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La p-pésèiit i70ntion pour* objt la préparation ":':'"e;" <3@ cléfcydrostér-oïdss polosj?géaés? par déshydrogéftatiôn et introduction cHeesyganô ësas 6:tVêr-me8 poitions par vola foloohîmlCii?. , On sait qu'on peut iatï'ocliîie de dans certaines positions ces stéroïdss, notaîasient n position 11, au sicyon ûq jaie2?oo± ssnlsîass Çof par esernpl la brevet amérieain 2,602i769 du 8 Juillet 1952 de la Société dite*
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Upjohn Co). Dans la derrick- èh brsvet déposée par la d'-3- .#andsresBû le 14 avril 1955 st ayant pour titra: "Procédé pour introduire de 1* oxygène dans doa v.-oW=,4 ", il est décrit un procédé permettant, par utilisation de certains champignons, d ! O2:y sénsr des 1Jtél"oY$C::; en position 17.
Coin- formément à la demande de brevet déposés par la demanderesse le 1 juillet 1955 et ayant pour titre: "procédé pour intro-
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duire dt1 1 tOÎ\.llsne dans dys at6:'ol;' n, il est en outre possible, par voie biochimique d'introduire de l'oxygène
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on position 21 de GtÓl"oï6s. Il est également; connu qu'on p3ut, à l'aids de cultures de certains ch&mp1snon, oxygéner dQS t.Jro!de3 Dimult6ant cans diverses positions, par exemple en position 6 et 11.
Conformément à la demande ' de brevet dap03éc par la decandcresse le 6 février 1956 et ayant pour titre: F' r sa: de préparation de déhydro- composéa de la série dos téo1:diêSn on peut en outre, par voie microb101og1qu et sans dégrader la chaîne latérale ni scinder l'anneau, introduire dans des stéroïdes une double liaison en position 1,2, et le cas échéant, en position 4,5. Jusque présent, il n'était toutefois .pas possible, en un seul stads opératoire et par voie bio-
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chimique, d'introduire de 11o:JQlg0né dans l'une au moins des positions importantes, !le 17 et 21, et une double liaison en position 1,2 et/ou en position 4,5.
Il est clair qu'un tel procédé serait d'une grande importance au point de vue technique.
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La présente invention est relative à un procédé
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permettant de préparer de façon simple des dêhydront6ro±den polyoxygénés, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire agir en un stade opératoire, sur des stéroïdes sa- turés en position 1,2 et/ou en position 4,5 et non oxygénés au moins dans Il.une des positions 11, 17 et 21, des enzymes
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de cultures aérobies de Calonectria décora, d'Ophlobolue hotercotrophus, d'ophlobolus Miyabeanus, d'Alternarla passiflore ou de Didymella lycoporsîei capables de dés- hydrogéner des stéroïdes en position 1,2 et/ou en position 4,5,
et des enzymes de cultures aérobies d'au moins l'un des trois groupes de champignons permettant d'introduire de 1'oxygène en position 11,17 ou 21.
Les substances de départ pour le nouveau procédé sont des stéroïdes saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5, par exemple des dérivés du spirostan, de l'allo-
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aplrostane, du furostane, do 1 ga.lo'uroacanF du ho.anor de l'allocholane, de l'androstans, du testane, de préférence des composés de la série du prégnane, parmi lesquels il
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y a lieu d'entendre des dérivés du lo, l3âirnthy.=l'-thy.
cyclopnt3nopolyhydrophénanthrène de n'importe quelle con tiguratlo stérique, ainsi que de ses homologufe?3 supérieurs et inférieurs, par exemple des A-nor-, D-homo- et 19-nor- composés.Ils peuvent être saturés ou présenter des doubles liaisons, par exemple en position 1 ou 4, ainsi qu'en
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.position 5, 6, 7, 8, 9, 11, 14, 15 et/ou 16. La configura- tion des substances de départ est, en particulier, celle
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du prégnane, du 5a-prégnane, du 17a-prégnane ou de racémates correspondants, tels qu'on les obtient par synthèse totale.
Comme substances de départ de ce genre, on utilise surtout des composés saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5, oxygénés en position 3 et 20, et, le cas échéant, en position 18 et/ou dans l'une des position 11, 17 et 21, ainsi que leurs dérivés fonctionnels, c'est-à-dire des prégnaues présentant dans les positions indiquées un groupe oxo ou un groupe hydroxy libre ou fonetionnellement modifié, par
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exemple les esters, les éthers, les thio-éthers, les thiol- ou thlon-estersj les acétals, les mercaptals, les edtalne les dérivée énoliques tels que les esters énoliques ou les énamines, les hydrazines, les semi-aarba2ofes et analogues, Ils peuvent aussi porter des substituants,
par exemple a d'autres positions que celles mentionnées oi- dessus, notamment des groupes hydroxy, oxo ou époxy libres
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ou fonotionnellement modifiés, par exemple en position 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16 ou 19 et dautre part des atomes d'halo- gène, comme le chlore ou le fluor, en position 9, ou un groupe méthylique en position 17a ou 17ss Des substances
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de départ spécifique3 sont, entre autres, la progestérone, la 17a-progestérone, la loa-hydroxy-, la 17a-hydroxy- ou la 18-hydroxy-progestérone, la cortGXOn6, la 18-hydroxy
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ou la 18-oxo-cortexone, la 11-c6to-proge8trone, la lisa- 'ainsi que la 11-hydroxy-progeat6rone, la 9,11- ou la 'Z1,3.2-débydro-progstrone,
la 3.9-hyrs.y-progstrotar V" la 9-ehloro. ou la g f.uoro3.33phydraxyprogstrone, la .1p,18-d,hydro-progstrot, la ilp.hydroy-18-r.o.pro- gestérone, la 9-chloro- ou la 9-'.uoro-..°..hrdraxy-.8-oxo- progestérone, la l,â.8-d3,ato-pragstron, la 19-Ror-pro- gsstérone, la ...tnr-3.I-hydroxy.-.8.-oxo.-progs:dro, des
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composas correspondants non saturés en position 1 au lieu
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d'en position k9 la prégnénolons, les A5¯prégnèno.320- dlols, la prgnan.3824adion, la prégnùne-'-ol-20-oné, 1 a5,ioprga.n-3, 2-cio3a, la prëgnane-31120-tyione l|alloprégnane 5;ll 20--t;
rioa 17a*olJ, ou leurs dérivas
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fonctionnels.
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Les enzymes utilisés pour l'oxydation on position
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11 sont produits avantageusement par des cultures aérobies
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de champignons du genre Rhizopuo, Y4uoor$ Aspargillus,
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Pénicillium, Ourvularia, Cunninghamella, Spondylocladium
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ou Strsptomyôes. Pour l'oxydation en position 17, sont appropriés les enzymes de cultures aérobies de Triehotheoium roseum, de Leptoephaeria maculans, de Oucurbitaela .aburn3., d'Acrospeira lovais, de Lophotriohus martini1, d Yalano- spore parsuit1ca ou de Thlèlav1a terricole.. Les enzymes pour l'oxydation en position 21 sont avantageusement ob tenus à l'aide de cultures aérobies d'Ophiobolus herpotrichus
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ou de Sclerotinia fructicola.
La déf\hydrcg'::aJ;':;.cl1 '.:;11 po- sition 1,2 et/ou en position 1,5 ênt effectuée à :.w.dw t#nz;n de Dldyrncl1a yapcx3.ui. os Ca2.o::ctia décora, dfAlternaria passiflorac, dsOp:.7a. !'wt x-ra:.;.¯: ou d t Oph1obola r.Iiyabeanus. On peut (tIc.: ê;:ra.v::.il1c'? s.'\' es préparations d'enzymes isolés ou enrichit* . r.... :,; :? f: .i r toutefois avec dej culturuc. :'2:'UtU; c:,:.':.l:':,?l;;,.:.,..)Í.1: .::- crois- sance, avec leurs filtrats ou aveo l.'-:2 ,:3:.J",::,:¯c:::: r....:'
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mycélium.
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Les solutions bzz 3G. L?¯.'# '.; ::11i,; ;:,J )'::":12} cultiver "''''8 champignons sont %8.i.f.v.'"¯<i3i..ai':; ..'¯'.',:.; .:i., s ...,...Yr"c:"'i':i# secoures ou '.tgi.'G' ss'.r ,g i ût 1.J.C::; '';:aÉ...."s",. ; du :..:Cî:..w as- 6!1m11able# en particulier çloc. lf7Ô..,..'i.a%r..¯i (, (';:"bC'l0',. T l.# 4r '2.L; que;, le cas échéant dos ...Wiûi=Str..i,:,.-'1 Cl wJ..f.:7s,akbM, par exemple de Itêau de WSid......¯..'".:: ùu lli1z eu du 0ût cl bir3, et des sels inorganique-.. 0:1 r.,:t don t1":'i...lit:r des solutions nutritives naturelles., z:.tth';'1ç)B ou scai- synthétiques. On utilise avantageusement 1:;K solutions nutritives qui offrent à toua les champignons u(ilir:J6s des conditions de croissance optizi.
Il zot également pos- sible d'ajouter dans le cours de 1 opération do sub.' icoms
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nutritives et des substances de croissance spécialement favorables au développement de l'un ou l'autre des cham- pignons utilisés.
Ce procédé est exécuté on un stade opératoire.
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.Il s'est toutefois avéré avantageux d entreprendra eue- passivement dans le temps, la déshydrogénatlon et les oxy- génations aux positions indiquées des molécules des corps envisagés* Le procédé le plus simple pratiquement est décrit dans ce qui suit, sans que l'invention se trouve pour autant limitée par les indications fournies
On cultive l'organisme nécessaire pour la première oxygénation ou pour la déshydrogénation, dans des appareils et dans des conditions analogues à ceux qui sont cornus
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pour les cultures limierg6az, dans la fabrication des antî- biotiques. Lorsque les cultures sont bien développées, on ajoute les substances de départ indiquées,
à l'état de
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eino diep3?i3loîi ou de solution, par exemple dans le méthanol, l'acétone ou l'éthylènê-glyooll et poursuit l'incubation juaqutà ce que la transformation maximum soit atteinte. On ajoute alors au mélange réactionnol, sans filtrer 'ou sans isoler le produit rdaetîontiol, une culture bien développée du s-scond organisme ete si etest nécessaire., des substances nutritives et des substances de croissance correspondantes, et poursuit l'incubation. Le cas échéant on répète cette
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opération avoo un m1oroorganlDln frais. On peut suivre par chrosatographio sur papier le déroulement de la déehydro génation ot des divarses oxygénations.
Finalement, on sd- pars 1 mycelimn, extrait le filtrat et/ou la masse de mycélium et isole les produits réaotionnela de l'extrait
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Ce manière en elle-même connue, par exemple par répartition
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entre solvants ou mélanges de solvants non rais ciblas l'un
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avec l'autre par absorption, ch?'o:-t.o-hi: cristallisation. transformation en <5driv&; jCo;ictio::îyj2t' t' c;r,:. 1.-: ceci-
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poses do Girard ou par <I ? r.u tr--j #nr-oc'cjc c-r-ï.-c.--'Jii'>- On peut ajouter 1, '-.-.1----2- c oh-: i-pisneiis ou les enzymes claîir; v.n or-c:cc- ousioc.. '.'7, f.. ..y-zc-.Z.-"- - :! "###iy"-3 permettent fin rtaats de d-jtr-nf.'-.:? ,.\ -:..:;u:î.r. ruXL r.
Suivant !\}:;;: :-: l:< 1:: '- ,-"' - "'; o.-. ::::::::.-...;\.:54 -.';..t précieux #é<Sicar cntiJ c ils ivols -I:-c r;:::Jc2t..:-'., i arti- oulier ôc la sri du p -.':, v;,; c:t, eomparis :: composas -i:;hÚ'aputlquC:1h::n/..:: actif., qui #,<-.-- .-j ui-:ï; # '..ition 12, produits du proedda, il y 11.:.-.. c.'. ciVi;-2 su pi;î.ôuliei? 14 A -31I.20-t.?loxoI7a,Sl..ihy.-..p:?.T:.ji
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A 5,20-dioxo-ll,17G,21-'c2?ihydro;-pi-t-.:i5ikao, la A*' -3,Xl,20-trlojco-2i-hydroxy-pï'ésr a*5ii.iVi, lo A1- ' -5,20- dioxo¯ll±,21-dihyaroxy-pré±nadicno, le v ' ..3=?,=F;.a:aw - .'cx! 2i-dihydraxy..prcgt2d.rw, le à'' -, 2 :=-ria.c.-2ß.nydroey.. prégnadiène, le px ', ..
CJt 2" yrl'.t.:'J. q E 3 'l.i.,! t-,Àisar.. prsgnadiène, le 4'' -'- . ; .: y.. prégnadiène.. le tJ -, 2t?-dt o<<t-..3, $, 2'i ..s .a;; c:ixior . prgnad1èn.# le d ' -, $, 2G-ric.og'i ï,, .', 2..;,r3hydxoy.. prdgnadiéne, la b'' -3, 3.., .$, 20- 3s c-.3.7rr,, 2,.c.hydro.'y
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prégnadiène, 1e '' -3,24âlioxalp, l'a,18, 21 tdtrahydroxy prégnadlène, le Al, 4 -3,20-dloXo-18,21-dihydroxy-prgnadlènc, le â-' -3 18, 2-trioxo-3,-hydrosyprgnadiric, le là'' -3, 2Q d.oxo-Z7a,l$,21-trihydroxy-prégtad3n, le i'-3,l$,2 trioxo-.7a,21-d9.hydroxy-.prgnadita les 21-oxo- ainsi que les 21-désoxy-composés correspondants, ou d'autre part les dérivas fonctionnels correspondants tels que les esters, éthers, dérivés halogènes, par exemple les dérivés 9a- halogènes,
notamment les dérives fluorés et chlorés, pour autant que les produits du présent procédé ne présentent pas la configuration ni les substituants de stéroïdes
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thdrspautiquement utilisables, ils peuvent servir de pro- duits intermédiaires pour leur préparation, par exemple pour la préparation des composés indiqués ci-dessus,
Les produits réactionnels obtenus conformément au procédé peuvent être, d'un manière en elle-même connue, transformés on leurs dérivés fonctionnels tels que les dérivés oxygénés,soufrés ou azotes, par exemple en esters,
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6thera, esters oenoliques, éthers énoliques, cétals, thlo- éthúrsj et th3.o-cdt.s, ainsi.qu'en hydrazonea, oximes et énamines.
Dans ces .composés, les groupes hydroxy et/ou les groupes oxo peuvent être totalement ou partiellement mo- difiés du point de vue fonctionnel.
Dans les esters et dans les estera énoliques, les restes d'acide sont ceux de n'importe quels acides
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.organiques et inorganiques comme les acides carboxyliques,
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hïon-e8rhoxyliques, thiol-oarboxy liques et sultoniques
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aliphatiques, alicycliques, araliphatiques, aromatiques
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ou hé téroey cliques, de préférence ceux de l'acide formique, de l'acide acétique, des acides chloracétiqueu, de l'acide trifluoracétique, de l'acide propioniquep des acides bu- tyriques, des acides valérîques, de l'acide trimdthyl acétique, de l'acide diéthylacétique, des acides cavrolques,
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des acides oenanthiques$ des acides capryliques, de
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l'acide palmitique , de l'acide crotonîque, de l'acide und4aan1que, de l'acide undécylénique, de l'acide oxalique, de l'acide succinique,
de l'acide pimdlique, de l'acide
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malélque, de l'acide lactique, des acides carbamiques, des
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acides alcoxycarboxyliques, de l'acide p-cyclopentyl-pro- ploniquee de l'acide hexahydrobenzoïque, de Itacido benzoïque, de l'acide phénylacétique, de l'acide cyalohexylacétiqueg des acides phénylpropioniques, de l'acide triméthylgallique,
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de l'acide phtalique, de l'acide furanne¯2 carboxylique,
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de l'acide isonicotiniquat de l'acide methane-aulfonique, de l'acide toluène-sultonique, des acides sulfuriques, des
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hydracides halogènes ou des acides phosphoriques,
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Si on le désire, on peut, dans les composes ob-
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tenus, transformer en groupes libres des groupes hydroxy ou des groupes oxo fonctionnellement modifiés.
De cette manière, en particulier dans des dérivés polysubstitués,
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on peut aussi mettre partiellement en liberté les groupes
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fonct1onn113ment modifiés. Cela a lieu par exemple par hydrolyse chimique ou enzymatique, par. exemple en utili- gant des agents acides ou basiques, par alcoolise ou trans-
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àeëtalisation.
A partir des dérivés obtenus de cette façon ou aussi directement, et'qui ne sont que partiellement modifiés par exemple estérifiés ou éthérifiés, on peut, par transformation fonctionnelle subséquent, par exemple
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par B6rifioation ou éthdrifloatlon, préparer des ddrivéa polyoubstltuéze notamment aussi des esters ou des éthers mixtes, ou des estera-éthera.
Les 9yllpozycompoés obtenus peuvent Otre transfosméa en 9,11-halogéno-hydrin correnpondantes, par rdaetloïl sur des hydracides halogènes, ïiotaN#nt sur Itacide fluorlnydrîque ou l'acide chlorhydrique.
Les produits du procédé peuvent être utilisas eoH méd10amente ou conne produits intédia1rè6 pour leur préparation Lt1hvênton concertia également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés définis ci-dessus.
L'invention est décrit plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés centigrades.
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Exemple 1
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Dans un récipient agitateur dtuno eonio.anoe de 16 litres, on stérilise 3,6 litres de moût de bière et les ensemence avec 400 c.,n3 d'une culture dagitation, âgée de deux Jours, d'Ophîobolus horpotrichu3 dévDIoppée sur du moût de bière. On agite deux jours à 27 ; la culture se développe bien. On ajoute alors, dans des conditions stériles, une solution de 1,0 g de progestérone dans 25 car d'acétone. En. même temps, on ensemence dans un second ré- cipient agitateur, 3,6 litres de moût de bière stérile
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avec 400 on' d'une culture d'agitation, Ùq6e de deux jours, de Calonectria décora dév}lopp6c également su%:> du moût de bière.
On agite les deux rdolpients à 270 pendant 3 jours. On transfère alors la culture de Caloncotria décora bien développés, dans le récipient do 16 litres que l'on agite
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encore deux jours à 27 0. On sépara alo.a lu mycélium et extraie le filtrat de culture à quatre reprises avec chaque fois 2 litres d'acétate d'éthyle. On lave les extraits à trois reprisas, chaque fois avec 300 om d'eau, les sèche
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et les évapore sous vîdv. On dissout le ri-'&,,!du obtonu (1,4 g) dans 160 en? de xéthanol, ajoute 40 ara3 d toau et sxtrait à trois reprises avac chaque fois 50 ce de pcntané.
Les ax ,;raite pentaniquos uo que dos impuretés huileuses, tandis que les J5 èéroïdce restent dans la so- lution métlianolique. On évapore cstta dernière sous vide
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à 30 et la sèche sous un vide poussé. On chromatographie le résidu sur 30 g de gel de Billes suivant la méthode par passage en éluant d'abord avec du chloroforme, puis avec des mélanges de chloroforma et d'acétone d'une teneur croissante en acétone, et finalement avec de l'acétone.
On soumet les diverses fractions (chacune de 100 cm3) à
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un examen ahromatographique sur papier. Les fractions éludés au chloroforme renferment, à côté d'impuretés, un peu de la matière do départ, et les mélanges de chloro-
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forme ct d'acétone (975 ! z 2,5) un peu de cortexone (Il- <3ésoxy-corticostrone).
la quantité principale de la sub- stance ci trouve dans les fractions obtenues avec le mélange
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de chloroforme et d'acétone (95 c 5) ot allé est constitua par de la l-déhydro-eorteone que l'on obtient à l'état cristallin au moyen d'un mélange d'acétone et d'éther de pétrole. Elle fond à 185-1930 et présente
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un pouvoir rotatoire spécifique [a] 22 - *}- 120 (chloroforme).
Spectre d'absorption en ultra-violet (dans Itéthanol)t À M#lx::?44 m (, - 14100).
Exemple 2 Durs une fiole conique d'unc ccntensnoedc 500 a J, on attJ:...:t11iJê 50 cru 3 de moût de bière et les ensemença avec do 110,)Iiio')ol-us h.el>potr1.chuD. On agite la culture à 270. Au bout du trois jours, elle s'est bien développées on y ajoute,
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dans des conditions stériles, une solution de 15 mg do pro- gestérone dans 0,75 cm d'acétone. Au mê moment, on stérilise, dans une seconde fiole conique 50 cm3 do moût
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de bière et les ensemence avec ur.'"! """"'c}j-,; de Cur.ularia brachyspora. On agite alors les deur C': t'::- do la #Smc manière à 70. Au bout de trois jourz, on ajoute, Car.8 des conditions stériles, la culture d Curvularia bien développée, à la culture d E3phioboaus . On continue dtagiter les cultures réunies.
En même temps, dans une troisième fiole conique, on ensemence avec du Calonectria décora, 50 car de moût de bière stérile et agita à 27 . Au bout de trois jours, on ajoute dans des conditions stériles
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cette culture de Calonectria au mélange des deux autres cultures, après quoi on agite à 27 . Au bout do trois jours, on sépare le mycélium et extrait le filtrat de culture à trois reprises avec chaque fois 30 cm d'acétate d'éthyle.
On lave les extraits à l'eau, les sèche et los évapore. Un examen ohromatographique sur papier du résidu indique la
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présence de i-dhydro-.i3,2i.-d.bydroxypxog tdronc (1-dé- hydroaort1c08trone).
Si, dans la procède ci-dessus, on remplace la progestérone par la 18'c.o-progestercne, on obtient alors de la 3.-déhydro-aido : 6r ne ,
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Exemple 3 @
Comma décrit à l'exemple 2, on ajoute à une cul- tur d'Ophiobolus herpotrichus dans 50 cm3 de moût de bière, une solution de 15 mg de progestérone dans 0,75 cm3 d'acétone, En même temps, on ensemence, dans uns seconde fiole conique, 50 cm3 de moût de bière stérilisé avec du Trichothecium roseum. On agite alors les deux cultures à 27 .
Au bout de trois jours., en évitant des contaminations, on les réunit et continue d'agiter le mélange pendant trois Jours à la même température.En même temps,dans une troisième fiole conique, on ensemence 50 cm3 de moût de bière stérile avec du Calonectria décora et agite à 27 . Au bout de trois jours;, on ajoute, dans des conditions stériles, cette cul- turc de Calonectria au mélange des deux autres cultures, puis on continue d'agiter à 27 . Au bout de trois Jours, on sépare le mycélium et extrait le filtrat de culture comme décrit à l'exemple 1. Le résidu d'extraction renferme, d'après une détermination effectuée par chromatographie sur papier, de la 1-déhydro-17Ó,21-dihydroxy-progestérone.
Exemple 4
Si l'on remplace dans l'exemple 3 la progestérone pas de la 11-céto-progestérone et qu'on incube de la manière décrite avec des cultures d'Ophiobolus herpotrichus, de
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'l'%'iohothoo1um roseum et de Calonectria décora on pu. 6 alors déceler dans le résidu d'extraction .,;,g Qanbité notables de ldéhydro-ll-céto-17c:,21-dibvdrox 'progestérone
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(1-déhydro-cortisone).
Exemple 5 Si l'on remplace dans l'exemple 3 la progestérone
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par de la llp-hydroxy-progestérone et qu'on incuba de la même manière avec des cultures d'Ophiobolus hrpor-1ahus, de Triohotheoium roseum et de Caloncotria décora, on peut alors déceler dans la résidu d'extraction dea qu&ut1taa notables de l-déhydro-lip>lTaJ.21 trIhsfdroiQr¯progBtéron (1-déhydro-hydrocorti3onc).
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Exemple 6
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Comme décrit à l'axmplo 2, on ajoute à une oul- ture d'Ophiobolus herpotriohub dans 50 cm' do mofit de bière, dans des conditions stériles, utra f-oluion de 15 mg de progestérone dans 0,75 cm, d'scétona, an #eme tc-sf.s, on ensemence., dans'une seconds fiolû cOlique, 50 en" <Î3 moût da bière.stérile avec du 14 ,cria Cn agite les deux cultures à 270 le,', au, fce t <3u trois jours. En même temps, en ensecencs, dans b.-zll3o-Lëme fiole conique, 50 on!} de Roûb c Mira -...le a-;e au
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,Cu2vulr1a lUflata On agite pendant trois jours à 270 cette culture et le -m6la2lga do cultures indiqué, ce qui fait que la culture da Curvularia 00 développe bien. On la réunit alorme dans dos conditions stériles au mélange de cultures.
Od. agite snoore trois Jours à 27 . En m6'nllt'! temps, ësns xmû quatrième fiole coniques, on ensm@nc<a 50 em do moût do b1rG mté110 avec do ItAiteniarla paàa1florae et agite à 270. Au bout ae trois jours, on ajoute dans dos conditions Ëtdrilos cette eulturë d7Altêrnari& au mélange des trois autres cultures, après quoi on agite à 270. On sépara alors le mycélium et extrait la filtpat de culture cornais décrit il l'axeaple 1, Un @x3nsen chï>oasatogïiaphlqi5è sur papier du résidu dee4-.tvaot;Lon indique la présence de quantifie no- de lhydï'o-'llp3.721-trihydyosy-<'progestPOMe (I déhy<aro-hy<3a?oeortiisons5 à o8téi de 1 ,.ddhydro-11-céto- 17aj2l-dlhydrosy"-pi o3stérone (l-dhydro-cox''tisoï5e).
Esaaplô 7 Si dans Vszcmpl 6, on rnodi {1:i3i} 1 ordre dans lequel on ajoute ...1.# cmltu:l"G6 1ndi<;u!i:a81 en Incubant la progestérone d "abord e-vec une do Curvulapia , ,',tata" en ajoutant risuite -3 "abord de la manièZ'\ dél"'.1tQ un -sulfure d'Ophiobolus lievpotrîchua puis une culture d'Al- ternaris passif loras et finalement une aultu-o de Lmw- iosphaeria maOUlani!).;
le résidu ,Pe:trat1on obterAU d la
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manière usuelle renferme alors également de la 1-déhydro-
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ll 17a, 21-tr1hydroxy -proges térone { 1-déhy dro-hydroc ortis on ) et de la l-déhydro-ll-céto-17a,21-dlhydroxy-progo3t5rcns (1-déhydro-cortisone).
Exemple 8 On ensemence 50 3 de moût de bière stérile aveu
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du Outininghamella Blakesleena. on agit./ la culture pondant 2 jours à 270 et y ajoute ensuite dans des conditions stériles, ' une solution de 15 mg de 11-d6ooxy-cortloostérone (oort<sxone) dans 0,75 cm 3 d'acétone. En mémo temps, on encomonce dans une seconde fiole conique 50 om3 do moût de bicre stérile avec du Trîchothoclum ronoum. On continue d'agiter les deux cultures pendant deux jours à la même
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tickip6rature, les réunit alors dans des conditions stériles et continue d'agiter.
En m@me temps, on Ch6GIDOnOC dens uno troisième fiole conique 50 cm 3 do moût do bit'C at6j."1le avec du Calonectria dccora et agite à 27 ,Au bout de trois jours, on ajoute dans des conditions stériles cctto culture do Calonectria au mélange des doux autres cultures, après
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quoi on continue d'a3it'Jr à 27 . Au bout do doux jou2z, on sépara le mycolium. L'extraction du filtrat dû culture
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a r.icu comme on lta décrit à l'exemple 2.
Le résidu d'extrac- tion renferme de la I-déhydro-llp,17a,21-tr1hydroxy-po- gestérone (1-déhydro-hydrocortisor-o) à o6d de 1-ddhydro-
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ll.to-17c21-dihydpoxy "proses tenons ( lûêhg ûro-ôcrtiaone )
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Exemple 9
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Dans un récipient agitateur dfunô contenance de 18 litres on stérilise 3e6 litres de moût do bièro ot les fj"ûf>3ia'/iGS avec une culture d'agitation d*Gphioboiuss bas?- ,potr->ichufJ 2:gGI de deux jours a développé sur du. moût de Oi0X-,?;; . Ol'l agit joue±, z, 27 la lJu2 't;m,"c f 0 (16v 10ppè
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bien. On ajoute.alors dans des conditions stériles une
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solution leo g Ci..';! progestérone Gans 25 esn"5 d'aodtonc.
Sa. Bi-Saio 'temps:! on e#ae5i3K.c@ c1a.l'lG Ul1 fiouxiômo récipient BQta,tsiVûp 3,6 Xitro-3 <3o moût do bière stérile avee 400 *nl3 d"uno culture <3agitatlon d@ Trloothecium roa@um âg<5s de trois Jours dÓveloppéo également ou? du moût de bière.
On agita les deux récipients à 27 0 pondant trois jours. on alora dans des conditions stériles la culture cM\7i!!10ppéo de Tricothoeiusi dans le ûipient de 18 litres et en EiC-m teps nsemence dans un autre récipient agita*- 3e6 litres do août de Mors stérile avae 400 cm" 5 d 1 i).n1! culture d'agitation de Caloneotria décora âgée de 2 h2;m:).D J dévlopp:te sur du moût do bière On agite ce 2'doipiuit d tag:'1:tatlcl'1, ainsi que celui renfermant le mélange de cultures qui vient d'être décrite pendant 3 jours à 27 ,
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puis réunit leur contenu dans des conditions stériles. En
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Blême temps, on ensemence 3 litres de moût de bière stérile avec 400 cm3 d'une culture d'agitation de Curvularia lunata âgée de 36 heures,développée sur du moût de bière.
On agite cette culture, ainsi que le mélange de cultures que con- tient le récipient de 18 litres, pendant 2 jours à 27 , après quoi on réunit leur contenu dans des conditions stériles. On agite à nouveau pendant 2 jours à la tempé- rature indiquée et sépare alors le mycélium. On Extrait le filtrat de culture à quatre reprises avec chaque fois 3 litres d'acétate d'éthyle. On lave les extraits à trois reprises avec chaque fois 500 cm3 d'eau, les sèche et les évapore. On dissout le résidu obtenu (1,1 g) dans 160 cm' do mthanol, ajoute 40 cm3 d'eau et extrait à trois reprises avec chaque fois 50 car 3 de pentane.
Les extraits pentaniques ne renferment que des impuretés huileuses tandis que les stéroïdes restent dans la solution méthanolique.On évapore cette dernière sous vide à 300 et la sèche sous un vide poussé. On chromatographie le résidu sur 30 g de gel de silice suivant la méthode par passage,en Gluant d'abord avec du chlorure de méthylène, puis avec du chloroforme et avec des mélanges de chloroforme et d'acétone et finalement avec de l'acétone. les diverses fractions (150 cm3) sont soumises à un examan chromatographique sur papier.
Les fractions éludes au chlorure de méthylène et au chloroforaie renferment des impuretés, un peu de la matière de départ
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et de la 11-dèsoxj-cort:Lcostéronc, tandis que dans les mélange de chloroforme et d'acétone (9:1 et 8:2) se trouva de la l-déhydro-ll-.céto-17c21-dihydroxy-progestérone (1-déhydro-cortisone).
Les fractions en question sont diva- porées après rseristaliisation du résidu dans un mélange d'acétone et dtéthér loopeopylîque, on obtient la 3..déhydro- cortisone en cristaux fondant à 230-233 0à Loo tractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (ltl) renfersint de la i-cFdhydro.ï:,,17c, 2Z-trihydroxprogQmt6rone (1-dhYdro-hYdrocort1Bonè) qui cristallisa dans un mélange d'aodtone et d'éther de pétrole;
elle fond à 238-2400.
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Exemple 10
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Si, dans .L t.EÎ S 9, on utilise, à la placé do la culturo do Calonsetria decoraj une culture do Didymella lycopernieî dévoloppdo de la même façon et qu*ott procède quant au vezto comme déorit à l'exemple 9, on obtient alors également la h.dhycro-.1...e6to-.7a,23dihydrony progattd.. ron<& (l-déhydro-oortisone) fondant à 230w233o, ainsi quo la I-dhydro-i.p, i7cc.2.-tr3hydrocy-progaatdrono (1-déhydro-hydrocortisone) fondant à 238.2F0 Ex@8iple 11
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On ensemence chaque fois 3,6 litres de moût de
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-bière stérilisé, respectivement avec de l'Ophiobolus her- potrichus, avec du Tricothecium roseum, avec du Didymella lycopersici et avec du Curvularia lunata, puis agite à 27 .
Au bout de trois jours on réunit les cultures et ajoute au mélange une solution de 1,0 g de progestérone dans 25 cm3 d'acétone et continue d'agiter à 27 . Au bout de quatre jours, on sépare le mycélium. On extrait le filtrat de culture comme décrit à 1'exemple 9 et chroma- tographie le résidu d'extraction sur du gel de silice.
On obtient de nouveau de la 1-déhydro-cortisone fondant à 230-233 et de la 1-déhydro-hydrocortisone fondant à 238-240 .
Exemple 12
On ensemence chaque fois 3,6 litres de moût de bière stérilisé, respectivement avec de l'Ophioblus her- potriohus, avec du Tricothecium roseum, avec du Didymella loycoperici et avec du Curvularia lunata, puis agite à 27 . Au bout de trois jours on réunit les quatre cultures$ sépare le mycélium et le met en suspension dans 5 litres dteau. On ajoute une solution de 1,0 g de progestérone dans 25 cm3 d'acétone et agite à 27 . Au bout de quatre jours, on sépare la suspension par filtration.
Comme décrit à l'exemple 9, on extrait le filtrat de culture et ohromatographie le résidu d'extraction. On obtient de
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la 1-déhydro-cortisone fondant à 230-2330 et de la 1-déhydro-hydrocortisone fondant à 238-240 .
Exemple 13
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¯..m......¯........¯ On ensemence 120 cm3 de moût de bière stérilisé
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avec du Tricotheeium roseum et agite 3 Jours à 27 . On ajoute alors une solution de 40 mg de 21 ac<5tatG de 911P<- µpoy.-aar'coa dans 1,5 em d'acétone. En momo temps, on ensemence 120 crn de moût de biers stérile avec ,du Didymella lyoopers1ai. On agite les deux oulturoo à 27 . Au bout de trois jours, on les réunit et agite encore trois Jours à 27 . On sépare alors le mycélium et extrait le filtrat de culture a trois reprises avec chaque fois 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Après les avoir réunis, on lave les extraits à l'eau, les sèche et les évapore sous vide.
Le résidu d'extraction (42 mg) est constitua, ainsi que le montre
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un examen ohromatograp}11qUê sur papier, essentiellement par de la .-dhydroD, 3-épo:yw1'echydroxy-cortocoris. On purifie cette dernière à l'aide d'une chromatographie préparatoire sur papier (système propylèneglycol-toluène) et l'acétyle de manière usuelle avec 4 cm d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique. On dissout le produit brut ainsi obtenu dans 5 cm3 de dioxanne, ajoute 1,25 cm3 d'acide fluorhydrique 2,5 fois normal dans du chloroforme et laisse reposer une heure à la température ambiante.
On
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ajoute alors de l'eau et extrait avec un mélange de chlo- roforme et d'éther (1:3), Après lavage à l'eau, séchage et évaporation du solvant nous vide, on obtient le 21-
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acétate de l-déhydro-9a-tluoro-hydooortison.. On le 1'e. cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole* il fond à 235-237 .
Exemple 14
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Avec du 'l'riohothec1um roseum, on ensemence 120 cm' de moût de bière stérilisa et agite trois Jours à 27 .On
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ajoute alors une solution de 40 mg de 22acs#babe de 9<x-' 3uaxa-or.aabtrara dans 1,5 cm3 d'acétone* En mêmes temps, on ensemence 120 car de moût de bière stérile avec du Didymella lycopersici. On agite les deux cultures à 27 .
Au bout de trois jours on les réunit et les agite encore trois Jours à 27 . On sépare alors le mycélium et extrait le filtrat de culture à trois reprises avec chaque fois 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Après avoir réuni les extraits, on les lave & l'eau, les sèche et les évapore sous vide.
Le résidu d'extraction (42 mg) est, ainsi que le montre un examen chromatographique sur papier,essentiellement
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constitué par de la l¯âéhydro-9a-fluoro hydrocortisone* On purifie cette dernière à l'aide d'un chromatogramme préparatoire sur papier dans le système propylèneglycol-
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toluène* On sèche le produit brut ainsi obtenu à 40 sous un vide pousser le reprend dans 2 cm3 de pyridine et y ajoute 2 cm3 d'anhydride acétique.
Après avoir laissé re- poser pendant 16 heures, on verse sur de la galce. On sépare par filtration le produit cristallin qui a préci-
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pité, le lave à l'eau, le scha et le rêoriBtal11se dans un mélange d'asdtone et d6thczr de pétrole. La 21-acétate do l-Séhydro<-9a-fluoro hydroeortisone que l'on obtient ainsi, fond à 235-237 .