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La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'un vaccin forme par une combinaison du virus . vivant de la maladie du chien, modifie par de l'oeuf, et du virus vivant de l'hépatite' infectieuse du chien modifié par culture sur un tissu.
La maladie du chien et l'hépatite infectieuse sont deux maladies à virus très fréquentes chez le dien. Très souvent, les deux maladies surviennent simultanément chez le même chien, et dans ce cas la mortalité est,beaucoup plus'grande que dans le cas où sévit seule l'une ou l'autre de ces deux maladies..
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Ces dernières années, on a utilisé des souches modifiées par l'oeuf du virus de la maladie, en vue de la production de vaccins contenant le virus vivant, capables de protéger les chiens contre la maladie, bien qu'incapables'de
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produire les symptômes usuels de la maladie chez le @@len.Ce virus modifié immunise le chien de manière satisfaisante contre la maladie, mais l'animal reste susceptible à l'hépatite infec- tieuse.
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Fieldsteel et Emery, Proceedings of the Society for Expérimental Biology and Medicine. 1954, vol. 86. SI9'823,, ont décrit récemment un procédé de culture sur tissus en vue du développement'et de la modification du virus de l'hépatite infectieuse du chien. Le virus de l'hépatite infectieuse du chien est modifié après une série de 51 passages ou davantage à travers des cultures sur tissus de rein; de rate, d'utérus ou de testicule du chien. La modification du virus est telle-que si l'on injecte le virus vivant à un chien susceptible, il ne manifeste pas les symptômes usuels de l'hépatite infectieuse,
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mais se trouve! protégé contre elle s'il est exposé par la suite au viras virulent de l'hépatite infectieuse du chien.
Des recherches ont révélé que,?dans des conditions
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appropriCesr le viru's vivant de la maladie du -chien, modifié par l'oeuf, et associé à'la matière de l'oeuf, peut être mélangé avec la matière fluide de la culture sur tissu contenant le virus vivant modifié de l'hépatite infectieuse du chien, en présence d'un agent stabilisant approprié, la matière liquide étant ensuite rapidement congelée à basse température et séchée à l'état congelé, de manière à obtenir une forme sèche stable du mélange des virus.
Ce mélange de virus sec peut ensuite être additionné d'eau distillée ou d'un autre diluant approprié, et la solution peut être utilisée -comme vaccin capable d'immuniser le chien à la fois contre la maladie et contre l'hépatite infectieuse canine.
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Qn voit donc qt-lobtentbn d'une combinaison, eh un seul produit, de ces deux virus vivants modifiés, de manière telle'qu'ils développent tous deux efficacement une immunisation contre la maladie correspondante, présente un grand intérêt par
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rapport à la production des deux vaccins sépares. La m@ise en suspension des deux matières dans les mêmes milieux liquides avant l'opération de séchage par congélation évite l'utilisation de deux fioles distinctes, qui seraient nécessaire si les deux vaccins étaient préparés séparément. De plus, le procédé est très économique étant donné qu'une seule opération,de séchage par. congélation suffit et qu'il ne faut qu'un seul emballage et une seule manipulation. Le vaccin mixte offre de nombreuses commodités d'utilisation.
Une seule injection suffit pour pro- téger le chien des deux maladies..
Pour la mise en oeuvre de l'invention,.on ensemence l'aide de virus vivant modifié de l'hépatite infectieuse, prépara selon le pxocédé de Fieldsteel et Emery, des fioles contenant des préparations tissulaires, et on soumet à l'incubation à une température appropriée pendant environ quatre jours, puis on récolte le fluide. A peu près en même temps qu'on procède à l'ensemencement des préparations tissulaires de l'hépatite @ infectieuse, on inocule des oeufs fécondée au moyen de virus vivant modifié de la maladie du chien.
Après une période d'incubation appropriée allant de cinq à sept jours, on recueille les membranes infectées des oeufs, et on les homogénéise de manière à obtenir une suspension uniforme au sein d'une solu- (ion de glutamage de saccharose, de manière que 2 ml de solutio contienne environ 1 gramme de tissu infecté A chaque fraction de
2 mi de suspension homogène de virus de la maladie, on ajoute
O,2'ml de fluide tissulaire contenant le virus de l'hépatite infectieuse. On répartit la solution mixte en quantités appro- priées dans des fioles stériles.
On congèle alors rapidement le liquide contenu dans les fioles, et on le sèche à l'état congela sous vide, de manière à obtenir un vaccin sec contenant les deux virus.vivants sous une forme stable.
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Préparation du virus vivant modifié de la maladie du chien..'
On utilise des oeufs de poule fécondés après sept à huit jours d'incubation pour cultiver le virus de la maladie.
On procède au mirage des oeufs, et seuls les embryons vivants sont inoculés. On perce un petit trou dans la coquille de l'oeuf, à l'endroit de la poche d'air, et on dépose sur la membrane.0,1 ml d'une dilution 10-2 d'une suspension reconsti- tuée de membrane chorio-allantoïque d'oeufs infectés au moyen de virus de la maladie du chien. On bouche le trou formé dans la coquille de l'oeuf, et on soumet celui-ci à une incubation à 37 C.,pendant environ cinq à sept jours, puis on récolte @ , ,les membranes infectées dans des conditions stériles.
On homogénéise alors les membranes recueillies sous forme d'une suspension uniforme, à l'aide d'une solution stérile de glutamate de saccharose, de manière que chaque fraction de 2 ml contienne environ 1 gramme de tissu infecté. La solution de glutamate de saccharose utilisée présente la composition suivante,,-, saccha- rose, ,.?5 graines, phosphate monopotassique,0,99 gramme, phosphate disodique 2,38 grammes, 1-glutamate mono-potassique monohydraté 0,36 gramme, eau distillée,QS.P. 1000 ml ; pH final 7,2-7,4.
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Préparation du virus modifié de l'hépatite. infectieuse du chien.
On ensemence une culture trypeinisée de rein de chien au sein d'un milieu nutritif formé de 8 parties de solution de Earle (la solution salée équilibrée de Earle contient 6,8 grain- mes de chlorure de sodium, 0,4 gramme de chlorure de potassium, 0,2 gramme de chlorure de calcium, 0,2 gramme de sulfate de magnésium, 0,125 gramme de phosrhate acide de sodium,,l gramme .de glucose, 2,2 grammesde bicarbonate de sodium et de l'eau pour faire 1 litre' 1 partie d'hydrolysat de lactalbumine à 5 %, et 1 partie de sérum de cheval désactivé, ou une culture
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contenant en suspension des fragments de rein de chien, au moyen de 0,2 ml de fluide non étendu provenant d'une culture trypsinisée antérieure de tissù rénal de chien,
contenant du virus modifié de l'hépatite infectieuse du chien ayant subi une série de 51 passages au moins et mieux de 100 ou plus.
On règle le pH du milieu à 7,6- 7,8, 'et on soumet à l'incuba- tion à 35 Ce Au bout de quatrejours d'incubation, on récolte les matières fluides contenant une forte concentration de virus vivant atténué d'hépatite infectieuse du chien, dans des condi- tions stériles. On peut effectuer des préparations similaires en utilisant des reins de porc au lieu' de reins de chien. On peut également utiliser d'autres solutions pour la culture sur tissu rénal, par exemple le milieu 199.
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Préparation du vaccin mixte.
A chaque fraction de 2 ml de solution homogénéisée d'embryon d'oeuf infecté de virus de.la maladie du chien, on ajoute 0,2 ml de fluide tissulaire contenant le virus vivant de l'hépatite infectieuse, et on mélange intimement. On introduit des portions de 2 ml du mélange de liquides dans des fioles de verre, dans des conditions stérilesOn congèle rapidement le liquide contenu dans les fioles, à des températures de l'ordre de -50 C, environ, et on sèche à l'état congel sous vide à basse température. Pour procéder à la vaccination des chiens, on reconstitue le vaccin séché à l'état congelé, en ajoutant 2 cc d'eau distilée ou de sérum normal.
Les proportions de virus présents utilisées dans les exemples sont les meilleures, mais on peut cependant utiliser d'autres' proportions, tout en obtenant un vaccin utilisable.
Il est toutefois essentiel que chacun des constituants du virus soit présent en quantité infectante et reste viable. La viabilité du mélange de virus paraît dépendre dans une certaine mesure de la solution tampon à base de glutamate de saccharose utilisée, et
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il est préférable que celle-ci soit présente dans la quantité Spécifiée. On peut toutefois utiliser de manière satisfaisante de plus grandes quantités.
L'étude suivante montre l'efficacité du vaccin combiné préparé selon l'invention,à titre d'agent immunisant pour le, chien.
On injecte par voie hypodermique, à quarante huit chiens 2 ml par animal de vaccin combiné préparé comme décrit ci-avant, et formé de virus modifié de l'hépatite infectieuse du chien et de virus modifié de la maladie du chien. On recueille des échantillons de sérum de ces chiens au moment de la vaccina- tion, et trois semaines plus tard ou davantage'. On effectue.sur ces échantillons de sérum des essais de neutralisation, en utilisant du virus de l'hépatite infectieuse du chien en culture tissulaire et du virus de la maladie en culture sur des oeufs" fécondés.
Indépendamment des essais effectués sur les échantil- lons.de sérum, on traite trente-et-un des chiens-au moyen d'une souche virulente de.la maladie du chien et d'une souche viru- - lente de l'hépatite infectieuse. Dans tous les cas, les échan- tillons de sérum des chiens prélevés au moment de la vaccination sont exempts d'anticorps. Après vaccination, tous les chiens manifestent une réaction significative au virus de l'hépatite infectieuse et au virus de la maladie. De plus, les trente-et- un chiens traités par les virus infectieux y résistent victo- rieusement.
Les détails de mise en oeuvre peuvent être modifiés, dans le domaine des équivalences techniques, sans qu'on s'écarte de l'invention*
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The present invention relates to a method of manufacturing a vaccine formed by a combination of the virus. living dog disease, modified by egg, and live infectious dog hepatitis virus modified by tissue culture.
Dog disease and infectious hepatitis are two very common virus diseases in dogs. Very often, the two diseases occur simultaneously in the same dog, and in this case the mortality is, much greater than in the case of one or the other of these two diseases alone.
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In recent years, egg-modified strains of the disease virus have been used for the production of vaccines containing the live virus capable of protecting dogs against disease, although unable to.
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produce the usual symptoms of the disease in @@ len. This modified virus satisfactorily immunizes the dog against the disease, but the animal remains susceptible to infectious hepatitis.
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Fieldsteel and Emery, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1954, vol. 86. SI9'823, recently described a method of tissue culture for the development and modification of infectious hepatitis virus in dogs. Dog infectious hepatitis virus is altered after a series of 51 or more passages through kidney tissue cultures; spleen, uterus or testis of the dog. The modification of the virus is such that if the live virus is injected into a susceptible dog, it does not show the usual symptoms of infectious hepatitis,
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but lies! protected against it if subsequently exposed to virulent infectious hepatitis in dogs virus.
Research has shown that,? Under conditions
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The appropriate live dog disease virus, modified by the egg, and associated with the egg material, can be mixed with the fluid material from the tissue culture containing the live modified infectious hepatitis virus. of the dog, in the presence of a suitable stabilizing agent, the liquid material then being rapidly frozen at low temperature and dried in the frozen state, so as to obtain a stable dry form of the mixture of viruses.
This mixture of dry virus can then be added to distilled water or other suitable diluent, and the solution can be used as a vaccine capable of immunizing the dog against both the disease and against canine infectious hepatitis.
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It is therefore seen that the result of a combination, in a single product, of these two modified living viruses, in such a way that they both efficiently develop immunization against the corresponding disease, is of great interest by
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compared to the production of the two separate vaccines. Suspending the two materials in the same liquid media prior to the freeze-drying operation avoids the use of two separate vials, which would be necessary if the two vaccines were prepared separately. In addition, the process is very economical since only one operation, drying per. freezing is sufficient and only one packaging and one handling is required. The mixed vaccine offers many convenience of use.
A single injection is enough to protect the dog from both diseases.
For the practice of the invention, .won seed with the aid of living modified infectious hepatitis virus, prepared according to the method of Fieldsteel and Emery, vials containing tissue preparations, and subjected to incubation at an appropriate temperature for about four days, then the fluid is harvested. At about the same time as the seeding of infectious hepatitis tissue preparations is made, fertilized eggs are inoculated with live modified dog disease virus.
After a suitable incubation period ranging from five to seven days, the infected membranes of the eggs are collected and homogenized so as to obtain a uniform suspension within a glutamate solution of sucrose, so that 2 ml of solutio contains approximately 1 gram of infected tissue At each fraction of
2 mi of homogeneous suspension of the disease virus, add
0.2 ml of tissue fluid containing infectious hepatitis virus. The mixed solution is dispensed in appropriate amounts into sterile vials.
The liquid contained in the vials is then rapidly frozen and dried in a frozen state under vacuum, so as to obtain a dry vaccine containing the two living viruses in a stable form.
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Preparation of live modified dog disease virus.
Fertilized chicken eggs after seven to eight days of incubation are used to cultivate the disease virus.
The eggs are candled, and only the living embryos are inoculated. A small hole is drilled in the shell of the egg at the location of the air pocket and 0.1 ml of a 10-2 dilution of a reconstituted suspension of chorioallantoic membrane of eggs infected with dog disease virus. The hole formed in the shell of the egg is sealed, and the egg is incubated at 37 ° C., for about five to seven days, and the infected membranes are harvested under sterile conditions.
The membranes collected in the form of a uniform suspension are then homogenized, using a sterile solution of sucrose glutamate, so that each 2 ml fraction contains approximately 1 gram of infected tissue. The sucrose glutamate solution used has the following composition ,, -, sucrose,,.? 5 seeds, monopotassium phosphate, 0.99 gram, disodium phosphate 2.38 grams, mono-potassium 1-glutamate monohydrate 0.36 gram, distilled water, QS.P. 1000 ml; final pH 7.2-7.4.
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Preparation of modified hepatitis virus. infectious disease of the dog.
A trypeinized culture of dog kidney is inoculated into a nutrient medium consisting of 8 parts Earle's solution (Earle's balanced salt solution contains 6.8 grains of sodium chloride, 0.4 grams of sodium chloride. potassium, 0.2 gram of calcium chloride, 0.2 gram of magnesium sulfate, 0.125 gram of sodium acid phosrhate ,, 1 gram of glucose, 2.2 grams of sodium bicarbonate and water to make 1 liter '1 part of 5% lactalbumin hydrolyzate, and 1 part of deactivated horse serum, or a culture
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containing fragments of dog kidney in suspension, using 0.2 ml of unexpanded fluid from a previous trypsinized culture of dog kidney tissue,
Containing modified infectious hepatitis virus of dogs which has undergone a series of at least 51 passages and better than 100 or more.
The pH of the medium is adjusted to 7.6-7.8, and incubated at 35 Ce. After four days of incubation, fluid materials containing a high concentration of live attenuated virus are harvested. infectious hepatitis in dogs, under sterile conditions. Similar preparations can be made using pig kidneys instead of dog kidneys. Other solutions can also be used for culture on kidney tissue, for example Medium 199.
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Preparation of the mixed vaccine.
To each 2 ml fraction of homogenized egg embryo solution infected with dog disease virus, 0.2 ml of tissue fluid containing live infectious hepatitis virus is added, and mixed thoroughly. 2 ml portions of the mixture of liquids are introduced into glass vials under sterile conditions. The liquid contained in the vials is rapidly frozen at temperatures of the order of -50 C, approximately, and dried in the oven. frozen state under vacuum at low temperature. To vaccinate dogs, the dried vaccine is reconstituted in the frozen state, adding 2 cc of distilled water or normal serum.
The proportions of virus present used in the examples are the best, but other proportions can be used while still obtaining a usable vaccine.
However, it is essential that each of the constituents of the virus is present in an infectious amount and remains viable. The viability of the virus mixture appears to depend to some extent on the sucrose glutamate buffer solution used, and
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it is preferable that this is present in the specified amount. Larger amounts can, however, be used satisfactorily.
The following study shows the effectiveness of the combined vaccine prepared according to the invention, as an immunizing agent for dogs.
Forty eight dogs are injected hypodermally with 2 ml per animal of a combined vaccine prepared as described above, and formed of modified virus of infectious hepatitis of dogs and of modified virus of dog disease. Serum samples are collected from these dogs at the time of vaccination, and three weeks or more later. Neutralization assays were performed on these serum samples, using tissue culture dog infectious hepatitis virus and disease virus cultured on fertilized eggs.
Regardless of the tests performed on the serum samples, thirty-one of the dogs were treated with a virulent strain of dog disease and a virulent strain of infectious hepatitis . In all cases, the serum samples from dogs taken at the time of vaccination are free of antibodies. After vaccination, all dogs show a significant reaction to the infectious hepatitis virus and the disease virus. In addition, the thirty-one dogs treated with the infectious viruses successfully resist it.
The details of implementation can be modified, in the field of technical equivalences, without departing from the invention *