Procédé de préparation d'un vaccin de virus de poliomyélite
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin de virus de poliomyélite par propagation et modification du virus de la poliomyélite, de telle sorte que l'on puisse le transformer et l'utiliser sous forme d'un vaccin vivant sûr et efficace. On peut éga- lement préparer à partir du virus propagé et modifié, comme il est décrit, des vaccins du type tué non infectieux.
La poliomyélite est une affection à virus neurotropique qui attaque de nombreux êtres humains avec parfois des résultats particulièrement navrants. On sait très mal comment cette affection se propage et il est difficile de prendre des mesures préventives. L'examen de nombreux sujets indique qu'un assez grand pourcentage de la population a des anticorps de la poliomyélite, ce qui indique qu'ils ont été infectés pendant un certain moment par le virus, probablement sans qu'on le sache. Ces sujets, qui subissent des infections subcliniques, peuvent ne pas comprendre la nature de leur maladie et propager inconsciemment l'affec- tion à d'autres sujets qui peuvent en souffrir plus sévèrement.
Actuellement, il n'existe aucun moyen efficace de prévenir et de contrôler la poliomyélite.
On ne connaît actuellement aucun agent chimio-thérapeutique et aucun antibiotique qui puisse affecter le cours de la maladie. De toute façon, de tels agents seraient précieux, principalement pour aider dans la remise sur pied du malade, mais auraient peu d'effet sur le controlle de la contagion de l'affection à d'autres.
La globuline gamma, que l'on obtient à partir des êtres humains, est un moyen inadéquat et ne confère au mieux qu'une période temporaire de protection. On a proposé des vaccins tués de virus virulents de poliomyélite, mais ils ne se sont pas révélés satisfaisants à cet effet.
On considère que les vaccins de virus vivants sont les moyens les plus efficaces de prévention et de contrôle des infections par virus.
Ils confèrent une immunité plus prolongée que les vaccins tués ; le malade immunisé par eux peut résister à une infection plus virulente et ils sont meilleur marché à produire car de plus petites quantités confèrent l'immunité. Certains vaccins tués sont relativement inefficaces, tandis que les vaccins de virus vivants provoquent le développement d'anticorps protecteurs comparables à ceux que l'on rencontre dans les infections naturelles.
On ne peut pas administrer la plupart des agents virus non modifiés sous forme de vaccins vivants en raison de l'extrême pathogénicité de beaucoup de ces virus. Ceci a été surmonté dans beaucoup de cas par modification de la pathogénicité de l'agent de virus par des moyens chimiques ou physiques. Un procédé couramment employé consiste à propager le virus chez un hôte non naturel, de sorte qu'après un certain temps il est modifié de telle sorte qu'il donne naissance à des anticorps qui, injectés à des animaux non immunisés, ne provoquent pas les sévères manifestations pathologiques du cours normal de la maladie.
Bien qu'on ait modifié un grand nombre d'agents virus par ce processus général, un petit nombre, comprenant le virus de la poliomyélite, n'ont pas encore été modifiés avec succès par propagation chez un hôte non naturel.
La poliomyélite est une infection naturelle des primates. Il est difficile de propager ce virus chez d'autres animaux. Bien qu'on l'ait adapté à la croissance chez les rongeurs, on n'a pas signalé de changement marqué dans sa virulence ou ses caractéristiques de croissance.
Le virus de la poliomyélite est l'un des rares qui a ainsi résisté fortement aux efforts qu'on a déployés pour le faire croître dans du tissu vivant d'embryon de poulet, bien que l'on ait réalisé de nombreuses tentatives dans ce sens sans succès. Les raisons de ces échecs dans les tentatives de propagation du virus de la poliomyélite dans les oeufsjsn incubation ne sont pas connues. Plusieurs facteurs y contribuent probablement, dont l'un peut être son faible titre
LD50 par comparaison aux autres agents de virus neurotropiques.
Le procédé selon l'invention pour la prépa- ration d'un vaccin de virus contre la poliomyélite pour l'immunisation des primates est caractérisé en-ce qu'on modifie le virus de poliomyélite par passage en série dans des rongeurs à la mamelle jusqu'à ce qu'il soit devenu susceptible de se développer dans les embryons de volaille, on isole le virus modifié à partir du tissu nerveux des rongeurs, on inocule le virus de poliomyélite modifié à des embryons de volaille et, après une période d'incubation dans ces embryons de volaille, on récolte le tissu embryonnaire et on en récupère le virus de poliomyélite, on poursuit les opérations d'inoculation, d'incubation et de récolte jusqu'à ce que le virus soit modifié de telle sorte qu'on puisse l'administrer à des primates par ingestion orale sans provoquer de maladie,
mais avec production d'anticorps protecteurs, puis on prépare le vaccin de poliomyélite à partir du tissu embryonnaire récolté au passage final.
Il est ainsi possible de modifier d'abord le virus de poliomyélite par une série de passages chez des rongeurs à la mamelle jusqu'à ce qu'il soit devenu adapté à la croissance dans les embryons de poulet. De préférence, ce processus consiste dans une série de passages de virus virulents de poliomyélite chez des rongeurs à la mamelle jusqu'à ce que le titre LD50 sur souris ait atteint une valeur d'au moins 10-5 calculé par la formule de Reed-Muench (Amer. Jour.
Hyg. 1938, 27, 493-7).
On obtient facilement à partir de diverses sources des souches de virus de poliomyélite qui se propagent dans le tissu nerveux central des rongeurs. Cette matière, habituellement sous forme d'une suspension aqueuse du tissu nerveux broyé véhiculant la semence de virus, est inoculée intracérébralement chez des rongeurs à la mamelle, de préférence des hamsters d'environ 1 à 12 jours. L'utilisation d'autres rongeurs à la mamelle et d'autres âges pour l'ac- cumulation du titre LD50 chez la souris et son adaptation à la croissance dans un tissu d'oeuf embryonnaire n'est pas exclue. On laisse croître ce virus chez les rongeurs à la mamelle jusqu'à ce qu'on observe des symptômes chez au moins certains des animaux inoculés.
Ce temps, qui est de l'ordre de 48 heures au début de la série de passages, est ensuite réduit de 18 à 24 heures au fur et à mesure que le virus est modifié par les passages chez les rongeurs à la mamelle.
Quand les symptômes de maladie sont présentés par certains des nourrissons inoculés, on sacrifie la totalité, on prélevé leur tissu nerveux central, on les met en suspension habituellement dans une solution saline isotonique et l'on poursuit une nouvelle inoculation de la manière décrite.
Un point important, en plus de l'utilisation des rongeurs à la mamelle, est la récolte du tissu infecté juste avant le moment auquel com mencent à se présenter des symptômes de paralysie. On a observé qu'il existe, à un moment précédant les symptômes visibles de paralysie, une plus grande concentration de particules de virus vivant dans le tissu nerveux. Par suite, en sacrifiant les rongeurs à la mamelle juste avant qu'ils ne présentent ces symptômes, il est possible d'obtenir une plus grande concentration de particules de virus à partir de leur tissu nerveux. Un mode commode d'établir le moment de la récolte du tissu nerveux central consiste à inoculer un certain nombre de rongeurs à la mamelle au même moment et à récolter le tissu nerveux infecté de tout le groupe quand le premier présente des signes cliniques de maladie.
De cette façon, on sacrifie la majorité des rongeurs restants et l'on prélève leur tissu nerveux à un moment où le titre du virus est voisin du maximum.
On répète en série le processus d'inoculation de rongeurs à la mamelle, de préparation d'une suspension de leur tissu nerveux et d'inoculation de nourrissons non immunisés de la manière décrite en observant constamment le titre Lu50 sur la souris de la suspension résul- tante. On trouve qu'il résulte de ce mode de préparation de virus que le titre LDjo sur souris de la préparation montre une tendance persistante à augmenter jusqu'à des niveaux aussi élevés que 10-5, et même 10-7, par des séries de passages répétées.
Quand le titre LD50 sur souris de la suspension préparée à partir du tissu nerveux central a atteint une valeur d'au moins 10-5, on peut transférer le virus à des oeufs en incubation de la manière décrite ci-après, puis le faire passer en série dans 1'embryon de poulet jusqu'à ce que le virus ait été modifié de telle sorte qu'on puisse l'utiliser avec sécurité comme vaccin vivant pour la prévention de la poliomyé- lite chez les humains et autres primates.
Dans le but de mieux faire comprendre l'in- vention, on va maintenant la décrire en se référant aux exemples particuliers suivants de passages en série du virus chez des hamsters à la mamelle et des embryons de poulet.
On prélève les cerveaux de deux souris ayant été infectés par la souche MEF-1 du virus de poliomyélite de type Lansing, on les met en suspension dans un mélange à parties égales de glycérol et d'eau et l'on réalise la suspension par broyage. On injecte cette suspension à des souris saines. Quand ces souris sont paralysées, on les tue, on prélève leur système nerveux central, on le broie dans une solution saline aqueuse isotonique et l'on injecte la suspension du tissu dans les cerveaux d'autres souris. On répète ce processus pendant neuf séries de passages dans des souris blanches de Suisse.
On injecte une suspension de tissu nerveux central provenant du neuvième passage chez des souris blanches de Suisse dans les cerveaux d'hamsters de Syrie (dorés) de 6 à 8 semaines.
Quand ces hamsters deviennent paralysés ou partiellement paralysés, on les tue et l'on broie leur système nerveux central en une suspension que l'on injecte dans les cerveaux d'autres hamsters du même âge. On poursuit ce processus pendant treize séries de passages et, au bout de ce temps, on trouve que le titre LD50 du virus ne varie pas considérablement d'un passage à l'autre une fois que la croissance a dé- buté dans les hamsters de cet âge. Le titre LDfio ne varie que de 10-2 à 10-3, tel qu'on le calcule par la formule de Reed-Muench.
A ce moment, on met en suspension les tissus nerveux centraux obtenus à partir des hamsters vieux de 6 à 8 semaines en broyant l'ensemble du cerveau et de la moelle épinière dans un broyeur Ten-Broeck dans les proportions de 1 g de tissu frais pour 9 cc de solution de Ringer pour obtenir une suspension à 10 /o.
La solution de Ringer utilisée contient 9 g de chlorure de sodium, 0, 3 g de chlorure de potassium, 0, 2 g de chlorure de calcium et 0, 2 g de bicarbonate de sodium dans 1 litre de solution.
On centrifuge la suspension obtenue par déchiquetage du tissu nerveux, pendant 30 minutes, dans une centrifugeuse de marque International N 1 à environ 2500 tours/minute. On utilise alors la suspension pour l'injecter à des hamsters à la mamelle comme il est décrit ciaprès.
On injecte une quantité de 0, 03 cc de la suspension à 10 ouzo ci-dessus intracérébrale ment dans chacun de 20 hamsters à la mamelle non sevrés de Syrie de 10 jours. Environ 48 heures plus tard, deux des animaux montrent des signes de maladie, et le troisième jour deux autres des animaux sont, de même, malades. Le jour où l'on note pour la première fois des symptômes, on tue les quatre animaux affectés, on prélève leur cerveau et leur moelle épinière et on les met en suspension à 10 10/o comme décrit ci-dessus. On congèle la suspension et on la conserve à - 15 avant de la soumettre à un essai pour en déterminer la stérilité bacté- rienne, la suspension étant alors prête pour une nouvelle utilisation.
Après l'essai de stérilité, on décongèle la suspension congelée et l'on en injecte 0, 03 cc dans les cerveaux d'autres hamsters à la mamelle non sevrés de 1 à 12 jours d'âge. On répète le processus de récolte comme il est décrit ci-dessus et l'on poursuit l'inoculation des autres hamsters à la mamelle par passages en séries. Dans certains cas, on utilise une solution saline isotonique pour préparer la suspension de virus au lieu de la solution de Ringer. D'autres fois, on ne récolte que le cervelet et la moelle épinière des hamsters à la mamelle infectés.
Au fur et à mesure que l'on poursuit les séries de passages, on trouve que le temps entre l'injection intracérébrale et les premiers symptômes de la maladie se raccourcit progressivement, de sorte qu'après un certain nombre de séries de passages, on récolte le tissu nerveux central approximativement 18 à 24 heures après l'inoculation au lieu de deux ou trois jours au commencement des séries.
Pendant la série de passages, on détermine constamment le titre LDso de la suspension de tissu. On a fait la constatation surprenante que le titre LD50 présente des accroissements définis. Ceci peut être illustré par le tableau suivant :
EMI4.1
Passage
<tb> par <SEP> hamster
<tb> Titre
<tb> LD50
<tb> Passage
<tb> par <SEP> hamster
<tb> Titre
<tb> LD50
<tb> Passage
<tb> par <SEP> hamster
<tb> Titre
<tb> LD50
<tb>
EMI4.2
<SEP> 1 <SEP> 10-2,65 <SEP> 45 <SEP> 10-5,50 <SEP> 85 <SEP> 10-6,70
<tb> <SEP> 5 <SEP> 10-2,60 <SEP> 50 <SEP> 10-5,20 <SEP> 90 <SEP> 10-560
<tb> 10 <SEP> 10-2,75 <SEP> 55 <SEP> 10-5,50 <SEP> 100 <SEP> 10-6,00
<tb> 15 <SEP> 10-4,00 <SEP> 60 <SEP> 10-4,80 <SEP> 105 <SEP> 10-6,25
<tb> 20 <SEP> 10-4,10 <SEP> 65 <SEP> 10-5,25 <SEP> 110 <SEP> 10-7,00
<tb> 25 <SEP> 10-4,75 <SEP> 70 <SEP> 10-5,
25 <SEP> 115 <SEP> 10-6,35
<tb> 30 <SEP> 75lO-s-so12010-5 <SEP>
<tb> 35 <SEP> 10-5,50 <SEP> 80 <SEP> 10-6,00 <SEP> 125 <SEP> 10-6,65
<tb> 4010-5, <SEP> 35130l0-o <SEP>
<tb>
Le premier passage dans des hamsters de 7 à 10 jours constitue le résultat de l'inoculation des animaux par une matière représentant le trente-deuxième passage en série chez des hamsters vieux de 6 à 8 semaines.
On voit d'après ce qui précède que le résultat du processus d'inoculation d'hamsters à la mamelle non sevrés et de récoltes de leur tissu nerveux central au moment où un premier animal ou les deux premiers présentent des signes de maladie, qu'il est possible de développer une souche de virus de poliomyélite ayant un titre
LD50 considérablement supérieur à toute valeur déjà indiquée.
On obtient la preuve que le virus conserve les caractéristiques de la souche Lansing de virus de la poliomyélite par des tests standard de neutralisation employant des antisérums spécifiques connus.
Dans une autre série de passages du virus chez des hamsters à la mamelle, on prépare une suspension à 10 ouzo de tissu nerveux provenant du vingt-troisième passage chez des bébés hamsters comme il est décrit ci-dessus et l'on injecte intracérébralement 0, 02 cc de la suspension chez des hamsters de trois jours. Quand les hamsters deviennent paralysés, le second jour après l'injection, on les sacrifie et l'on récolte leur cerveau et leur moelle épinière et l'on en fait une suspension de tissu comme il est décrit ci-dessus. On poursuit cette série de passages en raccourcissant le temps d'incubation du virus à environ 24 heures.
Le titre
LD50 sur souris de cette série présente la même valeur irrégulière, mais croissante, jusqu'à environ 10-625 au 8le passage en série avec un accroissement du titre jusqu'à plus de 10-7 au 115"'passage. Le virus venant du tissu nerveux central conserve également les caractéristiques sérologiques du virus de poliomyélite, comme le prouvent les tests de neutralisation utilisant un antisérum de singe efficace contre la souche
Lansing de poliomyélite.
On a fait la constatation surprenante que le virus de bébé hamster ainsi décrit est modifié à la suite de cette série de passages, de telle sorte qu'il perd son aptitude à provoquer une maladie nette chez les primates. Quand on inocule à des singes Rhésus intracérébralement 1 cc d'une suspension à 10 /o de virus de po liomyélite non modifié, invariablement ils deviennent prostrés et meurent. Par comparaison on peut inoculer intracérébralement à des singes Rhésus le virus modifié en série décrit ci-dessus et cependant ils se remettent généralement sans aucun symptôme de maladie et seulement des cas isolés de décès.
Malgré la modification du virus provoquée par une série de passages chez les hamsters, par laquelle sa virulence pour les primates est notablement diminuée, il n'a pas perdu sa capacité à déclencher la formation d'anticorps. Par exemple, quand on soumet des singes Rhésus à une injection intramusculaire de 4 cc d'une suspension à 10 ouzo de matière préparée à partir du cerveau et de la moelle épinière d'hamsters à la mamelle au 63e passage, laquelle suspension a un titre LDso sur souris de 10-5, le sérum de singe obtenu un mois après injection contient des anticorps de la poliomyélite. De même, on a introduit chez des chimpanzés le virus d'hamsters à la mamelle provenant des 82e, 84e et 94e passages en série à des intervalles d'approximativement un mois et trois mois respectivement.
On a trouvé que le sérum obtenu à partir des chimpanzés neutralise le virus homologue, ce qui établit le fait que l'on peut donner naissance à des anticorps de la poliomyélite en absorbant un vaccin de virus vivant. Le sérum prélevé sur les chimpanzés avant l'injection du virus ne neutralise pas le virus homologue de poliomyélite.
Les essais avec des souris au 119"passage sur jeune hamster indiquent que le virus a un titre LD d'environ 10"s. 5. On prépare une suspension à 10 /o de moelle épinière de souris paralysées inoculées par une matière provenant du 119e passage par hamster et l'on en inocule 0, 6 cc dans le sac à jaune d'embryons de poulet de sept jours.
Le quatrième jour après l'inoculation on récolte les embryons, on prépare une suspension contenant environ 75 O/o d'embryons et on l'essaie à nouveau sur des souris par injection intracérébrale. On trouve que le titre LD50 de la suspension d'embryons de poulet préparée est un peu inférieur, à savoir environ 10-2 5. Cependant, tous les animaux inoculés deviennent paralysés quatre à six jours après l'inoculation, moment auquel on les sacrifie, on prépare une suspension à 10 ouzo de leur moelle épinière et l'on injecte des portions de 0, 6 cc dans le sac à jaune d'embryons de poulet de sept jours comme précédemment.
On récolte à nouveau les embryons, on les met en suspension et on les essaie sur les souris. Le titre LD50 reste approximativement constant.
On prépare des suspensions du tissu nerveux des souris et on les inocule dans le sac à jaune d'oeufs en incubation. Le septième jour après l'inoculation, on récolte les embryons, on prépare une suspension de la matière réunie et on l'inocule dans le sac à jaune d'embryons de poulet, comme précédemment.
On poursuit l'inoculation des embryons de poulet en série en vérifiant de temps en temps le titre LD50 sur souris. Au fur et à mesure que l'on poursuit des séries de passages dans les oeufs'on on trouve que le virus conserve sa patho génicité pour les souris mais que, quand on l'injecte intracérébralement chez les singes, il est moins virulent que la souche parente, ce qui montre la propagation satisfaisante du virus dans le tissu d'embryons de poulet et une réduction de la virulence du virus par la suite de passages en série chez les embryons de poulet.
Dans une autre série de passages chez les embryons de poulet, on inocule des embryons de sept jours dans la cavité allantoïque par 0, 25 cc d'une suspension à 20 zozo de tissu nerveux central infecté récolté chez des hamsters à la mamelle au 131e passage, comme décrit cidessus. On incube ces oeufs à 370 pendant sept jours, après quoi on récolte les embryons et les membranes aseptiquement, on les réunit, on les broie dans un mélangeur Waring et on les centrifuge à 2000 tours/minute pendant 20 minutes dans une centrifugeuse Anglehead.
On prépare une suspension à 20 ouzo du tissu broyé provenant du premier passage par oeuf et on l'inocule dans la cavité allantoïque d'embryons de poulet de sept jours et l'on poursuit l'incubation pendant sept jours à 37 . On réalise ainsi 10 passages successifs par oeuf en utilisant des embryons de sept jours et une pé- riode d'incubation de sept jours à 370.
Tandis que l'on poursuit ces passages par oeuf on réalise des titrages sur souris de la suspension préparée à partir du tissu embryonnaire infecté. On trouve que le virus se propage dans les oeufs en incubation. Par ailleurs, on trouve qu'une période d'incubation de 4 à 5 jours à 370 après inoculation dans la suspension de virus donne un titre LD50 sur souris plus élevé dans le tissu embryonnaire que celui qu'on obtient pendant la période d'incubation de sept jours. Par suite, on utilise des périodes d'incubation plus courtes dans les passages par oeuf successifs. Au fur et à mesure que l'on poursuit les séries de passages dans les tissus embryonnaires, on observe que le titre LDso sur souris montre une nette tendance à augmenter.
On obtient la preuve de l'identité de l'agent propagé sur oeuf avec le virus de poliomyélite du type Lansing par l'essai de neutralisation sur souris réalisé à différents niveaux de passage par oeuf avec du sérum de singe sain de type connu provenant des différentes sources. Des études de contre-neutralisation sur souris montrent que des anticorps stimulés dans des singes par des virus de poliomyélite des types Brunhilde et Leon neutralisent le virus du type
Lansing propagé sur oeuf à un degré suggérant une certaine relation sérologique avec la souche parente obtenue par les passages en série sur oeuf.
D'autres tests ayant trait à la virulence du virus pour les primates montrent qu'il est modifié par les passages en série dans du tissu embryonnaire d'oeuf au point que l'on peut l'utili- ser comme vaccin de virus vivant, de préférence pour l'administration par voie buccale.
Les avantages de la propagation du virus de poliomyélite dans 1'embryon de poulet sont évidents pour les spécialistes de la question.
Quand on prépare des vaccins de virus vivants à partir du tissu central nerveux d'animaux, il existe le danger toujours présent que l'animal puisse être infecté par quelque autre affection neurotropique et que l'on puisse ainsi inoculer au patient certains pathogènes qui pourraient provoquer une maladie ou même la mort. Malheureusement, il n'est pas toujours possible de détecter ces contaminations avant que le mal ait été fait et des accidents de ce type, ainsi que des attaques d'encéphalite allergique se sont produits quand on a utilisé des vaccins préparés à partir de tissu nerveux central d'animaux.
Quand on utilise des embryons de poulet, le milieu de culture est exempt d'agents potentiellement pathogènes pour l'homme et il y a peu de danger de récolter un organisme contaminant en même temps que le tissu d'embryons de poulet à partir duquel on prépare le vaccin de virus vivant. De plus, étant un hôte non naturel pour la plupart des agents de virus, le tissu embryonnaire de poulet se compose remarquablement bien pour la modification du virus au point désiré de sécurité. En outre, on dispose d'une façon illimitée d'oeufs fertiles que l'on peut se procurer facilement à toute époque de l'année et qui sont relativement peu coûteux par comparaison avec les animaux. Bien que l'on puisse utiliser des oeufs d'autres volailles, on préfère ceux de poule en raison de leur bas prix et du fait qu'ils sont à peu près constamment disponibles.
Pour ces raisons, ainsi que d'autres, on considère comme un progrès net dans la technique de propager du virus de poliomyélite dans du tissu d'embryon de poulet.
On peut suivre diverses méthodes de croissance du virus de poliomyélite dans les embryons de poulet. Le point d'inoculation peut être la membrane chorio-allantoïque, le sac allantoïque, le sac à jaune ou autre part. La période d'incubation peut varier de 2 à 10 jours ou plus en tenant compte naturellement de la production la plus efficace de corps virulents, ce qu'on détermine par des essais de titration sur les souris. Comme on l'a noté ci-dessus, on préfère une période d'incubation de 2 à 7 jours après l'inoculation. L'âge de 1'embryon au moment de l'inoculation peut de même largement varier depuis environ 1 à 12 jours.
Le volume de l'inoculum peut également varier considérablement, mais il est généralement de l'ordre de 0, 05 à 0, 8 cc, de préférence d'environ 0, 2 à 0, 5 cc. La matière récoltée contenant le virus désiré peut consister dans 1'embryon tout entier ou si on le désire, certaines parties de celui-ci, telles que la membrane chorio allantoïque, le fluide allantoïque ou le sac à jaune. Ces points peuvent être facilement dé- terminés par les spécialistes de la question avec très peu d'expérimentation en suivant les indications fournies ici.
Pour préparer un vaccin de virus vivant à partir du tissu embryonnaire, on le récolte de la manière décrite ci-dessus, puis on le broie en suspension avec une solution isotonique saline de Ringer ou tout autre agent de suspension classique. Si on le désire, on peut centrifuger la matière pour éliminer les tissus grossiers.
Comme la route préférée d'inoculation est l'in- gestion par voie buccale, le vaccin peut être constitué simplement par le tissu embryonnaire broyé que l'on peut administrer directement ou de préférence dans du lait, du chocolat ou toute autre nourriture. Environ 1 à 5 cc du tissu embryonnaire broyé de 20 à 50 ouzo constitue normalement une dose d'immunisation du vaccin de virus vivant. On peut répéter le processus d'immunisation à intervalles de 1 à 3 mois ou plus jusqu'à ce qu'on atteigne le niveau désiré d'anticorps chez le patient.
Si l'on désire préparer un vaccin de virus tué, on peut traiter le tissu embryonnaire infecté par de la formaline, du phénol, de l'oxyde d'éthylène ou tout autre agent chimique ou physique désactivant qui détruit le virus sans affecter son antigénicité.
Par exemple, on peut traiter une suspension de 20 à 50 ouzo de tissu embryonnaire de poulet par de la formaline au taux d'environ 0, 1 à 0, 2 ouzo en poids par rapport au volume de la totalité de suspension de tissu. On maintient ensuite cette préparation jusqu'à ce que toutes les particules de virus soient désactivées. A la place de la formaline, on peut utiliser du phénol au taux de 0, 4 O/o en poids ou de l'oxyde d'éthylène en quantité d'environ 0, 05"/o à 2, 5 /0. On préfère en réalité ce dernier en raison du fait qu'il désactive réellement le virus dans les 48 heures. On peut éliminer l'excès d'oxyde d'éthylène par évaporation quand des essais sur souris montrent que le virus n'est plus pathogène.
Method of preparing a polio virus vaccine
The present invention relates to a process for preparing a polio virus vaccine by spreading and modifying the polio virus so that it can be processed and used as a safe and effective live vaccine. . Also, from the propagated and modified virus, as described, vaccines of the killed non-infectious type can be prepared.
Polio is a neurotropic virus disease that attacks many human beings with sometimes particularly distressing results. It is very poorly understood how this condition spreads and it is difficult to take preventive measures. Examination of many subjects indicates that a fairly large percentage of the population has antibodies to polio, indicating that they have been infected with the virus for some time, probably without knowing it. These subjects, who experience subclinical infections, may not understand the nature of their disease and subconsciously spread the disease to other subjects who may have it more severely.
Currently, there is no effective way to prevent and control polio.
There is currently no known chemotherapeutic agent and no antibiotic that can affect the course of the disease. Either way, such agents would be of value, primarily to aid in the recovery of the patient, but would have little effect in controlling the contagion of the disease to others.
Gamma globulin, which is obtained from humans, is an inadequate means and at best only provides a temporary period of protection. Killed vaccines of virulent polio viruses have been proposed, but they have not been found to be satisfactory for this purpose.
Live virus vaccines are considered to be the most effective means of preventing and controlling virus infections.
They confer longer immunity than killed vaccines; the patient immunized by them can resist a more virulent infection and they are cheaper to produce because smaller amounts confer immunity. Some killed vaccines are relatively ineffective, while live virus vaccines cause the development of protective antibodies comparable to those found in natural infections.
Most unmodified virus agents cannot be administered as live vaccines because of the extreme pathogenicity of many of these viruses. This has been overcome in many cases by altering the pathogenicity of the virus agent by chemical or physical means. A commonly used method is to propagate the virus in an unnatural host, so that after some time it is modified so that it gives rise to antibodies which, when injected into unimmunized animals, do not cause them severe pathological manifestations of the normal course of the disease.
Although a large number of virus agents have been modified by this general process, a small number, including the polio virus, have not yet been successfully modified by propagation in an unnatural host.
Poliomyelitis is a natural infection of primates. It is difficult to spread this virus to other animals. Although it has been adapted for growth in rodents, no marked change in its virulence or growth characteristics has been reported.
The polio virus is one of the few which has thus strongly resisted efforts to grow it in living chick embryo tissue, although many attempts have been made to do so. without success. The reasons for these failures in attempts to propagate the polio virus in incubating eggs are not known. Several factors probably contribute to this, one of which may be its low title.
LD50 compared to other neurotropic virus agents.
The process according to the invention for the preparation of a polio virus vaccine for the immunization of primates is characterized in that the polio virus is modified by serial passage in rodents at the udder. '' until it has become susceptible to development in poultry embryos, the modified virus is isolated from the nervous tissue of rodents, the modified polio virus is inoculated into poultry embryos and, after a period of incubation in these poultry embryos, the embryonic tissue is harvested and the poliomyelitis virus is recovered, the inoculation, incubation and harvesting operations are continued until the virus is modified in such a way that can administer it to primates by oral ingestion without causing disease,
but with production of protective antibodies, then the polio vaccine is prepared from the embryonic tissue harvested in the final passage.
It is thus possible to modify the polio virus first through a series of passages in udder rodents until it has become adapted to growth in chick embryos. Preferably, this process consists of a series of passages of virulent polio viruses in udder rodents until the LD50 titre in mice has reached a value of at least 10-5 calculated by Reed's formula. Muench (Amer. Day.
Hyg. 1938, 27, 493-7).
Poliomyelitis virus strains which spread in the central nervous tissue of rodents are readily obtained from various sources. This material, usually in the form of an aqueous suspension of ground nervous tissue carrying virus seed, is inoculated intracerebrally into udder rodents, preferably hamsters of about 1 to 12 days of age. The use of other udder rodents and other ages for the accumulation of LD50 titre in mice and its adaptation to growth in embryonic egg tissue is not excluded. This virus is allowed to grow in udder rodents until symptoms are observed in at least some of the inoculated animals.
This time, which is of the order of 48 hours at the start of the series of passages, is then reduced from 18 to 24 hours as the virus is modified by the passages in rodents at the udder.
When symptoms of illness are exhibited by some of the inoculated infants, all of them are sacrificed, their central nervous tissue removed, usually suspended in isotonic saline, and re-inoculation continued as described.
An important point, in addition to the use of udder rodents, is the harvesting of infected tissue just before the start of symptoms of paralysis. It has been observed that there is, at a time preceding the visible symptoms of paralysis, a greater concentration of particles of living virus in the nervous tissue. Therefore, by sacrificing rodents at the udder just before they show these symptoms, it is possible to obtain a greater concentration of virus particles from their nervous tissue. A convenient method of establishing the time of harvesting of central nervous tissue is to inoculate a number of rodents at the same time and harvest infected nervous tissue from the whole group when the first shows clinical signs of disease.
In this way, the majority of the remaining rodents are sacrificed and their nervous tissue is removed at a time when the virus titre is close to the maximum.
The process of inoculating rodents at the udder, preparing a suspension of their nervous tissue, and inoculating unimmunized infants as described by constantly observing the Lu50 titre on the mouse of the resulting suspension is serially repeated. - aunt. It was found to result from this mode of virus preparation that the mouse LD 10 titer of the preparation showed a persistent tendency to increase to levels as high as 10-5, and even 10-7, by series of repeated passages.
When the mouse LD50 titre of the suspension prepared from the central nervous tissue has reached a value of at least 10-5, the virus can be transferred to incubating eggs as described below and then passed. serially in the chick embryo until the virus has been modified so that it can be used safely as a live vaccine for the prevention of poliomyelitis in humans and other primates.
In order to better understand the invention, it will now be described with reference to the following specific examples of serial passages of the virus in hamsters on the udder and in chicken embryos.
The brains of two mice which have been infected with the MEF-1 strain of the Lansing-type poliomyelitis virus are removed, they are suspended in a mixture of equal parts of glycerol and water and the suspension is made by grinding. . This suspension is injected into healthy mice. When these mice are paralyzed, they are killed, their central nervous system removed, crushed in isotonic aqueous saline, and the tissue suspension injected into the brains of other mice. This process is repeated for nine series of passages in white mice from Switzerland.
A suspension of central nervous tissue from the ninth passage in Swiss white mice is injected into the brains of Syrian (golden) hamsters 6 to 8 weeks old.
When these hamsters become paralyzed or partially paralyzed, they are killed and their central nervous system crushed into a suspension that is injected into the brains of other hamsters of the same age. This process was continued for thirteen sets of passages and at the end of this time it was found that the LD50 titre of the virus did not vary considerably from passage to passage once growth had started in the hamsters of. this age. The LDfio titre varies only from 10-2 to 10-3, as calculated by the Reed-Muench formula.
At this time, the central nervous tissues obtained from the 6-8 week old hamsters are suspended by grinding the whole brain and spinal cord in a Ten-Broeck grinder in the proportions of 1 g of fresh tissue. for 9 cc of Ringer's solution to obtain a 10 / o suspension.
The Ringer's solution used contains 9 g of sodium chloride, 0.3 g of potassium chloride, 0.2 g of calcium chloride and 0.2 g of sodium bicarbonate in 1 liter of solution.
The suspension obtained by shredding the nervous tissue is centrifuged for 30 minutes in an International N 1 brand centrifuge at approximately 2500 revolutions / minute. The suspension is then used for injection into udder hamsters as described below.
0.03 cc of the above 10-ouzo suspension is injected intracerebrally into each of 20 10-day-old Syrian unweaned udder hamsters. About 48 hours later, two of the animals show signs of illness, and on the third day two more of the animals are also sick. On the day symptoms are first noted, the four affected animals are killed, their brains and spinal cord removed, and suspended at 10 10% as described above. The suspension is frozen and stored at -15 before testing for bacterial sterility, the suspension then being ready for further use.
After the sterility test, the frozen suspension is thawed and 0.03 cc is injected into the brains of other unweaned udder hamsters 1 to 12 days of age. The harvesting process is repeated as described above and inoculation of the other udder hamsters is continued in serial passages. In some cases, isotonic saline solution is used to prepare the virus suspension instead of Ringer's solution. Other times, only the cerebellum and spinal cord of infected udder hamsters are harvested.
As the series of passages are continued, the time between intracerebral injection and the first symptoms of the disease is found to gradually shorten, so that after a number of series of passages, one finds harvests central nervous tissue approximately 18-24 hours after inoculation instead of two or three days at the start of the series.
During the series of passes, the LD 50 titer of the tissue suspension is constantly determined. The surprising finding was made that the LD50 titre shows definite increases. This can be illustrated by the following table:
EMI4.1
Passage
<tb> by <SEP> hamster
<tb> Title
<tb> LD50
<tb> Passage
<tb> by <SEP> hamster
<tb> Title
<tb> LD50
<tb> Passage
<tb> by <SEP> hamster
<tb> Title
<tb> LD50
<tb>
EMI4.2
<SEP> 1 <SEP> 10-2.65 <SEP> 45 <SEP> 10-5.50 <SEP> 85 <SEP> 10-6.70
<tb> <SEP> 5 <SEP> 10-2.60 <SEP> 50 <SEP> 10-5.20 <SEP> 90 <SEP> 10-560
<tb> 10 <SEP> 10-2.75 <SEP> 55 <SEP> 10-5.50 <SEP> 100 <SEP> 10-6.00
<tb> 15 <SEP> 10-4.00 <SEP> 60 <SEP> 10-4.80 <SEP> 105 <SEP> 10-6.25
<tb> 20 <SEP> 10-4.10 <SEP> 65 <SEP> 10-5.25 <SEP> 110 <SEP> 10-7.00
<tb> 25 <SEP> 10-4.75 <SEP> 70 <SEP> 10-5,
25 <SEP> 115 <SEP> 10-6.35
<tb> 30 <SEP> 75lO-s-so12010-5 <SEP>
<tb> 35 <SEP> 10-5.50 <SEP> 80 <SEP> 10-6.00 <SEP> 125 <SEP> 10-6.65
<tb> 4010-5, <SEP> 35130l0-o <SEP>
<tb>
The first pass through 7-10 day old hamsters is the result of inoculating the animals with material representing the 32nd serial pass in 6-8 week old hamsters.
It can be seen from the above that the result of the process of inoculating unweaned udder hamsters and harvesting their central nervous tissue at the time when a first or two animals show signs of disease, that it is possible to develop a strain of poliomyelitis virus with a titer
LD50 considerably higher than any value already stated.
Evidence that the virus retains the characteristics of the Lansing strain of polio virus is obtained by standard neutralization tests employing specific known antisera.
In another series of virus passages in udder hamsters, a 10-ouzo suspension of nervous tissue from the twenty-third passage in baby hamsters is prepared as described above and injected intracerebrally 0, 02 cc of the suspension in three-day-old hamsters. When the hamsters become paralyzed on the second day after injection, they are sacrificed and their brain and spinal cord harvested and made into a tissue suspension as described above. This series of passages is continued by shortening the incubation time of the virus to about 24 hours.
The title
LD50 in mice of this series shows the same irregular value, but increasing, up to about 10-625 on the serial passage with an increase in titer to more than 10-7 on the 115 "passage. central nervous tissue also retains the serological characteristics of the polio virus, as evidenced by neutralization tests using a monkey antiserum effective against the strain
Polio lansing.
It has been surprisingly found that the baby hamster virus thus described is modified as a result of this series of passages, so that it loses its ability to cause definite disease in primates. When Rhesus monkeys are inoculated intracerebrally with 1 cc of a 10% suspension of unmodified poliomyelitis virus, they invariably become prostrate and die. By comparison Rhesus monkeys can be inoculated intracerebrally with the serially modified virus described above and yet they generally recover without any symptoms of disease and only isolated cases of death.
Despite the modification of the virus caused by a series of passages in hamsters, whereby its virulence for primates is markedly reduced, it has not lost its ability to trigger antibody formation. For example, when Rhesus monkeys are subjected to an intramuscular injection of 4 cc of a 10 ouzo suspension of material prepared from the brain and spinal cord of hamsters at the udder in the 63rd passage, which suspension has a titre LD 50 in 10-5 mice, the monkey serum obtained one month after injection contains antibodies to poliomyelitis. Similarly, udder hamster virus from the 82nd, 84th and 94th serial passages was introduced into chimpanzees at intervals of approximately one month and three months respectively.
It has been found that the serum obtained from the chimpanzees neutralizes the homologous virus, which establishes the fact that one can give rise to polio antibodies by absorbing a live virus vaccine. Serum taken from chimpanzees before virus injection does not neutralize the homologous polio virus.
Tests with 119 "passage mice in young hamsters indicate that the virus has an LD titer of about 10" s. 5. Prepare a 10% suspension of spinal cord from paralyzed mice inoculated with material from the 119th hamster passage and inoculated with 0.6 cc into the yolk sac of seven day old chickens.
On the fourth day after inoculation, the embryos are harvested, a suspension containing about 75% of embryos is prepared and tested again on mice by intracerebral injection. The LD50 titre of the prepared chicken embryo suspension was found to be somewhat lower, around 10-25. However, all inoculated animals became paralyzed four to six days after inoculation at which time they were sacrificed. , a 10-ouzo suspension of their spinal cord is prepared and 0.6 cc portions are injected into the yolk sac of seven-day-old chick embryos as before.
The embryos are harvested again, suspended and tested on mice. The LD50 titre remains approximately constant.
Suspensions of the nervous tissue of the mice are prepared and inoculated into the incubating egg yolk sac. On the seventh day after inoculation, the embryos are harvested, a suspension of the pooled material is prepared and inoculated into the yolk sac of chicken embryos, as before.
Serial inoculation of chick embryos is continued, occasionally checking the LD50 titer in mice. As the series of passages through the eggs are continued, it is found that the virus retains its pathogenicity in mice but that, when injected intracerebrally in monkeys, it is less virulent than the virus. parent strain, showing satisfactory spread of virus in chicken embryo tissue and reduction in virulence of virus following serial passage in chicken embryos.
In another series of passages in chick embryos, seven day old embryos were inoculated into the allantoic cavity with 0.25 cc of a 20 zoz suspension of infected central nervous tissue harvested from udder hamsters in the 131st passage. , as described above. These eggs are incubated at 370 for seven days, after which the embryos and membranes are harvested aseptically, pooled, crushed in a Waring blender, and centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes in an Anglehead centrifuge.
A 20 ouzo suspension of the crushed tissue from the first egg passage is prepared and inoculated into the allantoic cavity of seven day old chick embryos and incubation continued for seven days at 37. 10 successive passages per egg are thus carried out using embryos of seven days and an incubation period of seven days at 370.
While these egg passages are continued, titrations are carried out on mice of the suspension prepared from the infected embryonic tissue. The virus is found to spread in incubating eggs. On the other hand, we find that an incubation period of 4 to 5 days at 370 after inoculation into the virus suspension gives a higher LD50 titer in mice in the embryonic tissue than that obtained during the incubation period. of seven days. Therefore, shorter incubation periods are used in successive egg passages. As the series of passages in the embryonic tissues are continued, it is observed that the LD 50 titer in mice shows a clear tendency to increase.
The identity of the agent propagated on egg with the polio virus of the Lansing type is obtained by the neutralization test in mice carried out at different levels of passage per egg with healthy monkey serum of known type obtained from different sources. Counter-neutralization studies in mice show that antibodies stimulated in monkeys by poliomyelitis viruses of the Brunhilde and Leon types neutralize the virus of the type
Lansing propagated in egg to a degree suggesting some serological relationship with the parent strain obtained by serial passage in egg.
Other tests relating to the virulence of the virus for primates show that it is modified by serial passages in embryonic egg tissue to the point that it can be used as a live virus vaccine, preferably for oral administration.
The benefits of spreading the poliomyelitis virus in the chick embryo are obvious to those skilled in the art.
When preparing live virus vaccines from the central nervous tissue of animals, there is the ever-present danger that the animal may be infected with some other neurotropic disease and that the patient may thus be inoculated with certain pathogens which could. cause illness or even death. Unfortunately, it is not always possible to detect these contaminations before the damage has been done and accidents of this type, as well as attacks of allergic encephalitis have occurred when vaccines prepared from nervous tissue have been used. central animals.
When using chicken embryos, the culture medium is free from agents potentially pathogenic to humans and there is little danger of harvesting a contaminating organism along with the chicken embryo tissue from which it is collected. preparing the live virus vaccine. In addition, being an unnatural host for most virus agents, chicken embryonic tissue composes remarkably well for modification of the virus to the desired point of safety. In addition, there is an unlimited supply of fertile eggs which are readily available at any time of the year and which are relatively inexpensive compared to animals. Although eggs from other poultry can be used, chicken eggs are preferred because of their low cost and the fact that they are almost always available.
For these and other reasons, it is considered a clear advance in the art of propagating polio virus in chicken embryo tissue.
Various methods of growing polio virus in chicken embryos can be followed. The point of inoculation may be the chorioallantoic membrane, allantoic sac, yolk sac, or elsewhere. The incubation period can vary from 2 to 10 days or more, naturally allowing for the most efficient production of virulent bodies, which is determined by titration tests in mice. As noted above, an incubation period of 2-7 days after inoculation is preferred. The age of the embryo at the time of inoculation can also vary widely from about 1 to 12 days.
The volume of the inoculum can also vary widely, but is generally on the order of 0.05-0.8cc, preferably about 0.2-0.5cc. The harvested material containing the desired virus may consist of the entire embryo or, if desired, parts thereof, such as the chorios allantoic membrane, allantoic fluid or yolk sac. These points can be easily determined by those skilled in the art with very little experimentation by following the guidelines provided here.
To prepare a live virus vaccine from embryonic tissue, it is harvested as described above and then ground in suspension with isotonic Ringer's saline or other conventional suspending agent. If desired, the material can be centrifuged to remove coarse tissue.
Since the preferred route of inoculation is oral administration, the vaccine may consist simply of the crushed embryonic tissue which can be administered directly or preferably in milk, chocolate or any other food. About 1 to 5 cc of embryonic tissue crushed from 20 to 50 ouzo normally constitutes an immunization dose of the live virus vaccine. The immunization process can be repeated at intervals of 1 to 3 months or more until the desired level of antibody is reached in the patient.
If it is desired to prepare a killed virus vaccine, the infected embryonic tissue can be treated with formalin, phenol, ethylene oxide or any other chemical or physical deactivating agent which destroys the virus without affecting its antigenicity. .
For example, a suspension of 20 to 50 ouzo of chicken embryonic tissue can be treated with formalin at a level of about 0.1 to 0.2 ouzo by weight based on the volume of the entire tissue suspension. This preparation is then maintained until all virus particles are deactivated. Instead of formalin, phenol can be used at a level of 0.40 / o by weight or ethylene oxide in an amount of about 0.05 "/ o to 2.5 / 0. actually prefers the latter because it actually deactivates the virus within 48 hours Excess ethylene oxide can be removed by evaporation when mice tests show that the virus is no longer pathogenic.