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la présente invention concerne un procédé de fabrication de vaccins antipoliomyélitiques à partir de virus vivant de polio- myélite.
Conformément à la présente invention, on soumet un fluide aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite à l'action à la fois d'un rayonnement ultra-violet et de la bêta-propiolactone, 1' action de l'un de ces agents étant suffisante pour tuer une propor- tion importante du virus vivant de poliomyélite présent dans le flui- de et celle de l'autre étant suffisante pour tuer tout le reste du virus vivant de poliomyélite présent dans le fluide, ni l'un ni 1' autre de ces agents, dans la mesure où on les utilise, n'étant sus- ceptible de tuer seul'et complètement tout le virus vivant de polio-. élite initialement présent-dans le fluide.
L'ordre dans lequel on
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utilise les deux agents n'est pas critique, c'est-à-dire que l'on peut soumettre le virus tout d'abord à l'action du rayonnement ul- tra-violet puis à l'action de la béta-propiolactone; l'ordre de traitement inverse est également satisfaisant. On peut également mettre les deux traitements en oeuvre simultanément.
Le vaccin obtenu par ce procédé est.non seulement exempt de virus vivant de poliomyélite, mais il possède encore un degré de pouvoir antigène plus élevé qu'un vaccin fabriqué par le procédé connu d'inactivation par le formaldéhyde. Il présente l'avantage @ supplémentaire, à l'opposé du vaccin tué au formaldéhyde, que le virus de poliomyélite tué et présent dans le vaccin ne montre au- cune tendance à se réactiver lors du stockage.
Ce vaccin présente un autre avantage qui réside dans le fait que l'agent chimique au- quel on a recours pour son obtention, à la différence d'autres agents chimiques tels que le formaldéhyde, se détruit lui-même lors du stockage, en se décomposant facilement en sous-produits inoffensifs
L'invention est applicable aux différents types de virus poliomyélitiques, à savoir les, types 1, 2 et 3. Dans la mise en pra- tique de la présente invention, on peut utiliser comme matière pre- mière des mélanges de ces trois types, mais en général on traite se parement chaque type de virus et le vaccin ainsi obtenu est combi- né par la suite avec le vaccin ou les vaccins préparés à partir de l'autre ou des autres types de virus.
On peut obtenir commodément le fluide aqueux'contenant le virus de poliomyélite vivant auquel on a recours comme matière première du procédé à partir d'un tissu servant de milieu de cultu- re dans lequel le virus poliomyélitique s'est accru ou s'est multi- plié.On peut isoler le fluide par n'importe quel moyen convenable, par exemple par filtration, décantation, centrifugation, etc. Il est commode d'utiliser un filtrat de culture sur tissu provenant d' un milieu connu sous le nom de milieu de culture sur tissu "199", porteur de virus poliomyélitique.
Un exemple d'un tel fluide de ,culture sur tissu est celui obtenu par filtration d'une culture de
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virus poliomyélitique sur tissu de rein de'singe, obtenue comme il est décrit par Dulbecco et autres dans le "Journal of Expérimental Medicine" Volume 99,page 167, (1954). Selon ce procédé on soumet des tissus de rein de singe macères à l'action de la trypsine en vue d'en séparer les tissus étranger.s. on laisse les cellules rési- duelles se multiplier, on inocule les milieux à l'aide de virus po- liomyélitique, on fait incuber le mélange et on recueille le fluide.
Bien que ce procédé soit celui que l'on préfère, on peut si on le d, sire omettre le stade de traitement par la trypsine. Dans ce dernier cas, toutefois, la teneur en protéine du vaccin peut être excessive, ment élevée et il convient de l'essayer avant usage afin d'éviter la production de vaccins pouvant,donner des réactions aux protéines, Dans la fabrication de vaccins mixtes, c'est-à-dire de vaccins con- tenant plus d'un type de virus de poliomyélite, il est permis de mettre en commun ou de mélanger les fluides recueillis contenant les divers types de virus avant de mettre en oeuvre le procédé de la pre sente invention, mais comme on l'a indiqué ci-dessus, il est généra/ lement préférable de mettre en,commun ou de mélanger les vaccins in- dividuels après la mise en oeuvre du procédé.
En pratique, on a in- térét à employer une matière première à base de virus possédant un pouvoir antigène élevé et c'est pourquoi il convient que le titre d'infectiosité du fluide aqueux soit d'ordre élevé, c'est-à-dire au moins égal à 10-5. On utilise en général un fluide ayant un ti- tre d'infectiosité de l'ordre de 10-8 ou plus. Dans des conditions normales de stockage, on conserve le fluide aqueux en le soumettant à une réfrigération, par exemple à une température comprise entre -5 et 10 C. Lorsqu'il est traité ultérieurement, conformément à 1' invention, le fluide se réchauffe, suivant les conditions de tempé- rature utilisées au cours du traitement.
Le fluide aqueux contenant le virus'poliomyélitique vivant est en général produit dans des con- ditions aseptiques, ce que l'on assure en soumettant le milieu à une filtration bactérienne avant de l'appliquer dans le procédé. En ou- tre, on peut concentrer et (ou) partiellement purifier le virus vi-
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vant et employer de telles solutions comme matières premières pour le procédé. On comprendra que par raison de commodité, de telles solutions se trouvent englobées dans l'expression "fluides aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite" telle qu'on l'utilisera dans la présente demande.
¯Comme il a été indiqué précédemment, on met l'invèntion en oeuvre en soumettant le fluide ,contenant le virus à l'action du rayonnement ultra-violet et de la béta-propiolactone. On met en oeu- vre la phase du procédé correspondant à l'irradiation par l'ultra- violet en exposant une mince pellicule ou un mince courant du flui- de aqueux contenant du virus de poliomyélite vivant à de la lumière ultra-violette dont la longueur d'onde est comprise entre 2000 et 3000 angstrbms et dont l'intensité est suffisamment forte pour ré- duire le titre d'infectiosité à une valeur extrêmement basse en un court espace de temps, ou bien lorsqu'on a recours, conformément à la présente invention, à un fluide déjà exposé à la bêta-propiolac- tone,
suffisamment fort pour réduire le titre d'infectiosité à zé- ro en un court espace de temps. Pour garantir les résultats désirés, il convient en général que l'épaisseur moyenne de la pellicue ou du courant qui est exposé ne soit pas supérieure à 100 microns et soit de préférence inférieure ou égale à 50 microns. On peut utiliser une épaisseur un peu supérieure à 100microns, mais dans ce cas on a besoin de durées d'exposition plus longues et en conséquence il en,résulte également une perte plus grande du pouvoir antigène.
Il convient que la source de lumière ultra-violette utilisée contien- ne une proportion élevée, de préférence s'élevant jusqu'à 95%, d'é- nergie ayant une longueur d'onde de 2537 angstrbms. Les sources de lumière émettant une proportion un peu plus faible d'énergie à cet- te longueur d'onde désirée sont satisfaisantes mais moins efficaces.
Pour obtenir les meilleurs résultats, on utilise une source de lu- mière uniforme émettant 95% de son énergie pour une longueur d'on- de de 2537 angströms, et ayant une puissance totale réelle de 10 à 25 watts. On utilise commodément la source lumineuse à une distance
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d'environ un centimètre de la surface du milieu aqueux à exposer.
Pour des besoins ordinaires, il convient que l'intensité de rayon- nement de la source de lumière soit telle qu'elle fournisse de 12.500 à 32.000 micro-watts environ par centimètre carré de surfa- ce de la pellicule soumise à l'exposition. Lorsqu'on a recours comme matière première à un fluide aqueux contenant du virus et ayant un titre d'infectiosité compris entre 10-5 et 10-8 et que l'on a re- cours aux conditions d'irradiation indiquées, une proportion extrê- mement élevée d'organismes vivants est tuée en l'espace de quelques secondes d'exposition. On peut faire varier considérablement la du- rée d'exposition, mais en général il est avantageux de réduire au minimum cette durée d'exposition afin d'éviter toute destruction excessive du pouvoir antigène inhérent au virus.
On préfère adopter une durée d'exposition inférieure à 10 secondes, et pour obtenir les meilleurs résultats, une durée de 0,5 à 2 secondes. Par exem- ple, lorsqu'on utilise de la lumière ultra-violette dont la longueur d'onde ést de 2637 angströms avec une intensité d'environ 25.00 0 micro-watts par centimètre carré; l'exposition pendant une seconde du fluide contenant le virus vivant sous la forme d'une pellicule ayant une épaisseur moyenne de 50 microns réduit le titre d'infec- tiosité de 10-7 jusqu'à environ 10-1. En général, il convient que les conditions d'exposition soient telles que le titre d'infec- tiosité soit réduit à une valeur comprise entre 10-0,5 et 10-2,5.
Pour la mise en pratique de la présente invention, le dispositif que l'on préfère est un appareil centrifuge de formation de pellicules du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n02.725.482 du 29 novembre 1955. Ce dispositif est constitué de plusieurs par- ties à savoir : tube ou un godet cylindrique légèrement conique et que l'on peut faire tourner, ayant environ 40 cm de longueur et pré- sentant une inclinaison vers l'extérieur de 1 à partir de l'extré- mité fermée.constituant le fond et un diamètre intérieur de 9,5 cm au sommet; des moyens pour faire tourner rapidement le godet ; un tube d'amenée suspendu au centre du godet et dont l'orifice est
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placé près du fond du godet;
six lampes à a.ltra-violet ayant appro- ximativertient 30 cm de longueur efficace;, suspendues dans le godet, entourant le tube d' ,1enÉe et disposées de telle sorte que leur sur- face externe soit à environ 1 cm de laparoi intérieure du godet; et un récipient convenable entourant le sommet du godet en vue de recueillir et d'évacuer le fluide qui est refoulé du sommet du go-
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det lorsque celui-ci tourne rb9id ent pendant le fonctionnement du dispositif.
En fonctionnement;; on introduit le fluide à irradier
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par le tube d3ainenc-e dans le fond du godet en rotation rapide et il se trouve refoulé vers l'extérieur et dans une direction ascendante sous la forme d'une pellicule en regard des lampes à ultra-violet.
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La pellicule de liquide est co;tin:el,le31ent repoussée vers le haut par l'introduction d'une nouvelle quantité de matière arrivant par le tube d'amenée jusqu'à ce que finalement elle se répande dans le récipient entourant le sommet du godet et soit recueillie. Un au- tre dispositif qui convient a été décrit dans le brevet des Etats-
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Unis dAmérique n 2.5.''l26 du 11 mars 1952.
On comprendra que tout autre dispositif comparable pour l'exposition de pellicules ou de courants de faible épaisseur à la lumière ultra-violette pendant de courts espaces de teups pourra. convenir pour la mise en pratique de l'invention.
La température du fluide aqueux pendant l'irradiation n'
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est pas critique. A moins d'appliquer de la chaleur ertr-rieure, le fluide sera ordinairement à une température inférieure ou égale à la température ambiante. Toutefois, on obtient des résultats sa- tisfaisants lorsque l'or¯ effectue l'irradiation sur des fluides aqueux ayant une température supérieure, 3'7 à 40 C par exerlpi e.
Dans la phase du procédé où l'on a recours à la bâta-
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propiolactone, il convient que la quantité de béta-propiolactone à appliquer soit inférieure a ce?le nécessaire pour tuer complète- ment tout le virus de poliomyélite vivant se trouvant dans le flui de aqueux non traité.
Dans ce but, lorsqu'on utilise des fluides
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aqueux contenant du virus et dont le titre est coltipris dans la gaz-
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me de ceux auxquels on a recours ordinairement dans la fabrication des vaccins antipoliomyélitiques la quantité de béta-propiolactone à laquelle onarecours est ordinairement comprise entre 0,0002 et 0,0010 gramme et de préférence entre 0,0004 et 0,0006 gramme par millilitre de fluide contenant du virus. Dans les cas où on emploie la bêta-propiolactone en plus grande quàntité, l'excès restant après l'inactivation de virus peut être.aisément décomposé par chauffage.
Dans la mesure où il a été possible de le déterminer cha cun des typesde virus de poliomyélite-exige 'L'application d'environ les mêmes concentrations de bêta-propiolactone. Du fait de la sen- sibilité aux acides et aux alcalis de la protéine qui se trouve dans le fluide aqueux auquel on a recours comme matière première, on met de préférence le procédé en oeuvre à une valeur du pH comprise en- tre 5 et 9, et pour obtenir les meilleurs résultats comprise entre 7,5 et 8,5. La température à laquelle on effectue cette phase du . procédé n'est pas critique et on peut la faire varier largement.
Pour une température relativement basse, la vitesse d'inactivation est faible., par exemple à une température de 4 C, on a besoin d' une période de 24 à soixante douze heures pour 1'inactivation. Par conséquent, il est préférable d'effectuer cette phase du procédé à la température ambiante ou à une température supérieure.
La tempe- rature optimum est d'environ 37 C et quoique l'on puisse effectuer cette phase du procédé à une .température plus élevée., le produit final a tendance à cette température plus élevée à perdre de maniè- re indésirable son pouvoir antigène* -En conséquence, il est avanta- geux d'opérer à une température comprise entre 20 et .0 C. La. réac- ti.on qui a lieu par suite du traitement par la bêta-propiolactone est à la fois irréversible et rapide. Le produit contenant le vi- rus est "fixé" en ce qui concerne la destruction des virus, c'est-à dire que,le virus n'a pas de retour de virulence après stockage, dilution ou autre traitement.
Le virus est ordinairement tué com- plètement en l'espace de deux heures ou moins à une température de 37 C. Il est important que la bêta-propiolactone que l'on utilise
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soi'.:, fraîche. Il ne faut pas avoir recours a de la béta-prcpiolac- tone qui n' a pas été stockée en étant soumise à une réfrigération ou bien que l'on a. laissée venir au C 4......+- d= !''''')P-''1.l..L. La. bêts- susceptible d'être obtenue dans le CC¯!L:e:::ce sous .:'or- -.;e purifiée est satisfaisante.
La. description qui procède a, éo4 li-=".-itse dans un but d e si r lßc; t au trite.ient des fluides aqueux contenant du virus poliomyélitique co¯.iolFtenent virule.t, Toutefois, on cO.,19ren:lra que la description qui procède s'applique avec autant de.force à des fluides qui ont dé;]à 4té sowiis à une inactivation partielle ou dans lesquels le virus a déjà été partiellement tué.
La demanderesse a constate que l'on obtient les résul- tats les plus réguliers si l'on soumet le fluide aqueux initial con
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tenant le virus poliomyélitique vivant soit à une filbration bacté- rienne par exemple une filtration de Seit, soit à une filtration
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sur du verre fritte extrêmeuent fin, avant l'irradiation ou le traiteinent par la bêta-propiolactonet
Si on le désire, on peut incorporer dans les vaccins ob- tenus par le procédé de l'invention des agents germicides et (ou) stabilisants.
Par exemple, on peut ajouter du chlorure de benzetho- niu.n dans les vaccins 'obtenus jusqu'à une concentration d'environ 1 : 20.000à 1 : 50.000 et de préférence une concentration de 1: 40.000
Les vaccins obtenus par le procédé de l'invention ne con-
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tiennent pas de virus polio:ny41itique vivant. Ils sont également sté- riles sous tous les autres rapports c'est--à--dire au'ils ne contien- nent pas de bactéries, de levures ou de moisissures vivantes. Les produits obtenus sont susceptibles après avoir été administrés à des ères sensibles à une contamination par le virus poliomyé-
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liticue vivant, de produire une ii*iunit4 du Elammifere contre une contanination par le virus vivant correspondant.
Le terme Il adminis... trer" tel qu'on l'utilise dans la présente demande signifie une in- jection sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire. On peut a- vour recours aux vaccins obtenus soit pour la fabrication d'autres
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vaccins contre les virus poliomyélitiques tels que les vaccins de virus précipités par l'alun ou par le phosphate d'aluminium, ou bien on peut les administrer à des mammifères afin de les immuni- ser, On peut, si on le'désire, administrer les produits sans les diluer;. mais si leur activité est supérieure aux exigences des essais normalisés, on peut les diluer à l'aide d'une quantité rai- sonnable d'un milieu aqueux stérile convenable.
Comme exemples de diluants convenables, on peut citer la solution stérile de Hank, de l'eau salée stérile et l'eau distillée stérile.
L'invention est illustrée par les exemples suivants EXEMPLE 1. -
On prépare des cellules destinées à la culture du virus poliomyélitique par le procédé de Dulbecco défini dans le "Journal of Expérimental Medicine, 92, page 167 (1954)". En résumé, ce mode opératoire consiste à préparer tout d'abord une suspension de cel- Iules épithéliales de rein de singe (voir Dulbecco, Proc. Nat. Acad Sci. 38, page 747 (1952) ) en traitant un tissu macéré de rein de singe provenant de singes Cynomolgus ou Rhesus bien portants, par de la trypsine en vue d'éliminer la matière étrangère et de libérer les cellules individuelles.
On laisse ces cellules se multiplier sur une surface de verre convenable dans n'importe lequel d'un cer- tain nombre de milieux de culture de tissus tels que le milieu 11199 On inocule ensuite la couche de cellules de rein ainsi obtenue à l'aide d'une culture d'ensemencement du virus poliomyélitique du ty- pe 1 (souche Mahoney) et on fait incuber le mélange à une températu- re de 36 - 37 C jusqu'à ce que la destruction des cellules soit com- plète et que l'on ait libéré de grandes quantités de virus nouveau, On.recueille le fluide contenant le virus et on le fait passer à travers une bougie en verre fritte extrêmement fin. On essaie le filtrat contenant le virus poliomyélitique vivant du type 1 en ce qui concerne, sa teneur en virus, sa stérilité bactérienne et la pu- reté de souche.
D'une. manière analogue., on prépare un filtrat con- tenant du virus vivant du type 2 (souche MEF-l) et un filtrat con-
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tenant le type 3 (souche Saukett) ).
On refroidit à 4 C quatre litres du filtrat contenant du virus poliomyélitique du type 1 et ayant un titre d'infectiosité de 10-6,et on y ajoute, tout en agitant, 20 ml d'une solution aqueu- se à 10% contenant 0,115 g/ml de bêta-propiolactone. On laisse repo. ser à cette température pendant deux heures la solution ainsi obte- nue, qui contient 0,0005 g/ml de bêta-propiolactone et on la fait ensuite passer à travers un appareil centrifuge de formation de 'pelliculé., à la vitesse de 600 ml à la minute'en l'exposant à un rayonnement ultra-violet ayant une.puissance de 25 watts.
Le dis- positif centrifuge de formation de pellicule que l'on utilise, qui appartient au type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2.725.482 précité et qui est fabriqué par la "Research Laborato- ry Division" de la General Motors Corporation, Detroit, Michigan., comprend une chambre cylindrique en forme de godet disposée verti- calement, susceptible d'être mise en rotation, des moyens pour fai- re tourner la chambre à une vitesse de fonctionnement normale de 1700 tours à la minute, et un ensemble tubulaire formé de six lam- pes à ultra-violet régulièrement réparties et disposées axialement à l'intérieur de la chambre.
Le diamètre intérieur du bord supé- rieur de la chambre est approximativement de 9,5 cm et la paroi intérieure de la chambre est inclinée vers l'intérieur à partir du sommet,la pente étant de 1 par rapport à la verticale. La hau- teur verticale de la paroi intérieure de la chambre est approxima- ' tivement de 40 cm.
La surface extérieure de l'ensemble de lampes se trouve à une distance de 1 cm de la paroi intérieure de la cham- bre et l'intensité efficace du rayonnement ultra-violet sur la sur- face intérieure de la chambre est approximativement de 25.000 micro- watts par centimètre carré. L'épaisseur moyenne de la pellicule de la solution exposée à l'irradiation est approximativement de 75 mi-' crons et la durée to tale d'exposition est d'une seconde.
A la suite de cette exposition combinée, il n'y a aucun virus-vivant résiduel susceptible d'être détecté dans la solution par une titration du
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du type courant avec du tissu de rein de singe ti tratton dans la-- quelle on en'3cnenee dix échantillons da o,5 5 i:J¯ et on les conserve pendant sept jours. Toutefois,> des traces de virus vivant peuvent être présentes? ceci peut être démontre par un essai de sécurité par ('O};'.21.1p1e P e8;:::ai normalisé de sécurité exposé dans le document iÎ:.Fii;5-;zu#.i He(lUireme"nts of Polio;"11yéli tis 'Vaccine" publié le 11 novem- bre 1955 par le Ministère de la Santé Publique des Etats-Unis d'
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2.l(;rlQueQ On fait ensuite incuber la solution irradiée à une tem- pérature de 37 C pendant trois heures.
A la suite de l'incubation)! la solution est conrplëteinent exempte de virus poliomyélitique vi- ,,r.:'2t C0Jr:::e y ':LIld 3. ;1.1e le résultat négatif obtenu dans l'essai de sécurité, L'essai de sécurité utilisé est une variante de l'essai normalisé que l'on vient de citer variante dans laquelle on ense-
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}1",en..ce chacune de dix 'bouteilles contenant le milieu mutritif de culture de tissu à l'aide d'une partie aliquote de 50 ml du vaccin
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et on les conserve dans des concU tons favorables à la croissance du vicus pendant 32 jours. L'absence de croissance du virus indique que le vaccin est sûr.
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De la. même 1namère, on prépare deux autres lots de vacciij à base de virus poliomyélitique tué à partir de souches différentes de vrus.'l 1.'un des lots provenant de la souche du type 2 (FIEF-1) et l'autre provenant de la souche du type 3 (souche Saukett) Sous tous les autres rapports, la préparation de ces deux lots de vac- cin est identique à la préparation du vaccin ci-dessus contenant la souche tuée du type 1; ces vaccins sont également exempts de vi. rus vivant de poliomyélite comme on peut le mettre en évidence .par le procédé de tressai de sécurité cité ci-dessus.
Les trois vaccins (des types 1, 2 et 3) possèdent un pou- voir antigène d'un ordre élevé et on peut les utiliser de manière convenable soit seuls soit en combinaiÇon, ou bien on peut les di-
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l-'aen> à 19 aide éi" eau salée stérile ou de solution de Hank stérile, comme on le désire)) en vue de réaliser des vaccins moins concentrés,;,
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On peut déterminer de la manière suivante le pouvoir antigène des vaccins obtenus. On prépare une gamme de dilutions progressives du vaccin. On répartit par groupes de cinq à dix de jeunes poussins (vieux de sept à dix jours) chaque groupe devant recevoir par injection individuelle intramusculaire une des dilu- tions préparées.
On inocule alors à chaque poussin deux doses de 0,5 ml du vaccin à deux semaines d'intervalle. On saigne ensuite les poussins une semaine après la denière injection, on sépare le sérum du sang et on l'essaie séparément pour rechercher la présen- ce d'anticorps spécifique à un faible taux de dilution (1 : 4).
Dans cet essai, on oppose un volume de 0,25 ml du sérum dilué à un volume égal de fluide de culture sur tissu contenant de 10 à 1000 doses infectieuses à 50% en culture sur tissu (TCID50) du type par- ticulier de virus de poliomyélite dont on doit rechercher les anti- corps dans le sérum. Au mélange de ces deux volumes placé dans un récipient convenable, on ajoute 0,25 ml de cellules de rein de sin- ge trypsinisées en milieu nutritif, la concentration étant de 240. 000 cellules par ml. On fait ensuite incuber tout le mélange dans des conditons favorables à la croissance des cellules et du virus. Sept jours après, on examine ces cultures de tissus au mi- croscope pour déceler la dégénérescence cytopathique résultant de la oroissance du virus.
Celles des cultures qui ont été protégées du virus qui leur a été opposé par les anticorps du sérum particu- lier ne manifestent pas cette dégénérescence. On peut déterminer le taux de dilution en antigène 50% ou "titre de dilution antigène" à partir des sérum apportant une protection et provenant de pous- sins ayant reçu l'inoculum à la dilution maximum. On peut calculer commodément ce résultat par le procédé de Reed and Muench relaté dans le périodique "American Journal of Hygiene". Volume 27, page 493- 497 (1938) et exposé sous une forme modifiée dans le livre d'es- sais normalisés "Viral and Rickettsial Infections. of Man", River, pages 75 et 78, J.B.
Lippincott Company. Cette détermination ré- vèle la mesure -suivant laquelle on peut diluer la préparation d'
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antigène pour susciter la formation d9antîcorps chez 50% des poussins recevant la dilution dinoculum. Etant donné que la concentra- tion de la dose opposée dans l'essai de neutralisation par le se- peut avoir une certaine influence sur la valeur numérique du ti- tre de dilution antigène,1} on indique ci-après la dose opposée de ma-
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nière à faire ressortir 1importance propre de la valeur de cette dose pour le titre de dilution antigène.
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Dans le tableau 1 ci-dessous. on donne les résultats de la détermination du pouvoir antigène des vaccins obtenus par le procédé el.-dessus, que leoli peut comparer avec ceux des filtrats non traites contenant le virus vivant auquel on a recours comme ma- tière première.
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-TABLEAU.¯¯.,¯-
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<tb> Echantillon.soumis <SEP> à <SEP> ).il <SEP> essai <SEP> Titre <SEP> de <SEP> Concentra.,
<tb>
<tb> dilution <SEP> tion <SEP> de <SEP> la <SEP>
<tb>
<tb> antigène <SEP> dose <SEP> oppo-
<tb>
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s (TCID 5.Q1'
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<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 1 <SEP> obtenu <SEP> par <SEP> traitement <SEP> par
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.,05.% de bêta-propiolactone et par la l1:
ul1iè- -" 08
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<tb> re <SEP> ultra-violette' <SEP> 10-, <SEP> 204
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité <SEP> contenant <SEP> du.. <SEP> virus <SEP> po- <SEP> 2,33
<tb>
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l:J.omyéJ:ltique vivant (type 1) lO.2;3.3 204
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<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 2 <SEP> obtenu <SEP> par <SEP> traitement <SEP> par
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<tb>
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<tb> 0,05% <SEP> de <SEP> bêta-propiolactone <SEP> et <SEP> par <SEP> la <SEP> lumiè- <SEP> 2,5
<tb>
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<tb>
<tb> re <SEP> ultra-violette <SEP> (type <SEP> 2) <SEP> 10- <SEP> 32
<tb>
<tb>
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<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité <SEP> contenant <SEP> du <SEP> virus <SEP> vivant
<tb>
<tb>
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<tb> de <SEP> poliomyélite <SEP> (type <SEP> 2) <SEP> 10-3,
0 <SEP> 32
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<tb>
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<tb> Vaccin <SEP> de <SEP> type <SEP> 3 <SEP> obtenu <SEP> par <SEP> traitement <SEP> par
<tb>
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01!051b de bêta-propiolactone et par la l'amie" -1 6'2
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<tb> re <SEP> ultra-viclstte <SEP> 10-1, <SEP> 58
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité <SEP> contenant <SEP> du <SEP> virus <SEP> de <SEP> po- <SEP> 2,5
<tb>
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11omyél1te vivant (type 3) 10-"',!I 58
Le pouvoir antigène des produits reste à un niveau élevé pendant de longs espaces de temps,, Ceci est mis en évidence dans le cas des vaccins sus-mentionnés (des types le 2 et 3) après un stoc- kage de six mois dans des conditions de réfrigération.
A la fin de la période de stockage, on dilue chacun des produits avec trois vo-
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lwàes de solutions stériles de Hank on met en comlnun. les troïp, sa-
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lutions résultantes et on détermine le pouvoir antigène de ce mélan- ge. On effectue cette détermination non seulement au moyen de l'es- sai sus-mentioné sur les poussins-qui indique le titre de dilution antigène, mais également par un essai classique en utilisant des singes commeanimaux d'essai au lieu de poussins. Les détails de cet essai sont exposés dans le document "Amendment Number 2 to the Mini- mum Requirements of Poliomyélitis Vaccine" publié le 20 mai 1954 par le Ministère de la Santé Publique des Etats-Unis d'Amérique.
En ré- sumé, on effectue cet essai de la façon suivante On inocule des singes Rhésus à l'aide de trois doses de 1 ml du vaccin à des in- tervalles d'une semaine, on saigne les animaux une semaine après la fin de la série d'inoculations, on prépare un sérum à partir du sang recueilli et on détermine le nombre d'anticorps présents dans le sérum.
On procède à cette détermination en effectuant une série de dilutions du sérum à l'aide d'eau salée, et en mélangeant les parties aliquotes diluées ainsi obtenues avec une solution normali- sée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du type donné de virus poliomyélitique, Par exemple si l'on procède à la détermi- nation de l'activité du sérum vis-à-vis du virus du type 1, on a recours à une solution normalisée contenant un nombre connu d'uni- tés infectieuses de virus de poliomyélite du type 1; pour effectuer la détermination en ce qui concerne le type 2 ou le type 3, on a re- cours à une solution normalisée de germes infectieux de virus de ty- pe 2 ou 3.
Le point final de la titration est la dilution pour la- quelle le sérum contient suffisamment d'anticorps pour neutraliser exactement le nombre connu d'unités infectieuses de virus se trou- vant dans la solution normalisée, c'est-à-dire pour se combiner avec elles et les rendre non infectieuses. On a recours à un certain nom- bre de singes pour l'analyse de l'activité pour chaque type de virus poliomyélitique. Etant donné que le titre géométrique moyen dépend du pouvoir de l'activité de la solution normalisée'du virus polio- myélitique infectieux à laquelle on a recours dans l'essai, il est nécessaire de préciser le nombre d'unités infectieuses de virus de
<Desc/Clms Page number 15>
poliomyélite présentes dans la solution normalisée pour préciser la signification propre du- titre géométrique moyen.
Le procédé de cal- cul du titre géométrique moyen est exposé en détails dans le docu- ment "Amendement Number 2 of the "Minimum Requirements of Poliomyé- litis Vaccinelt publié le 20 mai 1954 par le Ministère de la Santé Publique des Etats-Unis d'Amérique.
On détermine également le facteur d'activité sur le singe pour chaque type de virus: cette détermination comporte une compa- raison avec le titre géométrique moyen du sérum de référence des Etats-Unis d'Amérique (IIA-1) du National Institutes of Health". Les résultats de ces déterminations sont exposés dans le tableau II qui suit : TABLEAU 11.
EMI15.1
<tb>
Essai <SEP> sur <SEP> les <SEP> 'poussins. <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> les <SEP> singes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Type <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Facteur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> de <SEP> de <SEP> di- <SEP> tration <SEP> géomé- <SEP> tration <SEP> d'activi.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> essayé <SEP> virus <SEP> lution <SEP> de <SEP> la <SEP> trique <SEP> de <SEP> la <SEP> té <SEP> sur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> antigè- <SEP> dose <SEP> moyen <SEP> dose <SEP> les <SEP> sin-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ne <SEP> opposée <SEP> opposée <SEP> ges
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (TCID50) <SEP> (TCID50)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> mélangé <SEP> 1 <SEP> 10-1,2 <SEP> 24 <SEP> 83 <SEP> 53 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> les
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> types <SEP> 1,
<SEP> 2 <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> de <SEP> virus <SEP> 2 <SEP> 10-1,5 <SEP> 27 <SEP> 63 <SEP> 68 <SEP> 1,27
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> poliomyéli-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> te <SEP> tues <SEP> par <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,05% <SEP> de <SEP> bêta-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> propiolactone
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et.
<SEP> par <SEP> la <SEP> lumiè- <SEP> 3 <SEP> 10-1,4 <SEP> 22 <SEP> 33 <SEP> 36 <SEP> 0,47
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> re <SEP> ultra-violet-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> te, <SEP> et <SEP> conservé
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pendant <SEP> six <SEP> mois
<tb>
* Pour un type de virus particulier, on calcule le facteur d'activité sur le singe en divisant le titre géométrique moyen du sérum inoculé au singe soumis à l'essai par le titre géométrique moyen du sérum de reférence IIA-1 (Na- tional Institutes of Health) en ce qui concerne le même type de virus.
Les fa.cteurs minimum acceptables pour le singe pour les divers types de virus poliomyélitique' sont: Type 1-0,29; Type 2-0,25 et Type 3-0,16. Des détails supplémentaires, sont donnés dans "Minimun Requirements of Poliomyélitis Vaccine" publié le 11 novem- bre 1955, par le Ministère de la Santé Publique des Etats-Unis d' Amérique.
<Desc/Clms Page number 16>
Il ressort du tableau ci-dessus qu'après un stockage de six mois.le vaccin n'est pas altéré de manière importante en ce qui concerne le pouvoir antigène ou l'activité. Il convient d'indiquer que les titres des dilutions antigènes des vaccins des tableaux I et II susceptibles d'être composés sont différents, mais que ceci est dû en grande partie au fait que le vaccin du tableau II a été dilué au douzième. Il est important que l'activité du vaccin, après un stockage prolongé, dépasse les normes officielles pour chaque ty- pe de virus, et ceci très largement.
Bien que l'on ne connaisse pas les causes des qualités inhabituelles de conservation que présen- tent les vaccins obtenus par le procédé de la présente invention, on suppose que ces qualités sont dues au moins en partie au fait que l'agent chimique d'inactivation, à savoir la bêta-propiolacto- ne, se distingue des.autres agents chimiques tels que le formaldé- hyde, par une dégradation rapide, sans précautions spéciales, en se transformant en sous-produits inoffensifs qui sont.compatibles avec les facteurs antigènes du vaccin et n'ontpas d'influence nuisible sur eux.
EXEMPLE 2.-
Sur un filtre en verre fritté extrêmement fin, on filtre un milieu aqueux contenant du virus poliomyélitique vivant du type 1 (14àhoney) (titre d'infectiosité 10-6), préparé comme il est dé- crit dans l'exemple 1. Dans quatre litres du filtrat, on verse 20 ml d'une solution aqueuse à dix pour cent de bêta-propiolactone, (contenant 0,115 gramme de bêta-propiol.actone par millilitre).
On chauffe pendant deux heures à 37 C le mélange ainsi obteu, qui con- tient 0,0005 gramme de bêta-propiolactone par millilitre, et on fait ensuite passer la suspension ainsi obtenue qui a un titre d' infectiosité inférieur à 10-0,1, à travers un appareil centrifuge pour la'formation de pellicules suivant un débit de 600 ml à la minute., en .exposant ledit mélange à un rayonnement ultra-violet dont la puissance est de 25 watts, et en ayant recours au disposi- tif et au procédé décritsdans l'exemple 1. L'épaisseur de la pelli-
<Desc/Clms Page number 17>
cule pendant l'exposition est approximativement égale à 50 microns et la durée d'exposition est légèrement inférieure à une seconde.
On filtre à nouveau la solution de virus ainsi obtenue sur un filtre en verre fritté extrêmement fin et on en soumet un échantillon à un essai de sécurité, comme il est décrit dans l'exemple 1. A ce stade le vaccin ne contient pas de virus vivant, ce qui est indi- qué par un résultat négatif obtenu dans l'essai de sécurité.
On prépare de la même manière deux autres lots de vac- cins tués de virus de poliomyélite à partir de différentes souches de virus, l'un des lots provenant de la souche du type 2 (MEF-l) et l'autre de la souche du type 3 (Saukett). Pour le reste, on a re- cours au mode opératoire utilisé pour le vaccin ci-dessus contenant la souche tuée du. type 1; ces vaccins sont également exempts de vî- rus poliomyélitique vivant.
Les trois vaccins ainsi obtenus (types 1, 2 et 3) pos- sèdent un pouvoir- antigène d'un ordre élevé et peuvent être utili- sés de manière convenable soit seuls, soit en combinaisons, ou bien on peut les diluer soit à'l'aide d'une solution saline stéri- le, soit avec une solution stérile de Hank, à volonté, de manière à obtenir des vaccins moins concentrés.
.Un détermine le pouvoir antigène des trois lots de virus en fonction du titre de dilution antigène, du. titre géométrique moyen et du facteur d'activité sur le singe, en opérant conformé- ment aux procédés. exposés dans l'exemple 1. Dans le tableau III ci- dessous, on donne les résultats de la détermination du pouvoir an.- tigène ainsi obtenu, que l'on rapproche des résultats comparables obtenus pour des filtrats non traités contenant le virus vivant au- quel on a recours comme matière première.
<Desc/Clms Page number 18>
TABLEAU III.
EMI18.1
<tb>
Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> poussins <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> singes
<tb>
<tb>
<tb> Titr% <SEP> de <SEP> Concen- <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Facteur
<tb>
<tb>
<tb> dilution <SEP> tration <SEP> géomé- <SEP> tration <SEP> d'activi-
<tb>
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> antigène <SEP> de <SEP> la <SEP> trique <SEP> de <SEP> la <SEP> té <SEP> sur <SEP> les
<tb>
<tb>
<tb> traité <SEP> dose <SEP> moyen <SEP> dose <SEP> singes
<tb>
<tb>
<tb> opposée <SEP> opposée
<tb>
EMI18.2
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ (TCTD - (TCIDS
EMI18.3
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traite-
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> par <SEP> 0,05% <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bêta-propiolactone
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> par <SEP> la <SEP> lumière <SEP> 2.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ultra-violette <SEP> 10-2,
0 <SEP> 204 <SEP> 525 <SEP> 43 <SEP> 13,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> poliomyélitique <SEP> vi- <SEP> -2,33
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vant <SEP> du <SEP> type <SEP> 1 <SEP> 10-2,33 <SEP> 204 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traite-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> par <SEP> 0,05%.de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bêta-propiolactone
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> par <SEP> la <SEP> lumière <SEP> 2.8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ultra-violette <SEP> 10-2,8 <SEP> 32 <SEP> 141 <SEP> 32 <SEP> 1,
18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> poliomyélitique <SEP> vi- <SEP> 10-3,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vaut <SEP> du <SEP> type <SEP> 2 <SEP> 10-3,0 <SEP> 32- <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traite-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> par <SEP> 0,05% <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bêta-propiolactone
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> par <SEP> la <SEP> lumière <SEP> ' <SEP> 1.67 <SEP> 100
<tb>
EMI18.4
ultra-violette 10-l'67 58 100 L,58 145
EMI18.5
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb> poliomyélitique <SEP> vi- <SEP> -2,5
<tb>
<tb> vant <SEP> du <SEP> type <SEP> 3 <SEP> 10-2,
5 <SEP> 58 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
Il ressort du tableau III que le pouvoir,antigène des trois types de vaccins obtenus par le procédé de la présente inven, tion est sensiblement aussi élevé que celui des échantillons té- moins non traités, tout en étant bien supérieur aux normes offi- cielles minima en ce qui concerne le facteur d'activité sur les sin. ges.
On détermine également le pouvoir antigène des produits après six mois de stockage. A la fin de la période de stockage, on dilue chacun des produits à l'aide de trois volumes de solution sté rile de Hank, on mélange les 'solutions ainsi obtenues et on déter-
<Desc/Clms Page number 19>
mine le pouvoir antigène du produit mélange. Le résultat de cette détermination est exposé dans le tableau IV qui suit.
TABLEAU IV.
EMI19.1
<tb>
Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> poussins <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> singes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Type <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Fac-
<tb>
<tb>
<tb> essayé <SEP> de <SEP> de <SEP> di- <SEP> tration <SEP> géomé- <SEP> tration <SEP> teur
<tb>
<tb>
<tb> virus <SEP> lution <SEP> de <SEP> la <SEP> trique <SEP> de <SEP> la <SEP> d'ac-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> anti- <SEP> dose. <SEP> ' <SEP> moyen <SEP> dose <SEP> tivite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gène <SEP> ' <SEP> opposée <SEP> opposée <SEP> sur <SEP> le
<tb>
EMI19.2
(TCID 50) (TCID5J singe
EMI19.3
<tb> Vaccin <SEP> mélangé
<tb> contenant <SEP> les
<tb>
EMI19.4
types lx 2 et 3 1 l0-1937 J* 26 53 0,35
EMI19.5
<tb> de <SEP> virus <SEP> de <SEP> po-
<tb>
<tb> liomyélite <SEP> tués
<tb>
EMI19.6
par o,05)5 de -2 10-1910 27 42 68 0,82 bt8..-:
9ropio1ac- tone et par la le34 lwnière ultra- 3 10-'' 3' 22 18 36 ou 26
EMI19.7
<tb> violette <SEP> et <SEP> con-
<tb>
<tb> servé <SEP> pendant
<tb>
<tb> six <SEP> mois
<tb>
Le tableau IV illustre de plus la stabilité des vaccins obtenus par le procédé de l'invention après un stockage prolongé et une dilution au douzième. Il fait ressortir également que des résultants satisfaisants sont susceptibles d'être obtenus même si l'on fait varier l'ordre des stades d'inactivation. exemple 3. -
Sur un filtre en verre fritte extrêmement fin, on filtre un milieu aqueux contenant du virus poliomyélitique du type '1
EMI19.8
(Mahoney) (titre d'ïiifectiosité lUl6) préparé comme il est décrit dans l'exemple 1,, et on refroidit le filtrat à une température de 4 C.
Dans quatre litres du filtrat refroidi on verse, tout en agi-
EMI19.9
tant, t,.0 ml d'une solution aqueuse à 7.0 â contenant 0,11 gramme @ millilitre de bêta-propiolactone et on conserve pendant deux ., ares à la même température le mélange résultant qui contient 0,001 gramme par ml de bêta-propiolactone. On fait ensuite passer le mélange à tavers un appareil centrifuge par la'formation de pel licules, suivant un débit de 600 ml par minute, en l'exposant à un rayonnement ultra-violet ayant une puissance de 25 watts, et en
<Desc/Clms Page number 20>
utilisant l'appareil de façon conforme au procédé décrit dans l' exemple 1. L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est ap- proximativement égale à 50 microns et la durée légèrement inférieure à une seconde.
On recueille ensuite le produit qui en sort, on le chauffe à 37 C, et on le maintient à cette température pendant trois heures. On dilue la solution de virus ainsi obtenue à l'aide de trois volumes de solution de Hank, et on la mélange en vue de réa- liser un milieu aqueux qui contienne du virus poliomyélitique tué, ainsi que l'indique le résultat négatif obtenu dans l'essai de sécu- rité.
Le milieu ainsi obtenu possède un pouvoir antigène d'un ordre élevé et on peut l'utiliser de manière convenable comme vac- cin. On détermine le pouvoir antigène du milieu contenant le virus en fonction du titre de dilution antigène, du titre géométrique moyen, et du facteur d'activité sur le singe. Dans le tableau V, on donne les résultats de la détermination du pouvoir antigène ainsi obtenu que l'on rapproche des résultats comparables obtenus pour la matière première non traitée.
TABLEAU V.
EMI20.1
<tb>
Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> poulets <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> singes
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Titre <SEP> de <SEP> Concen- <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Facteur
<tb>
<tb> soumis <SEP> à <SEP> dilution <SEP> tration <SEP> géomé- <SEP> tration <SEP> d'activi-
<tb>
<tb> l'essai <SEP> antigène <SEP> de <SEP> la <SEP> trique <SEP> de <SEP> la <SEP> té <SEP> sur
<tb>
<tb> dose <SEP> moyen <SEP> dose <SEP> le <SEP> singe
<tb>
<tb> opposée <SEP> opposée
<tb>
EMI20.2
(TCID5 (TCID 5
EMI20.3
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traite-
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> par <SEP> 0,1% <SEP> de <SEP> bêta-
<tb>
<tb>
<tb> propiolactone <SEP> et <SEP> par
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> lumière <SEP> ultra- <SEP> -1,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> violette <SEP> 10-1,5 <SEP> 204 <SEP> 218 <SEP> 53 <SEP> 5,
8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb> poliomyélitique <SEP> vi- <SEP> -2,33
<tb>
<tb>
<tb> vant <SEP> du <SEP> type <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 204.
<tb>
Les résultats du tableau V montrent que le fait d'avoir recours à une proportion relativement plus forte de bêta-propiolac- tone fournit un vaccin conforme à l'invention quLdépasse fortement la morme minimum concernant le facteur d'activité,
<Desc/Clms Page number 21>
EXEMPLE 4. -
Sur un filtré en verre fritté ultra-fin, on filtre un milieu, aqueux contenant du virus poliomyélitique vivant du type 1 (Mahoney) ayant un titre d'infectiosité de 10-6 préparé comme il est décrit dans l'exemple 1.
Dans quatre litres du filtrat, on ver- se 40 ral d'une solution aqueuse à 10% contenant 0,115 gramme de bêta-propiolactone 'par,millilitre. On chauffe pendant'deux heures à 37 C le mélange ainsi obtenu qui contient 0,001 gramme de bêta-- propiolactone par millilitre, et on fait ensuite passer la suspen- sion ainsi obtenue (ayant un titre d'infectiosité inférieur à 10-0,1 à travers un appareil centrifuge pour la formation de pellicule, suivant un débit de 600 ml par minute, en les exposant à un rayon- ne;sent ultra-violet d'une puissance de 25 watts, et en employant le dispositif et le procédé décruts dans l'exemple 1.
L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est approximativement égale à 50 microns et la durée d'exposition est légèrement inférieure à une seconde. On filtre à nouveau le mélange à travers un filtre en verre fritté ultra-fin et on en soumet un échantillon à un essai normalisé de sécurité'. A ce stade, le vaccin ne contient pas de virus vivant, ainsi que l'indique le résultat négatif dans l'essai de sécurité.
De la même manière, on prépare deux autres lots de vac- cin tué de virus de poliomyélite à partir de différentes souches dE virus, l'un des lots provenant de la souche du type 2 (MEF-l) et l'autre de la souche du type 3 (Saukett). Pour le reste, la prépa- ration de ces deux lots de vaccin est identique à la fabrication du vaccin ci-dessus contenant la souche tuée du type 1; ces vac- cins sont également exempts de virus vivant de poliomyélite.
Les trois vaccins ainsi obtenus (des types 1, 2 et 3) possèdent un pouvoir antigène d'un. ordre élevé et on peut les uti- liser de manière convenable soit seuls soit en combinaison, ou bien on peut les diluer soit à l'aide d'une solution saline stérile soit d'une solution de Hank stérile,à volonté, en vue d'obtenir des
<Desc/Clms Page number 22>
vaccins moins concentrés.
On détermine le pouvoir antigène des trois vaccins en fonction du titre de dilution antigène, du titre géométrique moyen et du facteur d'activité sur le singe,.en opérant conformément aux procédés exposés dans l'exemple 1. Dans le tableau VI ci-dessous on donne les résultats de la détermination,du pouvoir antigène ainsi obtenu, que l'on peut rapprocher des résultats comparables du filtrat' non traité contenant du virus vivant auquel on a recours comme ma- tière première.
TABLEAU VI.
EMI22.1
<tb>
Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> poussins <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> des <SEP> singes
<tb> Echantillon <SEP> Titre <SEP> Concentra- <SEP> 'Titre <SEP> Concen- <SEP> Facteur
<tb> soumis <SEP> à <SEP> de <SEP> di- <SEP> tion <SEP> de <SEP> la <SEP> géomé- <SEP> tration <SEP> d'activil'essai <SEP> lution <SEP> dose <SEP> oppo- <SEP> trique <SEP> de <SEP> la <SEP> té <SEP> sur
<tb> anti- <SEP> sée <SEP> moyen <SEP> dose <SEP> op- <SEP> le <SEP> singe
<tb> gène <SEP> (TCID50) <SEP> posée
<tb>
<tb> gène <SEP> (TCID50) <SEP> (TCID50) <SEP> ¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 1
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traitement <SEP> par <SEP> 0,1% <SEP> de
<tb>
EMI22.2
bêta-propiolactome
EMI22.3
<tb> et <SEP> par <SEP> la <SEP> lumière <SEP> -1,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ultra-violette <SEP> 10-1,5 <SEP> 204 <SEP> 178 <SEP> 53 <SEP> 4,
78
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vivant <SEP> de <SEP> polio- <SEP> -2,33
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> myélite <SEP> du <SEP> type <SEP> 1 <SEP> 10-2,33 <SEP> 204- <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traite-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> 'par <SEP> 0,1% <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bêta-propiolactone
<tb>
EMI22.4
et par la lumière 6d 32 320 6$ 2,,5
EMI22.5
<tb> ultra-violette <SEP> 10-2,68 <SEP> 320
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb> vivant <SEP> de <SEP> polio-
<tb>
<tb>
<tb> myélite <SEP> du <SEP> type <SEP> 2 <SEP> 10-3,
0 <SEP> 32 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> du <SEP> type <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb> obtenu <SEP> par <SEP> traite-
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> par <SEP> 0,1% <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> bêta-propiolactone
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> par <SEP> la <SEP> lumière <SEP> -1,5
<tb>
<tb>
<tb> ultra-violette <SEP> 10-1,5 <SEP> 58 <SEP> 110 <SEP> 36 <SEP> 1,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> contenant <SEP> du <SEP> virus
<tb>
<tb>
<tb> vivant <SEP> de <SEP> polio-
<tb>
<tb>
<tb> myélite <SEP> (type <SEP> 3) <SEP> 10-2,5 <SEP> 58
<tb>
Il ressort du tableau VI que le pouvoir antigène des
<Desc/Clms Page number 23>
vaccins monovalents, pris séparément, obtenus par le procède de
EMI23.1
10invention peut être comparé avantageus8uent à celui des écran- tillons témoins non traités,
et qu'il est nettement plus important que les normes minima en ce qui concerne le facteur d'activité sur le singe.
On détermine également le pouvoir antigène des vaccins obtenus après six mois de stockage. A la fin de la période de stoc- kage, on dilue chacun des produits à l'aide de 3 volumes de solu- tion stérile de Hank, on met en commun les solutions ainsi obte- nues et on détermine leur pouvoir antigène. Dans le tableau VII, on expose le résultat de cette détermination.
TABLEAU VII.
EMI23.2
<tb>
Essai <SEP> sur <SEP> les <SEP> poussins <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> les <SEP> singes
<tb>
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Type <SEP> Titre <SEP> de <SEP> Concen- <SEP> Titre <SEP> Concen- <SEP> Fac-
<tb>
<tb>
<tb> essayé <SEP> de <SEP> dilution <SEP> tration <SEP> géomé- <SEP> tration <SEP> teur
<tb>
<tb>
<tb> virus <SEP> antigène <SEP> de <SEP> la <SEP> trique <SEP> de <SEP> la <SEP> d'ac-
<tb>
<tb>
<tb> dose <SEP> moyen <SEP> dose <SEP> tivité
<tb>
<tb>
<tb> opposée <SEP> opposée <SEP> sur%
<tb>
EMI23.3
(TC'ID5d.
(TCID 50) singes
EMI23.4
<tb> Vaccin <SEP> à <SEP> l'état
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> mélange <SEP> contenant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> les <SEP> types <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10-1,3 <SEP> 24 <SEP> 60 <SEP> 53 <SEP> 0,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> virus <SEP> de <SEP> poliomyé-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lite <SEP> tué <SEP> par <SEP> 0,1% <SEP> de <SEP> 1,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bêta-propiolactone <SEP> et <SEP> 2 <SEP> 10-1,0 <SEP> 27 <SEP> 91 <SEP> 68 <SEP> 1,76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> la <SEP> lumière <SEP> ultra-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> violette <SEP> et <SEP> conservé
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pendant <SEP> six <SEP> mois.
<SEP> 3 <SEP> 10-1,5 <SEP> 22 <SEP> 53 <SEP> 36 <SEP> 0,75
<tb>
Le vaccin du tableau VII est un vaccii constitué par un mélange obtenu à partir de vaccins monovalents conservés pendant six' mois et correspondant à une dilution au douzième, il peut être com- paré avantageusement avec les vaccins du tableau VI en ce qui con- cerne le titre.
Bien que dans la description qui précède on ait décrit différents modes de réalisation exposés en détail., il est évident que 1-'on pourra y apporter un grand nombre de modifications sans sortir de 1''esprit et du cadre de l'invention.