BE549221A

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Info

Publication number: BE549221A
Authority: BE

Description


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  La présente invention ust relative à un procède biosynthétique pour la préparation de 11/ -liyfiroxy-stisroî- des de la série du prút;nane (y compris le prugnène et le prégtz4diéne) , spécialement pour la préparation ùe ±'- pr égtladiètm-1.1/3 , l'7 4 ,21-triol-3,2U-dione et ses 21-es- ters, ,ce procédé impliquant. l'oxydation microbiologique du 11.-désoxy-stéroide correspondant, .spécialement de la il 1,4- prégnadiene-17 c( ,21-diol-j,2Ù-dione et ses 21-esters. 



  Plus particulièrement, le procédé suivant la pré- sente invention consiste à soumettre de a LI -pr<g11a J.G- ne-17 < ,21-diol-3,20-dione ou un 21-ester de ce composé à l'action d'une enzyme (ou d'enzymes ou d'un système d'enzy- mes) dun microorganisme du genre Coniotllyrium '(de préféren -ce, Coniothyriuta helleborine) dans un milieu aqueux, en présence d'oxygène, et à récupérer la fi 1,4 -prégiiadièiie- 11/5 , 17 d Y21-triol-3,20-dioiie ou un 21-ester de ce compo-   sé qui s'est formé.

   L'action de l'enzyme, peut être pro-    duite, soit en mettant la stéroide dans une culture aérée du   microorganisme   dans ou sur un milieu nutritif approprié, soit en mettant en présence dans un milieu aqueux ke 
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 Sté" îdep de l'oxygène et l'enzyme de cellules non proli- férantes du   microorganisme,   la première alternative étant celle que l'on préfère. 



   Les stéroïdes utilisables dans le procédé suivant la présente invention englobent, entre autres, la ¯ 1,4 
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 prégnadiène-17 ai, l-diol-3, 20-d.ione et ses 21-esters. Par- mi les acides estérifiant appropriés, si un 21-ester est utilisé, on peut citer les acides organiques carboxyliques, en particulier les acidescarboxyliques hydrocarbonés ayant 

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 moins de 10 atomes de carbone, tels que les acide alkanoï- ques inférieurs (par exemple, les acides   acétique ,   propio- nique et énanthique),   le.,;   acides alkanedioïques inférieurs (par exemple, l'acide succinique), les acides aromatiques hydrocarbonés (par exemple, l'acide benzoïque) et les aci- des aralkanoiques hydrocarbonés (par exemple, l'acide phény: -acétique et l'acide /3 phénylpropionique). 



   Un milieu   nutritif'   approprié comprend essentielle ment une source de facteurs azotés et une source assimila- ble de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone (tel que sucrose, mélasses, glucose maltose, amidon ou dextrine), un acide gras, une graisse et/ou le stéroïde lui-même. De préférence, le milieu   compo'   te cependant une source assimilable de carbone et d'énergi en plus du stéroïde.

   Parmi les graisses utilisables pour le but visé par l'invention, on peut citer l'huile de lard, l'huile de graines de soja, l'huile de lin, l'huile de grai ries de coton, l'huile d'arachide,, l'huile de coco, l'huile de maïs, l'huile de ricin, l'huile.de sésame, lthuile de palme brute, le suif de mouton, l'huile de spermacéti, l'huile d'olive, la   tristéarine,   la tripalmitine, la trio- léine et la   trilaurine.   Parmi les acides gras utilisables pour le but visé par l'invention, on peut citer l'acide stéarique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide linoléique et l'acide   myristique.   



   La source de facteurs azotés peut être organique (par exemple, farine de graine de soja, liqueur de macéra- tion de mais, extrait de viande et/ou solubles de distilla- teurs) ou synthétique (par exemple, composée organiques et   inorganiques     synthétiqables   simples, tels que sels   ammoniques,   nitrates alcalins,   aminé-acides   ou urée). 

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   Une alimentation adéquate   en   air stérile doit être maintenue pendant la fermentation, par exemple par les 
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 méthodes usuelles d'exposltion d'une grande surface du ifii- lieu à l'air ou par utilisation d'une culture submergée. 



   La   stéroide   peut être ajouté à la culture pendant la période d'incubation ou inclus dans le milieu avant la stérilisation ou inoculation. La   garnie   préférée (mais non limitative) de concentrations du stéroïde dans la culture est d'environ 0,01 à 0,105 La période de culture ou plutôt 
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 . le temps pendant lequel la stérolde est soumis à 1' ac- tion de l'enzyme peut varier considérablement, ce   temps   pouvant, par exemple, être d'environ 6 à 98 heures (cette gamme de temps n'étant pas limitative). 



   Le 11/3 -hydroxy-stéroide formé peut être   récupér-'   de la culture, dans laquelle il est formé par extraction 
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 à l'aide d'un solvant organique (tel que méthylisobutylcé- tone, chloroforme et dichlorure.de méthylène), suivie d'u concentration de l'extrait et d'une cristallisation dans un solvant organique approprié. 



   Les exemples suivants illustrent l'invention. 



     EXEMPLE   1. 



   1,4 
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 Li -prégnadiène-ll!.3 ,17 ci, 21-triol-), 20-dione. - (a) Fermentation.- On prépare un milieu de fermentation de composition   suivate   
Amidon 20 gr sirop extrait de céréales maltées 10 gr peptone 20 gr cérélose 44 gr 
NaNO3 3 gr 
KH2PO4 1 gr 
KCl 0,5gr 
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 1"'1±S 4 , ?ÎI 20 0,5 gr FeSO 4' 7H20 0,0183 gr Eau q.s. ad.   1 litre.   



  Le pH du milieu est ajuste à 7,0¯ 0,1 à l'aide 
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 d'une solution 2N de IdaUIi et des fractions de 50 cc du ,ni- 

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 lieu sont réparties dans des flacons d'Erlenmeyer d'une capacité de 250 cc. Les flacons sont bouchésà l'aide   d'un   tampon de coton et stérilisés par chauffage à l'autoclave pendant 30 minutes à 120 C.

   Après refroidissement, chacun des flacons est inooulé à l'aide   d'une   suspension à 5% de spores de Coniothyrium   he Lleborine,   (que   l'on   peut   notam-   ment obtenir au Département de B   tanique   du Kansas State 
Collège).   /--La   culture sporulée est obtenue en faisant pous. ser le microorganisme sur du mais fissuré pendant 2 à 3 semaines, de façon à permettre une sporulation maximum. 



   La suspension est, de préférence, préparée dans une solutia aqueuse à   0,01   de Duponal. 2,5 cc de suspension, contenar environ   1/60e   des spores produites sur 15 gr de mais sont utilisés peur inoculer 5u cc du premier groupe de fla- cons à agitera. 



   Les flacons sont ensuite agités mécaniquement pendant 60 heures sur un agitateur rotatif à 280 tours par minute à 25 C et un transfert de 6% en volume est alors opé. ré dans   40   flacons d'une capacité de 250 cc contenant des fractions de 50 cc du milieu   suivant :   
Glucose 40 gr 
NaNO3 3 gr 
KH2PO4 1 gr 
Eau q.s. ad. 1 litre 
L'inoculation est alors exécutée pendant   48   heures à 25 C, par agitation mécanique sur un agitateur ro- tatif à 280 tours par minute, après quoi 500 mgr de ¯ 1,4, prégnadiène-17 Ó, 21-diol-3,20-dione sont ajoutés dans 20 cc de méthanol. L'incubation est poursuivie pendant encore 48 heures.

   Le contenu des flacons est refroidi, filtré sur un tampon Seitz et lavé avec environ 10%   d'eau;   Le volume de filtrat et d'eau de lavage est de 1875 cc. 

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  (b) IsolotJ\0nt de la IJ. 1,1'¯p,'Ó;';na<llLn}e-ll/.3 ,1'1 d , 21-,ri.ol- (b) :Lo7¯ertent de la /, ¯ 1 ¯ ,¯,..¯.¯... ¯ ¯   3,20-dione.-   
Le filtrat de culture ainsi   obtenu   est   extraits   à l'aide de 3 fractions d'un litre de chloroforme et :La so- 
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 lution chloroformique restante est évaporée sous vide   jusqu'à   siccité.

   Le résidu (environ 238   est   trituré 
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 avec du chloroforme et le précipité crisl:;a1lin résultant (environ 140 mgr). qui est constitué par un mélange de matière de départ et du produit   hydroxylé   désiré, est   acéty-   lé à l'aide de 2 cc de pyridine anhydre et de 2 cc d'anhy- dride acétique à   température     ambiante   pendant   18   heures. 



  Le mélange d'acétates obtenu par évaporation des réactifs est cristallisé à quatre reprises dans de l'alcool à 95%. 
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  On obtient du 21-acétate de Ó 1,4¯prégnadiè!fe -1y3 il/ 0( , 1-tr.o.-3, U-diot>,e f . f. environ 237-239 C. L-ci J3= + l12  (dioxeaie) i\ m 1 , 9'l u, 3 , U'7 lU, 5 , 72 11) 5,81 r' 6,16 u, 6,24 lt, 6,3U p. / ce spectre infra-rouge est identi- que à celui d'un échantillon authentique).      



   Par saponification du   21-acétate   précité à   l'aide   de carbonate de potassium dans du méthanol, on obtient de 
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 la 6 1,4¯prégnadiène-lJ3 ,.7 c( ,21-trio7.-3,'U-diotxe aut,hen-- tique; P.F. environ 239-240 C. 



   L'invention peut être mise en oeuvre de diverses autres manières, sans sortir du cadre des revendications suivantes. 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

REVENDICATIONS.- 1.- Procédé de production d'un stéroide choisi EMI5.6 dans le groupe comprenant la à ' ''-prégnadièno-11/5 ,17 et 2l-triol-3,20-dion.e et ses 21-esters, dans lequel procédé on soumet un stéroïde choisi dans le groupe comprenant la à lj4¯prégiiidir-%tie-l'/ ,2.-diol-3,zU-.dione et se; r1-.esterr <Desc/Clms Page number 6> à l'action d'une enzyme d'un microorganisme du genre Conio- thyrium dans un milieu aqueux en présence d'oxygène, et on récupère le stéroide formé.

2. - Procédé suivant la revendication 1, dans le- quel l'organisme est le Coniothyrium helleborine.

3.- Procédé suivant la revendication 2, dans le- quel le stéroide est un 21-ester de ¯ 1,4-prégnadiène-17 Ó, 21-diol-3,20-dione avec un acide hydrocarboné carboxylique comportant moins de 10 atomes de carbone.

4. - Procédé suivant la revendication 3, dans le- quel l'acide est un acide alkanoïque inférieur.

5.- Procédé suivant la revendication 3, dans le- quel l'acide est l'acide acétique.

6. - Procédé, en substance, tel que décrit plus haut.

7. - ¯ 1,4-prégnadiène-11/3 ,17 Ó, 21-triol-3,20- dione et ses 21-esters, lorsqu'ils sont obtenus par le pro cédé suivant l'une ou l'autre des revendications précéden- tes.