOxe, 1957, avait été décrite dos 1)1ü par 'béalci3r,,,ann et Curtis, et reclassé par '.iakl:ll:1onn et Heinrich en l4ts, Toutefois, le Streptomyces 011)0±lavun tol qu'il a été décrit, et qu'on peut; se .w procurer à partir des diverses son-
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chas existant dans Ion colleetionu dont. on dispose, ne convient
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pas à la préparation de l' oX"{t ltr.c,ycl1ne. quo ce soit au lobo-
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r&toire ou dans l'industrie.
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Lu fioucho orleinolle de Streptomyoes alboflavue, dont on est parti pour obtenir, par mutation et sélection, la var16- tau utilise dune lao roc.d:: objet do l'invention, provenait de la collection du Oentraalbureau voor oh.anrnelaul.tures l Baaya (ornnis djsin6 ei-dessous par OêBèJàë)t et constitue une descendance directe de la variutj étudiée nur WQksranna, Cette vaxi,t produit essontiellon.ent dos antibiotiques qui., selon toute vraisemblance, appartiennent au groupe- des nct.ao.nyo,ne, présentant un R,o compris entre 0,85 et 0,95, quand le bouillon !erl.1enté est souuis à la chronctographie sur papi!1 et une co- loration violette sous la lumière dia Wood.
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Le mutant utilisa suivant l'invention a été obtenu
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par irradiation ultraviolette de cultures monospores de la cul-
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ture primitive' définie plus haut, suivie d'une sélection soi-
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::neusoH:mt r el'.t'ectu0e, selon les techniques et critères connus.
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Parmi divers mutants ainsi obtenus, on en a choisi plusieurs après évaluation analytique pour la production de l'oxyttra- cycline, e l'une d'entre elles est décrite en détail dans ce qui suit. '
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En vue d'une part de caractériser la variété mut an- ,
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te Streptomyces alboflavua M-108-OX# et d'autre part de démon-
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trer l'ampleur des modifications des caractéristiques qui est intervenue, on donne ci-dessous uno description comparée entre les variétés suivantes :
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Streptomyces alboi'lavus, provenant du C.B.S., sou- che dite "type ials;t:rann"; Streptonyces alboflavus M-108 -OX, variété mutante , obtenue par le Demandeur ;\ partir de la pre3donte; enfin âtr:tan;cos riaosus (Sobin, .J'inlay & al), variété
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provenant également du C.B.S.
Cotte dernière espèce n'a été incluse dans la présen- te description que dans un but de comparaison, étant donné que
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c'est là le ::;icro-or;an.sc:o le plus connu pour obtenir 1'ox,y.
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ttJt1'ac;l:i.ne.
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Les trois souches ont été cultivées simultanément
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dino quatorze milieux cïo culture diffuron'ce; leurs Ccract5r.a tiques, not/.1,IJ.ent la couleur mlo la culture, la sporulation (si elle existe), !>"# couleur dos pi Honts formée, etc.., ont été observées :3L décrites.
Apr'':a des oultureu répétées on n obsorvé, au bout do suize jours d'incubation a '26"0, les on%.'nobJr1otua tHti V/ln tus
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1.) Milieu contenant de la liqueur de macération du
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mats (0,6 ;) de co'position !
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A .1lJ'.'...r.lÍt1r 10 g Lic1u,Htr de nt 10.;r{1 tion du qats i n 50 .. 5 s Glucose 15 S (IÎH4)2HPÛ4 2,5 KH 715 49 7!I;p 1 g ;nC7. 0,002 g Cu504? 5H20 0,002 g
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znS 4t z0 0,025 g
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<tb> :.au <SEP> 500 <SEP> ce.
<tb>
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pH 7 (après stérilisation)
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Strepto.nyces alboflavus donne des colonise brillan"
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tes, bien distinctes, d'un jaune sala, sans formation de spores
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ni de pi;r..ents;
Stre,,to,,,-!cc-s :1b4f1,vu8 :-1G-GY (la variété mutante) produit des colonies à spores 14 ;r e...ert blipe-grisetres et un
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pigment 'brun clair, diffusible;
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Z VGr irojyces ri.:os:a lo Lin coté se développe peu,
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sans sporulation, donnant une colonie de couleur beige avec un mycélium aérien rare et un oignent brun clair, diffusible, en
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très faible Tuuntitu, 2) Sur milieu à li liqueur de cac ration du maïa, concentration z4 ;r, -le ;::
.e co.npoaition que ci-dessue mais où la qunntit-5 de la liqueur a 610 réduite de 3 2 6< les trois souches se dv.^.lo.yent, respectivement, coume sur le milieu ilool, mais plus lont!o"t0tit, 3) ur un Milieu à la gélatine, de formule
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Extrait da viando 115 g portons 2,5 s (îjlotlno 80 g 'E'iu dil3tillo . 500 ces
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pli 6,2 (avant st-jrilisation) les trois souches ne développent assez bien, produisant une liquéfaction assois lento ; Streptouycea alboflavus }!..08..0X (Blutant) esi; le seul à donner un pilent orangé.
4) Milieu z la dextrine C:I!¯,pe.k-Dox, de formule j
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Dextrine 5 s lailo3 z1 S -- #
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K,,f'0 0,58 i,ït74, 71120 0925 9 KOL 0,25 S 'oS04 un cristal de petite taille Aar-a:;ar 7, 5 g Eau distillue 500 ce.
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pH 6,8 (après stérilisation).
Stgoptoriyces albo±14Zuo produit des colonies bien
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séparées, rondos, beige clair, entourée d'une auréole blanche
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formée par un nycéliua aérien jeune avec un très léger pigment diffusible bolye clair; , itre2toi icea albof rsvus -10 0 donne des colonies
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brun foncé, relises entre elles, donnant lieu à une lente forma- tion de mycélium aérien blanc recouvrant la coloration initiale;
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B-.tropto"iYOCI3 rimosus se développe lentement. sans donner de 1".lj'cÓliu;.. aérien et tn formant des colonies tondues entre elles et un pi;.'1..e:nt boire foncé.
5) wur carotte de pau.ae-de-torra t Une carotta do pomme-da-terre (1,5 cm, 4-6 cm de hau- teur) a été lavée au moyen d'une solution de Na20fl 10 ;, et
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stérilisée dans un tube à essai avec 1,5 ce d'eau distillée.
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Strefltornyces alboflavue donne une croissance végéta- tive beige- rosfitro avec un mycélium aérien rare, allant du blanc scle au beige; Streptovces nlboflavue L:-108-OX donne rapidement un mycélium a6rien blanc, épais, à aspect ridé; Stre'1to':YCes rlrco3UB se développe bien, recouvrent la surface de la carotte de oo..ne-de-terro d'une végétation al-
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véolaire, allant du bronze au bronze-violacé brillant, sans produire de mycélium aérien. La couleur de la carotte de pomme- de-terre reste inchangée dans les sonos exemptes de végétation
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dans les deux premiers cas, alors que ;ans celui de Strep-
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tO:I1YOOS r:.osus, elle nreud une coloration bruno fonclie.
6) Milieu de nenett, du ior uï.e t
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<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
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Oau.'inc de Lydrolys-le g
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<tb> Glucose <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> Ajur-njar <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
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Zou distillio 500 ce
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lo pil, ajuste à 7, don110 après stérilisation pH 6,7. r;,ta:;yces 1 iaTl,vue ne don giune croissance vé- gétative sans pi nent ni ..,rc:.7.,u; .1i.l'C::,tO ;.yces rllboi'lnvus t:-106-0 donne une croissan- ce v6Z,*;tative bleu d* scier à .;1ycJliu:a aérien blano à blanc-gris, et un pi/'.:ont dil'fusibic brun fonçât rimoeus oo développe lentement, donnant des colonies v'cÓttltives bol-je foncé avec tt1:oéliwn aérien rare, de'couleur grisâtre clairo.
7) Hilleu à lr é,hc:x.r.s-a;;xraina de fornule j
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<tb> Glycérine <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> Asparaine <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
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{;ID:'O 4 0,25 G Âcar-aGcr 7.5 g
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<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 500 <SEP> ce
<tb>
pH 6,9 après stérilisation.
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Strepto:..yces albof1vus donne des colonies distinctes, blanc-s3le, brillantes, sans myciliux aérien ni piments, Streptoyces wlboflavus h-108-CX donne des colonies brune foncées, presque noires, formant du mycélium aérien, blanc, et du pistent dif fusible, bronze à bronze -violet}
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Strentoaycea riroa'.1s donne du pigment diffusible $au-
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no clair, et des colonies bei,;e clair avec rare mycélium aérien
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blanc sels.
8) Milieu de CZl.1pek-Dox, de formule ;
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l;ol70; Kaaw4 0,5 g 2:S04' 7II2. 0,25 s L'ai 0,25 g Fe$04 un cristal de petite taille A.;cr-asor- 7t5 s 2înu distillie 500 ce
EMI7.5
PU 711 stérilisation
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On n'obsorvo sur Co miliou aucune croissance saut dune le cas à JtpeOLtcea -illb2fln= qui donne une môd1oor.
01'otsslinoe V';;':'C.t,v0 jaune olaipt 9) milieu 11'..e);'lsont da forisulo 1
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xtrttit do levure g ,,'!..ni'.on soluble 7t5 1<:,,1±1- 4 095 15 I;t0, 7It::.0 0,25 If J,;':r-a6ur 10 g ;,,u distillée 00 oc
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l'!I ? ('lp:t.; stérilisation ) ibN orecs nlboflavus donna dea colonies plates, lQt ;o);'I"Jl.1Emt rid-ioa, j'tune beige, et un p.ü :en4 diffusible de 111 môme couleur, sczns jJyoliu::l aérien;
StrC:'1t;Ct :,'QC "l)o:"l"vuo t-1t'8-0X¯et .3tro:->to'WQO:3 ,7:ceue se dvelo. l' lm;. '10 façon semblable, pr-duissnt dos colonies vG6- tutiVI.Jf3 jaune A ai,^e, et uh pljr.cnt jaune brunâtre , celui-ci itant un neu r>lug cZ:e3.x d'\nr: le cas de âtre-p¯:vCe ri:r.asus, ****' ' ' -'M--Mowt
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10) Amidon Czapek-Dox, de formule
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<tb> A <SEP> idon <SEP> soluble <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> NaNO3 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
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KaI#04 0.5 g QS04' 7H20 0,25 S
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<tb> KCl <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb>
<tb> FeS04 <SEP> un <SEP> cristal <SEP> de <SEP> petite <SEP> taillé
<tb>
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#Agar-agar 7 5 S
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<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 500 <SEP> cc
<tb>
pH 7(après stérilisation)
Les trois varias sa développent de manière exacte-
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méat semblable, recpeotiV9M@n, à ce qui ost observa sur le milieu 5) (Dextrine 0aopek*DoxO 11) 1ilieu cu $lait violet", C "iurple Millell) milieu oo'ercisi vendu par la société dite DIV00t pH 6,45 Oant st6ri. lisetion.
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Les trois variétés se développent bien, suna modifica- tion du pH.
12) Milieu nutritif do formule !
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<tb> Extrait <SEP> do <SEP> viande <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb>
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eortone 215 5 A;ar-aar 795 g
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<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 500 <SEP> ce
<tb>
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pK ô,8apruc -1 S:tI'C ,to:;lYces nlboi'lavuFJ produit des colonies végéta- tives distinctes} ronderit brillanten, allant d'un blanc sale à uno nu*in 1o lifôreaont avec trùs léser piC;Lient dirrusl. blet jaune clair;
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âbr3orofcca olboriuvua H-1G6-CX et 3t?n'boy008 ri,- aioouo !>r/IUonl,,;:n1i lo j-Coe aspect, avec v Mutation beige à jeu""' nfître avoc .3!;vr plient; diffuaible couleur dor6e claire.
1.3) Milieu au t;lucora-apara,.na, de formule !
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<tb> Glucose <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
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Aaporr.Jine 0,25 g
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<tb> .Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,25 <SEP> g <SEP>
<tb>
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A'r-a ar 7,5 g
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<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 500 <SEP> oc
<tb>
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pli, 6,9 (aprùs stérilisation.)
Sur co milieu, l'aspect des trois variétés est sem- blable à celui obtenu sur la Milieu précédent, le développement
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'tant cependant plus lent et les pineots formés de couleur plus claire.
14) Milieu au sucre-dextrine-nitrate, de formule
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<tb> Dextrine <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> NaNo3 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
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:,50,, 7R20 . 0,2' g
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<tb> KCl <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 15 <SEP> g
<tb>
<tb> FeSO4 <SEP> un <SEP> cristal <SEP> de <SEP> petite <SEP> taille
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillé <SEP> 500 <SEP> oc
<tb>
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pli 7 (après stérilisation.) atrbr ..tpuyco.s alboflovus donne un mycélium aér1en blanc à bolt;f croissance rapide, avec un pisment dit:U8ibl. jaune clair.
Streotosyces ciboflavus produit une végéta* tien presque noire avec un pigment dirus1ble marron foncé et un rare mycélium aérien blanc.
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trc:t>tà: ';YCUI1 ri'..o sus donne v.G:itutin rab planent: d t:t:ùolblo, toue, ou;; de colore uion JHUt10 ,.runtttrr, Bllna ,yc6li li\0rien, Les nilioux de culture d6critn ci-dosnua ont été prjpal'Ws 21 partir du produit fournis 'nI' l:t 3ocl$t± Et ,."E.WK, D:.1rstnlt (pour 'Lus co.:pos,:s invr,.;ltd'luo::3 ot l' ol3')Q.rlJ.c;ine), et DÏFOO, Détroit pour le roo ;e.
Strr to'iyoca albori"v\isi I.i-*1Ci-CXi|t contraira-uonfe à sa souche d'origine, produit dos oooilion an Lrd cambre, detiv '.':;' ohaînoo t'orment àouvf..rvfc dos p.Lr:,les ouvertes, Les conidies sont olllpsoïdales, :lesu.t'l:l!lt de 0,7 0,9 microns, par 1 ,G a 1,5 .dcr0l13, ot nr'.a: ut-:nt;
unr) ourfsco lisse La co- loration des spores en mttoso osc chaMois olivtrot trc to...;Ges plooflt:.vua 1i-10a-oX convient bien à la fermentation Gub.-.ortjc à l'échelle industrielle, avec rendements élevas,
Le milieu nutritif aqueux pour cette fermentation industrielle contient une source d'azote assimilable, une sour-
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ce de carbone' et des sels :'1inú.ro.ux, Corme source d'azote on peut utiliser un hydrolysat de caséïne, de l'extrait de naît, d'orgé ou de mais, de la li-
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queur de :
{cér(.ltion de grains (ou de mais), de la farine d'ara- chides, de la farine de soja, etc$@* L source de carbone peut être fournie par divers carbohydrates contenant du glucose, dextrose, rultose, amidon dextrine, etc.... Outre des sels niméraux. présents h l'état de traces, tels que fer, cuivre, cobalt, zinc, le milieu l'en-
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ferre aussi du carbonate de calcium et du phosphate d'anoniust, principalement en vue du replace- du pH du l:1il1eu.
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Les proportions ou mantitis des ,jl(bonts nutritifs ont..'t''- Ln'li'1U)13 d:.1tlc les exa"Iylas.
L'addition -.\1;>: milieux de culture usuels, préparés o5" e inuiv*'1 t11u.3 a,a 1e de ,:; i â.bf3tlN;j t:1Ji.rl:?û;.a,n , (D33D), nu;..,et0 le ronionsat :four de ,Ql1S x.su.tut, lu quantité de DJ::iD ajoutée. loi* St-re comprise entra 10 et ûCO ;,g/l.rn du tn3,..au. en a de meilleurs résultats en ajoutant 1 DB±D soue for* ue d'ucétabe ou du lactate, on plusieurs fractions uu cours de la ,('c:1:'; :cnt. [,d:; l.on , la quantité inititlle ajouté nu milieu avant ensemencement 'tan... 00;,1.,1'160 entre 10 et 100 ug/1. Ln fôrueata- tion a lieu cintre 4 et ;1(.,0, avec forte aération de 1. ordre de o ,1 0,7 :1(;1't1oD du voluxu un fermentation, selon le stade de fcr'1'(':rlt:\ on, Un vuo d'o:,t;'nir de.3 r::u.t;tts optimaux on ajuste lo pH untre 7 et 7 5 u dcbut de la .'oz'aontnt.on; lo pH.d.l.So1'o!t ensuite) 1 |5,2 -5,<3 pour revenir \ 5.2 -6,5 b.
In fin do In fer- :mnt;:xiri..n, La 'c1r':e de 1; fomentation jusqu'.\ l'obtention de 1 ' '3UI!tltiM !:,nxJ uni ,.,' !'.1.'oç'.u;1.t eut do 9 \ 10 heures colon les conditionot k1J.'lJH fictive .0:14 do l\ fox\.;untation, on extrait l'an- tiiloti ,U\1 -n-a' no 1 tlulatiol1 du milieu JU:': :u':\ un p!I de 1 a 2, fm "\o'rOIl d'un ncido. Lo milieu acidulJ: est ensuite filtrj.
L'an- tibioti'.uo#oie oosenti/;) 1.1e ,0:'1 duna le filtrat d'où on ;out l'isoler pur lea # rocJd'o connus 'rjoipitation, extraction d.-..n3 un solvant or .ni uo, ote,.., cuivio do reoristullisationt II eut 'r'fbio oe:'tm(ll1n't 'uti7.,cer 11:1 proc.d à lu D:')oo'"J:;D.
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à savoir
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On 1 oxto lo pli du filtrat obtenu par extraction a- cido jusqu'à 5 à. 6 on ajoutant de 1'(\ ..oniaque à 12 , |v
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et on ajoute l'acétate de DBED jusqu'à ce'Vu'on ait obtenu une concentration do 1/10 à 115 en poids do l'oxytwtracyoline con- tenue dans le milieu fur:
.,ontà (la quantité de D3ËD déjà ajoutée Yentue.7,e,,cnt pend.n' la fermentation ,,vrjnt ',t6 le cas elis on rajuste le pyl entre 8#5 &et 9 par de l'act- aoniaque à 12 t ce qui provoque lu nrui 3.tctt.on de complexe de D3ËD dl trac -1,01 ine F.- l'état prouquo puri ces complexes ayant une composition corraspoecnt à Ox-ft,.tracycline2oDBED,Ca (au ces où le ...il,leu contient des ions Ca). Des complexes ayant d'autres corriporitions, d'i.-iport..ncr,, secondaire, peuvent ;o7.e. ment 8tre forcés.
On filtre le complexe nr' ail.t4: on le lave à l'eau et on le coche dans le vide entre bzz et 600, j'iprùs avoir oulvérlsé le complexe, on le recr'ist'jllise duos un alcool alipha- tï,.ur., ayant entre un et tra..3 atouoes io carbone, et l'coidule jusqu'à un pli co.pris entre 1 et ;e par de l'acide ohlorhydrique Gazeux, Lu ci,laxhyraxe.to vini3i cristallise
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au bout de six heures.
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En c.mulrant lo co:::r,=:cc ,j:Niu'rau point .co ilee,r9... que dans un uiliou aqueux, on fait pr icipltex1 l'oxyt<'-traoycli- no sous foré dû sa t,4sG, cc w'crx..u7.a il 9$ 2il Os et d'a-
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naisse :
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Calculée: V$yZ<i r II 5,ôb 1; id j,'i4 Il 10 7,3 '/ Trouvée: 5-3 ii H 5,- >;5 il <j>, 7 >,i il 7,4 ;:.
Le point 1:1.isi,-n cnu du 16C 1", '-vcq eut rotation opti >ne /A' /D - 1;., (C 1 dans IIC1 d<5cinor ml)t L'nbsorptioM f.h'.r.H jL'ultrf-.-violot, a;.,,c, un trnpon 'iu plioph, 1 te 0,1 volo, 5 ni: 4,5 ,sL (li'1'" <-40 ir <-9C ou e: 76 m u, 300 'ICfit j: /.al 1 )')# aru .LY produit; :t' t3Ous la :'ox,:o de chlor- hydrate ou de 1.- base, il os'o intit'uo i 'ax,,t:rttc;cl.no standard fournie .ar la "l'oo-,l :tn.i :ru '.3:in.:tr,tian' des
<Desc/Clms Page number 13>
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U,J,A$, t'-nt doft . oinln ".n vue , niio do son pouvoir S i r'1ti')'\O\"1j,{JtI.
L'=..,:br: ;o inl,r:Wrta, du !!).'oo:dt objot do l'in- vuublon, >1o'nb :p',l:I.o' 1;11')0 rh: -m t tint rfcii'loiel treto-r:!: .bo.'l;v u: ;.r.1G:¯ t 1! )nir1u Q3:,'jntiQll neût dans le trôs haute valeur '11) l':''Jf10..t;!n1;, qui. d,aars da loin les rondsmants les plus '..fyln i.llbl1..:a A ce jour, obtenus uar loo proc6ds employant lc3 a.v':r:l:z "tlri' t c # Nr'ç;,to,.rCos r tmo3Us Lao ;acs,,pl,va qui suivent servent à. illustrer le pro- c dé objet do l'invention, nais sont donnas sans intention li- mitative.
EMI13.2
J:;AÍ;;...P1E 1.
@ous les Milieux do oulturo sont préparés à l'aide du milieu
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d'oau du robinet. On onso .C;InOO 1 llt;xs/stûril3.sd de oomposi- tion ;
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Ligueur de aobration de nota 10 g
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<tb> Sucre <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
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(;:HI+) 2l#Q4 Y.1I04 2 g 1'S04' 7H,0 0 tï5 a
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<tb> Eau <SEP> 1000 <SEP> 00
<tb>
EMI13.8
avec 1 ra. d'uno suspension do s,loro3 de ijïre>t9t.'!oec albols L,1 ..ÔX, 01, on Incube à 2'. duns un 61angeut sotatif pandarit 6 heures. On onacwonoe ensuite avec la proulture de 3 heur..
4ain:L o,t<:ff11l0 danc une cuve da ormontlJt1on pilot$ un milieu nt6rilis de composition !
EMI13.9
<tb> Eau <SEP> 120 <SEP> 1
<tb>
<tb> Amidon <SEP> 6 <SEP> kg
<tb>
EMI13.10
Ligueur de :uc.:raiot de NBÏs(50 ) 2$7 kg tx00, 0.72 k$ om)2S04 opta kg
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i4l. 0,2 kg Goal, 0,11.0 b (;U.jo4t 0 OtG ta04 710 6 ; F,i.JO4 OJIL-0 g : 'lutle de tournesol 0, kg
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il On rocède alors h 1j; entntion 3ubJ\crgêa â. 260 avec D.Citr.1tiotl ut a6rntion stérile, 1" 11!! m milieu et leu qu'mtit0t1 <1' oxyt.Jtrcyclino
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forcée, clit ûti dt:r.:inâcfJ ,\ di '1:-'rents intorvullea, avec les r-Saultiafca suivants j
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Heures -\0 p H il'illt.ti3Ei <1' oxytl:trucy- f or- cntatîon. nline (meg/ml)
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<tb> 0 <SEP> 7,2
<tb>
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6, 180 46 5,9 1200 .
5,7 ;100 S5 5,? 3400 110 5,6 49CO 195 6,5 oo 150 6,.1; 6600
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On et fin à la fomentation après 15C heures ; 1 la concentrat!.n ±.nE7.o en nr:racro..ze est alors de 6,6 g/1.
BXLE ÏQ akïâ- On procède co:..me dann l' e;:a::p. précédent, nols on ajoute au silieu de culture do la :; ,1i t -dibenzylJthylène-dir.mine di:c5tnte cn luw eura fructiona, à savoir 6,4 gavant ense- mencement, 8,4 s erres 5C Usures de forint tien et 2,4 ± après 1(" heures. Au bout. de '1 heures, la quantité d'ox-rtstrnoyal3ne obtenue est de 8,1 s ',:.r 1 î...--tro 'le bouillon.
E:C-:..TLS 3. - Cn ccidule .le bouillon òr:.ent: obttnu selon l'axe,:.-
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pie 1 avec de l'acide sulfurique à 25 K jusqu'à PII 115, on le filtre et on lave le mycélium à l'eau. L'ensemble des filtrats a un volu.:e de 240 litres. On ajoute alors 2 Gli d'éthylènedia. nine-ttr/jtte do odiw3 (aGent de séquestration). On ajuste le pH à 3 avec de i' s.:,.ffionilUe (11; %), on ajoute 1::;0 g de dia- otato de et; on porte le pH à 9,5 j avec de l' H .Llontc;.ue (12 Après agitation pendant 3 heures, on filtre ut lave ln ,rticipit6 ùoraù juscu'à ce que le pH des eaux de lavabo atteint pil 7. On sèche la précipité à 50 dans le vide.
On broie lo ace et on le -%et on suspension dons deux fois son poids de :,Jthnnol..\près agitation pendant 30 mi- nutos, on l'acidulc z-.vec du 1101 ::a::e\1x jusque pH 2, puis, à l'aide d'acide chlorhydriouo a $<5 ',*% on abaisse la pH à 1%5 et on ut,,ïte, On filtre le rJoipit-: form6 et on lave au 6thunol et sèche dans lo vide pondant 6 heures. Le rendement en chlorhy- drate d'ox>rt'''fcrrio;' llna ont de 81 ' On met on suspension Io produit obtonu dan l'exenpio ;; dans un poids u.1 -lu ou on J.'o,lo 10 pil à 718 avec un .a'.l.vnjo \ rtio3 6 .fies do !iJt..onoX ot de trithyle.;.11n..
On filtre '1" l\olu:;ion obtenue. l'uil3 on on ajuste le pH à 5 et on ajoute 1.0 l'er.u on 'rooortion j.j'de à cinq fois la volume de If, solution. H b:.ae o:=-'Jc: tl'uoycli::13 cr.llJt!..llise, Après fil... cri scho âuar- lo viùv* eb on <1vtiant: lo base Livoc un rjndu;:unv de '/>## L'invoaUion a ."0'n' objet un de prpcrtion d'ox'- 1 'îCracyolinc par frtOnttion, ro..arouable|e8ooutiellefflont 1 en ce ulon fuit for..ont or un oouilloa do culture, dans des con-
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ditions aérobies, et; à une température comprise entre 22 et 30 tvec des .tutants de Streptoc ces ulbofluvus (loaksarznn et Curtis) , e qu'on isole l' o;, t . trcc fcl; ne ror.-:
:a nu coupe de la four- :Mentc,tion, Ce pio.c6de peut présenter encore . les particularités suivantes prises isoleront ou on toute combinaison opérante ! a) la f or.aenfc .##"ion est ex.cut4e en subversion, et le bouillon contient des sources do carbone assimilable et d'a- zote ainsi '..ue dos sols r.lin ;r:,ux, favorisent le développement du [:11'oro-or±;::. n:ts'"e. b) le uubent est Outeuu t r,,ru.Lz' d'une oerttiuo 3- ohe de âtreptomyces rlbo7.rvus 'tVaksmann, du Oentraal-bureau ." voor Sohi;h3ieloulturos, à Banrn, la variât mutante productrice d'ox-Jtt'f1ac;ycline ayant t6 d,jPOIJJ6, avec la orjoente demande, dans la collection du CE:lr. 1;;rac.1burenu sous la dénomination "âbreto.,,rae4 :.31bofltWUS, . .:-1CG-CX";
c) on isole l' O:r.,i't :trao701ino du sein du moût fer- ;.iont6 rJoua la Porr.io .de co",p1oxec de 1(,Ii'-.dibonryl5laylne-d,am,r do l'or.yt tr;zc;lcl.ne on tr'scnce d'Ions oaJ,cium.; d) on conduit la l',r.:ont:xt:on en prjsenoe d'un seul colublo clana l'euu, do :7r :r' :runr,o l'o6tate, do l'[,H'-dibeQzy" 1 sthylônodicnlne, qu'on ajoute au :..iliett de culture en plu- sieurs fractions au cours du la for .anttïon, eil quantit6 totale oO:r<riso entre 1CO et 1CC0 ;a;/1, puis on isole l' oxyt,1traoyoline pure sous la :Cor; ,(;: do complexes, se..l1.1 ou de la base.