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"Vaccin obtenu à partir du virus Vivant atténué de la rougeole".
La présente invention se rapporte à un procédé de production d'un vaccin de la rougeole amélioré et à un vaccin de la rougeole amélioré servant à immuniser les êtres humains contre la rougeole. L'invention concerne également un procédé de production du virus de la rougeble de la souche. dite de Schwarz.
Des chercheurs ont réussi à adapter le virus de la
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rougeole de manière qu'il puisse se développer et se propager dans des cultures de tissus ou de cellules n'appartenant pas à des êtres humains. Il a été démontré que des souches du virus de la rougeole qui sont appropriées pour une inoculation aux être humains peuvent être obtenues par atténuation dans de telles cultures de cellules n'appartenant pas à des êtres nu- mains.
Des essais cliniques du virus vivant de la rougeole, adapté et atténué, ainsi obtenu, ont prouva qu'il est capable de former des anti-corps dans les sujets inoculés en les immu- nisant contre l'infection par la rougeole. Malheureusement, des réactions indésirables telles qu'une fièvre élevée peuvent se manifester à un degré important chez les personnes inoculées.
Une grande partie des enfants auxquels on a inoculé des vac- cins obtenus à partir de la souche adaptée et atténuée des vi- rus de la rougeole dont on disposait jusqu'ici ont été sujets à de fortes éruption et à d'autres réactions dues à l'inocula- tion.
Les effets secondaires indésirables pourraient être supprimés ou éviter uns une certaine mesure par l'injection simultanée de globuline gamma qui a un effet marqué en ce qui concerne la prot ction des enfants contre les symptômes plus sévères des réactions indésirables. La prévention des réactions par application combinée uu vaccin de lu rougeole et de la glo- buline gamma est peu commode et coûteuse et ne convient généra- lement pas pour des programmes d'inoculation à grande échelle.
On a actuellement constata qu'on peut éviter les effets secondaires appréciables et les symptômes indésirables ou tout au moins les réduire fortement chez les personnes ino- culées si l'on utilise, pour l'immunisation, un vaccin amélioré qui est obtenu à partir de la souche dite de Schwarz du virus vivant de la rougeole. Avec ce nouveau vaccin, il n'est pas re- quis d'injecter simultanément de la globuline gamma. On peut obtenir actuellement une action aussi bonne ou meilleure en ce
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qui concerne la fréquence et la sévérité des réactions chez les personnes inoculées en utilisant le vaccin amélioré de la rou- geole conforme à la présents invention seul.
La souche Schwarz du virus de la rougeole se dis- tinbue des souches du virus de lu rougeole cunnues jusqu'ici par l'absence d'effets secondaires et de réactions indésirables chez les personnes inoculées avec ce vaccin et par l'absence notable des symptômes pathologiques habituels de la rougeole sans réduction apparente de sa capacité d'immunisation et de son efficacités
La sécurité et l'action améliorée de la euche Schwartz du virus de la rougeole peuvent être obtenues par l'atténuation d'un virus adapté de la rougeole, de manière tel- le que la virulence du virus soit affaiblie à un degré plus élevé que dans le cas des procédés d'atténuation qui ont été utilisés jusqu'à ce jour.
Les vaccins nouveaux et perfectionnés de la présente invention contenant un virus vivant atténué de la rougeole peuvent être facilement obtenus conformément à la présenta in- vention par la propagation et la croissance de la souche Schwarz du virus de la rougeole dans un milieu de culture comprenant des cellules animales vivantes, après quoi les cellules et les débris sont séparés du milieu de culture. Le vaccin obtenu de cette manière peut être utilisé directement ou être stockée et les agents habituels de dilution, de stabilisation, etc peu- vent être ajoutés à n'importe quel moment. Le stockage est facilité si le vaccin est congelé et est maintenu dans cet état en vue d'une utilisation ultérieure.
Si la propagation de la souche Schwarz du virus de la rougeole a lieu dans des conditions et à des températures telles que le virus ait la possibilité de reprendre une forme plus virulente, il eat bon de prendre la précaution de faire appel, au cours de la fabrication et/ou de la préparation de réserves d'ensemencement à partir de la souche Schwarz existante
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du virus, à plusieurs passades dans des conditions réductrices de la virulence, par exemple de cultiver le virus pendant plu-
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sieurs passades & des températures inférieures à 35*0 et plus avantageusement inférieures à 3200.
Si, en dépit de toutes les précautions, la souche Schwarz du virus revient à une forme plus virulente, elle ce=.se de constituer une matière de départ appropriée pour la aise en oeuvre ce la présente invention et
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on doit la remplacer par une substance nouvelle rpondant à la définition d,9 ny plus haut pour la souche Schwarz du virus de la rougeole.
Selon, l'utilisation envisabée, le vaccin obtenu à partir du Milieu de culture peut être dilué avec un diluant appropriâtde préférence avec de l'eau distillée et stérilisée.
Dans une variante, on peut sécner le vaccin par congélation
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pour .'sut6sç.xax et le reconstituer ",vue un diluant aruprié, de préférence en. ajoutant de l'eau distillée et stérilisée, avant de l'utiliser.
Il est souvent avantageux d'ajouter au vaccin un
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atoent assumât sa stabilisation. On a pu constater qu'une solu- tion de lactose et de glutamate constitue un agent stabilisant excellent pour le vaccin.
Le virus vivant de la rougeole appartenant à la sou-
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che 8chwa^aw virus qui constitue la matière de départ pour la production des vaccina améliorés conformes à la présente inven- tion, peut être facilement obtenu par l'adaptation du virus de la rougeole, de manière telle qu'il puisse croître dans un tis- su cellulaire vivant n'appartenant pas à un être humain ou dans un milieu contenant ces cellules vivantes et par atténuation
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du virus adapté Krtee à plusieurs passades à travers un milieu de culture comprent des cellules animales vivantes, aans des conditions réduisant la virulence et à des températures infé- rieures 4 37*0 mais .supérieures à celles à laquelle la propaga- tion du virua cesse.
Comme mentionné plus haut, le procédé de
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production de la souche Schwarz uu virus de la rougeole entre également dans le cadre de la présente invention. Au lieu d'a- dapter des virus natifs de la rougeole, il est également possi- ble d'utiliser comme matière de départ une souche adaptée du vi- rus de la rougeole telle que celle que des chercheurs ont pu obtenir antérieurement en adaptant et en atténuant la soudhe Edmoneton du virus de la rougeole, comme la souche .fondera. L'at- ténuation des souches adaptées disponibles grâce à.
plusieurs passages du virus dans un milieu de culture contenant des cel- lules vivantes n'appartenant pas à des être humains, de la ma- nière réductrice de la virulence décrite ci-dessus, donne la souche Schwarz du virus de la rougeole.
Il est préférable qu'au moins une partie del'incu- bation, dans le processus d'atténuation, soit exécutée a une température inférieure à 35 C et plus avantageusement inférieure à 32 C. Au moins plusieurs passages ou une partie des passages, quand leur nombre est important, doivent être exécutés à une température inférieure à 35 C et plus avantageusement comprise entre 28 et 32 C. Toutefois, si on le désire, tous les passages du processus d'atténuation du virus peuvent être exécutés feux températures inférieures qu'on vient de mentionner.
On peut facilement adapter le virus de.;la rougeble de manière qu'il soit capable de se propager dans des tissus d'embryon de poulet ou dans un milieu ae culture contenant des cellules vivantes de ce tissu.Ce même tissu ou un milieu nu- tritif contenant les cellules vivantes de ce tisbu peuvent également servir de milieu de croissance pour la production du vaccin à partir de la souche Schwarz du virus.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de production de la souche Schwarz du virus de la rougeole les cultures d'un tissu animal sont obtenues de façon classique dans un fluide nu.ritif, qui n'est pas toxique vis-à-vis diïl virus de la rougeole et qui entretient la croissance de ce tis- su, puis on les inocule avec le virus vivant de la rougeole.
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On fuit ensuite incuber les cultures de tissu inoculées, a ?7'* 3? G et pensum, un certain laps de temps, puis on fuit pusaer le virus, à plusieurs reprises sur le même tisu animal et pen- dant un nombre de passades suffisant pour assurer l'adaptation du virus à lu croissance sur le tissu particulier utilisé. De cette façon, on a constaté par exemple que le virus de la rou-
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6aele peut être adapté à la croissance sur un tissu provenant du rein de chien, da rein de boeuf, du rein de porc, et sur un tissu d'embryon de poulet.
Après cette culture d'adaptation, on fait ensuite passer le virus en série dans une culture de tissu, sur le support particulier auquel un l'a adapté, l'in- cubation du virus étant exécutée à des températures inférieures
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à la normale et comprises entre environ 28 et 32 C pour modifier le virus, ce qui fait que le virus modifié, quand4l est&njecté à des enfants qui ne sont pas immunisés contre lu rougeole, est capable de stimuler la production d'anti-corps protecteurs de la rougeole sans produire d'éruption appréciable, une fièvre
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notable ou d'autres symptômes pathologiques usuels de la rùu- - geole . Le procédé précite de culture du virus de la rougeole, quand il est exécuté sur des tissus avians, en particulier des tissus d'embryon de poulet, représente un mode de réalisation préféré de la présente invention.
Dans un autre mode de production de lu souche Schwarz du virus de la rougeole, conformément à la présente in- vention, on inocule le virus vivant initial de la rougeole dans une culture de tissu unimal et on le fait incuber à des tempé-
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ratures inférieures à la normale, cvwme mentionné ex# iessus, sans adaptation préalable au tisitu particulier a des températu- res d'incubation normales. nsu.l.te, on continue le transfert en série et l'incubation à ces températures inférieures à la normale, de préférence entre environ ..6 et ?<i 0, pendant un nom- bre de passées suffisants pour obtenir l'atténuation désirée du virus.
Dans une variante, quand le virus natif frais de la
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rougeole constitue la matière de départ, il est fréquemment dé- sirable d'effectuer la multiplication initiale du virus dans une culture de tissu humain, comme une culture d'un tissu.de rein humain, d'un tissu amniotique humain ou d'un tissu de coeur humain, ou d'un tissu animal dont on sait qu'il peut servir facilement de tissu porteur pour la multiplication de ce virus natif, par exemple une culture d'un tiwsu de rej.n de chien.
Dans un tel cas, il peut être désirable de poursuivre la culture sur ce tissu humain ou ce tissu de chien pendant plusieurs passages en série, jusqu'à ce que l'identité et la pureté du virus puis- sent être établies, Ensuite, on procède à l'adaptation du virus à d'autres tissus animaux et l'atténuation de ce virus par incubation à des températures basses de la manière décrite ci- dessus. Dans n'importes quelles opérations d'adaptation anté rieures à l'amorçage de l'incubation à des températures infé- rieures à la normale, il est compréhensible c.u'on peut procéder à des transferts intermédiaires sur d'autres tissus ou sur des oeufs ambryonnaires par des techniques classiques sans sortir du cadre de la présente invention.
Il est étalement possible de procéder à l'atténuation conformément à la présente invention avec des souches existantes de virus de la rougeole qui sont adaptées en vue d'une croissance dans des tissus animaux ou dans un milieu de croissance contenant des cellules de ces tis- sus, par exemple avec la souche Enders du virus de la rougeole.
Dans l'un des procédés, on forme une culture de tis- su animal de la manière décrite précédemment et; lorsqu'on peut constater une croissance satisfaisante sur le tissu, la charge initiale de fluide nutritif est remplacée par du fluide nutritif frais et on inocule les cultures avec le, virus vint de la rougeole. Pendant l'incubation du virus, on peut abiter doucement les récipients de culture, par exemple au moyen d'un ensemble à tambour et galets. Oh peut aussi appliquer des pro- cédés ue culture statique, à condition de faire en sorte que
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les cellules tissulaires soient immergées dans le fluide nutritif. La multiplication du virus est habituellement démon- trée par un effet cytopathogène distinct sur les cellules tissu. laires qu'on peut observer au microscope.
Toutefois, dans cer- tains cas, en particulier au début de l'adaptation du virus à un nouveau type de cellules, un effet cytopathogène n'est vi- sible qu'après une longue période d'incubation, si même il est visiole. Toutefois, dans ces cas, on peut suivre la multiplica- tion du virus par titrage d'une partie du fluide ae culture du tissu inoculé dans une culture de tisau humain, comme le tissu amniotique humain, le tissu au coeur humain ou un tissu analo- sensible gue à ce virus. Ce genre de tissu montre rapidement un effet cytopathogène typique quand on l'infecte avec le virus de la rou- geole.
Dans le mode de mise en oeuvre préféré, on fait passer le virus en succession à travers des cultures successives de tissu animal, frais, avec incubation à 35 C, pendant quelques- uns de ces passages, de préférence environ une dizaine de pas- sages, pour assurer une adaptation au tissu particulier utilisé.
En tout cas, on procède ensuite à plusieurs passages en série dans cette culture de tissu, avec incubation du virus à des tem- p6ratures inférieures à la normale, de préference comprise en- tre environ 28 et 32 C, pour obtenir l'atténuation désirée du virus. Le nombre exact des passages successifs à la température inférieure qui est nécessaire dépend de facteurs tels que la souche particulière du virus de la rougeole qui est utilisée, l'histoire antérieure de sa culture et le tissu particulier utilisé dans la culture sur le tissu.
Dans une culture de tissu d'embryon de poulet, on obtient de bons résultats en ce qui concerne l'atténuation, avec environ quarante passades en série du virus à une température d'incubation de 28 à 32 C
Quand on a atténué le virus de la manière précéden- te, la Boucha Schwarz atténuée du virus peut être maintenue sur un tissu du même type que celui auquel le virus a été adapté
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en poursuivant l'incubation à des températures de 28 à 32 C En général, il est désirable, mais non pas nécessaire, de trans- férer le virus dans des cultures de tissu frais quand environ
20 à 75%, de préférence 25 à. 50%, des cellules contenues dans une quantité donnée d'une culture de tissu inoculée, montrent un effet cytoputhogene.
On utilise des techniques similaires pour multipli- er le virus atténué en vue d'obtenir des réserves pour la pré- paration des vaccins. Dans ces dernières opérations, on fait incuber la culture jusqu'à ce que le virus se soit mu tiplié de façon telle qu'on en obtienne une concentration utile et on'récolte le fluide provenant des récipients de culture sur tissu, par exemple par décantation dans des conditions aseptique puis on le clarifie par centrifugation, filtration, etc, . Le produit résultant peut être utilisé directement sous la forme d'un vaccin ou, selon sa concentration en virus, on peut le di- luer avec.un diluant injectable approprié ou une solution sta- bilisante, non toxique vis-à-vis du virus, pour préparer un vaccin liquide final.
Quand une partie appréciable des cellules , de tissu contenues dans la culture n'a pas été désintégrée par l'effet cytopathogène de la croissance du virus, un fluide frais, comme une solution appropriée de stabilisation du vacc in, une solution saline équilibrée, un milieu nutritif frais ou un pro- duit analogue, peut être introduit dans les récipients de cul- ture après la décantation, et on fait passer ces récipients et leur contenu par un cycle de congélation et de décongélation pour libérer de nouvelles quantités de virus des cellules des tissus* On recueille le fluiue résultant et on le réunit à celui qu'on a récolté précédèrent, pour obtenin un concentré de vaccin.
On débarrasse ce dernier des cellules de tissus et des débris d'une manière appropriée, comme mentionné plus haut, puis on normalise la teneur en virus par titrabe, par exemple en fonc- tion des-cellules de culture de tissus humains. Ensuite, si on
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le désire, on peut utili er le concentré de vaccin directement pour la vaccination d'êtres humains non immunisés, ou bien,
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on peut le diluer avec un aent stabilisant stérile comme une solution de lactose et, de glutamate et, le stocker à l'état con- gelé, de préférence à une température comprise entre -20 et
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"j0 C, jusqu'au moment de son Utilisation.
Dans une variante. le vaccin stabilisé peut être séché par congélation, ce qui donne un vaccin sec qui peut être facilement stocké et qu'on peut reconstituer avec de l'eau stérilisée ou une substance ana- loue au moment de son utilisation.
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Bien qu'on profère poursuivre'incubation aux tempe- ratures inférieures à la normale, prescrites pour assurer l'at"
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ténuation désirée du virus en vue de produire la souche echwart du virus avec le plus petit nombre possible de passades succès-' sifs, on peut apporter des modifications mineures. Ainsi, par
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exemple, les passais en série à e8-3,eOC peuvent être interrom- pus par un ou plusieurs passades à des températures plus élevées, à condition que le nombre total de passades à la température inférieure à la normale soit suffisant pour assurer l'atténua- tion désirée.
De façon similaire, lorsque l'atténuation dési-
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3ët est obtenue, ont peut procéder à un ou deux passades de multiplication pf-ur propager la réserve du vaccin à des tempé- ratures plus élevées appropriées, si on le désire,
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EXi-TPLE 1 Technique de culture sur tissu.
On découpe finement des embryons de poulets de 8 à 10 jours, dans aes conditions asceptiues, après avoir enlevé les yeux, et on lave le tissu émincé ainsi obtenu avec une solu-
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tion saline tamponnée au phosphate. On traite le tivsu lavé avec de la trypsine, de la manière habituelle, en utilisant un flacon d'Erlenmeyer pour-vu d'un agitateur magnétique. On cen-
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trifuge le tissu ainsi traité à une vitesse de 1.uuO taurs/minu te et pendant > minutes, après quoi les cellules concentrées ré- sultantes sont mises en suspension dans un milieu de culture ,
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4 raison de 5UU.UUU à 6GU.OuU cellules par ml.
Le milieu de cul- ture est une solution saline basique de JSarle (6,8 gr de chloru- re de sodium, 0,4 gr de chlorure de potassium,0,2 gr de chloru- re de calcium, 0,2 gr de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,15 gr de phosphate disodique, 1,0 gr de glucose, 2,2 gr de bicaroonate de souae et 0,02 gr de rouge de phénol dissous dans l'eau en-quantité suffisante pour faire 1000 ml) contenant 5%
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de sérum de veau et 0,5ira d'hydrolysat de lactalbumine et con- tenant en outre 600 unites de péniciline et 400 microgrammes de streptomycine, par ml. On inocule des quantités de 1 ml de la suspension résultante dans des tubes stériles et on fait in-
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cuber pendant 24 à 48 heures à 35*G.
On procède également de la même manière pour former de plus grandes masses en introduisant 60 à 70 ml de la suspension dans des flacons de culture de Blake ou de Roux.
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Après la période d'incubation initielo es cellules de tissu d'embryon de poulet, on en enlève le milieu de cul- ture, on lave les cellules à deux reprises avec le milieu n 199
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de Morgan et Parker (Morgan et autres, "proceedings of the Society for Expérimental Biology and liedil.-ine" 1950, 7,IJP.l-d), et ensuite, 2 ml du milieu n 1t,9, rs contenant pas de sérum et ajusté au pH de 7'*7<2 sont introduits dans chaque tube, ou bien 100 ml de ce milieu dans chaque flacon.
Ensuite, on inocule 0,2 ml d'une suspension de virus vivant et actif de la rougeole -
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dans chaque flacon ou bien 1 ml de cette suspensioee virus dans chaque tube, et on fait incuber les cultures résultantes à 32-3800, pendant un laps de temps permettant d'obenir la mul- tiplication du virus, En général, la croissance du virus est aise en évidence par le fait que les cellules contenues dans la
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culturEtsui' tissu présentent un effet cytopathogène, et on procè- de habituellement à un passade eh série du virus dans un nou- veau milieu de culture sur tissu quand environ 25 à 50% des cellules ontenues dans le milieu de culture inoculé présentent
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un effet cytopathogène.
Dans une variante, on peut suivre la croissance du virus dans la culture sur tissu en titrant le mi- lieu de culture dans une culture de cellules de tissu humain, comme des tissus amniotiques humais, des tissus du coeur ou
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d'autres tis&us humains appropries, par le procéda décrit par Schwarz et Zirbel dans "roceedlnbs of the dociety for JSxperi- mental Biology ana 14edicine"g 1;59, vol. lu2, pp. 711-714.
Lorsqu'on a exécuté un nomure de passades suffisant
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pour atténuer le virus de la façon désirée, on procède à un ou plusieurs passades supplémentaires dans une culture de tibtsu d'embryon de poulets, à i8-;$c:oC, sur une échelle assez grande pour multiplier le virus à un degré suffisant pour obtenir une réserve de concentré de vaccin. On récolte le concentré de vac- cin de la manière habituelle par décantation, congélation et décongélation, puis lavage. On clarifie le vaccin de réserve par centrifugation du liquide de culture et par lavage de ce li-
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quiue jusqu'à ce qu'il soit exempt de cellules de tissus et de débris du cellules.
E.J#!.:PLE 2 Préparation et essais du vaccin
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Lors de la préparation d'un vaecin conformément au mode de réalisation préféré de l'invention, on maintient une souche Edmonston du virus de la rougeole, telle que décrite par Endors et autres, grâce à plusieurs passages en série dans
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une culture de tissu d'embryon de .poulet, avec incubation à :'5 0, 'plilndant 19 passages successifs. Ensuite, on soumet ce vi- t'us adapté sur embryo de poulet, en utilisant la teczique de l'exemple 1, à 37 passages successifs dans ur.e culture de tissu d'embryon de poulet avecs incubation à "0.
Le virus atténué résultant obtenu après le 37mie passage est soumis à trois passa- ges terminaux de dilution dans une culture de tissu d'embryon de poulet, puis à deux passades dans une telle culture de tissu pour multiplier le virus et produire une réserve de vaccin.
A chacun de cen derniers passages, on fait incuber la culture à
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3S"0< Les! concentrés de vaEie!tl résultants sont séparés des cel- lules des tissus ai deà débris et on les dilue avec le mme volume de solution do lactose et de glutamate servant e:6abi- lisant, La composition du la solution stabilisante de lactose et de glutamate est la suivante :
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Glutamate de potassium O,56 gr NaHPO z 5 gr KHi'04 ou52 gr
Lactose 100,00 gr
Eau, @@@. pour 1 litre On titre une portion du vaccin termine en fonction de cellules du tissu du coeur humain. On constate que les vaccins contien-
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nent de 103e5 à 10 493 doses infectieuses de culture de tissu (TOID50) pour 0,2 ml.
On essaie chaque réserve de vaccin par inoculation dans un milieu nutritif bactérien au thioglyco1ate, par inoculation par vu1e intrapéritoaéale et sous-cutanée à des cobayes et des souris, et par inoculation intramusculaire et in- tracérébrale à des singes cynomolotues, et on constateue ces réserves sont exemptes de contamination. On injecte à 9 en- fants, qui,ne sont pas immunisés contre la rougeole,des doses de
0,2 ml du vaccin, par voie intramusculaire chez deux des en- - fants et 'par voie sous-cutanée chez les 7 autres enfants. Aucun
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deolentants inoculés ne montre de sibne d'éruption de la rougeole et l'un d'entre eux seulement à une fièvre notable, qui n'est que temporaire, pendant la période d'ubservation qui suit la Vaccination.
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EX-ELLE 3
On poursuit les passages en srie du virus après le @ 3e passade à basse température de l'exemple 2, de la même maniè- re que dans cet exemple, jusqu'à obtention d'un total de 65 pas-
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sages à la température d'incubation de 72 C. On prépare des ré- serves de vaccin avec le stabilisant lactose-glutamate comme dé- crit précédemment et on les sèche par congélation. Le titre du vaccin reconstitua à partir de cette substance séchée par congé-
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lation est compris entre 1041 - 5 et 10,''S TOLD 50 pour 0,2 mlr On conserve ébaletélit une partie du vaccin par conbélation diz 1 sa 1 recta. On essaie le vaccin en ce qui concerne/sécurité de la manière décrite dans l'exemple 2.
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On inocule 0,2 ml dos vaccins décrits c1MuesuUW, par voie sous-cutanée, à chacun d3 70 enfants MW soumis à des teste concernant les anti-corps de neutralisation et de fixa- tion cte l'alexine et ne* présentât pas ces ant3-corpâ une dilution 1 : 2 de sérum, après quoi on met les enfants en ob- servation pendant plusieurs semaines, sous la surveillance d'un personnel médical éprouvé. On n'observe pas de réaction locale
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ou immédiate chez aucun des enfants, sauf une réaction jbe uri- carienne moyenne se produisant approximativement 4 heures après la vaccination. On prend la température des enfants au moins une fois par jour et celle de la plupart des enfants deux fois par jour, pendant la période d'observation.
Dans certains cas, une réponse fébrile moyenne durant environ 2 joura peut être notée 7 ou 6 jours après la vaccination. La température rectale
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maximum moyenne chez tous les enfants vaccinés est de 38*Co On observe une éruption moyenne analogue à celle de la rougeole chez deux enfants seulement, les lle et 13e jourijaprès la vao- cination. Aucune complication sérieuse d'un type quelconque
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n'est constatée pendant les essais e on ne constate pas de com plication nerveuse. On prélève, 5 à 6 semaines après la vaccina-
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tion, un échantillon de sérum du san de chaque enfant ot on l' e.ssae en ce qui concerne les anticorps de neutralisation et de fixation de l'alexine de la rougeole.
LQ6éveloppement;nti- corps chez 9?tlv des enfants est comparable à celui qui a lieu à la suite d'une infection naturelle de la rougeole.
EXhL.t:L.4 En appliquant le procédé de l'exemple 2, on soumet le virus de la ruu0eole provenant du 37e passade à 32 0 dudit exemple à 10 passades ;;u1,pl'menL;.;.ire-s, avec incubation à 32'>Cg suivis de 15 passades avec insubut-ton à 2oOû. Les vaccins pré-
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parés à partir du virus provenant du 15e passage à 28 C sont utilisés pour l'inoculation d'enfants non immunisés. la miss en ,observation des enfants inoculés et les tests auxquels on les soumet indiquent que le virus a été atténué en ce qui concerne la sévérité de leur réaction vis-à-vis de celui-ci, sans perte. décelable de son pouvoir antigène.
De façon similaire, on peut atténuer le virus d la rougeole en le cultivant sur un tissu isolé, à environ 28-32 C, en utilisant un tissu tel que le tissu du rein de boeuf.'Lors- qu'on prépare les cultures de tissus, on peut utiliser des en,. zymes protéolytiques autres que la trypsine pour dispenser les cellules des tissus. En outre, on peut utiliser d'autres flui- des de culture, tels que le milieu basique de fiable le milieu n 199 avec 5 à 10% de sérum de cheval inactivé ou un milieu formé de 8 parties de solution saline basique de Earle, de 1 partie d'un bydrolysat à 5% de lactalbumine et de 1 partie de sérum inactivé de cheval ou d'agneau.
REVENDICATIONS
1. Un procédé de production d'un vaccin de la rougeole à partir d'un virus vivant-et atténué de la rougeole, qui cousis. te à provoquer la propagation et la croissance de la souche Schwarz du virus de la rougeole dans un milieu de culture qui comprend des cellules animales vivantes, et à séparer les cellu- les et les débris du milieu de culture.
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"Vaccine obtained from Live attenuated measles virus".
The present invention relates to a method of producing an improved measles vaccine and an improved measles vaccine for immunizing humans against measles. The invention also relates to a method of producing the red disease virus of the strain. known as Schwarz.
Researchers have successfully adapted the virus from
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measles so that it can grow and spread in cultures of tissues or cells that do not belong to humans. It has been demonstrated that strains of the measles virus which are suitable for inoculation to humans can be obtained by attenuation in such cultures of cells not belonging to humans.
Clinical trials of the adapted and attenuated live measles virus thus obtained have shown that it is capable of forming antibodies in inoculated subjects by immunizing them against measles infection. Unfortunately, adverse reactions such as high fever can occur to a significant degree in those inoculated.
A large proportion of children who have been inoculated with vaccines obtained from the adapted and attenuated strain of measles virus previously available have been subject to severe rashes and other reactions due to the disease. inoculation.
The unwanted side effects could be suppressed or avoided to some extent by the simultaneous injection of gamma globulin which has a marked effect in the protection of children against the more severe symptoms of the adverse reactions. The prevention of reactions by the combined application of measles vaccine and gamma globulin is inconvenient and expensive and generally not suitable for large scale inoculation programs.
It has now been found that appreciable side effects and undesirable symptoms can be avoided or at least greatly reduced in inoculated persons if an improved vaccine which is obtained from this vaccine is used for immunization. the so-called Schwarz strain of the live measles virus. With this new vaccine, it is not necessary to inject gamma globulin simultaneously. Equally good or better action can be obtained now by
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which relates to the frequency and severity of reactions in persons inoculated using the improved measles vaccine according to the present invention alone.
The Schwarz strain of the measles virus is distinguished from the strains of the measles virus hitherto known by the absence of side effects and adverse reactions in persons inoculated with this vaccine and by the notable absence of symptoms. usual pathological conditions of measles with no apparent reduction in its immunization capacity and efficacy
The safety and improved action of the Schwartz virus of measles virus can be achieved by attenuation of a suitable measles virus such that the virulence of the virus is weakened to a greater degree than in the case of mitigation methods which have been used to date.
The new and improved vaccines of the present invention containing live attenuated measles virus can be readily obtained according to the present invention by propagating and growing the Schwarz strain of measles virus in a culture medium comprising living animal cells, after which the cells and debris are separated from the culture medium. The vaccine obtained in this way can be used directly or be stored and the usual diluting, stabilizing, etc. can be added at any time. Storage is facilitated if the vaccine is frozen and kept in that state for later use.
If the spread of the Schwarz strain of measles virus takes place under conditions and at temperatures such that the virus has the possibility of reverting to a more virulent form, it is advisable to take the precaution of calling, during the manufacture and / or preparation of seed stocks from the existing Schwarz strain
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virus, passes several times under virulence reducing conditions, for example, growing the virus for several
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passing and temperatures below 35 * 0 and more preferably below 3200.
If, in spite of all the precautions, the Schwarz strain of the virus returns to a more virulent form, it ceases to constitute an appropriate starting material for the ease of carrying out the present invention and
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it must be replaced by a new substance meeting the definition given in, 9 ny above for the Schwarz strain of the measles virus.
Depending on the intended use, the vaccine obtained from the culture medium can be diluted with an appropriate diluent preferably with distilled and sterilized water.
Alternatively, the vaccine can be secreted by freezing
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for .'sut6sç.xax and reconstitute it ", see an up-diluent, preferably by adding distilled and sterilized water, before use.
It is often advantageous to add a
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atoent assumed its stabilization. It has been found that a solution of lactose and glutamate is an excellent stabilizing agent for the vaccine.
The live measles virus belonging to the
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che 8chwa ^ aw virus which constitutes the starting material for the production of the improved vaccina according to the present invention, can be easily obtained by the adaptation of the measles virus, so that it can grow in a tis - in a living cell that does not belong to a human being or in a medium containing these living cells and by attenuation
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of Krtee adapted virus to several passes through culture medium include living animal cells, under conditions reducing virulence and at temperatures below 4 37 * 0 but higher than those at which spread of virus ceases. .
As mentioned above, the process of
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production of the Schwarz strain of measles virus is also within the scope of the present invention. Instead of adapting native measles viruses, it is also possible to use as a starting material an adapted strain of the measles virus such as that which researchers have been able to obtain previously by adapting and by attenuating the Edmoneton outbreak of the measles virus, as the strain will melt. The attenuation of suitable strains available through.
several passages of the virus through culture medium containing living cells not belonging to humans, in the virulence reducing manner described above, gives the Schwarz strain of measles virus.
It is preferable that at least part of the incubation, in the mitigation process, is carried out at a temperature below 35 C and more preferably below 32 C. At least several passes or a part of the passes, when their number is large, should be performed at a temperature below 35 C and more preferably between 28 and 32 C. However, if desired, all passages of the virus mitigation process can be performed fires temperatures lower than we just mentioned.
The measles virus can easily be adapted so that it is capable of spreading in chick embryo tissue or in a culture medium containing living cells of that tissue. This same tissue or a naked medium - Tritif containing the living cells of this tisbu can also serve as growth medium for the production of the vaccine from the Schwarz strain of the virus.
In a preferred embodiment of the method for producing the Schwarz strain of the measles virus, the cultures of an animal tissue are obtained in a conventional manner in a nu.ritive fluid, which is not toxic to the virus. They are then inoculated with live measles virus which sustains the growth of this tissue, and then inoculated with live measles virus.
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The inoculated tissue cultures are then incubated, a? 7 '* 3? G et pensum, a certain period of time, then the virus is escaped, repeatedly on the same animal tissue and for a number of passes sufficient to ensure the adaptation of the virus to the growth on the particular tissue used. In this way, it was found, for example, that the rou-
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6aele can be adapted for growth on tissue from dog kidney, beef kidney, pig kidney, and chicken embryo tissue.
After this adaptation culture, the virus is then passed serially in a tissue culture, on the particular medium to which one has adapted it, the incubation of the virus being carried out at lower temperatures.
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to normal and between about 28 and 32 C to modify the virus, so that the modified virus, when injected into children who are not immune to measles, is able to stimulate the production of protective antibodies. measles without producing an appreciable rash, fever
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noticeable or other common pathological symptoms of rùu- - geola. The above method of culturing measles virus, when performed on avian tissues, in particular chicken embryo tissues, represents a preferred embodiment of the present invention.
In another mode of producing the Schwarz strain of measles virus in accordance with the present invention, the initial live measles virus is inoculated into a culture of unimal tissue and incubated at high temperatures.
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less than normal erasures, as mentioned above, without prior adaptation to the particular situation at normal incubation temperatures. nsu.l.te, serial transfer and incubation is continued at these below normal temperatures, preferably between about .6 and <i 0, for a number of runs sufficient to achieve attenuation. desired virus.
Alternatively, when the fresh native virus of the
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Measles is the starting material, it is frequently desirable to carry out the initial multiplication of the virus in a culture of human tissue, such as a culture of human kidney tissue, human amniotic tissue or a human tissue culture. human heart tissue, or animal tissue which is known to readily serve as a carrier tissue for the multiplication of this native virus, for example a culture of a dog rej.n tiwsu.
In such a case, it may be desirable to continue the culture on this human tissue or dog tissue for several serial passages, until the identity and purity of the virus can be established. adapt the virus to other animal tissues and attenuate this virus by incubation at low temperatures as described above. In any adaptation operations prior to the initiation of incubation at lower than normal temperatures, it is understandable that intermediate transfers can be made to other tissues or to ambryonic eggs by conventional techniques without departing from the scope of the present invention.
It is possible to carry out the attenuation according to the present invention with existing strains of measles virus which are adapted for growth in animal tissues or in a growth medium containing cells of such tissues. sus, for example with the Enders strain of the measles virus.
In one of the methods, an animal tissue culture is formed as described above and; when satisfactory growth can be seen on the tissue, the initial load of nutrient fluid is replaced with fresh nutrient fluid and the cultures are inoculated with the measles virus. During virus incubation, the culture vessels can be gently housed, for example by means of a drum and roller assembly. Oh can also apply static culture methods, provided that
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the tissue cells are submerged in the nutrient fluid. Multiplication of the virus is usually demonstrated by a distinct cytopathic effect on tissue cells. layers that can be observed under a microscope.
However, in some cases, especially at the beginning of the adaptation of the virus to a new type of cell, a cytopathogenic effect is only visible after a long incubation period, if even visiole. However, in these cases, virus growth can be followed by titrating part of the culture fluid from the inoculated tissue in a human tissue culture, such as human amniotic tissue, human heart tissue, or similar tissue. - susceptible to this virus. This type of tissue quickly shows a typical cytopathic effect when infected with measles virus.
In the preferred embodiment, the virus is passed in succession through successive cultures of fresh animal tissue with incubation at 35 ° C. during a few of these passages, preferably about ten passages. , to ensure adaptation to the particular fabric used.
In any case, several serial passages are then carried out in this tissue culture, with incubation of the virus at temperatures below normal, preferably between about 28 and 32 ° C, to obtain the desired attenuation. virus. The exact number of successive passages at the lower temperature that is necessary depends on factors such as the particular strain of measles virus that is used, the past history of its culture, and the particular tissue used in the culture on the tissue.
In chicken embryo tissue culture, good attenuation results are obtained, with approximately forty serial passes of the virus at an incubation temperature of 28-32 C
When the virus has been attenuated in the preceding manner, the attenuated Boucha Schwarz of the virus can be maintained in tissue of the same type as that to which the virus has been adapted.
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by continuing incubation at temperatures of 28-32 C. In general, it is desirable, but not necessary, to transfer the virus to fresh tissue cultures when about
20 to 75%, preferably 25 to. 50% of the cells contained in a given amount of an inoculated tissue culture show a cytoputhogenic effect.
Similar techniques are used to multiply the attenuated virus to provide reserves for vaccine preparation. In these latter operations, the culture is incubated until the virus has multiplied to a useful concentration and the fluid is collected from the tissue culture vessels, for example by decantation. under aseptic conditions and then clarified by centrifugation, filtration, etc.,. The resulting product can be used directly in the form of a vaccine or, depending on its virus concentration, can be diluted with a suitable injectable diluent or a stabilizing solution, non-toxic to the virus. , to prepare a final liquid vaccine.
When an appreciable portion of the cells, tissue contained in the culture has not been disintegrated by the cytopathic effect of virus growth, fresh fluid, such as a suitable vaccine stabilizing solution, balanced saline, a Fresh nutrient medium, or the like, can be introduced into the culture vessels after decantation, and these vessels and their contents are passed through a cycle of freezing and thawing to release further amounts of virus from the cells. tissue * The resulting fluid is collected and combined with the one collected above, to obtain a vaccine concentrate.
The latter is freed of tissue cells and debris in a suitable manner, as mentioned above, and then the virus content is normalized per titrab, for example against human tissue culture cells. Then, if we
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If desired, the vaccine concentrate can be used directly for the vaccination of unimmunized humans, or,
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it can be diluted with a sterile stabilizing agent such as a solution of lactose and glutamate and stored in the frozen state, preferably at a temperature between -20 and
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"j0 C, until the moment of its use.
In a variant. the stabilized vaccine can be freeze dried resulting in a dry vaccine which can be easily stored and which can be reconstituted with sterilized water or an analogous substance at the time of use.
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Although the incubation should be continued at the below normal temperatures prescribed to ensure at "
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Desired attenuation of the virus in order to produce the echwart strain of the virus with the fewest possible number of successful passes, minor modifications can be made. Thus, by
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example, the serial passes at e8-3, eOC can be interrupted by one or more passes at higher temperatures, provided that the total number of passes at the temperature below normal is sufficient to ensure attenuation. - desired tion.
Similarly, when attenuation is desired
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3 and is achieved, one or two multiplication steps can be carried out to propagate the vaccine stock at appropriate higher temperatures, if desired,
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EXi-TPLE 1 Tissue culture technique.
Chickens 8 to 10 days old were finely cut up, under accepted conditions, after removing the eyes, and the minced tissue thus obtained was washed with a solution.
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phosphate buffered saline. The washed tivsu is treated with trypsin in the usual manner, using an Erlenmeyer flask fitted with a magnetic stirrer. We cen-
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trifuge the tissue thus treated at a rate of 1.uuO taurs / minute and for> minutes, after which the resulting concentrated cells are suspended in culture medium,
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4 ratio of 5UU.UUU to 6GU.OuU cells per ml.
The culture medium is a basic saline solution of JSarle (6.8 g of sodium chloride, 0.4 g of potassium chloride, 0.2 g of calcium chloride, 0.2 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.15 gr of disodium phosphate, 1.0 gr of glucose, 2.2 gr of sulfur bicaroonate and 0.02 gr of phenol red dissolved in water in sufficient quantity to make 1000 ml ) containing 5%
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of calf serum and 0.5% of lactalbumin hydrolyzate and additionally containing 600 units of penicilin and 400 micrograms of streptomycin, per ml. 1 ml quantities of the resulting suspension are inoculated into sterile tubes and injected.
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cube for 24 to 48 hours at 35 * G.
The procedure is also carried out in the same way to form larger masses by introducing 60 to 70 ml of the suspension into Blake or Roux culture flasks.
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After the initial incubation period, the chicken embryo tissue cells are removed from the culture medium, the cells are washed twice with medium # 199.
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de Morgan and Parker (Morgan et al., "proceedings of the Society for Experimental Biology and liedil.-ine" 1950, 7, IJP.ld), and then, 2 ml of medium n 1t, 9, rs containing no serum and adjusted to a pH of 7 '* 7 <2 are introduced into each tube, or else 100 ml of this medium in each flask.
Then 0.2 ml of a suspension of live and active measles virus is inoculated -
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in each vial or alternatively 1 ml of this virus suspension in each tube, and the resulting cultures are incubated at 32-3800, for a period of time to obtain the multiplication of the virus. In general, the growth of the virus is easily demonstrated by the fact that the cells contained in the
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tissue culture exhibits a cytopathogenic effect, and serial transmission of the virus is usually carried out in a new tissue culture medium when about 25 to 50% of the cells remaining in the inoculated culture medium show.
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a cytopathogenic effect.
Alternatively, the growth of the virus can be followed in tissue culture by titrating the culture medium in cell culture of human tissue, such as human amniotic tissue, heart tissue, or tissue culture.
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other suitable human tissues, by the procedure described by Schwarz and Zirbel in "Roceedlnbs of the dociety for Scientific Biology ana 14edicine" g 1.59, vol. lu2, pp. 711-714.
When we have performed a sufficient name of passing
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to attenuate the virus as desired, one or more additional passes are made in a culture of chicken embryo tibtsu, at i8 -; $ c: oC, on a scale large enough to multiply the virus to a sufficient degree to obtain a reserve of vaccine concentrate. The vaccine concentrate is harvested in the usual manner by decantation, freezing and thawing, followed by washing. The reserve vaccine is clarified by centrifugation of the culture liquid and washing this liquid.
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quiue until it is free of tissue cells and cell debris.
E.J #!.: PLE 2 Preparation and testing of the vaccine
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When preparing a vaecin in accordance with the preferred embodiment of the invention, an Edmonston strain of measles virus, as described by Endors et al., Is maintained by serial passage through
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a tissue culture of chicken embryo, with incubation at: '50,' plilndant 19 successive passages. Then, this adapted chick embryo vius, using the technique of Example 1, is subjected to 37 successive passages in a chick embryo tissue culture with incubation at 0.
The resulting attenuated virus obtained after the 37th passage is subjected to three terminal passes of dilution in a chicken embryo tissue culture, then to two passes in such a tissue culture to multiply the virus and produce a vaccine reserve. .
At each of these last passages, the culture is incubated at
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The resulting lactose and glutamate concentrates are separated from the cells of the debris tissue and diluted with the same volume of lactose and glutamate solution serving as stabilizer. The composition of the solution stabilizer of lactose and glutamate is as follows:
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Potassium glutamate O, 56 gr NaHPO z 5 gr KHi'04 or 52 gr
Lactose 100.00 gr
Water, @@@. per 1 liter A portion of the finished vaccine is titrated to cells of human heart tissue. Vaccines are found to contain
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nent from 103e5 to 10,493 infectious doses of tissue culture (TOID50) per 0.2 ml.
Each supply of vaccine is tested by inoculation in a bacterial thioglycolate nutrient medium, by intraperitoaeal and subcutaneous inoculation in guinea pigs and mice, and by intramuscular and intracerebral inoculation in cynomolotus monkeys, and these reserves are observed. are free from contamination. Nine children, who are not immune to measles, are injected with doses of
0.2 ml of the vaccine, intramuscularly in two of the children and subcutaneously in the other 7 children. No
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Inoculated deolentants show no signs of measles rash and only one of them has a noticeable fever, which is only temporary, during the observation period following vaccination.
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EX-SHE 3
Serial virus passages are continued after the 3rd low temperature pass of Example 2, in the same manner as in this example, until a total of 65 passes are obtained.
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At the incubation temperature of 72 ° C. Vaccine stocks were prepared with the lactose-glutamate stabilizer as described above and dried by freezing. The vaccine titer reconstituted from this leave-dried substance
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lation is between 1041 - 5 and 10, '' S TOLD 50 for 0.2 mlr A portion of the vaccine is stored ebaletelit by diz 1 sa 1 recta freezing. The vaccine is tested for / safety as described in Example 2.
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0.2 ml of the vaccines described in c1MuesuUW were inoculated, subcutaneously, each of 70 WM children tested for neutralizing and binding antibodies and alexin and lacking these ant3. -Corpâ a 1: 2 dilution of serum, after which the children are observed for several weeks, under the supervision of experienced medical personnel. We do not observe a local reaction
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or immediate in any of the children, except a moderate urinary tract reaction occurring approximately 4 hours after vaccination. The temperature of children is taken at least once a day and that of most children twice a day during the observation period.
In some cases, a moderate febrile response lasting about 2 daysa may be noted 7 or 6 days after vaccination. Rectal temperature
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mean maximum in all vaccinated children is 38 * Co. A measles-like mean rash was observed in only two children on day 11 and 13 after vaccination. No serious complications of any kind
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is not observed during the tests and there is no nerve complication. We take, 5 to 6 weeks after the vaccination
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tion, a sample of serum from the san of each child is e.ssae for neutralizing and binding antibodies to alexin in measles.
The development of the body in 9% of children is comparable to that which takes place following natural infection with measles.
EXhL.t: L.4 By applying the method of Example 2, the ruu0eole virus from the 37th pass is subjected to 32 0 of said 10 pass example ;; u1, pl'menL;.;. Ire-s , with incubation at 32 '> Cg followed by 15 passes with insubutton at 2oOû. Vaccines pre-
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trimmed from virus from the 15th passage at 28 C are used for inoculation of unimmunized children. The observation of the inoculated children and the tests to which they are subjected indicate that the virus has been attenuated in terms of the severity of their reaction to it, without loss. detectable by its antigenic power.
Similarly, the measles virus can be attenuated by culturing it on isolated tissue, at about 28-32 ° C, using tissue such as beef kidney tissue. fabrics, we can use in. proteolytic zymes other than trypsin to dispense cells from tissues. In addition, other culture fluids can be used, such as Reliable Medium # 199 medium with 5-10% inactivated horse serum or medium consisting of 8 parts Earle's Basic Saline. 1 part of a 5% lactalbumin bydrolyzate and 1 part of inactivated horse or lamb serum.
CLAIMS
1. A method of producing a measles vaccine from a live and attenuated measles virus, which sewn up. te to cause the spread and growth of the Schwarz strain of measles virus in a culture medium which comprises living animal cells, and to separate the cells and debris from the culture medium.