<Desc/Clms Page number 1>
AMERICAN CYANAMID COMPANY, résidant à NEW YORK.
PERFECTIONNEMENTS A LA PREPARATION DE SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES.
La présente addition concerne la production de la chlorotétra- cycline par propagation du Streptomvces aureofaciens dans un milieu nutri- tif par fermentation aérobie immergée.
Le but principal de la présente addition est l'augmentation du rendement en chlorotétracycline et la diminution du prix de production en faisant se développer l'organisme S.aureofaiens dans des conditions telles que l'on obtienne la chlorotétracycline au prix minimum.
Dans les procédés connus de production de chlorotétracycline par propagation du S.aureofaciens dans un milieu de culture aqueux, trois classes de matières sont nécessaires pour la production maximum de chloro- tétracycline : a) une source d'azote organique telle qu'une liqueur de macéra- tion de grains; b) un hydrate de carbone tel que l'amidon ou un sucre ; la présente invention on utilise l'amidon comme hydrate de carbone et on le remplace partiellement par l'huile de glycéride comme source d'énergie; c) un supplément minéral contenant les ions minéraux ammonium, cobalt, ferreux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, chlorure, phospha- te et sulfate ; une quantité précipitant la chlorotétracycline d'anions alcalino-terreux, de préférence du carbonate de calcium.
Le carbonate de calcium stabilise également le pH dans l'intervalle désiré.
<Desc/Clms Page number 2>
On prépare le milieu en mélangeant avec un groupe de sels four- nissant les ions minéraux désirés l'amidon et la liqueur de macération de grains et en faisant cuire suffisamment pour détruire les microorganismes contaminants puis en refroidissant, en inoculant et en faisant fermenter.
Selon la présente invention le milieu nutritif consiste en un milieu aqueux cuit comprenant, en poids, par litre, 13 à 80 g d'amidon, 10 à 40 go d'une source d'azote organique et un mélange de composés non to- xiques qui en solution fournissent les ions ammonium, calcium, cobalt, fer- reux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, carbonate, chlorure, phosphate et sulfate, ce milieu contenant également, pratiquement depuis le début de la propagation, 5 à 30 grammes d'une huile de glycéride.
Bien que l'on ait antérieurement utilisé l'huile de lard avec addition d'alcools supérieurs dans le but d'inhiber la formation de mousse, il n'a été indiqué pour cette utilisation que l'addition de petites quanti- tés, ordinairement 2 à 3 g d'huile par litre de milieu, et cette huile de lard est ajoutée selon les nécessités pour éviter la formation de mousse, la plus grande partie étant nécessaire pour cette destruction de mousse pendant les dernières phases de la fermentation.
Quand on utilise l'amidon comme principale source d'hydrate de carbone, on trouve que 5 à 30 g d'huile de glycéride par litre accroissent le rendement en chlorotétracycline.L'huile semble agir partiellement comme source assimilable d'énergie, et il se trouve qu'en même temps elle aide au contrôle du pH. Il est commode d'ajouter l'huile au milieu avant sa cuis- son, bien que par des processus aseptiques on puisse l'ajouter au milieu par ailleurs complet juste après son inoculation. Pour obtenir les meilleurs résultats on ne doit pas ajouter L'huile notablement plus tard que le mo- ment auquel on inocule le milieu.
L'huile peut contenir un alcool supérieur, tel que l'octadécanol, et on peut ajouter ultérieurement, pour le contrôle de la formation de mousse,des quantités supplémentaires de la même huile que celle utilisée comme agent nutritif.
L'amélioration résultant de l'addition de l'huile de glycéride à un milieu à base d'amidon est particulièrement surprenante car l'addition de la même huile en même quantité à un milieu à base de sucre n'accroît pas le rendement en chlorotétracycline. Dans une série de cycles dans des conditions comparables, on obtient un rendement d'environ 1.500 grammes de chlorotétracycline par litre avec le sucrose comme hydrate de carbone. Quand on introduit 20 grammes par litre d'huile de lard avant la fermentation, le rendement tombe à environ 1.000 g. de chlorotétracyline par litre. Avec un amidon fluidifié,. on obtient un rendement, initial de 2.000 g. de chloro- tétracycline par litre.
Par addition de 20 g d'huile de lard par litre le rendement en chlorotétracycline augmente jusqu'à 30000 g par litre.
Si l'on utilise comme hydrate de carbone un mélange d'amidon et de sucre le rendement en chlorotétracyclne obtenu peut être inférieur à ce- lui obtenu avec l'un ou l'autre seul
L'huile minérale peut servir comme agent de contrôle de mousse avec un sucre comme hydrate de carbone sans la perte de rendement provoquée par les huiles de glycéride. De même l'huile minérale n'a pas l'effet dési- ré d'accroissement du rendement quand on l'utilise dans un milieu à base d'a- midon.
Les huiles de glycéride telles que l'huile de lard, l'huile de mais, l'huile d'arachide, l'huile de coton, l'huile de soja, l'huile d'oli- ve, l'huile de spermacéti, l'huile de palme, l'huile de baleine, le monosté- arate de glycéryle et le mono-oléate de glycéryle se scindent partiellement dans la fermentation et aident au contrôle du pH.
<Desc/Clms Page number 3>
Une portion considérable de l'huile peut être isolée après le cycle de fermentation, mais ce résidu a des caractéristiques différentes de celles de l'huile qui a été ajoutéeapparemment à cause de l'action enzymatique pendant la fermentation.
Le tableau suivant montre les effets de différentes quantités d'huile de lard en conditions contrôlées, le rendement sans huile étant utilisé comme contrôle.
EMI3.1
<tb>
% <SEP> l'huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> en <SEP> poids <SEP> Rendement <SEP> relatif
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> 180
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 190
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1,5 <SEP> 165
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 190
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,5 <SEP> 250
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,0 <SEP> 245
<tb>
On peut utiliser une huile de glycéride telle que l'huile de lard seule comme source d'énergie, sans amidon ni sucre, mais les rendements obtenus sont de loin inférieurs à ceux obtenus par utilisation d'amidon com- me principale source d'énergie.
Les rendements les plus élevés obtenus dans plusieurs milliers de fermentations expérimentales avec des centaines de modifications des in- grédients ont été ceux obtenus avec un milieu contenant 20 g d'huile de lard et 30 g d'amidon par litre de milieu.
Bien que les résultats obtenus dans des ballons à agitation pour expériences en laboratoire et des réservoirs de fermentation expérimentale à petite échelle donnent des indications sur les résultats auxquels on peut s'attendre, le seul critère satisfaisant pour la détermination finale des quantités produites est obtenu dans des unités de dimensions industrielles.
On a trouvé qu'en quantités industrielles, par exemple dans des réservoirs contenant au moins 378 litres de milieu, on peut obtenir des résultats uni- formément supérieurs par utilisation d'une composition amidon-huile de lard.
La mise en route de nombreux réservoirs industriels a confirmé les résultats expérimentaux obtenus à petite échelle et montré sans équivoque qu'un milieu de fermentation à l'amidon-huile de lard accroît la production moyenne géné- rale de chlorotétracycline.
Selon une autre caractéristique de l'invention, on a trouvé qu'en utilisant un amidon à fluidité au moins partiellement modifiée par un acide comme source d'hydrate de carbone, de préférence 30 à 60 g par litre de mi- lieu, il est possible d'assurer des rendements uniformément élevés en chlo- rotétracycline avec diverses liqueurs de macération de grains des économies opératoires sont réalisées en particulier dans la stérilisation du milieu de fermentation, ce qui permet une utilisation plus rapide et plus efficace d'un appareillage de fermentation que celle antérieurement connue. L'utili- sation d'un amidon à fluidité modifiée aide également au contrôle de la for- mation de mousse pendant la fermentation.
On peut préparer un amidon à fluidité modifiée à partir d'amidon de blé ordinaire en chauffant celui-ci en présence d'ions de chlorure ou sulfate particulièrement en conditions acides grâce à quoi l'amidon est partiellement modifié de telle façon que l'on obtienne un produit plus flui- de. On suppose que l'amidon est partiellement scindé mais pas aussi loin que jusqu'au dextrose.
Dans le commerce on mesure la fluidité en vitesse d'écou- lement dans un viscosimètre et dans les conditions spécifiées on la donne en nombre de cm3 s'écoulant à travers un orifice. U.. amidon brut a une fluidité
<Desc/Clms Page number 4>
d'environ 1 Pour la présente invention une fluidité d'environ 90 est pré- férable.Un amidon commercial particulier tel que celui connu sous la mar- que "Foxhead 140" présente une humidité de 11 %, une fluidité de 90, une viscosité Scott de 45 à 60 secondes et un pH de 4,8 à 5 avec une teneur en cendres d'approximativement 0,3 % On trouvera une description des procédés d'essais d'amidon dans un article de W.R. Fetzer "Methods in the Starch and Dextrose Industry", Analytical Chemistry 24, 1129-1137 (1952).
Comme avantage particulier l'utilisation d'amidon¯fluide permet la préparation du milieu de fermentation sous forme d'un concentrât de sorte que l'on peut le cuire sous la forme concentrée, puis le refroidir et le diluer.
L'amidon ordinaire donne une masse d'une viscosité tellement élevée qu'il est impossible de préparer un concentrât de plus de deux fois environ la concentration finale et de le manipuler comme un liquide, tan- dis qu'en utilisant l'amidon fluide selon l'invention il est possible de mélanger un milieu à une concentration d'au moins quatre fois la concentra- tion finale de fermentation et de le cuire dans cet état concentré. Le temps nécessaire pour chauffer et refroidir la charge d'un fermentateur à l'état dilué est très long et certaines portions de la charge peuvent être locale- ment surchauffées. Quand on cuit la charge sous forme d'un concentrât on chauffe alors un beaucoup plus petit volume et il est par suite possible d'utiliser un appareillage plus petit et plus économique et de chauffer et refroidir la charge plus rapidement et plus économiquement.
Dans la mesure où la charge est dégradée par un maintien trop prolongé à température éle- vée, ceci présente un avantage opératoire considérable à la fois du point de vue du transfert thermique amélioré et du fait qu'il est possible de .cuire la charge et d'ajuster la température de fermentation plus facilement et plus rapidement. Pour la dilution on utilise de l'eau stérilisée. Il est plus économique de stériliser l'eau avant son addition à la masse que de tenter de stériliser la masse diluée. L'utilisation d'amidon fluide dans la présente invention permet de traiter davantage de charges par semaine dans un fermentateur donné avec un appareillage auxiliaire-plus petit et avec les avantages opératoires qui en découlent.
Dans la mise en pratique de la présente invention il est préfé- rable d'utiliser une couche de S.. aureofaciens donnant de la chlorotétracy- cline avec un rendement élevé. Les mutantes artificielles et naturelles du S. aureofaciens donnent des rendements variés en produits de fermentation et par le choix des souches de mutantes qui donnent des rendements élevés il est possible d'accroître le rendement en ehlorotétracycline à partir d'un fermentateur particulier. Dans la nomenclature scientifique ces souches de mutantes sont classées avec les espècas parentes mais sont désignées par un nom de souche séparé. Dans de nombreux cas les propriétés-descriptives des souches précieuses à haut rendement sont presque impossibles à distin- guer de celles de la souche parente ou les unes des autres.
Une grande ha- bileté et beaucoup de patience sont nécessaires pour choisir une souche à rendement élevé et avec certaines de ces souches un constituant particulier du milieu lui-même peut agir comme facteur limitatif empêchant un rendement élevé. Des procédés de sélection de souche à rendement élevé sont décrits dans un texte de Jackson W. Foster. "Chemical Activities of Fungi", Académie
Press, Inc. 1949, pages 209 à 250, dans un chapitre intitulé "Mutations
Physiological Genetics and Biochemical Synthèse". Ce texte expose les muta- tions spontanées et les mutations provoquées en citant des facteurs tels que traitement chimique et par rayonnement pour provoquer des mutations.
On peut utiliser comme produits chimiques pour provoquer la-mutation l'acide nitreux, la colchicine, le gaz moutarde, les moutardes azotées, des anti-eorps et autres agents. On peut utiliser pour provoquer la formation des mutantes des conditions de voisinage telles que l'irradiation par les rayons cathodi- ques, l'uranium, la lumière ultra-violette, etc. Une fois la mutation pro- voquée ou se produisant naturellement, il est nécessaire de choisir les sou- ches ayant les caractéristiques désirées. Ce choix est de nature largement
<Desc/Clms Page number 5>
empirique. On peut laisser se produire les modifications ou les provoquer, puis parmi les souches modifiées, on choisit celles qui possèdent les pro- priétés désirées.
Par un traitement continu et par sélection des souches à rendement élevé après chacun d'une série de traitements, il est possible d'ob- tenir des souches ayant les caractéristiques désirées. Dans le cas présent on désire des souches donnant un rendement élevé en chlorotétracycline et en vitamine B-12. On a utilisé d'autres formes de traitement telles que le traitement par un agent de phagolyse dilué avec d'autres streptomyces tels que par exemple ceux qui sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amé- rique n 2.585.713 du 12 février 1952 pour "Procédé de préparation de A.
Griseus résistants aux actinophages et de préparation de la streptomycine".
Beaucoup de ces procédés peuvent être adaptés à l'utilisation avec l'orga- nisme s. aureofaciens pour l'obtention d'une souche ayant une propriété dé- sirée. Dans le travail sur le plan industriel naturellement il est habituel de tenter continuellement d'améliorer les souches de façon à atteindre à tout moment le rendement le plus élevé possible.
L'invention sera illustrée par l'exemple particulier suivant :
On introduit dans un groupe de fermentateurs de taille industriel- le un milieu de fermentation préparé par mélange d'ingrédients à quadruple concentration suffisante pour donner une masse finale contenant par litre 30 g de liqueur de macération de grains (50 % de solides, qualité pour péni- cilline) 30 g d'amidon de fluidité 90/9 g de carbonate de calcium (qualité Pharmacopée U. S.), 3,3 g de sulfate d'ammonium, 1 g de chlorure d'ammonium, 2 g de chlorure de magnésium hexahydraté, 100 mg de sulfate de zinc hepta- hydraté, ainsi que des traces de fer, de manganèse et de cobalt et 10 gram- mes d'huile de lard (de la firme Armour spécialement hibernée).On cuit la masse à 1200 pendant 30 minutes, on la refroidit et on la dilue à son volu- me par de l'eau stérilisée.
On inocule les réservoirs par 40 cc par litre d'un réservoir de germe. On aère les réservoirs et on les agite en ajoutant de l'huile de lard supplémentaire comme il est nécessaire pour empêcher la formation de mousse, puis on effectue la récolte après approximativement 60 heures de fermentation à 27 . On obtient un rendement moyen de 2. 500 mg de chlorotétracycline par litre.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de préparation de chlorotétracycline par propagation de streptomvces aureofaciens dans un milieu nutritif par fermentation aéro- bie immergée, caractérisé en ce que le milieu nutritif comprend un milieu, aqueux cuit contenant en poids, par litre, 13 à 80 g d'amidon, 10 à 40 g d'une source d'azote organique et un mélange de composés non toxiques four- nissant en solution des ions ammonium, calcium, cobalt, ferreux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, carbonate, chlorure, phosphate et sulfate, et également sensiblement depuis le début de la propagation, 5 à 30 g d'une huile de glycéride.
<Desc / Clms Page number 1>
AMERICAN CYANAMID COMPANY, residing in NEW YORK.
IMPROVEMENTS IN THE PREPARATION OF ANTIBIOTIC SUBSTANCES.
The present addition relates to the production of chlorotetracyclin by propagation of Streptomyces aureofaciens in a nutrient medium by submerged aerobic fermentation.
The main purpose of the present addition is to increase the yield of chlorotetracycline and decrease the cost of production by growing the organism S. aureofaiens under conditions such that chlorotetracycline is obtained at the minimum price.
In the known methods of producing chlorotetracycline by propagation of S. aureofaciens in an aqueous culture medium, three classes of materials are required for the maximum production of chlorotetracycline: a) an organic nitrogen source such as a liquor of maceration of grains; b) a carbohydrate such as starch or a sugar; the present invention uses starch as a carbohydrate and is partially replaced by glyceride oil as an energy source; c) a mineral supplement containing the mineral ions ammonium, cobalt, ferrous, magnesium, manganous, potassium, zinc, chloride, phosphate and sulfate; a chlorotetracycline precipitating amount of alkaline earth anions, preferably calcium carbonate.
Calcium carbonate also stabilizes the pH in the desired range.
<Desc / Clms Page number 2>
The medium is prepared by mixing starch and grain maceration liquor with a group of salts providing the desired mineral ions and cooking sufficiently to destroy contaminating microorganisms followed by cooling, inoculating and fermenting.
According to the present invention the nutrient medium consists of a cooked aqueous medium comprising, by weight, per liter, 13 to 80 g of starch, 10 to 40 g of an organic nitrogen source and a mixture of non-toxic compounds. which in solution furnish the ammonium, calcium, cobalt, fer- rous, magnesium, manganous, potassium, zinc, carbonate, chloride, phosphate and sulphate ions, this medium also containing, practically from the start of propagation, 5 to 30 grams of 'a glyceride oil.
Although lard oil with the addition of higher alcohols has previously been used for the purpose of inhibiting foaming, only the addition of small amounts has been indicated for this use, usually the addition of small amounts. 2 to 3 g of oil per liter of medium, and this bacon oil is added as needed to avoid the formation of foam, the greater part being necessary for this destruction of foam during the last phases of the fermentation.
When starch is used as the main source of carbohydrate, 5 to 30 g of glyceride oil per liter has been found to increase the yield of chlorotetracycline. The oil appears to act partially as an available source of energy, and it it turns out that at the same time it helps to control the pH. It is convenient to add the oil to the medium before it is cooked, although by aseptic procedures it can be added to the otherwise complete medium just after its inoculation. For best results the oil should not be added significantly later than the time at which the medium is inoculated.
The oil may contain a higher alcohol, such as octadecanol, and additional amounts of the same oil as used as a nutrient may be added later for the control of foaming.
The improvement resulting from the addition of the glyceride oil to a starch-based medium is particularly surprising because adding the same oil in the same amount to a sugar-based medium does not increase the yield of chlorotetracycline. In a series of cycles under comparable conditions, a yield of about 1,500 grams of chlorotetracycline per liter is obtained with sucrose as carbohydrate. When 20 grams per liter of bacon oil are introduced before fermentation, the yield drops to about 1,000 g. of chlorotetracyline per liter. With a fluidized starch ,. an initial yield of 2,000 g is obtained. of chlorotetracycline per liter.
By adding 20 g of bacon oil per liter, the yield of chlorotetracycline increases to 30,000 g per liter.
If a mixture of starch and sugar is used as the carbohydrate, the yield of chlorotetracyclne obtained may be lower than that obtained with one or the other alone.
Mineral oil can serve as a foam control agent with sugar as a carbohydrate without the loss in yield caused by glyceride oils. Likewise, mineral oil does not have the desired yield enhancing effect when used in a starch medium.
Glyceride oils such as bacon oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, soybean oil, olive oil, coconut oil. spermaceti, palm oil, whale oil, glyceryl monostearate and glyceryl mono-oleate partially split in fermentation and aid in pH control.
<Desc / Clms Page number 3>
A considerable portion of the oil can be isolated after the fermentation cycle, but this residue has different characteristics from those of the oil which was added apparently due to the enzymatic action during fermentation.
The following table shows the effects of different amounts of bacon oil under controlled conditions, the oil-free yield being used as a control.
EMI3.1
<tb>
% <SEP> oil <SEP> from <SEP> bacon <SEP> in <SEP> weight <SEP> Relative yield <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.5 <SEP> 180
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1.0 <SEP> 190
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1.5 <SEP> 165
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2.0 <SEP> 190
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2.5 <SEP> 250
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3.0 <SEP> 245
<tb>
A glyceride oil such as bacon oil can be used alone as an energy source, without starch or sugar, but the yields obtained are far lower than those obtained by using starch as the main source of energy. .
The highest yields obtained in several thousand experimental fermentations with hundreds of modification of the ingredients were those obtained with a medium containing 20 g of bacon oil and 30 g of starch per liter of medium.
Although the results obtained in shaker flasks for laboratory experiments and small-scale experimental fermentation tanks give indications of the results to be expected, the only satisfactory criterion for the final determination of the quantities produced is obtained in units of industrial dimensions.
It has been found that in industrial quantities, for example in tanks containing at least 378 liters of medium, uniformly superior results can be obtained by using a starch-bacon oil composition.
The start-up of numerous industrial reservoirs confirmed the experimental results obtained on a small scale and showed unequivocally that a starch-lard oil fermentation medium increases the general average production of chlorotetracycline.
According to another characteristic of the invention, it has been found that by using a starch with a fluidity at least partially modified by an acid as a source of carbohydrate, preferably 30 to 60 g per liter of medium, it is possible to ensure uniformly high yields of chlorotetracycline with various grain maceration liquors operational savings are achieved especially in the sterilization of the fermentation medium, which allows faster and more efficient use of fermentation equipment than that previously known. The use of a fluidity modified starch also aids in the control of foam formation during fermentation.
A fluidity-modified starch can be prepared from ordinary wheat starch by heating it in the presence of chloride or sulfate ions particularly under acidic conditions whereby the starch is partially modified such that one. obtains a more fluid product. It is assumed that the starch is partially split but not as far as up to dextrose.
In the marketplace, the fluidity is measured by flow rate in a viscometer and under the specified conditions it is given in number of cm 3 flowing through an orifice. U .. raw starch has a fluidity
<Desc / Clms Page number 4>
of about 1 For the present invention a fluidity of about 90 is preferred. A particular commercial starch such as that known by the trademark "Foxhead 140" has a moisture of 11%, a fluidity of 90, a viscosity Scott from 45 to 60 seconds and a pH of 4.8 to 5 with an ash content of approximately 0.3%. A description of the starch test methods can be found in an article by WR Fetzer "Methods in the Starch. and Dextrose Industry ", Analytical Chemistry 24, 1129-1137 (1952).
As a particular advantage the use of fluid starch allows the preparation of the fermentation medium in the form of a concentrate so that it can be cooked in the concentrated form, then cooled and diluted.
Ordinary starch gives a mass of such a high viscosity that it is impossible to prepare a concentrate of more than about twice the final concentration and to handle it as a liquid, while using the fluid starch according to the invention it is possible to mix a medium at a concentration of at least four times the final fermentation concentration and to cook it in this concentrated state. The time required to heat and cool the batch of a diluted fermenter is very long and some portions of the batch can be locally superheated. When the batch is fired as a concentrate then a much smaller volume is heated and it is therefore possible to use smaller and more economical equipment and to heat and cool the batch faster and more economically.
Insofar as the charge is degraded by holding too long at a high temperature, this presents a considerable operational advantage both from the point of view of the improved heat transfer and from the fact that it is possible to cook the charge and to adjust the fermentation temperature more easily and quickly. For the dilution, sterilized water is used. It is more economical to sterilize the water before adding it to the mass than to attempt to sterilize the diluted mass. The use of flowable starch in the present invention allows more feeds per week to be processed in a given fermenter with smaller ancillary equipment and with the operational advantages that follow.
In the practice of the present invention it is preferred to use a layer of S. aureofaciens yielding chlorotetracycline in high yield. The artificial and natural mutants of S. aureofaciens give varied yields of fermentation products and by the choice of strains of mutants which give high yields it is possible to increase the yield of ehlorotetracycline from a particular fermenter. In scientific nomenclature these mutant strains are classified with the parent species but are designated by a separate strain name. In many cases the descriptive properties of valuable high yielding strains are almost indistinguishable from those of the parent strain or from each other.
A great deal of skill and patience is required in choosing a high yielding strain and with some of these strains a particular constituent of the medium itself may act as a limiting factor preventing a high yield. High yield strain selection methods are described in a text by Jackson W. Foster. "Chemical Activities of Fungi", Academy
Press, Inc. 1949, pages 209-250, in a chapter entitled "Mutations
Physiological Genetics and Biochemical Synthesis. ”This text discusses spontaneous mutations and induced mutations citing factors such as chemical and radiation treatment to induce mutations.
Nitrous acid, colchicine, mustard gas, nitrogen mustards, anti-bodies and other agents can be used as chemicals to induce the mutation. Neighboring conditions such as irradiation with cathode rays, uranium, ultraviolet light, etc. can be used to induce mutant formation. Once the mutation is caused or occurs naturally, it is necessary to choose the strains with the desired characteristics. This choice is largely
<Desc / Clms Page number 5>
empirical. The modifications can be allowed to occur or be induced, and then among the modified strains, those which have the desired properties are chosen.
By continuous treatment and selection of the high yielding strains after each of a series of treatments, it is possible to obtain strains with the desired characteristics. In the present case, strains giving a high yield of chlorotetracycline and vitamin B-12 are desired. Other forms of treatment have been used such as treatment with a diluted phagolysis agent with other streptomyces such as, for example, those described in US Pat. No. 2,585,713 of 12. February 1952 for "Method of preparation of A.
Griseus resistant to actinophages and streptomycin preparation ".
Many of these methods can be adapted for use with the body. aureofaciens to obtain a strain having a desired property. In industrial work, of course, it is customary to continually try to improve strains so as to achieve the highest possible yield at all times.
The invention will be illustrated by the following specific example:
A fermentation medium prepared by mixing ingredients at quadruple concentration sufficient to give a final mass containing per liter 30 g of grain maceration liquor (50% solids, quality for each liter) is introduced into a group of fermenters of industrial size. penicillin) 30 g of starch with a flow rate of 90/9 g of calcium carbonate (US Pharmacopoeia grade), 3.3 g of ammonium sulfate, 1 g of ammonium chloride, 2 g of magnesium chloride hexahydrate , 100 mg of zinc sulfate heptahydrate, as well as traces of iron, manganese and cobalt and 10 grams of bacon oil (from the firm Armor specially hibernated). The mass is cooked at 1200 for 30 minutes, it is cooled and diluted to its volume with sterilized water.
The reservoirs are inoculated with 40 cc per liter of a germ reservoir. The tanks are aerated and agitated with the addition of additional bacon oil as necessary to prevent foaming, then harvested after approximately 60 hours of fermentation at 27. An average yield of 2,500 mg of chlorotetracycline per liter is obtained.
CLAIMS.
1. Process for preparing chlorotetracycline by propagation of streptomvces aureofaciens in a nutrient medium by submerged aerobic fermentation, characterized in that the nutrient medium comprises a cooked aqueous medium containing, by weight, per liter, 13 to 80 g of starch , 10 to 40 g of an organic nitrogen source and a mixture of non-toxic compounds providing in solution ammonium, calcium, cobalt, ferrous, magnesium, manganous, potassium, zinc, carbonate, chloride, phosphate and sulfate ions , and also substantially from the start of propagation, 5 to 30 g of a glyceride oil.