"Production de virus dans une culture de tissu"
La présente invention concerne la production de virus dans une culture de tissu en utilisant un milieu chimiquement défini. L'expression "milieu chimiquement défini" est utilisée en virologie et dans la culture de tissus pour désigner des milieux de culture d'une composition chimique connue, à la fois du point de vue quantitatif et du point de vue qualitatif, par rapport à des milieux naturels ou indé-finis contenant des produits naturels, comme ur. sérum animal, des extraits d'embryons, des hydrolysats de levure, etc., d'une constitution chimique inconnue ou incomplètement connue.
On connaît un certain nombre de milieux chimiquement définis. La plupart de ces milieux sont des solutions d'agents nutritifs, par exemple des hydrates de carbone, des lipides et des am ino-acides, avec des vitamines, des sels et des minéraux, et contenant souvent d'autres matières nutritives, telles que des bases de purine, de l'adénosine triphosphate, etc.
On utilise généralement ces milieux sous forme d'une solution dans une solution de sel équilibrée ("BSS"), c'est-à-dire une solution équilibrée en quantité et en proportion en ce qui concerne les espèces ioniques de manière
à être physiologiquement acceptable en ce qui concerne le
pH, la teneur de minéraux, la pression osmotique, etc. Un certain nombre de solutions de sel équilibrées sont largement utilisées, par exemple la solution de sel équilibrée de Hank, la solution de sel équilibrée d'Earle, la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, la solution saline de Puck et d'autres encore. Un certain nombre de milieux chimiquement définis sont également largement utilisés, par exemple le milieu 199 de Morgan, Morton et parker, Proc. Soc.
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Science 122:501-4 (19955) ; Science 123: 845-7 (1956) ; Eagle et consort, J. Biol. Chem. 226: 191-206 (1957) ; le milieu minimum essentiel d'Eagle, Eagle, Science 130: 432-7
(1959) ; le milieu de Trowell T8, Exper. Cell Res. 16: 118-
147 (1959) : le milieu Waymouth MB 752/1, J. Nat. Cancer Inst. 22: 1003-17 (1959) ; le milieu Puck N 16, Puck, Cie- <EMI ID=2.1>
256 (1960). Des détails quant à la préparation et à la formulation de ces milieux peuvent se retrouver dans les textes de référence traditionnels, par exemple le Handbook of Cell and Organ Culture, de Merchant, Kahn et Murphy, Burgess Publ. Co., Minneapolis (1960) ; et dans In Vitro Monograph No. 1, A Survey of Commercially Available Tissue Culture Media, par Helen C. Morton, In Vitro (J. Tissue Culture Association), Vol. 6, No. 2, pp. 89-108 (1970).
En plus de la classification des milieux en milieux . "définis" ou en milieux "indéfinis", on les classe également d'une manière générale sur la base de l'aptitude à entretenir le métabolisme et ia prolifération de cellules. Des milieux qui permettent le métabolisme de cellules à des taux appropriés pour de nombreux besoins, notamment la production de virus, mais qui ou bien n'entretiennent pas du tout une prolifération cellulaire importante ou bien n'entretiennent qu'une prolifération limitée marginale, sont désignés par "milieux d'entretien". Des milieux qui entretiennent une prolifération cellulaire sont généralement désignés par "milieux de croissance". La plupart des milieux de croissance ont comme base, une solution de sel équilibrée ou un milieu chimiquement défini, complété par un ou plusieurs produits naturels, habituellement un sérum d'animal.
Des milieux de croissance typiques sont le milieu basal d'Eagle ou le milieu <1>99, complété par 10 à 20 % de sérum entier d'animal, une solution de sel équilibrée avec 40 % de sérum, ainsi qu'une solution de sel équilibrée avec 40 % de sérum et 20 % d'extrait d'embryon. Certains milieux exempts de protéines, chimiquement définis, peuvent être utilisés comme milieux de croissance pour un nombre limité de types de cellules. Katsuta et Takaoka, Methods in Cell Biology VI, Ed. par Prescott, Academic Press (1973) Chapitre 1. Toutefois, pour la croissance de cellules primaires dans une culture de tissu et pour la plupart des cultures de tissu à grande échelle en vue de la production d'un vaccin, un complément de sérum s'est avéré nécessaire.
Les désavantages de l'utilisation d'un sérum dans une production de vaccin sont bien connus. Un sérum approprié est difficile et coûteux à obtenir, à stocker et à utiliser ; il constitue une source de protéines étrangères indésirables qui peuvent être emportées dans le vaccin produit final ; sa composition varie d'un lot à l'autre ; et il constitue une source potentielle de souillures de virus ou de mycoplasma ; Esber et consort, J. National Cancer Institute,
50: 559-62 (1973), Barile and Kerne, proc. Soc. Exp. Biol.
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91-3 (1972).
La présente invention utilise un milieu contenant de l'insuline. On connaît divers milieux contenant de l'insuline et on les a utilisés. Les milieux de croissance contenant un sérum comportent généralement une certaine quantité d'insuline, présente naturellement dans le sérum en des quantités variables, incontrôlables. D'autres milieux sont le milieu de Trowell T-8, supra, le "milieu exempt de sérum" de Neuman et Tytell, supra, le milieu de Frenkel, Am. J. Vet. Res., Vol. XI, 371-373 (1950) et Vol. XII, 187-90 (1951), et le milieu de Waymouth MAB 87/3, Tissue Culture, Ramakrishnan ed., Junk, La Haye (1965) page 168. Voir aussi les brevets <EMI ID=4.1>
USA n[deg.] 3.196.077 et 3.655.873, et Katsuka et Takaoka, Supra, Tableau II.
Le milieu de Frenkel contient environ 0,9 unité d'insuline par litre ; le milieu de Trowell contient environ
50 mg d'insuline par litre et comporte une quantité minimale de zinc ; le milieu de Waymouth contient 8 mg d'insuline par litre. Le milieu de Neuman et Tytell contient 1 mg d'insuline par litre (1 mg d'insuline correspond à plus de 20 unités, British Pharmacopoeia, 1973, 246). Bien que ces milieux aient eu diverses applications, ils n'ont pas été totalement satisfaisants pour des applications à grande échelle, par exemple une production de vaccin ou une culture de tissu primaire à grande échelle.
La protamine-zinc-insuline (que l'on désigne souvent par "PZI") est généralement disponible sous forme d'une solution stérile dans un tampon aqueux d'insuline, modifiée par du chlorure de zinc et de la protamine. La suspension de protamine-zinc-insuline contient environ 0,2 à environ 0,25 mg de zinc et environ 1,0 à environ 1,7 mg de protamine par
100 unités d'insuline, et la suspension a un pH d'environ 6,97,4 ; (voir, par exemple, United States pharmacopeia, XVIII,
(1970) pages 335-6 ; British Pharmacopeia, 1973, 246). La matière est disponible sur le marché sous une forme convenant pour l'injection à des êtres humains et cette forme est de préférence utilisée dans le cadre de la présente invention.
On sait que la protamine-zinc-insuline diffère nettement, en ce qui concerne son action biologique, d'autres formes de l'insuline, Remington's pharmaceutical Sciences,
13ème Ed., Mack Pub. Co. Easton, pa., Chapitre 62, pages
1048-9 (1965). Voir aussi Mcrck Index, 8e Ed., Merck Co.,
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La présente invention concerne la culture de tissus et la propagation de virus dans une culture de tissu, et elle concerne particulièrement la culture de tissus et la propagation de virus dans des milieux chimiquement définis. L'invention concerne plus particulièrement la culture de tissus et la propagation de virus dans une culture de tissu dans laquelle on fait croître des cellules animales dans une culture de tissu en utilisant un milieu d'entretien de culture, qui comprend une petite quantité de protamine-zinc-insuline, favorisant la croissance. L'invention englobe également un nouveau milieu comprenant une quantité, favorisant la croissance, de protamine-zinc-insuline, et un vaccin produit par un tel procédé.
On a maintenant découvert que l'addition de protamine-zinc-insuline à des milieux de culture de tissus, en particulier des milieux chimiquement définis, apporte des résultats bénéfiques inattendus en ce qui concerne une fixation rehaussée des cellules, une croissance accrue des cellules
à la fois qualitativement et quantitativement, une vie accrue de couches monomoléculaires de cellules de culture de tissu en excellent état, et en particulier des améliorations à la production d'un virus-vaccin dans de telles cellules de culture de tissu. L'invention permet la production de cellules animales et de virus-vaccins dans une culture de tissu en l'absence totale d'additif ou compléments chimiquement indéfinis, comme un sérum d'animal, des extraits d'embryons, etc. , et l'invention assure des résultats améliorés de manière constante, permettant son utilisation dans des opérations industrielles de production.
Le milieu de l'invention est un milieu d'entretien
de culture de tissu, chimiquement défini, stérile, qui comprend de la protamine-zinc-insuline (que l'on désigne ciaprès par "pzi") en dispersion, en une quantité efficace pour rehausser de façon significative la croissance de cellules animales dans la culture de tissu. La quantité optimum de
PZI à ajouter dans des cas particuliers peut varier suivant
des facteurs tels que le type des cellules, le type du milieu chimiquement défini, le pH (qui influence également la solubilité du PZI), les conditions d'incubation, etc. Dans des cas particuliers, les quantités employées pour obtenir le meilleur résultat peuvent �tre facilement vérifiées par des procédés classiques de recherche de gammes, existant pour l'étude d'une amélioration de croissance significative du point de vue statistique. A titre d'exemple, on peut prévoir une comparaison de milieux comportant différents taux de PZI avec le milieu d'entretie n. D'une manière générale, on obtient une croissance accrue avec des concentration de PZI d'environ 0,05 à environ 0,5 unité de PZI par ml de milieu de culture de tissu final.
Des quantités sensiblement inférieures de PZI, par exemple de 0,01 unité/litre, sont généralement insuffisantes pour rehausser la croissance, et des quantités sensiblement plus élevées, par exemple de 0,7 unité ou plus par litre, ne donnent généralement pas d'amélioration supplémentaire, tandis que
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centration de PZI allant d'environ 0,075 à environ 0,1 jusqu'à environ 0,2 à environ 0,3 unité par ml.
Suivant une forme de réalisation, le milieu comprend également une quantité supplémentaire de glucose, rehaussant la croissance, en plus du PZI. La quantité supplémentaire de glucose que l'on utilise est généralement la quantité nécessaire pour amener la concentration finale de glucose (comprenant le glucose du milieu d'entretien ainsi que le glucose de complément) depuis environ 1150 jusqu'à environ 2000 mg par litre ou plus. Suivant une autre forme de réalisation, le milieu contient une petite quantité de pyruvate, habituellement 5,50
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Le milieu d'entretien peut être constitué par n'importe quel milieu d'entretien de culture de tissu, par exemple le milieu 199, le milieu basal d'Eagle, le milieu essentiel minimum d'Eagle, etc, ainsi que par les nombreuses variantes de ces milieux, ou encore par un milieu spécialement formulé. Bien qu'il soit essentiel que le milieu soit un milieu fournissant une quantité suffisante d'agents nutritifs (sels, vitamines, hydrates de carbone, lipides, amino-acides, etc.) pour permettre une poursuite du métabolisme des cellules, il n'est toutefois pas essentiel que le milieu entretienne une prolifération rapide des cellules en question.
C'est-à-dire que le milieu, sans PZI, devrait lui-même être suffisant pour agir comme milieu d'entretien pour les cellules en cause, bien qu'il ne soit pas nécessaire qu'il soit suffisant pour servir seul de milieu de croissance pour ces mêmes cellules. Le milieu peut également être un milieu suffisant pour entretenir la croissance, auquel cas l'invention.apporte des résultats encore améliorés. Il devrait contenir moins d'environ 0,05 unité par ml de matière contenant de l'insuline, autre que la PZI, et il contient de préférence de la PZI à titre de seule source essentielle d'insuline décelable.
Bien que l'invention puisse se développer avec un milieu chimiquement indéfini, beaucoup des avantages fournis par l'invention seraient a lors sacrifiés ou diminués. A titre d'exemple, les avantages de la production de cellules et de virus dans un système chimiquement défini sont incompatibles avec l'utilisation de substances indéfinies, par exemple un sérum. En conséquence, le milieu devrait être un milieu exempt de fluides biologiques d'une composition chimiquement indéfinie, par exemple un sérum, un plasma, un fluide amniotique, des extraits d'embryons, etc., et il devrait de préférence être un milieu chimiquement défini. L'identité chimique et la quantité de tous les ingrédients se trouvant dans le milieu seront alors prédéterminées.
Dans la formulation du milieu suivant l'invention, on ajoute la PZI aux ingrédients du milieu d'entretien de n'importe quelle manière appropriée convenant pour la dispersion de la PZI dans la totalité du milieu, étant entendu qu'on entretient des conditions stériles et qu'on évite les conditions pouvant dénaturer la PZI. Suivant un procédé commode et préféré, un milieu d'entretien chimiquement défini est formulé, stérilisé par traitement à l'autoclave, filtration stérile ou les deux, puis la PZI est ajoutée sous la forme de la suspension injectable USP tamponnée aqueuse. L'addition est réalisée de façon commode en ajoutant la suspension de PZI à environ 5-15 volumes du milieu, en agitant le mélange pendant quelques heures (par exemple pendant 1 à 3 heures) à des températures d'environ 20 à 40[deg.]C, en y ajoutant ensuite
du milieu d'entretien supplémentaire pour obtenir la composition finale à utiliser.
On utilise le nouveau milieu, suivant l'invention, en ensemençant le milieu par des cellules qui doivent croître dans une culture de tissu, et en incubant les cellules et le milieu sous des conditions contribuant à une croissance des cellules dans la culture de tissu. L'incubation est normalement réalisée sous des conditions de pH (généralement de 7,17,2 à 7,5-7,6), de température (généralement environ 28-40[deg.]C,
de préférence environ 35-38[deg.]C), d'irradiation, d'asepsie, d'oxygénation, etc., qui sont connues comme convenant pour le type de cellules utilisé. L'incubation peut être réalisée dans n'importe quel réservoir approprié, notamment des bouteilles
de verre, des bouteilles en métal ou en matière plastique polymère organique, non toxique, ou dans des appareils de propagation de culture de tissu. On obtient une fixation rapide des cellules, c'est-à-dire que d'une façon générale au moins 50-
70 % des cellules s'attachent à la surface du réservoir après une incubation de 15 à 30 minutes.
Une prolifération excellente et rapide se manifieste généralement dans les 2'à 5 jours après l'ensemencement, c'est-à-dire après le début de l'incubation.
Lorsque des virus doivent être propagés, comme dans le cas de la production d'un virus-vaccin, l'incubation des
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tention d'un degré désiré prédéterminé de croissance des cellules (par exemple la fin de la "phase log" de la croissance des cellules, l'atteinte de 90 à 100 % de confluence des couches monomoléculaires des cellules, etc.). Le milieu comportant la PZI est alors séparé par des procédés traditionnels, par exemple une décantation, une aspiration, etc., et il est remplacé par un milieu d'entretien chimiquement défini qui ne contient pas de PZI ; les cellules sont inoculées par un virus d'ensemencement ; les cellules, le virus et le milieu d'entretien exempt de PZI sont incubés sous des conditions contri-buant à la propagation du virus jusqu'à ce qu'une propagation importante de celui-ci se soit produite ; ensuite, le virus est récolté suivant des procédés traditionnels.
La séparation du milieu contenant la PZI au moment de l'ensemencement du virus réduit au minimum les risques d'une sur-prolifération des cellules, et réduit la quantité de PZI restante à emporter dans le virus-vaccin final produit. Bien que le milieu de remplacement puisse être caractérisé comme étant "exempt de PZI", il doit être entendu qu'une certaine quantité de PZI restera généralement avec les cellules durant la production du virus. La concentra,tion restante de PZI se situe généralement en dessous des Laux qui pourraient avoir un effet nuisible important quelconque sur l'administration d'un virus-vaccin ; cette concentration peut encore être réduite par lavage ou rinçage des cellules avec un milieu exempt de PZI frais, avant l'addition du milieu de remplacement et du virus d'ensemencement.
D'une manière générale, la concentration de PZI sera une quantité mineure allant d'une valeur inférieure à la quantité quantifiable par une radio-immuno-titration (et de ce fait inférieure aux taux minima normaux dans le sérum humain d'environ 4 micro-unités ou 0,000004 unité par ml) jusqu'à des
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milieu de PZI fraîchement préparé, en diminuant d'environ
25 à 75 % après 24-72 heures de croissance de cellules, et en diminuant à nouveau jusqu'à une valeur allant d'un minimum inférieur aux niveaux quantifiables jusqu'à environ 50
à environ 400 ou environ 1000 micro-unités (0,00005 à 0,0004 unité) par ml durant la propagation et la récolte de virus.
Un vaccin produit dans le procédé de l'invention, avec ou sans lavage des cellules après séparation du milieu de PZI et avant ensemencement du virus peut contenir depuis environ 4 micro-unités ou moins jusqu'à environ 1000 microunités de PZI par ml. Bien que cette gamme de concentrations s'étende au-dessus des taux normaux d'insuline dans le sérum humain (environ 4-25 micro-unités par ml), elle se situe loin en dessous des concentrations présentes dans des suspensions de PZI pour injection (40, 80 ou 100 unités par ml) et elle est insuffisante pour montrer des effets physiologiques importants lors d'une utilisation dans un vaccin injectable.
Des virus-vaccins produits par le procédé de l'invention contiennent de préférence, en plus d'une dose immunisante efficace du virus, le résidu de récolte acceptable physiologiquement des cellules de culture de tissu et du milieu d'entretien, ainsi que d'éventuels stabilisants ou adjuvants ajoutés, une quantité de PZI allant depuis une quantité décelable par une radio-immuno-titration ou un procédé équivalent jusqu'à une concentration maximum physiologiquement acceptable pour injection, sans effets physiologiques nuisibles importants attribuables à la PZI. La concentration se situe de façon convenable entre environ 4 micro-unités ou moins et 1000 microunités de PZI par ml du vaccin sous la forme finale de dosage.
Les virus-vaccins produits suivant l'invention comprennent : (1) le virus, généralement un virus vivant atténué, capable d'immuniser des sujets susceptibles sans provoquer de symptômes importants de la maladie contre laquelle on immunise ou sans degré important d'effets secondaires ; (2) des adjuvants facultatifs, acceptables du point de vue pharmaceutique, tels que des tampons, des stabilisants, tels que du lactoseglutamate (brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.133.861), du sucre, de l'albumine ou du phosphate de glutamine (brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3.401.084 et 3.555.149), et, lorsqu'ils sont prêts à l'injection, un fluide acceptable du point de vue pharmaceutique pour injection, par exemple une eau stérile exempte de pyrogène ou une solution saline isotonique ;
et (3) un résidu de récolte acceptable pharmacologiquement, résultant de la production et de la récolte du vaccin. Le résidu de récolte est généralement un mélange chimiquement indéfini contenant des ingrédients métabolisés provenant du milieu d'entretien de culture de tissu durant la production du virus ; des produits métaboliques de cellules ; une petite quantité de débris cellulaires qui ne sont pas séparés 'par les techniques de récolte et de clarification du vaccin ; et de l'insuline résiduaire provenant de la croissance initiale des cellules dans le milieu de PZI. Le vaccin suivant l'invention est essentiellement exempt de matières chimiquement indéfinies exogènes. Cela signifie que le vaccin ne contient pas de matière biologique chimiquement indéfinie, décelable à l'analyse, autre que celle résultant de la croissance et du
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tre d'exemple, un vaccin produit dans une culture de tissu d'embryons de poulet sera exempt de composants de sérum bovin décelables.
Il sera évident de ce qui précède que la présente invention peut être aisément adaptée à la production de vaccins et de cellules dans une culture de tissu, dans toute une large variété de cas, en employant des procédés traditionnels dans la culture des tissus et dans l'art des vaccins. L'invention convient particulièrement bien à la production de nouvelles compositions de virus-vaccins vivants, contenant de la PZI résiduelle comme mentionné précédemment, et elle peut être adaptée à l'utilisation dans des systèmes de cellules aussi bien de mammifères que d'espèces aviaires. L'invention sera décrite plus en détail encore ci-après.
Les Exemples suivants illustrent l'application de l'invention avec utilisation de cellules d'embryons de poulet primaires dans une culture de tissu, et le virus de la rubéole atténué vivant (souche de Schwarz) à titre de virusvaccin. D'autres Exemples illustrent d'autres cellules, à savoir d'embryons de canard, de rein de lapin, de rein de singe, ainsi que d'autres virus, à savoir oreillons, rubéole, poliomyélite, etc. Dans les Exemples, le milieu complet 199 <EMI ID=12.1> de Hank, est généralement utilisée comme milieu- d'entretien chimiquement défini.
Les cellules de la culture de tissu d'embryon de poulet sont préparées en partant d'oeufs exempts de RIF (facteur d'interférence de Rous) suivant des techniques classiques, par exemple enlèvement des yeux, du bec et des membres arrière, lavage, hachage, trypsinisation, filtration, centrifugation pour séparer les cellules à partir de la solution de trypsine, et mise en suspension des cellules dans un milieu frais. D'autres systèmes cellulaires sont préparés par des techniques classiques. Comme aussi bien la technique de préparation des cellules que la technique de préparation du milieu sont bien connues, elles ne sont pas décrites plus en détails dans le cas présent.
Exemple 1 - Culture et croissance de cellules
On prépare une suspension de cellules en utilisant des embryons de poulet de 12 jours, on procède à trypsinisation pendant 2 heures à 37[deg.]C et on met en suspension dans une solution de sel équilibrée de Hank à une concentration d'environ 3 x 105 cellules par ml. On prépare une série de bouteilles de culture de tissu, d'une contenance de 0,92 1, en verre. Dans chaque bouteille, on ajoute 75 ml de M-199 stérile. On ajoute divers additifs d'essai à divers groupes de bouteilles d'essai, 3 bouteilles par groupe, et on ensemence ensuite ces bouteilles par la suspension de cellules. Les cellules sont alors incubées à 36,5-37[deg.]C. Après 48 heures, le milieu est décanté et remplacé par du M-199 frais avec de la solution de sel équilibrée de Hank, mais sans additifs d'essai. Les cellules sont observées journellement. L'as-
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"G" = bon ; "F" = moyen ; "P" = pauvre, etc.) et le degré de confluence des couches monocellulaires en pourcentage de surface recouverte sont donnés ci-après.
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Exemple 2
Dans un procédé semblable à celui de l'Exemple 1,
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chacune 75 ml de M-199. On a ajouté divers additifs à des groupes de bouteilles d'essai, puis les milieux d'essai ont été ensemencés par 1,7 ml par bouteille d'une suspension de cellules d'embryon de poulet, contenant 3 x 10 cellules par ml. Les bouteilles résultantes ont été incubées à 37[deg.]C et on les a observées journellement pendant 10 jours, puis à de plus longs intervalles pendant 10 autres jours.
Le M-199 avec 0,1 % de glucose a montré une lente
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avec 2 % de sérum de foetus de veau a été coté E/90 le 3e jour, E/100 du 4e au Se jour, la rétraction des cellules commençant le 9e jour, la séparation des cellules à partir de la surface dans la bouteille étant trop forte pour permettre une cotation
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Le M-199 avec 10 unités de protamine-zinc-insuline ("PZI") par bouteille (0,13 unité de PZI par ml) et avec 0,25 % d'addition de glucose en poids donne d'excellents résultats, en étant coté E/100 en commençant le 4e jour (dès le 2e ou le 3e jour dans certaines bouteilles) et avec maintien de ces cotations durant la totalité de l'essai. Un milieu identique contenant 0,267 unité de PZI par ml et 0,25 % de
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et par la suite. Avec 0,40 unité de PZI par ml et 0,25 % d'addition de glucose, la cotation a été de G/100 pour les jours 5-7, de G-E/100 pour les jours 8-10, 12. et 14, avec une chute jusqu'à F-G/90 le 20e jour. Avec 0,53 unité de <EMI ID=20.1>
été de F/100 le jour 5, avec amélioration jusqu'à G/100 les jours 6-10, 12 et 14, et ensuite chute à G/95 le 20e jour.
La croissance des cellules dans du M-199 ne comportant comme additif que 0,267 unité de PZI par ml a été cotée G/95 les jours 4 et 5, G/100 les jours 6 et 7, et E/100 le 8e jour et les jours suivants. La croissance des cellules dans du M-199 ne comportant comme additif que 0,267 unité par ml d'insuline a été cotée E/95 les jours 5et 6, et E/100 le 7e jour et les jours suivants. La même quantité d'additif d'insuline avec
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une cotation de G/100 ou de G-E/100 les jours 5-9, et de E/100 les jours suivants. Des quantités supérieures de sulfate de protamine ne semblaient pas particulièrement avantageuses ;
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tion similaire, du M-199 plus du sulfate de protamine uniquement apparaissait toxique pour des cellules de culture de tissu d'embryon de poulet.
Exemple 3
Dans la réalisation des estimations de l'Exemple 2, on a préparé deux groupes de bouteilles supplémentaires de culture et on les a ensemencées par des cellules. Les milieux d'essai utilisés étaient (A) du M-199 plus 2 % de sérum de foetus de veau, et (B) du M-199 plus 0,267 unité de PZI par ml.
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puis les milieux d'essai ont été séparés des cellules attachées et remplacés par du M-199 ne contenant pas d'additif de sérum ou de PZI. L'incubation a été reprise à 32[deg.]C. Le second jour après la mise en place des cellules, 24 heures après le chan-
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rus de la rubéole (vivant, souche de Schwarz atténuée) . Les jours 7, 8, 9 et 10, du virus a été récolté de chaque bouteille de chaque groupe. Les récoltes journalières provenant de chaque groupe A ou B ont été rassemblées et on a procédé à la filtration du virus ainsi amassé. Pour le groupe A, les titres journaliers étaient de 4,1, de 4,4, de 4,8 et de 5,0. Pour le groupe B, les titres journaliers correspondants étaient de 3,9, de 4,6, de 4,6 et de 5,5 (le titre de virus est exprimé par le logarithme ordinaire (base 10) du nombre 'de doses infectieuses à 50 % dans la culture de tissu
(TCID50) par ml.
Exemple 4 - Croissance de cellules à grande échelle
On a préparé un mélange préalable de protaminezinc- insuline (PZI) en ajoutant 20 ml de PZI (100 unités par ml) à 180 ml de M-199 et en agitant pendant 2 heures à
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concentration finale de PZI dans ce mélange préalable est ainsi de 10 unités par ml.
Un concentré de cellules d'embryon de poulet (CEC)
a été préparé en utilisant des embryons de 11 jours avec trypsinisation à 37[deg.]C et lavage dans du M-199. On a préparé
330 ml de suspension contenant environ 3,0 x 107 cellules par ml.
Le mélange préalable de PZI, le concentré de CEC et du milieu M-199 sont mélangés au cours d'une série d'opérations distinctes dans des réservoirs distincts de 4 litres, puis 75 ml de chacun de ces réservoirs ont été introduits dans des bouteilles en verre d'une contenance de 0,92 litre, et les cellules ont été incubées à 37 "C et observées pour ce qui concerne leur morphologie et le pourcentage de confluence des couches de cellules. On a également utilisé des opérations de vérification utilisant du M-199 et du M-199 plus 2 % de sérum de foetus de veau. Dans tous les cas, les proportions des ingrédients ont été choisies pour fournir 1,5 ml de con-
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1 ml de concentré de PZI (10 unités) par 75 ml en bouteille, pour une concentration finale de PZI de 0,133 unité par ml.
Avec du M-199 seul, la morphologie des cellules a été sans arrêt pauvre et la confluence n'augmentait que de
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qu'à 30-40 % le 2e jour et 60 % le 3e jour. La morphologie était moyenne à bonne le 4e jour et la confluence de la couche de cellules était complète à 75-85 %. Lorsque les composants étaient mélangés dans un récipient en verre Pyrex de 4 litres, en ajoutant d'abord le concentré CEC au M-199, en ajoutant ensuite le mélange préalable de PZI, on observait
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tation se poursuivait le 2e jour. On a obtenu des résultats similaires avec une distribution sous pression dans les bouteilles de culture en verre, et on a obtenu une confluence
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place ou introduction dans des bouteilles en matière plastique Falcon.
Lorsque l'ordre d'addition du mélange préalable de PZI et du concentré CEC est inversé (PZI avant CEC), on obtient une morphologie moyenne à bonne avec une confluence de 60 à 70 % après 1 jour, à la fois lors d'une introduction par gravité et lors d'une introduction sous pression. Le 3e jour, ces bouteilles contenant la culture de tissu ont été estiméesà une confluence de 70-75 % avec une bonne morphologie.
Au cours de deux autres opérations, les composants ont été mélangés en ajoutant les cellules en dernier lieu. Au cours d'une opération, on a employé un récipient en acier inoxydable de 4 litres ; au cours de l'autre opération, le mélange s'est fait dans un récipient en matière plastique Falcon. Dans les deux cas, une morphologie moyenne à bonne et
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d'incubation.
Au cours d'autres opérations, on a ensemencé des cellules d'embryon de poulet dans un appareil de propagation de culture de tissu, comportant une feuille de polystyrène interne en une configuration de spirale à titre d'élément de fixation de cellules et de surface de croissance (Dyna Cell, Cooke Laboratory Products, Alexandria, Virginie). On a fait croître les cellules dans du M-199 contenant 0,13 unité de PZI par ml jusqu'à une confluence pratiquement totale, avec ensuite ensemencement par le virus de la rougeole et incubation avec du M-199 (sans PZI). La reproduction du virus était excellente.
Exemple 5 - Production du virus de la rougeole
Pour la préparation du virus-vaccin de la rougeole dans des fibroblastes d'embryon de poulet, que l'on a fait croître dans des milieux exempts de sérum, on a préparé ce qui suit :
A. Milieu de croissance M-199 - M-199 avec solution de sel équilibrée de Hank, plus 0,350 g de bicarbonate de sodium par litre ;
B. Milieu d'entretien M-199 - M-199 avec solution de sel équilibrée de Hank, plus 1 g de bicarbonate de sodium par litre ;
C. Solution de L-glutamine, 10 mg de L-glutamine par litre de solution B ;
D. Solution de pyruvate de sodium, 5,5 mg de pyruvate par litre de solution B ;
<EMI ID=31.1>
par litre de solution B ;
F. Mélange préalable de PZI, 10 unités de protamine.zinc-insuline par ml, préparation comme suivant l'Exemple 4 ;
G. D-Glucose - solution à 20 % dans de l'eau doublement distillée, avec traitement à l'autoclave à 121[deg.]C pendant 15 minutes pour la stérilisation ;
H. Suspension de fibroblastes d'embryon de poulet dans du M-199 ; 2,7 x 10 cellules par ml.
On a préparé trois suspensions de cellules en vrac et on les a introduites dans des bouteilles de verre d'une contenance de 0,92 litre, et ce de la façon suivante.
Suspension en vrac n[deg.] 1 : ("FCS" ; milieu de sérum de foetus de veau), 2450 ml de A avec 50 ml de sérum de foetus de veau et 60 ml de H ; agitation modérée pendant 15 minutes avant introduction dans les bouteilles.
Suspension en vrac n[deg.] 2 : ("PZI" ; milieu de protamine-zinc-insuline), 2400 ml de A, 18,75 ml de G, 12,5 ml
de C, 12,5 ml de D, 60,0 ml de H et 33,3 ml de F (mélange préalable de PZI) ; agitation modérée pendant 15 minutes
avant introduction dans les bouteilles ; l'addition de glucose donne une concentration finale de glucose d'environ 0,25% en poids.
Suspension en vrac n[deg.] 3 : ("PZIT", milieu de PZI avec de la thyroxine), 2400 ml de A, 18,75 ml de G, 12,5 ml
de chacun des C et D, 50,0 ml de E, 60,0 ml de H, et 33,3 ml de F ; agitation modérée pendant 15 minutes avant l'introduction dans les bouteilles.
Les cellules sont incubées à 37[deg.]C jusqu'à obtention d'un confluence de 95 à 100 % dans chaque bouteille, 24 heures dans tous les cas. Les bouteilles comportant la suspension
n[deg.] 1 ont été ensemencées par le virus après 24 heures ; les bouteilles contenant les suspensions 2 et 3 ont été ensemencées après 48 heures. L'ensemencement du virus a été réalisé par aspiration du milieu à partir de la couche des cellules,
<EMI ID=32.1>
des bouteilles à 32 [deg.]C par la suite.
Le virus a été récolté 7 jours plus tard et on a procédé à une seconde récolte à partir des bouteilles des groupes 1 et 3, 3 jours après la première récolte.
Exemple 6
Dans un procédé similaire à celui de l'Exemple 5, on a réalisé la propagation du virus de la rougeole dans une culture de tissu de fibroblastes d'embryon de poulet, que
<EMI ID=33.1>
ce moment, on a séparé des milieux par aspiration et on a aj.outé 100 ml de milieu d'entretien M-199 (solution B de l'Exemple 5), en même temps que le virus d'ensemencement de la rougeole. Les bouteilles infectées ont été incubées à
32[deg.]C et on les a observées pour les effets cytopathiques et la titration du virus.
Les résultats d'une série d'opérations de ce genre sont présentés ci-après. Différents groupes de bouteilles ont été infectés par différents virus d'ensemencement de la rou-
<EMI ID=34.1>
par 0,5 ml. L'effet cytopathique "CPE" est indiqué numériquement sur une échelle allant de 0 (pas d'effet visible) jusqu'à 4 (feuille cellulaire détruite). Lorsque deux lectures sont rapportées pour le même jour, elles ont été faites à environ
7 heures d'écart.
<EMI ID=35.1>
<EMI ID=36.1>
En consirérant le Tableau précédent, il est évident que les titrations du virus-vaccin obtenues avec des cellules mise à croître dans les milieux PZI et PZIT exempts de sérum sont en moyenne d'environ 1 log (dix fois) supérieures aux titrations obtenues dans le milieu FCS. Ce Tableau indique également que les titrations maxima de vaccin obtenues en utilisant les mileux exempts de sérum sont généralement égales ou supérieures aux titrations obtenues du système FCS et que les titrations de pointe sont généralement maintenues plus longtemps que dans le cas du système cellulaire FCS.
Exemple 7
On a répété le procédé de l'Exemple 6 en utilisant des fibroblastes d'embryon. de poulet, provenant d'embryons de 9 ou de 11 jours, ayant subi une trypsinisation pendant 30 minutes à 37[deg.]C, et en utilisant le milieu PZI et le virus d'ensemencement S2 de l'Exemple 6, ainsi qu'un troisième virus d'ensemencement S3. Avec l'ensemencement S- et les cellules provenant des embryons de 11 jours, on a atteint une titration de virus de 4,3 le 6e jour et on a obtenu des titrations de 4,2-4,9 journellement jusqu'au 10e jour.
<EMI ID=37.1>
jour.
Dans les cellules provenant des embryons de 9 jours, la titration avec l'ensemencement S2 a atteint 4,4 le 6e jour et on a obtenu des titrations de 4,8-5,3 les jours 7-9. Le 12e jour, on a obtenu une titration de 5,2, dans des cellules similaires, la titration avec l'ensemencement S3 a été de 4,6 après 5 jours, en augmentant à 5,25,9 les jours 6 et 7, puis jusqu'à 6,0 le 8e jour, moment où toute culture supplémentaire était terminée.
On a obtenu des résultats similaires en utilisant un virus vivant des oreillons (souche de Jeryl Lynn),
au lieu du virus de la rougeole (voir le brevet des EtatsUnis d'Amérique n[deg.] 3.555.149).
Exemple 8
En utilisant le milieu PZI tel que décrit précédemment, on a procédé à la propagation du virus de la rougeole
(souche Schwarz) dans une culture de tissu CEC. On a créé trois lots, en employant trois lots de virus d'ensemencement, et des échantillons ont été prélevés pour analyse de l'insuline par radio-immuno-titration à différents stades du procé-
<EMI ID=38.1>
Le milieu d'entretien chimiquement défini M-199, utilisé seul ou ensemencé par des cellules d'embryon de poulet, et les virus d'ensemencement contenaient, d'après ce qu'on
a trouvé, moins de 4 micro-unités d'insuline par ml. Le milieu M-199 contenant la PZI, ensemencé par les cellules d'em-
<EMI ID=39.1>
nuant jusqu'à environ 0,07 unité par ml après 48 heures d'incubation. A titre comparatif, on a trouvé que deux lots de sérum bovin venant de foetus contiennent 5,3 et 7,3 microunités par ml, tandis qu'un milieu M-199 chimiquement indéfini, plus 2 % de sérum de veau, contenait moins de 4 microunités par ml.
On a trouvé que les vaccins finals de récolte contenaient environ 374, 95 et 357 micro-unités d'insuline par ml (moyenne de deux déterminations). Aux titrations produites, un dosage typique est de 0,5 ml.
Exemple 9
On a utilisé l'invention dans la production du virus de la rubéole sur des embryons de canard d'après un pro-cédé similaire (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique
3.401.084.
On a préparé des embryons de canard de 10 jours, on les a soumis à trypsinisation à 37[deg.]C pendant 50 minutes, puis à centrifugation, lavage et mise en suspension dans du M-199 additionné de 0,007 % de NaHC03. On a préparé un milieu PZI en utilisant 901 ml de M-199 similaire, 13 ml d'un mélange préalable de PZI de l'Exemple 4, et 61 ml de la suspension de cellules. La suspension de cellules et du milieu PZI a été placée dans des bouteilles de culture de tissu
d'une contenance de 0,92 litre, en verre, et dans des récipients pour culture de tissu, en polystyrène, de 75 cm<2>, et
on a procédé à une incubation à 37[deg.]C. On a observé qu'au moins 75 % des cellules se sont attachées à la surface des récipients dans les 3 heures environ. par contre, une incubation témoin dans du M-199 plus 2 % de sérum de veau a montré une fixation de 25 % seulement à ce même moment.
Après une incubation de 18 heures, les cellules d'embryon de canard dans le milieu PZI ont montré une confluence de 80-90 % avec une répartition très uniforme, tandis que les cellules dans le milieu de sérum de veau témoin ont montré une confluence de 60-70 %. 42 heures après introduction, les cellules d'embryon de canard dans le milieu PZI ont montré 100 % de confluence. Le milieu a été décanté et remplacé par du M-199 avec de la solution de sel basale d'Eagle et
<EMI ID=40.1>
teilles par une souche de HPV-77 adaptée de cellules de canard, avec virus-vaccin de la rubéole (Meruvax de la Société Merck, Sharp et Dohme) et on a ensemencé 4 bouteilles par la souche Cendehill du virus-vaccin de la rubéole (normalement propagé dans une culture de tissu de rein de lapin).
L'ensemencement des virus a été réalisé en reconstituant 5 fioles à dose unique du virus sur embryon de canard, lyophilisé, dans 2,5 ml de mïlieu d'entretien, et en mélangeant le mélange résultant avec 500 ml du milieu d'entretien. On a utilisé 100 ml de la dilution de virus par bouteille. L'ensemencement du virus Cendehill a été réalisé de façon similaire. Le virus a été récolté journellement du 4e au 8e jour.
Exemple 10
On a utilisé le milieu de l'invention dans une
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de la souche Cendehill du virus-vaccin vivant de la rubéole. On a prélevé les reins de manière aseptique sur des lapins de 21 jours, on les a hachés, lavés dans du milieu d'entretien M-199, trypsinisé et centrifugé. Les cellules centrifugées ont été lavées deux fois dans du M-199 et mises en suspension dans du M-199 par des procédés traditionnels.
Les cellules ont été ensemencées dans des bouteilles de culture de tissu, en polystyrène, de 75 cm<2>, à une concentration d'environ 1,6 x 10 cellules par bouteille , avec du M-199 additionné du sel équilibré de Hank et de 1 g de NaHCO- par litre, avec du glucose jusqu'à une concentration finale de 2,5 g par litre, et avec 28 �g de pyruvate de
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semencement des cellules dans le milieu a une concentration finale de 5 x 10 cellules par ml. On a jouté un mélange préalable de PZI préparé comme dans le cas de l'Exemple 4 pour obtenir une concentration finale de PZI de 0,13 unité par ml.
Les cellules et le milieu ont été incubés à 37 [deg.]C pendant 4 jours, après quoi le milieu de PZI a été remplacé par le milieu d'entretien identique sans PZI. Ce milieu d'entretien a été remplacé tous les deux jours par la suite. On
a obtenu une confluence totale le 5e jour et les cellules mises à croître dans le milieu de PZI conservaient l'aspect épithélial presque pur, même durant les 14 jours de culture
du tissu.
On peut obtenir de bons rendements du virus-vaccin de la rubéole en faisant croître des cellules de rein de lapin dans une culture de tissu telle que décrite ci-dessus, en décantant le milieu PZI après obtention d'une confluence pratiquement totale (du 4e jour environ jusqu'au 7e jour), en ensemençant les cellules par un virus de rubéole atténué vivant (souche Cendehill), en ajoutant du milieu d'entretien de remplacement et en incubant pendant 3 à 5 jours jusqu'à ce qu'une bonne prolifération du virus se produise.
Exemple 11
On a préparé de" cellules d'embryon de poulet,
du M-199 et un mélange préalable de PZI, essentiellement comme décrit précédemment dans les Exemples 1 à 4. Les cellules ont été mises en place à une concentration de 6 x 105 cellules par ml dans du M-199 contenant une concentration finale de PZI de 0,133 unité par ml. On a introduit 75 ml de la suspension résultante de cellules dans chacune d'une série de bouteilles de verre d'une contenance de 0,92 litre et on a procédé à une incubation pendant 48-72 heures à 37[deg.]C. A ce moment, la confluence et la morphologie étaient excellentes. Les bouteilles ont été ensuite ensemencées par du virus vivant atténué des oreillons (souche de Jeryl Lynn) en utilisant 2 ml par bouteille d'une dilution à 250 fois dans du M--199 du virus d'ensemen-
<EMI ID=43.1>
L'ensemencement du virus a été réalisé directement après sépa-ration du milieu de PZI dans une série de bouteilles, et après séparation du milieu de PZI suivi par un rinçage de la couche monomoléculaire de cellules, une fois avec environ
75 ml de M-199 (sans PZI) dans une seconde série de bouteilles. Les cellules infectées ont été incubées à 37[deg.]C avec du M-199 frais (sans PZI). L'observation des effets cytopathologiques ("CPE") de l'infection par le virus des oreillons a pu se faire le 4e jour après l'ensemencement du virus. Le virus a été récolté le 4e jour, et ensuite deux fois par jour jusqu'à ce que la valeur CPE atteigne 4+ (sur une échelle allant de 0 à 4+), en récoltant le milieu de culture et en le .remplaçant par du M-199 frais. Les titrations allaient de <EMI ID=44.1>
différence significative entre les cellules rincées après la séparation du milieu PZI et les cellules ensemencées sans lavage ou rinçage. Une répétition des opérations a montré des résultats similaires, avec une obtention de 3 à 6 récoltes par bouteille.
Exemple 12
On a réalisé une opération semblable à celle de l'Exemple 11, en utilisant un virus atténué de la rougeole. On a obtenu d'excellents résultats similaires dans une série d'opérations utilisant une phase de lavage avant l'ensemencement du virus et dans une série d'opérations au cours desquelles on omettait ce lavage.
Exemple 13
Des reins de callitriche d'Afrique ont été soumis à trypsinisation à 37[deg.]C pendant 4 heures et mis en place
<EMI ID=45.1>
comportant 0,13 unité de PZI par ml. Le procédé utilisé était semblable à celui décrit dans les Exemples 11 et 12. 20 mi-
<EMI ID=46.1>
croscopique a montré qu'au moins 50 % des cellules étaient attachées au verre. Une incubation a été faite à 37[deg.]C car les cellules de reins de singe sont connues comane étant difficiles à faire croître sur une culture de tissu, le milieu du M-199 avec PZI a été remplacé par du milieu M-199 frais et du PZI après 48 heures, et à nouveau 3 jours plus tard. On a observé une confluence de 95 % après une incubation de 8 jours,
<EMI ID=47.1>
cellules étaient alors ensemencées par un virus vivant atténué .de la polio, virus polio (2), 0,4 ml de virus d'ensemencement
(dilution de 100 fois) par bouteille. Les cellules et le virus ont été ensuite incubés avec 100 ml de M-199 (sans PZI) à <EMI ID=48.1>
heures, on a obtenu des titrations de 1,75-1,8 x 105 unités formant plaques ("PFU") par ml, ces valeurs augmentant jusqu'à 2,3-2,4 x 105 PFU/ml après 72 heures d'incubation.
Exemple 14
Dans des procédés semblables à ceux décrits précédemment, on a fait croître des couches monomoléculaires confluentes de cellules d'embryon de poulet dans du M-199 avec PZI pendant 3 jours. Le M-199 avec PZI a été ensuite remplacé par du M-199 (100 ml par bouteille) et du virus de
<EMI ID=49.1>
Après 20 jours d'incubation supplémentaire à 37[deg.]C, on a noté une prolifération intense du virus à l'observation des effets cytopathologiques. Le CPE a été coté à 4 à ce moment (sur l'échelle de 0 à 4+). Des cellules mises à croître de façon similaire et infectées par du VSV, mais en utilisant du M-199 plus 2 % de sérum de veau au lieu de M-199 avec PZI, avaient une qualité CPE de 3. Les titres de VSV après 20 jours dans
des cellules mise;? à croître dans du M-199 avec PZI étaient
de 1,36-2,36 x 106 PFU/ml/
D'autres applications illustratives intéressantes de l'invention se situent dans la production du virus de
la rage sur des cellules d'embryon de poulet mises à croître dans une culture de tissu, en utilisant un milieu exempt de sérum (de préférence du M-199) avec du PZI (voir le brevet
des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.255.080), dans la production
du virus de l'hépatite canine infectieuse, en utilisant une culture de tissu de rein de porc ou une culture de tissu de rein de chien (voir les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos
2.915.436 et 3.000.788), dans la production du virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse, du virus de la diarrhée bovine et du virus du para-influenza (PI-3) dans une culture
de tissu de rein de bovin (voir les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 2.941.925 et 2.934.473), dans la production
du virus de l'influenza dans une culture de tissu d'embryon
de poulet, et dans la production du virus de la rage dans une culture de tissu de rein de bovin (voir le brevet des EtatsUnis d'Amérique n[deg.] 3.585.266).
REVENDICATIONS
1. Un milieu de croissance pour culture de tissu, comportant une quantité, favorisant la croissance, de protamine-zinc-insuline en dispersion.
"Virus production in tissue culture"
The present invention relates to the production of viruses in tissue culture using a chemically defined medium. The term "chemically defined medium" is used in virology and in tissue culture to denote culture media of known chemical composition, both quantitatively and qualitatively, with respect to natural or undefined environments containing natural products, such as ur. animal serum, embryo extracts, yeast hydrolysates, etc., of unknown or incompletely known chemical constitution.
A number of chemically defined media are known. Most of these media are solutions of nutrients, for example carbohydrates, lipids and amino acids, with vitamins, salts and minerals, and often containing other nutrients, such as purine bases, adenosine triphosphate, etc.
These media are generally used in the form of a solution in a balanced salt solution ("BSS"), that is to say a solution balanced in quantity and in proportion with regard to the ionic species in such a way.
to be physiologically acceptable with regard to
pH, mineral content, osmotic pressure, etc. A number of balanced salt solutions are widely used, for example Hank's Balanced Salt Solution, Earle's Balanced Salt Solution, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Puck's Saline and others. . A number of chemically defined media are also widely used, for example Medium 199 from Morgan, Morton and Parker, Proc. Soc.
<EMI ID = 1.1>
Science 122: 501-4 (19955); Science 123: 845-7 (1956); Eagle et al., J. Biol. Chem. 226: 191-206 (1957); Eagle's minimum essential medium, Eagle, Science 130: 432-7
(1959); the medium of Trowell T8, Exper. Cell Res. 16: 118-
147 (1959): Waymouth Medium MB 752/1, J. Nat. Cancer Inst. 22: 1003-17 (1959); the medium Puck N 16, Puck, Cie- <EMI ID = 2.1>
256 (1960). Details of the preparation and formulation of these media can be found in traditional reference texts, for example, Handbook of Cell and Organ Culture, by Merchant, Kahn and Murphy, Burgess Publ. Co., Minneapolis (1960); and in In Vitro Monograph No. 1, A Survey of Commercially Available Tissue Culture Media, by Helen C. Morton, In Vitro (J. Tissue Culture Association), Vol. 6, No. 2, pp. 89-108 (1970).
In addition to the classification of environments in environments. "Defined" or in "Undefined" media, they are also generally classified on the basis of the ability to support cell metabolism and proliferation. Media which allow cells to be metabolized at rates appropriate for many purposes, including virus production, but which either do not support significant cell proliferation at all or only support marginal limited proliferation, are referred to as "maintenance media". Media which support cell proliferation are generally referred to as "growth media". Most growth media are based on a balanced salt solution or a chemically defined medium, supplemented with one or more natural products, usually animal serum.
Typical growth media are Eagle's basal medium or <1> 99 medium, supplemented with 10-20% whole animal serum, a salt solution balanced with 40% serum, as well as a solution of salt balanced with 40% serum and 20% embryo extract. Certain chemically defined protein-free media can be used as growth media for a limited number of cell types. Katsuta and Takaoka, Methods in Cell Biology VI, Ed. By Prescott, Academic Press (1973) Chapter 1. However, for the growth of primary cells in tissue culture and for most large scale tissue cultures with a view to production of a vaccine, additional serum was required.
The disadvantages of using a serum in vaccine production are well known. A suitable serum is difficult and expensive to obtain, store and use; it constitutes a source of unwanted foreign proteins which can be carried away in the final product vaccine; its composition varies from batch to batch; and it constitutes a potential source of soiling of virus or mycoplasma; Esber et al, J. National Cancer Institute,
50: 559-62 (1973), Barile and Kerne, proc. Soc. Exp. Biol.
<EMI ID = 3.1>
91-3 (1972).
The present invention uses a medium containing insulin. Various media containing insulin are known and have been used. Growth media containing serum generally contain a certain amount of insulin, which is naturally present in the serum in variable, uncontrollable amounts. Other media are Trowell's T-8 medium, supra, Neuman and Tytell's "serum-free medium", supra, Frenkel's medium, Am. J. Vet. Res., Vol. XI, 371-373 (1950) and Vol. XII, 187-90 (1951), and Waymouth's medium MAB 87/3, Tissue Culture, Ramakrishnan ed., Junk, The Hague (1965) page 168. See also patents <EMI ID = 4.1>
USA n [deg.] 3,196,077 and 3,655,873, and Katsuka and Takaoka, Supra, Table II.
Frenkel's medium contains about 0.9 units of insulin per liter; Trowell's medium contains approximately
50 mg of insulin per liter and contains a minimum amount of zinc; Waymouth's medium contains 8 mg of insulin per liter. Neuman and Tytell's medium contains 1 mg of insulin per liter (1 mg of insulin corresponds to more than 20 units, British Pharmacopoeia, 1973, 246). Although these media have had various applications, they have not been fully satisfactory for large scale applications, eg, vaccine production or large scale primary tissue culture.
Protamine-zinc-insulin (often referred to as "PZI") is generally available as a sterile solution in aqueous insulin buffer, modified with zinc chloride and protamine. The protamine-zinc-insulin suspension contains about 0.2 to about 0.25 mg of zinc and about 1.0 to about 1.7 mg of protamine per
100 units of insulin, and the suspension has a pH of about 6.97.4; (see, for example, United States pharmacopeia, XVIII,
(1970) pages 335-6; British Pharmacopeia, 1973, 246). The material is commercially available in a form suitable for injection into humans and this form is preferably used within the scope of the present invention.
It is known that protamine-zinc-insulin differs markedly in its biological action from other forms of insulin, Remington's pharmaceutical Sciences,
13th Ed., Mack Pub. Co. Easton, pa., Chapter 62, pages
1048-9 (1965). See also Mcrck Index, 8th Ed., Merck Co.,
<EMI ID = 5.1> <EMI ID = 6.1>
The present invention relates to tissue culture and virus propagation in tissue culture, and particularly relates to tissue culture and virus propagation in chemically defined media. More particularly, the invention relates to tissue culture and virus propagation in tissue culture in which animal cells are grown in tissue culture using a culture maintenance medium, which comprises a small amount of protamine. -zinc-insulin, promoting growth. The invention also encompasses a novel medium comprising a growth promoting amount of protamine-zinc-insulin, and a vaccine produced by such a method.
It has now been found that the addition of protamine-zinc-insulin to tissue culture media, especially chemically defined media, provides unexpected beneficial results with respect to enhanced cell uptake, increased cell growth.
both qualitatively and quantitatively, increased life of monomolecular layers of tissue culture cells in excellent condition, and in particular improvements in vaccine virus production in such tissue culture cells. The invention allows the production of animal cells and virus-vaccines in tissue culture in the complete absence of chemically undefined additives or supplements, such as animal serum, embryo extracts, etc. , and the invention provides consistently improved results, allowing its use in industrial production operations.
The medium of the invention is a maintenance medium
of chemically defined, sterile tissue culture which comprises protamine-zinc-insulin (hereinafter referred to as "pzi") in dispersion, in an amount effective to significantly enhance the growth of animal cells in the cell. tissue culture. The optimum amount of
PZI to be added in special cases may vary depending on
factors such as type of cells, type of chemically defined medium, pH (which also influences the solubility of PZI), incubation conditions, etc. In special cases, the amounts employed to obtain the best result can be readily verified by conventional range finding methods available for the study of statistically significant improvement in growth. By way of example, provision can be made for a comparison of media comprising different levels of PZI with the maintenance medium n. Generally, increased growth is obtained with PZI concentrations of from about 0.05 to about 0.5 PZI units per ml of final tissue culture medium.
Significantly lower amounts of PZI, for example 0.01 units / liter, are generally insufficient to enhance growth, and significantly higher amounts, for example 0.7 units or more per liter, generally do not give rise to growth. further improvement, while
<EMI ID = 7.1>
Centration of PZI ranging from about 0.075 to about 0.1 up to about 0.2 to about 0.3 units per ml.
In one embodiment, the medium also comprises an additional amount of growth enhancing glucose, in addition to PZI. The additional amount of glucose that is used is generally the amount needed to bring the final glucose concentration (including maintenance medium glucose as well as supplemental glucose) from about 1150 to about 2000 mg per liter or more. In another embodiment, the medium contains a small amount of pyruvate, usually 5.50
<EMI ID = 8.1>
The maintenance medium can be any tissue culture maintenance medium, for example Medium 199, Eagle's basal medium, Eagle's minimum essential medium, etc., as well as the many variants of these media, or by a specially formulated medium. Although it is essential that the medium be a medium providing a sufficient amount of nutrients (salts, vitamins, carbohydrates, lipids, amino acids, etc.) to allow continued metabolism of cells, it does not However, it is not essential that the medium sustains rapid proliferation of the cells in question.
That is, the medium, without PZI, should itself be sufficient to act as a maintenance medium for the cells involved, although it need not be sufficient to serve as a stand alone. growth medium for these same cells. The medium may also be a medium sufficient to maintain growth, in which case the invention provides further improved results. It should contain less than about 0.05 units per ml of insulin-containing material, other than PZI, and preferably contains PZI as the sole essential source of detectable insulin.
Although the invention can be developed with a chemically undefined medium, many of the advantages provided by the invention would therefore be sacrificed or diminished. For example, the advantages of producing cells and viruses in a chemically defined system are incompatible with the use of undefined substances, for example serum. Accordingly, the medium should be a medium free from biological fluids of chemically undefined composition, for example serum, plasma, amniotic fluid, embryo extracts, etc., and it should preferably be a chemically undefined medium. defined. The chemical identity and the quantity of all the ingredients in the medium will then be predetermined.
In formulating the medium according to the invention, the PZI is added to the ingredients of the maintenance medium in any suitable manner suitable for the dispersion of the PZI throughout the medium, it being understood that sterile conditions are maintained. and that conditions that could denature the PZI are avoided. In a convenient and preferred method, a chemically defined maintenance medium is formulated, sterilized by autoclaving, sterile filtration or both, and then the PZI is added in the form of the aqueous buffered USP injection suspension. The addition is conveniently accomplished by adding the PZI suspension to about 5-15 volumes of the medium, stirring the mixture for a few hours (eg, 1-3 hours) at temperatures of about 20-40 ° C. .] C, then adding
additional maintenance medium to obtain the final composition to be used.
The novel medium, according to the invention, is used by seeding the medium with cells which are to be grown in a tissue culture, and incubating the cells and the medium under conditions contributing to growth of the cells in the tissue culture. Incubation is normally carried out under conditions of pH (generally 7.17.2-7.5-7.6), temperature (generally around 28-40 [deg.] C,
preferably about 35-38 [deg.] C), irradiation, asepsis, oxygenation, etc., which are known to be suitable for the type of cells used. Incubation can be performed in any suitable tank, including bottles
glass, bottles made of metal or organic, non-toxic polymeric plastic, or in tissue culture propagation devices. Rapid uptake of cells is obtained, i.e. generally at least 50-
70% of cells attach to the surface of the reservoir after a 15 to 30 minute incubation.
Excellent and rapid proliferation is generally manifested within 2 to 5 days after inoculation, that is to say after the start of incubation.
When viruses are to be spread, as in the case of virus-vaccine production, incubation of the
<EMI ID = 9.1>
attention to a predetermined desired degree of cell growth (eg, completion of the "log phase" of cell growth, attainment of 90-100% confluence of the monomolecular layers of cells, etc.). The medium comprising the PZI is then separated by traditional methods, for example decantation, suction, etc., and it is replaced by a chemically defined maintenance medium which does not contain PZI; cells are inoculated with a seed virus; the cells, virus and maintenance medium free of PZI are incubated under conditions which aid in the propagation of the virus until significant spread of the virus has occurred; then the virus is harvested according to traditional methods.
Separation of the PZI-containing medium at the time of virus seeding minimizes the risk of overproliferation of cells, and reduces the amount of PZI remaining to carry in the final virus-vaccine produced. While the replacement medium can be characterized as "PZI free", it should be understood that some amount of PZI will generally remain with the cells during virus production. The remaining concentration of PZI is generally below the levels which could have any significant deleterious effect on the administration of a vaccine virus; this concentration can be further reduced by washing or rinsing the cells with fresh PZI-free medium, prior to the addition of the replacement medium and seed virus.
In general, the concentration of PZI will be a minor amount ranging from a value lower than the amount quantifiable by radioimmuno-titration (and therefore lower than the normal minimum levels in human serum of about 4 micro -units or 0.000004 units per ml) up to
<EMI ID = 10.1>
freshly prepared PZI medium, decreasing by approximately
25-75% after 24-72 hours of cell growth, and decreasing again to a value from a minimum below quantifiable levels down to about 50
to about 400 or about 1000 microunits (0.00005 to 0.0004 units) per ml during virus propagation and harvesting.
A vaccine produced in the process of the invention, with or without washing the cells after separation of the PZI medium and before seeding of the virus can contain from about 4 microunits or less up to about 1000 micrunits of PZI per ml. Although this range of concentrations extends above normal levels of insulin in human serum (approximately 4-25 microunits per ml), it is far below the concentrations present in PZI suspensions for injection. (40, 80 or 100 units per ml) and it is insufficient to show significant physiological effects when used in an injectable vaccine.
Virus-vaccines produced by the method of the invention preferably contain, in addition to an effective immunizing dose of the virus, the physiologically acceptable harvest residue of the tissue culture cells and maintenance medium, as well as any stabilizers or adjuvants added, an amount of PZI ranging from an amount detectable by radioimmuno-titration or equivalent method to a maximum physiologically acceptable concentration for injection, without significant adverse physiological effects attributable to PZI. The concentration is suitably between about 4 microunits or less and 1000 micrunits of PZI per ml of the vaccine in the final dosage form.
The virus vaccines produced according to the invention include: (1) the virus, generally a live attenuated virus, capable of immunizing susceptible subjects without causing significant symptoms of the disease to which one is immunizing or without a significant degree of side effects ; (2) optional, pharmaceutically acceptable adjuvants, such as buffers, stabilizers, such as lactoseglutamate (US Patent No. 3,133,861), sugar, albumin or glutamine phosphate (U.S. Patent Nos. 3,401,084 and 3,555,149), and, when ready for injection, a pharmaceutically acceptable fluid for injection, such as example sterile pyrogen-free water or isotonic saline solution;
and (3) a pharmacologically acceptable crop residue resulting from the production and harvesting of the vaccine. The crop residue is generally a chemically undefined mixture containing ingredients metabolized from the tissue culture maintenance medium during virus production; metabolic products of cells; a small amount of cellular debris which is not separated by vaccine harvesting and clarification techniques; and residual insulin from the initial growth of cells in PZI medium. The vaccine according to the invention is essentially free from exogenous chemically undefined materials. This means that the vaccine does not contain chemically undefined biological material detectable on analysis other than that resulting from growth and
<EMI ID = 11.1>
For example, a vaccine produced in a chicken embryo tissue culture will be free from detectable bovine serum components.
It will be evident from the foregoing that the present invention can be readily adapted for the production of vaccines and cells in tissue culture, in a wide variety of cases, employing methods traditional in tissue culture and in the art. art of vaccines. The invention is particularly suitable for the production of novel live virus-vaccine compositions, containing residual PZI as mentioned above, and it may be suitable for use in cell systems of both mammalian and avian species. . The invention will be described in further detail below.
The following Examples illustrate the application of the invention with the use of primary chick embryo cells in tissue culture, and live attenuated rubella virus (Schwarz strain) as vaccine virus. Other Examples illustrate other cells, namely duck embryos, rabbit kidney, monkey kidney, as well as other viruses, namely mumps, rubella, polio, etc. In the Examples, Hank's Complete Medium 199 <EMI ID = 12.1> is generally used as a chemically defined maintenance medium.
The cells of the chicken embryo tissue culture are prepared from eggs free of RIF (Rous interference factor) according to standard techniques, e.g. eye, beak and hind limb removal, lavage, etc. mincing, trypsinization, filtration, centrifugation to separate cells from the trypsin solution, and suspending the cells in fresh medium. Other cell systems are prepared by standard techniques. As both the technique for preparing the cells and the technique for preparing the medium are well known, they are not described in more detail in the present case.
Example 1 - Culture and Growth of Cells
Prepare a cell suspension using 12 day old chicken embryos, trypsinize for 2 hours at 37 [deg.] C and suspend in Hank's balanced salt solution to a concentration of about 3. x 105 cells per ml. A series of tissue culture bottles, with a capacity of 0.92 L, made of glass are prepared. To each bottle is added 75 ml of sterile M-199. Various test additives are added to various groups of test bottles, 3 bottles per group, and these bottles are then inoculated with the cell suspension. The cells are then incubated at 36.5-37 [deg.] C. After 48 hours the medium is decanted and replaced with fresh M-199 with Hank's balanced salt solution, but without test additives. The cells are observed daily. The ace-
<EMI ID = 13.1>
"G" = good; "F" = medium; "P" = poor, etc.) and the degree of confluence of the single-cell layers as a percentage of surface area covered are given below.
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
Example 2
In a process similar to that of Example 1,
<EMI ID = 16.1>
each 75 ml of M-199. Various additives were added to groups of test bottles, then the test media was seeded with 1.7 ml per bottle of a chicken embryo cell suspension, containing 3 x 10 cells per ml. The resulting bottles were incubated at 37 [deg.] C and observed daily for 10 days, then at longer intervals for another 10 days.
M-199 with 0.1% glucose showed a slow
<EMI ID = 17.1>
with 2% fetal calf serum was rated E / 90 on day 3, E / 100 from day 4 to day 4, cell retraction starting on day 9, separation of cells from the surface in the bottle being too strong to allow a quotation
<EMI ID = 18.1>
M-199 with 10 units of protamine-zinc-insulin ("PZI") per bottle (0.13 units of PZI per ml) and with 0.25% glucose addition by weight gives excellent results, in being rated E / 100 starting on the 4th day (from the 2nd or 3rd day in certain bottles) and with these ratings maintained throughout the entire test. An identical medium containing 0.267 units of PZI per ml and 0.25% of
<EMI ID = 19.1>
and next. With 0.40 units of PZI per ml and 0.25% glucose addition, the score was G / 100 for days 5-7, GE / 100 for days 8-10, 12. and 14 , with a drop to FG / 90 on the 20th day. With 0.53 unit of <EMI ID = 20.1>
was F / 100 on day 5, improving to G / 100 on days 6-10, 12 and 14, and then dropping to G / 95 on day 20.
The growth of cells in M-199 containing as additive only 0.267 units of PZI per ml was graded G / 95 on days 4 and 5, G / 100 on days 6 and 7, and E / 100 on day 8 and following days. The growth of the cells in M-199 containing only 0.267 units per ml of insulin as additive was graded E / 95 on days 5 and 6, and E / 100 on day 7 and the following days. The same amount of insulin additive with
<EMI ID = 21.1>
a rating of G / 100 or G-E / 100 on days 5-9, and of E / 100 on subsequent days. Higher amounts of protamine sulfate did not seem particularly advantageous;
<EMI ID = 22.1>
Similarly, M-199 plus protamine sulfate only appeared to be toxic to chick embryo tissue culture cells.
Example 3
In performing the estimations of Example 2, two sets of additional culture bottles were prepared and seeded with cells. The test media used were (A) M-199 plus 2% fetal calf serum, and (B) M-199 plus 0.267 PZI units per ml.
<EMI ID = 23.1>
then the test media were separated from the attached cells and replaced with M-199 containing no serum additive or PZI. Incubation was resumed at 32 [deg.] C. The second day after placement of the cells, 24 hours after the change
<EMI ID = 24.1>
rubella rus (live, attenuated Schwarz strain). On days 7, 8, 9 and 10, virus was harvested from each bottle in each group. Daily harvests from each group A or B were pooled and the virus thus collected was filtered. For group A, the daily titles were 4.1, 4.4, 4.8 and 5.0. For group B, the corresponding daily titers were 3.9, 4.6, 4.6 and 5.5 (the virus titer is expressed by the ordinary logarithm (base 10) of the number of infectious doses. 50% in tissue culture
(TCID50) per ml.
Example 4 - Large-scale cell growth
A protaminezinc-insulin (PZI) premix was prepared by adding 20 ml of PZI (100 units per ml) to 180 ml of M-199 and stirring for 2 hours at
<EMI ID = 25.1>
final concentration of PZI in this preliminary mixture is thus 10 units per ml.
A concentrate of chicken embryo cells (CEC)
was prepared using 11 day old embryos with trypsinization at 37 [deg.] C and washing in M-199. We prepared
330 ml of suspension containing approximately 3.0 x 107 cells per ml.
The pre-mix of PZI, CEC concentrate and M-199 medium are mixed in a series of separate operations in separate 4 liter tanks, then 75 ml of each of these tanks were added to bottles. glass with a capacity of 0.92 liters, and the cells were incubated at 37 ° C and observed for their morphology and the percentage of confluence of the cell layers. Verification procedures using cell layer were also used. M-199 and M-199 plus 2% fetal calf serum In all cases, the proportions of the ingredients were chosen to provide 1.5 ml of con-
<EMI ID = 26.1>
1 ml of PZI concentrate (10 units) per 75 ml in the bottle, for a final PZI concentration of 0.133 units per ml.
With M-199 alone, cell morphology was persistently poor and confluence only increased by
<EMI ID = 27.1>
at 30-40% on the 2nd day and 60% on the 3rd day. Morphology was moderate to good on day 4 and cell layer confluence was 75-85% complete. When the components were mixed in a 4 liter Pyrex glass container, first adding the CEC concentrate to M-199, then adding the PZI pre-mix, it was observed
<EMI ID = 28.1>
tation continued on the 2nd day. Similar results were obtained with distribution under pressure into the glass culture bottles, and confluence was obtained.
<EMI ID = 29.1>
place or introduction in Falcon plastic bottles.
When the order of addition of the prior mixture of PZI and CEC concentrate is reversed (PZI before CEC), an average to good morphology is obtained with a confluence of 60 to 70% after 1 day, both during a introduction by gravity and during introduction under pressure. On day 3, these bottles containing the tissue culture were estimated at 70-75% confluence with good morphology.
In two further operations the components were mixed, adding the cells last. In one operation, a 4 liter stainless steel container was used; in the other operation, the mixing took place in a Falcon plastic container. In both cases, an average to good morphology and
<EMI ID = 30.1>
incubation.
In other operations, chicken embryo cells were seeded in a tissue culture propagation apparatus, having an internal polystyrene sheet in a spiral configuration as a cell and surface binding element. growth (Dyna Cell, Cooke Laboratory Products, Alexandria, Virginia). Cells were grown in M-199 containing 0.13 units of PZI per ml to almost complete confluence, followed by seeding with measles virus and incubation with M-199 (without PZI). Reproduction of the virus was excellent.
Example 5 - Production of measles virus
For the preparation of measles vaccine virus in chicken embryo fibroblasts, which were grown in serum-free media, the following was prepared:
A. Growth medium M-199 - M-199 with Hank's balanced salt solution, plus 0.350 g of sodium bicarbonate per liter;
B. Maintenance Medium M-199 - M-199 with Hank's Balanced Salt Solution, plus 1 g of sodium bicarbonate per liter;
C. L-glutamine solution, 10 mg of L-glutamine per liter of solution B;
D. Sodium pyruvate solution, 5.5 mg of pyruvate per liter of solution B;
<EMI ID = 31.1>
per liter of solution B;
F. Pre-mix of PZI, 10 units of protamine.zinc-insulin per ml, preparation as according to Example 4;
G. D-Glucose - 20% solution in double distilled water, autoclaved at 121 [deg.] C for 15 minutes for sterilization;
H. Suspension of chicken embryo fibroblasts in M-199; 2.7 x 10 cells per ml.
Three bulk cell suspensions were prepared and filled into 0.92 liter glass bottles as follows.
Bulk suspension n [deg.] 1: ("FCS"; fetal calf serum medium), 2450 ml of A with 50 ml of fetal calf serum and 60 ml of H; moderate agitation for 15 minutes before introduction into the bottles.
Bulk suspension n [deg.] 2: ("PZI"; protamine-zinc-insulin medium), 2400 ml of A, 18.75 ml of G, 12.5 ml
of C, 12.5 ml of D, 60.0 ml of H and 33.3 ml of F (premix of PZI); moderate agitation for 15 minutes
before introduction into the bottles; the addition of glucose gives a final glucose concentration of about 0.25% by weight.
Bulk suspension n [deg.] 3: ("PZIT", PZI medium with thyroxine), 2400 ml of A, 18.75 ml of G, 12.5 ml
of each of C and D, 50.0 ml of E, 60.0 ml of H, and 33.3 ml of F; moderate agitation for 15 minutes before introduction into the bottles.
The cells are incubated at 37 [deg.] C until a confluence of 95 to 100% is obtained in each bottle, 24 hours in all cases. Bottles with the suspension
n [deg.] 1 were seeded with the virus after 24 hours; the bottles containing suspensions 2 and 3 were inoculated after 48 hours. The inoculation of the virus was carried out by aspirating the medium from the layer of cells,
<EMI ID = 32.1>
bottles at 32 [deg.] C thereafter.
The virus was harvested 7 days later and a second harvest was carried out from the bottles of groups 1 and 3, 3 days after the first harvest.
Example 6
In a method similar to that of Example 5, the spread of measles virus was carried out in a tissue culture of chicken embryo fibroblasts, which
<EMI ID = 33.1>
At this point, media were removed by aspiration and 100 ml of M-199 maintenance medium (solution B of Example 5) was added, along with the measles seed virus. Infected bottles were incubated at
32 [deg.] C and observed for cytopathic effects and virus titration.
The results of a series of such operations are presented below. Different groups of bottles were infected with different roughage seed viruses.
<EMI ID = 34.1>
per 0.5 ml. The "CPE" cytopathic effect is indicated numerically on a scale ranging from 0 (no visible effect) to 4 (cell leaf destroyed). When two readings are reported for the same day, they were taken at approximately
7 hours apart.
<EMI ID = 35.1>
<EMI ID = 36.1>
From the previous Table, it is evident that the virus-vaccine titrations obtained with cells grown in the serum-free PZI and PZIT media are on average about 1 log (ten times) higher than the titrations obtained in the FCS medium. This Table also indicates that the maximum vaccine titrations obtained using the serum-free media are generally equal to or greater than the titrations obtained from the FCS system and that peak titrations are generally maintained longer than in the case of the FCS cell system.
Example 7
The procedure of Example 6 was repeated using embryonic fibroblasts. of chicken, from 9 or 11 day embryos, trypsinized for 30 minutes at 37 [deg.] C, and using PZI medium and S2 seed virus of Example 6, as well as 'a third S3 seed virus. With S- seeding and cells from the 11 day embryos, a virus titration of 4.3 was reached on day 6 and titrations of 4.2-4.9 were obtained daily through day 10. .
<EMI ID = 37.1>
day.
In cells from day 9 embryos, titration with the S2 seeding reached 4.4 on day 6 and titrations of 4.8-5.3 were obtained on days 7-9. On day 12 a titration of 5.2 was obtained, in similar cells the titration with seeding S3 was 4.6 after 5 days, increasing to 5.25.9 on days 6 and 7, then to 6.0 on day 8 when any further culture was completed.
Similar results were obtained using a live mumps virus (Jeryl Lynn strain),
instead of the measles virus (see US Pat. No. 3,555,149).
Example 8
Using the PZI medium as described above, the measles virus was propagated
(Schwarz strain) in CEC tissue culture. Three lots were created, using three lots of seed virus, and samples were taken for insulin analysis by radioimmunoassay at different stages of the process.
<EMI ID = 38.1>
Chemically defined maintenance medium M-199, used alone or seeded with chick embryo cells, and seed viruses were reported to contain
found, less than 4 micro units of insulin per ml. The M-199 medium containing the PZI, seeded with the seed cells
<EMI ID = 39.1>
clouding up to about 0.07 units per ml after 48 hours of incubation. For comparison, two batches of fetal bovine serum were found to contain 5.3 and 7.3 micrunits per ml, while chemically undefined M-199 medium, plus 2% calf serum, contained less. 4 microunits per ml.
The final harvest vaccines were found to contain approximately 374, 95 and 357 microunits of insulin per ml (average of two determinations). At the titrations produced, a typical dosage is 0.5 ml.
Example 9
The invention has been used in the production of rubella virus on duck embryos by a similar procedure (see US patent
3,401,084.
10 day old duck embryos were prepared, trypsinized at 37 [deg.] C for 50 minutes, then centrifuged, washed and suspended in M-199 supplemented with 0.007% NaHCO3. PZI medium was prepared using 901 ml of similar M-199, 13 ml of a pre-mix of PZI from Example 4, and 61 ml of the cell suspension. The suspension of cells and PZI medium was placed in tissue culture bottles.
of a capacity of 0.92 liters, in glass, and in tissue culture vessels, in polystyrene, of 75 cm <2>, and
an incubation was carried out at 37 [deg.] C. At least 75% of the cells were observed to attach to the surface of the vessels within about 3 hours. in contrast, a control incubation in M-199 plus 2% calf serum showed only 25% uptake at this same time.
After an 18 hour incubation, the duck embryo cells in PZI medium showed 80-90% confluence with a very uniform distribution, while cells in control calf serum medium showed confluence of 60-70%. 42 hours after introduction, the duck embryo cells in the PZI medium showed 100% confluence. The medium was decanted and replaced with M-199 with Eagle's basal salt solution and
<EMI ID = 40.1>
bottles with a strain of HPV-77 adapted from duck cells, with rubella virus-vaccine (Meruvax from the Company Merck, Sharp and Dohme) and 4 bottles were inoculated with the Cendehill strain of rubella virus-vaccine ( normally propagated in rabbit kidney tissue culture).
Virus seeding was accomplished by reconstituting 5 single dose vials of lyophilized duck embryo virus in 2.5 ml of maintenance medium, and mixing the resulting mixture with 500 ml of maintenance medium. 100 ml of the virus dilution per bottle was used. Cendehill virus seeding was carried out in a similar fashion. The virus was harvested daily from the 4th to the 8th day.
Example 10
The medium of the invention was used in a
<EMI ID = 41.1>
of the Cendehill strain of the live rubella vaccine virus. Kidneys were aseptically removed from 21 day old rabbits, chopped, washed in M-199 maintenance medium, trypsinized and centrifuged. The centrifuged cells were washed twice in M-199 and suspended in M-199 by conventional methods.
Cells were seeded in 75 cm <2> tissue culture, polystyrene bottles, at a concentration of approximately 1.6 x 10 cells per bottle, with M-199 supplemented with Hank's balanced salt and of 1 g of NaHCO- per liter, with glucose to a final concentration of 2.5 g per liter, and with 28 g of pyruvate
<EMI ID = 42.1>
Seeding the cells into the medium at a final concentration of 5 x 10 cells per ml. A preliminary mixture of PZI prepared as in the case of Example 4 was added to obtain a final concentration of PZI of 0.13 units per ml.
Cells and medium were incubated at 37 deg. C for 4 days, after which the PZI medium was replaced with the identical maintenance medium without PZI. This maintenance medium was replaced every other day thereafter. We
achieved full confluence on day 5 and cells grown in PZI medium retained almost pure epithelial appearance, even during the 14 days of culture
fabric.
Good yields of rubella vaccine virus can be obtained by growing rabbit kidney cells in tissue culture as described above, decanting the PZI medium after obtaining substantially complete confluence (from 4th approximately day through day 7), inoculating cells with live attenuated rubella virus (Cendehill strain), adding replacement maintenance medium and incubating for 3 to 5 days until good proliferation of the virus occurs.
Example 11
Chicken embryo cells were prepared,
M-199 and a premix of PZI, essentially as described previously in Examples 1 to 4. The cells were placed at a concentration of 6 x 105 cells per ml in M-199 containing a final concentration of PZI of 0.133 units per ml. 75 ml of the resulting cell suspension was added to each of a series of 0.92 liter glass bottles and incubated for 48-72 hours at 37 [deg.] C. At this time, the confluence and morphology were excellent. The bottles were then inoculated with live attenuated mumps virus (strain of Jeryl Lynn) using 2 ml per bottle of a 250-fold dilution in M - 199 of the seed virus.
<EMI ID = 43.1>
Seeding of the virus was carried out directly after separation of the PZI medium in a series of bottles, and after separation of the PZI medium followed by rinsing the monomolecular layer of cells, once with approximately
75 ml of M-199 (without PZI) in a second series of bottles. The infected cells were incubated at 37 [deg.] C with fresh M-199 (without PZI). Observation of the cytopathological effects ("CPE") of the infection by the mumps virus could be done on the 4th day after seeding of the virus. Virus was harvested on day 4, and then twice daily until the CPE value reached 4+ (on a scale of 0 to 4+), harvesting the culture medium and replacing it with of fresh M-199. Titrations ranged from <EMI ID = 44.1>
significant difference between the cells rinsed after separation from the PZI medium and the cells seeded without washing or rinsing. A repetition of the operations showed similar results, with 3 to 6 harvests per bottle.
Example 12
A similar operation to that of Example 11 was performed using attenuated measles virus. Similar excellent results were obtained in a series of operations using a washing phase before seeding the virus and in a series of operations in which this washing was omitted.
Example 13
Kidneys from African callitriches were trypsinized at 37 [deg.] C for 4 hours and placed
<EMI ID = 45.1>
comprising 0.13 units of PZI per ml. The process used was similar to that described in Examples 11 and 12.
<EMI ID = 46.1>
Croscopy showed that at least 50% of the cells were attached to the glass. Incubation was done at 37 [deg.] C because monkey kidney cells are known to be difficult to grow in tissue culture, M-199 medium with PZI was replaced with M-199 medium. fresh and PZI after 48 hours, and again 3 days later. 95% confluence was observed after an 8 day incubation,
<EMI ID = 47.1>
cells were then seeded with a live attenuated polio virus, polio virus (2), 0.4 ml of seed virus
(100 times dilution) per bottle. The cells and virus were then incubated with 100 ml of M-199 (without PZI) at <EMI ID = 48.1>
hours, titrations of 1.75-1.8 x 105 plate forming units ("PFU") per ml were obtained, these values increasing to 2.3-2.4 x 105 PFU / ml after 72 hours of 'incubation.
Example 14
In methods similar to those described above, confluent monomolecular layers of chick embryo cells were grown in M-199 with PZI for 3 days. M-199 with PZI was then replaced by M-199 (100 ml per bottle) and virus of
<EMI ID = 49.1>
After 20 days of additional incubation at 37 [deg.] C, intense proliferation of the virus was noted on observation of the cytopathological effects. The CPE was rated 4 at this time (on a scale of 0 to 4+). Cells grown similarly and infected with VSV, but using M-199 plus 2% calf serum instead of M-199 with PZI, had a CPE quality of 3. VSV titers after 20 days in
cells setting ;? to grow in M-199 with PZI were
from 1.36-2.36 x 106 PFU / ml /
Other interesting illustrative applications of the invention lie in the production of the virus of
rabies on chicken embryo cells grown in tissue culture, using serum-free medium (preferably M-199) with PZI (see patent
of the United States of America n [deg.] 3,255,080), in production
infectious canine hepatitis virus, using a swine kidney tissue culture or dog kidney tissue culture (see U.S. Patents Nos.
2.915.436 and 3.000.788), in the production of infectious bovine rhinotracheitis virus, bovine diarrhea virus and para-influenza virus (PI-3) in culture
of bovine kidney tissue (see U.S. Patent Nos. 2,941,925 and 2,934,473), in the production
influenza virus in an embryonic tissue culture
chicken, and in the production of rabies virus in bovine kidney tissue culture (see US Patent No. [deg.] 3,585,266).
CLAIMS
1. A growth medium for tissue culture comprising a growth promoting amount of protamine-zinc-insulin in dispersion.