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La présente invention est -relative à la préparation d'hormone du type de la cortine.
On sait que la cortine, est constituée par l'extrait total des capsules surrénales et que c'est une hormone de constitution complexe pouvant assurer la survie des organismes privés de surrénales et permettant de remédier aux insuffisances surrénales. C'est de ce fait .un produit thérapeutique précieux qui n'a pu jusqu'ici être produit de manière économique par suite de la petitesse des glandes d'au il est extrait, après sacrifice de l'animal.
L'invention se propose de remédier à ces inconvénients en fournissant un procédé de préparation économique d'une hormone du type de la cortine bénéfi- ciant des mêmes propriétés avantageuses pour ce qui
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concerne les insuffisances surrénales que la cortine.
Il a en effet été découvert selon l'inven- tion que le lait et la mamelle et la tétine des mammi- fères , en particulier de la vache, contiennent d'im- portantes quantités d'hormone du type de la cortine que l'on peut extraire facilement.
On se rendra compte aisément des avanta- ges de l'invention en sachant que deux à trois litres de lait contiennent autant d'hormone cortinique que celle que l'on extrait actuellement de la totalité de l'ani- mal, Par ailleurs, l'extraction de l'hormone du lait ne nécessitant pas le sacrifice de l'animal, un même animal peut fournir dans le cours de son existence une très importante quantité d'hormone, Enfin, la mamelle et la tétine fournissent une source complémentaire d'hor- mone, en plus des capsules surrénales, chez les animaux sacrifiés aux fins de boucherie par exemple.
L'extraction de l'hormone du lait et de la mamelle et de la tétine des mammifères est basée sur . la solubilité sélective de l'hormone dans les*solvants des stéroïdes miscibles à l'eau, tels que les alcools et les cétones, et notamment l'alcool éthylique et l'acé- tone, lorsque la température est basse, entre - 5 et + 2 C en particulier. A température élevée, en effet, l'hormone a tendance à se répartir entre ces solvants et les corps gras, en sorte qu'une importante partie en est perdue et ce d'autant plus que la température est plus élevée.
Le procédé de préparation de l'hormone de type cortinique suivant l'invention est donc reùarquable notamment en ce qu'il consiste à extraire le lait ou la mamelle et la tétine d'un mammifère,à basse tempé-
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rature, de préférence entre -5 et +2 C, au moyen d'un solvant des stéroïdes miscibles à l'eau, à séparer l'ex- trait ainsi obtenu et à le purifier.
L'extraction de l'hormone peut se faire au pH naturel du lait et des organes broyés (mamelle et tétine) prélevé, sur l'animal. Elle est toutefois favo- risée par.acidification à pH 4,5 à 5, qui assure une séparation de l'hormone des complexes lipoîdiques dans lesquels elle est contenue. Cette acidification peut se faire au moyen de tout acide minéral ou organique tel que l'acide chlorhydrique ou l'acide acétique.
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Pour assurer un bon contact du solvant, tel qu'un mélange d'éthanol et d'acétone,avec le produit à extraire, il convient d'agiter l'ensemble.Dans le cas où l'on part de lait, ceci provoque la formation de beurre, qui vient surnager au-dessus du petit lait con- tenant le solvant ajouté et l'hormone, Ceci assure une séparation naturelle par décantation de l'extrait cher- ché. Il faut toutefois prendre soin de. recueillir dans l'extrait la zone de séparation du beurre et du petit lait riche en hormone.
Le beurre prélevé peut être jeté ou bien livré à la consommation, lorsqu'il n'y a pas eu acidifi- cation ou que cette acidification a été faite au moyen d'acide acétique.
A remarquer que le .procédé au lieu d'être appliqué au lait entier pourrait l'être au petit lait.Ce dernier mode de mise en oeuvre, moins avantageux car une grande partie de l'hormone serait perdue dans la crème, n'en tombe pas moins sous le coup de l'invention et le terme "lait" utilisé ici vise aussi bien le lait entier que le lait écrémé.
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L'extrait obtenu, soit à partir de lait, soit à partir des organes broyés, est filtré toujours à basse température pour éliminer dans le premier cas la caséine et dans le second cas les résidus d'organes.
A partir de ce stade, la purification de l'extrait est effectuée de la même manière ,quel que soit le produit de départ.
Cette purification est basée sur des éva- porations et des reprises successives avec des solvants, chaque évaporation étant précédée d'une filtration pour éliminer les fractions insolubles. Chaque filtration doit être faite de préférence à basse température pour éviter qu'une partie de l'hormone ne passe dans le résidu.inso- lubie. Les évaporations et reprises successives sont ef- jusqu@à que l@o n' és*ldu fectuées jusqu'à ce que l'on/obtienne plus de résidu insoluble.
A titre d'exemple, les différentes reprises de l'hormone peuvent être effectuées successivement par l'acétone, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'alcool méthylique et finalement l'alcool éthylique. La solution de l'hormone dans l'alcool éthylique finalement obtenue contient 70 % de l'hormone primitivement présente. Elle peut être traitée par le réactif de Girard pour obtenir l'hormone sous forme de corticostéroïdes cristallisés.
Cette solution peut également être utilisée telle quelle après dilution à l'eau sous forme de solution buvable ou injectable, -'On peut récupérer'une grande partie de la fraction d'hormone perdue au cours des diverses opéra- tions dans les résidus solides. A cette fin ,il convient d'hydrolyser ces résidus en milieu aqueux acide de pH 2 environ, puis d'extraire la phase aqueuse au moyen de
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l'un des solvants précités. Cet extrait peut être ajouté à l'extrait principal à un stade quelconque de la puri- fication. Cette récupération est particulièrement avan- tageuse sur les résidus de l'extraction primaire.
On peut ainsi au total obtenir 0,60 à
2 mg d'hormone par litre de lait.
1.,L'exemple ci-dessous illustre un mode . de mise en oeuvre du procédé selon l'invention appliqué au lait entier.
Exemple .- a) Extraction.
On recueille immédiatement après traite
500 cm3 de lait dans un flacon jaune contenant 250 cm3 d'éthanol et 250 cm3 d'acétone pure et on acidifie à pH 4,5 avec de l'acide chlorhydrique. On agite une demi-heure et on laisse au repos au moins 48 heures à +2 C. On élimine le beurre figé que l'on jette, en ayant soin de prélever toutefois, en même temps que la phase aqueuse contenant l'alcool et l'acétone,la zone de sé- paration du beurre et du petit lait.
On filtre cette phase aqueuse pour éli- miner la caséine et autres résidus.
On reprend ces résidus trois fois avec à chaque fois un mélange de 250 cm3 d'éthanol et 250 cm3 d'acétone.Les quatre fractions éthanolo-acétoniques sont réunies (2,5. litres au total) et soumises à la purifica- tion. b)Purification.
Les extraits éthanolo-acétoniques sont évaporés rapidement au-dessous de 40 C jusqu'à obtention d'une masse pâteuse. A cette masse, on ajoute 9 volumes d'acétone (200 à 500 cm3 environ'), on agite et laisse
48 heures en glacière entre 0 et 5 C.On filtre à cette
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température* On distille rapidement à 40 C le filtrat jusqu'à siccité. Le produit sec est repris trois fois - ¯ avec 5à 10 cm3 d'acétone pure et les extraits réunis sont laissés 24 heures en glacière puis filtrés à froid:
On chasse l'acétone des extraits filtrés par distillation rapide et on reprend 2 fois le résidu par
10 cm3 d'acétate d'éthyle. On laisse l'extrait 24 heu- res en glacière et on filtre à froid.
L'extrait filtré est évaporé rapidement et le résidu repris 2 fois par 5 cm3 de chloroforme.
On laisse l'extrait 24 heures en glacière et on filtre à froid.
L'extrait chloroformique filtré est éva- poré et le résidu repris 3 fois avec 2 cm3 d'alcool méthylique.
On laisse l'extrait méthylique 24 heures en glacière, on filtre à froid et on évapore l'alcool méthy- lique.
Le résidu est repris par.2 cm3 d'éthanol absolu.La solution alcoolique diluée avec de l'eau jus- qu'à une concentration en alcool de 15 % reste stable et peut servir à l'administration du produit par voie orale ou par injection.
Bien entendu, l'invention n'est pas li mitée aux modes de mise en oeuvres décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemples.
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The present invention relates to the preparation of hormone of the cortin type.
It is known that cortin is constituted by the total extract of the adrenal capsules and that it is a hormone of complex constitution capable of ensuring the survival of organisms deprived of adrenals and making it possible to remedy adrenal insufficiency. It is therefore a valuable therapeutic product which has heretofore not been able to be produced economically owing to the smallness of the glands from which it is extracted, after sacrifice of the animal.
The invention proposes to remedy these drawbacks by providing a process for the economical preparation of a hormone of the cortin type benefiting from the same advantageous properties in terms of
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relates to adrenal insufficiency than cortin.
It has in fact been discovered according to the invention that the milk and the udder and the teat of mammals, in particular of the cow, contain large quantities of hormone of the cortin type which the one can extract easily.
The advantages of the invention will readily be appreciated by knowing that two to three liters of milk contain as much cortin hormone as that which is currently extracted from the whole of the animal. 'Extraction of the hormone from milk does not require the sacrifice of the animal, the same animal can provide a very large quantity of hormone during its existence. Finally, the udder and the teat provide a complementary source of hormone, in addition to adrenal capsules, in animals sacrificed for slaughter for example.
Extraction of the hormone from the milk and udder and teat of mammals is based on. the selective solubility of the hormone in the solvents of water-miscible steroids, such as alcohols and ketones, and in particular ethyl alcohol and acetone, when the temperature is low, between -5 and + 2 C in particular. At high temperature, in fact, the hormone has a tendency to distribute itself between these solvents and the fatty substances, so that a large part is lost and this all the more so as the temperature is higher.
The process for the preparation of the cortin-type hormone according to the invention is therefore particularly desirable in that it consists in extracting the milk or the udder and the teat of a mammal, at low temperature.
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rature, preferably between -5 and +2 C, by means of a solvent for the water-miscible steroids, to separate the extract thus obtained and to purify it.
The hormone can be extracted at the natural pH of the milk and the crushed organs (udder and teat) taken from the animal. It is, however, favored by acidification to pH 4.5 to 5, which ensures separation of the hormone from the lipoid complexes in which it is contained. This acidification can be carried out by means of any mineral or organic acid such as hydrochloric acid or acetic acid.
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To ensure good contact of the solvent, such as a mixture of ethanol and acetone, with the product to be extracted, it is advisable to shake the whole. In the case of starting from milk, this causes the formation of butter, which floats above the whey containing the added solvent and the hormone, This ensures a natural separation by decantation of the extract sought. However, care must be taken. collect in the extract the zone of separation of the butter and the whey rich in hormone.
The collected butter may be discarded or delivered for consumption, when there has been no acidification or the acidification has been carried out by means of acetic acid.
It should be noted that the .procédé instead of being applied to whole milk could be applied to whey. This last method of implementation, less advantageous because a large part of the hormone would be lost in the cream, not nonetheless falls within the scope of the invention and the term "milk" used here covers both whole milk and skimmed milk.
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The extract obtained, either from milk or from crushed organs, is always filtered at low temperature to remove in the first case the casein and in the second case organ residues.
From this stage, the purification of the extract is carried out in the same way, regardless of the starting material.
This purification is based on successive evaporation and recovery with solvents, each evaporation being preceded by filtration to remove the insoluble fractions. Each filtration should preferably be done at low temperature to prevent part of the hormone from passing into the residue. The successive evaporations and resumptions are carried out until no more insoluble residue is obtained.
By way of example, the different take-ups of the hormone can be carried out successively with acetone, ethyl acetate, chloroform, methyl alcohol and finally ethyl alcohol. The solution of the hormone in ethyl alcohol finally obtained contains 70% of the hormone originally present. It can be treated with Girard's reagent to obtain the hormone in the form of crystallized corticosteroids.
This solution can also be used as it is after dilution with water in the form of an oral or injectable solution. A large part of the fraction of hormone lost during the various operations can be recovered in the solid residues. To this end, it is advisable to hydrolyze these residues in an acidic aqueous medium of approximately pH 2, then to extract the aqueous phase by means of
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one of the aforementioned solvents. This extract can be added to the main extract at any stage of the purification. This recovery is particularly advantageous on the residues of the primary extraction.
We can thus obtain a total of 0.60 to
2 mg of hormone per liter of milk.
1., The example below illustrates one mode. for implementing the method according to the invention applied to whole milk.
Example .- a) Extraction.
We collect immediately after milking
500 cm3 of milk in a yellow flask containing 250 cm3 of ethanol and 250 cm3 of pure acetone and acidified to pH 4.5 with hydrochloric acid. Stir for half an hour and leave to stand for at least 48 hours at +2 C. The frozen butter is removed and discarded, taking care to remove, however, at the same time as the aqueous phase containing the alcohol and acetone, the zone where butter and whey separate.
This aqueous phase is filtered to remove casein and other residues.
These residues are taken up three times with a mixture of 250 cm3 of ethanol and 250 cm3 of acetone each time. The four ethanoloacetone fractions are combined (2.5 liters in total) and subjected to purification. b) Purification.
The ethanol-acetone extracts are evaporated rapidly below 40 ° C. until a pasty mass is obtained. To this mass, 9 volumes of acetone (200 to 500 cm3 approximately ') are added, the mixture is stirred and left
48 hours in a cooler between 0 and 5 C. We filter through this
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temperature * The filtrate is rapidly distilled at 40 ° C. to dryness. The dry product is taken up three times - ¯ with 5 to 10 cm3 of pure acetone and the combined extracts are left for 24 hours in a cooler and then filtered cold:
The acetone is removed from the filtered extracts by rapid distillation and the residue is taken up twice in
10 cm3 of ethyl acetate. The extract is left for 24 hours in a cooler and filtered cold.
The filtered extract is evaporated rapidly and the residue taken up twice in 5 cm 3 of chloroform.
The extract is left for 24 hours in a cooler and filtered cold.
The filtered chloroform extract is evaporated and the residue taken up 3 times with 2 cm3 of methyl alcohol.
The methyl extract is left for 24 hours in a cooler, filtered cold and the methyl alcohol is evaporated off.
The residue is taken up in 2 cm3 of absolute ethanol. The alcoholic solution diluted with water to an alcohol concentration of 15% remains stable and can be used for the administration of the product orally or by injection.
Of course, the invention is not limited to the embodiments described which have been given only as examples.