BE524902A - - Google Patents

Description

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   AMERICAN CYANAMID COMPANY, résidant à NEW YORK. 



  PERFECTIONNEMENTS A LA PREPARATION DE SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES. 



   La présente addition concerne la production de la chlorotétra- cycline par propagation du   Streptomvces   aureofaciens dans un milieu nutri- tif par fermentation aérobie immergée. 



   Le but principal de la présente addition est l'augmentation du rendement en chlorotétracycline et la diminution du prix de production en faisant se développer l'organisme S.aureofaiens dans des conditions telles que l'on obtienne la chlorotétracycline au prix minimum. 



   Dans les procédés connus de production de chlorotétracycline par propagation du   S.aureofaciens   dans un milieu de culture aqueux, trois classes de matières sont nécessaires pour la production maximum de chloro- tétracycline : a) une source d'azote organique telle qu'une liqueur de macéra- tion de grains;   b) un hydrate de carbone tel que l'amidon ou un sucre ; la   présente invention on utilise l'amidon comme hydrate de carbone et on le remplace partiellement par l'huile de glycéride comme source d'énergie; c) un supplément minéral contenant les ions minéraux ammonium, cobalt, ferreux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, chlorure, phospha-   te et sulfate ; une quantité précipitant la chlorotétracycline d'anions   alcalino-terreux, de préférence du carbonate de calcium.

   Le carbonate de calcium stabilise également le pH dans l'intervalle désiré. 

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   On prépare le milieu en mélangeant avec un groupe de sels four- nissant les ions minéraux désirés l'amidon et la liqueur de macération de grains et en faisant cuire suffisamment pour détruire les microorganismes contaminants puis en refroidissant, en inoculant et en faisant fermenter. 



   Selon la présente invention le milieu nutritif consiste en un milieu aqueux cuit comprenant, en poids, par litre, 13 à 80 g d'amidon, 10 à 40 go d'une source d'azote organique et un mélange de composés non to- xiques qui en solution fournissent les ions ammonium, calcium, cobalt, fer- reux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, carbonate, chlorure, phosphate et sulfate, ce milieu contenant également, pratiquement depuis le début de la propagation, 5 à 30 grammes d'une huile de glycéride. 



   Bien que l'on ait antérieurement utilisé l'huile de lard avec addition d'alcools supérieurs dans le but d'inhiber la formation de mousse, il n'a été indiqué pour cette utilisation que l'addition de petites quanti- tés, ordinairement 2 à 3 g d'huile par litre de milieu, et cette huile de lard est ajoutée selon les nécessités pour éviter la formation de mousse, la plus grande partie étant nécessaire pour cette destruction de mousse pendant les dernières phases de la fermentation. 



   Quand on utilise l'amidon comme principale source d'hydrate de carbone, on   trouve   que 5 à 30 g d'huile de glycéride par litre accroissent le rendement en chlorotétracycline.L'huile semble agir partiellement comme source assimilable d'énergie, et il se trouve qu'en même temps elle aide au contrôle du pH. Il est commode d'ajouter l'huile au milieu avant sa cuis- son, bien que par des processus aseptiques on puisse l'ajouter au milieu par ailleurs complet juste après son inoculation. Pour obtenir les meilleurs résultats on ne doit pas ajouter L'huile notablement plus tard que le mo- ment auquel on inocule le milieu.

   L'huile peut contenir un alcool supérieur, tel que   l'octadécanol,   et on peut ajouter ultérieurement, pour le contrôle de la formation de mousse,des quantités supplémentaires de la même huile que celle utilisée comme agent nutritif. 



   L'amélioration résultant de l'addition de l'huile de glycéride à un milieu à base d'amidon est particulièrement surprenante car l'addition de la même huile en même quantité à un milieu à base de sucre n'accroît pas le rendement en chlorotétracycline. Dans une série de cycles dans des conditions comparables, on obtient un rendement d'environ 1.500 grammes de chlorotétracycline par litre avec le sucrose comme hydrate de carbone. Quand on introduit 20 grammes par litre d'huile de lard avant la fermentation, le rendement tombe à environ   1.000   g. de chlorotétracyline par litre. Avec un amidon fluidifié,. on obtient un   rendement,   initial de 2.000 g. de chloro- tétracycline par litre.

   Par addition de 20 g d'huile de lard par litre le rendement en chlorotétracycline augmente jusqu'à   30000   g par litre. 



   Si l'on utilise comme hydrate de carbone un mélange d'amidon et de sucre le rendement en chlorotétracyclne obtenu peut être inférieur à ce- lui obtenu avec l'un ou l'autre seul 
L'huile minérale peut servir comme agent de contrôle de mousse avec un sucre comme hydrate de carbone sans la perte de rendement provoquée par les huiles de glycéride. De même l'huile minérale n'a pas l'effet dési- ré d'accroissement du rendement quand on l'utilise dans un milieu à base d'a- midon. 



   Les huiles de glycéride telles que l'huile de lard, l'huile de mais, l'huile d'arachide, l'huile de coton, l'huile de soja, l'huile d'oli- ve, l'huile de spermacéti, l'huile de palme, l'huile de baleine, le monosté- arate de glycéryle et le mono-oléate de glycéryle se scindent partiellement dans la fermentation et aident au contrôle du pH. 

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   Une portion considérable de l'huile peut être isolée après le cycle de fermentation, mais ce résidu a des caractéristiques différentes de celles de l'huile qui a été ajoutéeapparemment à cause de l'action enzymatique pendant la fermentation. 



   Le tableau suivant montre les effets de différentes quantités d'huile de lard en conditions contrôlées, le rendement sans huile étant utilisé comme contrôle. 
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On peut utiliser une huile de glycéride telle que l'huile de lard seule comme source d'énergie, sans amidon ni sucre, mais les rendements obtenus sont de loin inférieurs à ceux obtenus par utilisation d'amidon com- me principale source d'énergie. 



   Les rendements les plus élevés obtenus dans plusieurs milliers de fermentations expérimentales avec des centaines de modifications des in- grédients ont été ceux obtenus avec un milieu contenant 20 g d'huile de lard et 30 g d'amidon par litre de milieu. 



   Bien que les résultats obtenus dans des ballons à agitation pour expériences en laboratoire et des réservoirs de fermentation expérimentale à petite échelle donnent des indications sur les résultats auxquels on peut s'attendre, le seul critère satisfaisant pour la détermination finale des quantités produites est obtenu dans des unités de dimensions industrielles. 



  On a trouvé qu'en quantités industrielles, par exemple dans des réservoirs contenant au moins 378 litres de milieu, on peut obtenir des résultats uni- formément supérieurs par utilisation d'une composition amidon-huile de lard. 



  La mise en route de nombreux réservoirs industriels a confirmé les résultats expérimentaux obtenus à petite échelle et montré sans équivoque qu'un milieu de fermentation à l'amidon-huile de lard accroît la production moyenne géné- rale de chlorotétracycline. 



   Selon une autre caractéristique de l'invention, on a trouvé qu'en utilisant un amidon à fluidité au moins partiellement modifiée par un acide comme source d'hydrate de carbone, de préférence 30 à 60 g par litre de mi- lieu, il est possible d'assurer des rendements uniformément élevés en chlo- rotétracycline avec diverses liqueurs de macération de grains des économies opératoires sont réalisées en particulier dans la stérilisation du milieu de fermentation, ce qui permet une utilisation plus rapide et plus efficace d'un appareillage de fermentation que celle antérieurement connue. L'utili- sation d'un amidon à fluidité modifiée aide également au contrôle de la for- mation de mousse pendant la fermentation. 



   On peut préparer un amidon à fluidité modifiée à partir d'amidon de blé ordinaire en chauffant celui-ci en présence d'ions de chlorure ou sulfate particulièrement en conditions acides grâce à quoi l'amidon est partiellement modifié de telle façon que l'on obtienne un produit plus flui- de. On suppose que l'amidon est partiellement scindé mais pas aussi loin que jusqu'au dextrose.

   Dans le commerce on mesure la fluidité en vitesse d'écou- lement dans un viscosimètre et dans les conditions spécifiées on la donne en nombre de cm3 s'écoulant à travers un   orifice.   U.. amidon brut a une fluidité 

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 d'environ 1 Pour la présente invention une fluidité d'environ 90 est pré- férable.Un amidon commercial particulier tel que celui connu sous la mar- que "Foxhead   140"   présente une humidité de 11 %, une fluidité de 90, une viscosité Scott de 45 à 60 secondes et un pH de 4,8 à 5 avec une teneur en cendres d'approximativement 0,3 % On trouvera une description des procédés d'essais d'amidon dans un article de W.R. Fetzer "Methods in the Starch and Dextrose Industry", Analytical Chemistry 24, 1129-1137 (1952).

   Comme avantage particulier l'utilisation d'amidon¯fluide permet la préparation du milieu de fermentation sous forme d'un concentrât de sorte que l'on peut le cuire sous la forme concentrée, puis le refroidir et le diluer. 



   L'amidon ordinaire donne une masse d'une viscosité tellement élevée qu'il est impossible de préparer un concentrât de plus de deux fois environ la concentration finale et de le manipuler comme un liquide, tan- dis qu'en utilisant l'amidon fluide selon l'invention il est possible de mélanger un milieu à une concentration d'au moins quatre fois la concentra- tion finale de fermentation et de le cuire dans cet état concentré. Le temps nécessaire pour chauffer et refroidir la charge d'un fermentateur à l'état dilué est très long et certaines portions de la charge peuvent être locale- ment surchauffées. Quand on cuit la charge sous forme d'un concentrât on chauffe alors un beaucoup plus petit volume et il est par suite possible d'utiliser un appareillage plus petit et plus économique et de chauffer et refroidir la charge plus rapidement et plus économiquement.

   Dans la mesure où la charge est dégradée par un maintien trop prolongé à température éle- vée, ceci présente un avantage opératoire considérable à la fois du point de vue du transfert thermique amélioré et du fait qu'il est possible de .cuire la charge et d'ajuster la température de fermentation plus facilement et plus rapidement. Pour la dilution on utilise de l'eau stérilisée. Il est plus économique de stériliser l'eau avant son addition à la masse que de tenter de stériliser la masse diluée. L'utilisation d'amidon fluide dans la présente invention permet de traiter davantage de charges par semaine dans un fermentateur donné avec un appareillage auxiliaire-plus petit et avec les avantages opératoires qui en découlent. 



   Dans la mise en pratique de la présente invention il est préfé- rable d'utiliser une couche de   S..   aureofaciens donnant de la chlorotétracy- cline avec un rendement élevé. Les mutantes artificielles et naturelles du S. aureofaciens donnent des rendements variés en produits de fermentation et par le choix des souches de mutantes qui donnent des rendements élevés il est possible d'accroître le rendement en   ehlorotétracycline   à partir d'un fermentateur particulier. Dans la nomenclature scientifique ces souches de mutantes sont classées avec les espècas parentes mais sont désignées par un nom de souche séparé. Dans de nombreux cas les propriétés-descriptives des souches précieuses à haut rendement sont presque impossibles à distin- guer de celles de la souche parente ou les unes des autres.

   Une grande ha- bileté et beaucoup de patience sont nécessaires pour choisir une souche à rendement élevé et avec certaines de ces souches un constituant particulier du milieu lui-même peut agir comme facteur limitatif empêchant un rendement élevé. Des procédés de sélection de souche à rendement élevé sont décrits dans un texte de Jackson W. Foster. "Chemical Activities of Fungi", Académie 
Press, Inc. 1949, pages 209 à 250, dans un chapitre intitulé "Mutations 
Physiological Genetics and Biochemical   Synthèse".   Ce texte expose les muta- tions spontanées et les mutations provoquées en citant des facteurs tels que traitement chimique et par rayonnement pour provoquer des mutations.

   On peut utiliser comme produits chimiques pour provoquer la-mutation l'acide nitreux, la colchicine, le gaz moutarde, les moutardes azotées, des anti-eorps et autres agents.   On   peut utiliser pour provoquer la formation des mutantes des conditions de voisinage telles que l'irradiation par les rayons cathodi- ques, l'uranium, la lumière   ultra-violette,   etc. Une fois la mutation pro- voquée ou se produisant naturellement, il est nécessaire de choisir les sou- ches ayant les caractéristiques désirées. Ce choix est de nature largement 

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 empirique. On peut laisser se produire les modifications ou les provoquer, puis parmi les souches modifiées, on choisit celles qui possèdent les pro- priétés désirées.

   Par un traitement continu et par sélection des souches à rendement élevé après chacun d'une série de traitements, il est possible d'ob- tenir des souches ayant les caractéristiques désirées. Dans le cas présent on désire des souches donnant un rendement élevé en chlorotétracycline et en vitamine B-12. On a utilisé d'autres formes de traitement telles que le traitement par un agent de phagolyse dilué avec d'autres streptomyces tels que par exemple ceux qui sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amé- rique n  2.585.713 du 12 février 1952 pour "Procédé de préparation de A. 



  Griseus résistants aux actinophages et de préparation de la streptomycine". 



  Beaucoup de ces procédés peuvent être adaptés à l'utilisation avec l'orga- nisme s. aureofaciens pour l'obtention d'une souche ayant une propriété dé- sirée. Dans le travail sur le plan industriel naturellement il est habituel de tenter continuellement d'améliorer les souches de façon à atteindre à tout moment le rendement le plus élevé possible. 



   L'invention sera illustrée par l'exemple particulier suivant : 
On introduit dans un groupe de fermentateurs de taille industriel- le un milieu de fermentation préparé par mélange d'ingrédients à quadruple concentration suffisante pour donner une masse finale contenant par litre 30 g de liqueur de macération de grains (50 % de solides, qualité pour péni- cilline) 30 g d'amidon de fluidité 90/9 g de carbonate de calcium (qualité Pharmacopée U. S.), 3,3 g de sulfate d'ammonium, 1 g de chlorure d'ammonium, 2 g de chlorure de magnésium hexahydraté, 100 mg de sulfate de zinc hepta- hydraté, ainsi que des traces de fer, de manganèse et de cobalt et 10 gram- mes d'huile de lard (de la firme Armour spécialement hibernée).On cuit la masse à 1200 pendant 30 minutes, on la refroidit et on la dilue à son volu- me par de l'eau stérilisée.

   On inocule les réservoirs par 40 cc par litre d'un réservoir de germe. On aère les réservoirs et on les agite en ajoutant de l'huile de lard supplémentaire comme il est nécessaire pour empêcher la formation de mousse, puis on effectue la récolte après approximativement 60 heures de fermentation à 27 . On obtient un rendement moyen de 2. 500 mg de chlorotétracycline par litre. 



   REVENDICATIONS. 



   1. Procédé de préparation de chlorotétracycline par propagation de   streptomvces   aureofaciens dans un milieu nutritif par fermentation aéro- bie immergée, caractérisé en ce que le milieu nutritif comprend un milieu, aqueux cuit contenant en poids, par litre, 13 à 80 g d'amidon, 10 à 40 g d'une source d'azote organique et un mélange de composés non toxiques four- nissant en solution des ions ammonium, calcium, cobalt, ferreux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, carbonate, chlorure, phosphate et sulfate, et également sensiblement depuis le début de la propagation, 5 à 30 g d'une huile de glycéride.

Claims (1)

1. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit l'huile de glycéride dans le groupe constitué par l'huile de lard, l'huile de maïs ,l'huile d'arachide, l'huile de coton, l'huile de soja, l'huile d'olive, l'huile de spermaceti, l'huile de palme, l'huile de balei- ne, le monostéarate de glycéryle et le mono-oléate de glycéryle.

   3. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la source d'azote organique est une liqueur de macé- ration de maïs.

   4. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'amidon est un amidon à fluidité au moins partielle- ment modifiée par un acide, de préférence un amidon de fluidité 90. <Desc/Clms Page number 6>

   5, Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on fait se propager une souche mutante de S. aureofa- ciens à haute rendement en chlorotétracycline.

   6. Milieu aqueux cuit pour là production de la chlorotétracycli- ne par fermentation aérobie immergée du S. aureofaciens,.caractérisé en ce qu'il contient en poids par litre 13 à 80 g d'amidon, 10 à 40 g d'une sour- ce d'azote organique et un mélange de composés non toxiques fournissant en solution des ions ammonium, calcium, cobalt, ferreux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, carboante, chlorure, phosphate et sulfate, et également, sensiblement depuis le début de la propagation, 5 à 30 g d'une huile de gly- céride 7 Milieu suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on choisit l'huile de glycéride dans le groupe constitué par l'huile de lard, l'huile de mais l'huile d'arachide, l'huile de coton, l'huile de soja, l'huile d'olive, l'huile de spermaceti, l'huile de palme, l'huile de balei- ne,

   le monostéarate de glycéryle et le mono-oléate de glycéryle.

   8. Milieu suivant l'une ou l'autre des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la source d'azote organique est une liqueur de macé- ration de maïs