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La présente invention concerne la préparation de la 1-lysine, un amino acide essentiel.
Un certain nombre d'aliments, en particulier ceux contenant des grai- nes de céréales, ou des produits en dérivant, manquent de l'amino-acide essen- tiel, la 1-lysine. Les amino-acides essentiels sont ceux qui sont nécessaires aux animaux pour leur maintien et leur croissance. Le corps animal n'est pas capable de synthétiser les amino-acides nécessaires à la formation de la proté- ine animale. Il y a un grand nombre d'amino-acides essentiels, et, par chance, la plus grande partie de la matière protéinique est faite d'un équilibre de ceux-ci de sorte que quand cette protéine est consommée, on dispose d'une alimen- tation suffisante en amino-acides appropriés après la digestion pour reconstitu- er la matière protéinique nécessaire pour la croissance des animaux.
Bien que la plus grande partie de la matière protéinique d'origine animale contienne un équilibre adéquat d'amino-acides essentiels, et bien que certaines matières protéiniques d'origine végétale conviennent à la croissance appropriée des ani- maux, un grand nombre de produits alimentaires manquent de la protéine qui don- nerait tous les amino-acides essentiels. Ceci est particulièrement le cas des protéines dérivés des graines de céréales telles que le riz, l'avoine, et le mais. Récemment, il est apparu que de nombreux aliments consommés par les ani- maux, y compris l'homme, ont besoin d'être complétés par la 1-lysine en vue de donner un équilibre approprié des amino-acides essentiels pour que ces aliments soient plus efficaces pour l'entretien et la croissance du corps animal.
Bien que l'on puisse préparer synthétiquement et par des processus de fermentation de bactéries la 1-lysine, ces procédés sont très coûteux et tendent à limiter l'emploi de la lysine comme complément alimentaire. Il était donc désirable de mettre au point un procédé bon marché de préparation de la 1- lysine sous une forme convenant à l'addition à la nourriture des animaux. La présente invention fournit un tel procédé.
Le procédé selon l'invention de préparation de la 1-lysine
EMI1.1
consiste à soumettre à l'action des enzymes de la levure un acide organique choisi dans le groupe constitué par
EMI1.2
0 0 (I) acide 5-formYl-2-oxovalérique CHOH2GH2CH2COOOH NE2 (Il) acide alpha-aminoadipique OOOHCH2CHCOOH 0 Il (III) acide alpha-cétoadipique 000HOH2CH2cH20COOH
Bien que 1 on sache que l'on peut préparer la 1-lysine par certains micro-organismes en utilisant certains précurseurs particuliers tels que l'acide diaminopimélique, on pense que l'on n'avait encore jamais découvert que les enzymes de la levure ont la propriété de transformer les acides organiques pré- cités en 1-lysine en quantités de loin supérieures à celles nécessaires à la cellule de la levure pour sa teneur en protéine.
En d'autres termes, on peut extraire la 1-lysine du milieu aqueux nutritif dans lequel croissent les cellu- les aussi bien que des cellules de levure sans qu'il soit nécessaire d'hydrolyser la protéine de la levure pour libérer la 1-lysine. La quantité de 1-lysine pro- duite peut être très élevée et comme les acides organiques précités peuvent être facilement synthétisés en quantités illimités et à bas prix, ce nouveau procédé donne un moyen d'obtention de la 1-lysine à bon marché et en quantités illimitées.
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Un des très importants avantages de l'invention découle du fait que l'on a fait croître de la levure à l'échelle industrielle depuis de nombreuses années comme source de nourriture animale. Il n'est donc pas nécessaire de mettre au point aucune nouvelle technique ou appareillage pour obtenir la 1-lysine sous une forme comestible. Si on le désire, on peut simplement ajouter la totalité de la liqueur de fermentation résultant du développement de cellules de levure dans un milieu contenant de l'acide 5-formyl -2-oxovalérique à des aliments pour animaux, sans.aucun traitement quel qu'il soit pour accroître la valeur nutritive de ces nourritures grâce aux quantités relativement grandes de lysine contenues dans toute la masse de fermentation.
Cette masse de fermentation peut être séchée et emballée et envoyée n'importe où, où elle est nécessaire. Selon une variante, on peut séparer de la masse les cellules de levure, les laver et les sécher et les utiliser partout où des cellules de levure seront utilisées comme complément alimentaire. La nouvelle levure obtenue par le procédé de l'invention est particulièrement efficace de ce point de vue car au lieu de ne contenir que 3 à 4 % de 1-lysine dont la plus grande partie est liée sous forme protéinique, les nouvelles cellules de levure préparées par le procédé qui sera décrit ci-après, peuvent contenir jusqu'à 20 % de 1-lysine, dont la plus grande partie sous forme de lysine libre.
Naturellement, si on le désire, on peut traiter les cellules de levure de la présente invention pour en libérer la teneur en lysine et en récupérer la 1-lysine libre sous forme pratiquement pure dans.les cas où l'on a besoin de lysine essentiellement pure.
Bien qu'un mode de mise en pratique préféré de l'invention consiste à ajouter un des acides organiques précités à une fermentation de levure et à lui permettre de se transformer en 1-lysine par les enzymes de la levure simul- tanément à la production de nouvelles cellules de levure, ces enzymes contenues dans les cellules de levure au repos peuvent également transformer ce précur- seur en 1-lysine. Tout ce qui est nécessaire dans cette réalisation de l'inven- tion est de mélanger cet acide organique avec des cellules de levure dans une suspension aqueuse et laisser les enzymes contenues dans les cellules de levure effectuer la conversion, de préférence en agitant et en aérant le mélange.
Cette conversion par les cellules au repos de levure intervient sur un inter- valle de pH de 2,5 à 8,5, de préférence de 3,0 à 5,0 et sur un large interval- le de température, par exemple de 5 à 50 . Une conversion notable est obtenue en 24 h à température ambiante bien que la période de temps puisse aller d'aussi peu qu'une heure à 48 h ou plus selon le pH, la température, le taux d'aération, l'agitation et autres facteurs.
Un autre mode de réalisation de l'invention, qui ne serait normale- mentpas utilisé dans la fabrication industrielle de la lysine consiste à rompre les cellules de la levure par des moyens physiques ou chimiques pour libérer les enzymes qu'elles contiennent et à ajouter l'un des acides organiques précités, ,de telle sorte qu'il soit converti en la 1-lysine désirée par les enzymes en solution.
Bien qu'il ait été indiqué ci-dessus que les acides organiques préci- tés sont convertis en 1-lysine par l'action des enzymes de la levure, on notera que le mécanisme de la conversion n'est pas connu avec certitude. En fait, il est possible qu'un mécanisme autre que l'action enzymatique intervienne. Sur la base de l'expérience cependant, il apparaît que la conversion résulte des enzy- mes, mais par plus d'une étape et probablement plusieurs. Il est bien entendu par conséquent que la présente invention n'est liée à aucune théorie. Le fait est que les acides organiques précités sont convertis en 1-lysine par biosyn- thèse avec un excellent rendement sous l'action des cellules de levure.
On com- prendra mieux l'invention grâce à la description suivante se référant aux exem- ples suivants.
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EXEMPLE 1 On prépare un milieu synthétique avec les composants suivants :
EMI3.1
<tb> Ingrédient <SEP> Milieu <SEP> synthétique
<tb>
<tb> puissance <SEP> finale <SEP> du <SEP> milieu <SEP> en <SEP> g/1
<tb> dextrose <SEP> 50
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,3
<tb> MgSO4 <SEP> 0,1
<tb> acide <SEP> aspartique <SEP> 0,2
<tb> acide <SEP> glutamique <SEP> 0,2
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 3,8
<tb> tampon <SEP> au <SEP> citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> * <SEP> 50 <SEP> cc
<tb> solution <SEP> vitaminée <SEP> ** <SEP> 10 <SEP> cc
<tb> eau <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
* tampon au citrate de sodium 100 g citrate de sodium
20 g acide citrique eau pour 1 litre
EMI3.2
<tb> ** <SEP> solution <SEP> vitaminée <SEP> Thiamine <SEP> 20,
0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> biotine <SEP> 0,2 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pyridoxine <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> inositol <SEP> 200,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acide <SEP> nicotinique <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> pour <SEP> 40 <SEP> cc
<tb>
On place dans des récipients de fermentation des portions du milieu synthétique cités et on les stérilise. A certaines,, on ajoute en conditions aseptiques des proportions variables d'acide 5-formyl-2-oxovalérique comme in- diqué au tableau ci-dessous. D'autres servent de contrôle.
On inocule les réci- pients de fermentation au moyen de cultures de 24 à 28 h de cellules de levure en cours de croissance. Les souches de levure Y-80 et Y-416 du tableau sont du Saccharomyces cereviseae. Les souches Y-3 et Y-4 sont des espèces non modifiées de Saccharomyces. On fait incuber les récipients de fermentation pendant 72 h à environ 24 dans une secoueuse à va-et-vient. Au bout de la période de fermen- tation, on passe à la vapeur le contenu des récipients pour rompre les cellules de levure et libérer la 1-lysine libre qu'elles contiennent.
On centrifuge la liqueur fermentée et on analyse la teneur de la liqueur surnageante en 1-lysine par une méthode microbiologique décrite par Steel et al. dans Journal of Biolo- gical Chemistry, 177, page 533, (1949)e Les résultats de cette série de fermen- tation sont indiqués au tableau ci-dessous.
TABLEAU I
EMI3.3
<tb> SOUCHE <SEP> DE <SEP> LEVURE
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> organique <SEP> Y-80 <SEP> Y-3 <SEP> Y-4 <SEP> Y-146
<tb>
<tb>
<tb> [gamma]/cc <SEP> 1-lysine <SEP> [gamma]/cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aucun <SEP> 42 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> -- <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> 68- <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 250 <SEP> -- <SEP> 29 <SEP> 22 <SEP> 62
<tb>
<tb>
<tb> 500 <SEP> 190 <SEP> 40 <SEP> 34 <SEP> 80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1500 <SEP> 136 <SEP> - <SEP> -- <SEP> --
<tb>
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Les résultats ci-dessus montrent que les enzymes de la levure sont capables de transformer l'acide 5-formyl-2-oxovalérique en 1-lysine.
On a utilisé un milieu synthétique pour illustrer cette propriété en raison du fait que les milieux contenant des substances naturelles contiennent un grand nombre de composants différents, dont plusieurs servent de précurseurs de lysine. Quand on prépare la 1-lysine sur une base commerciale avec l'acide 5-formyl-2-oxovalérique comme précurseur, la pratique préférée serait d'ajouter à une certaine quantité du milieu de fermentation une quantité de précurseur allant jusqu'à 2 % environ en poids et à laisser la fermentation se dérouler de manière normale. Toute fer- mentation de levure convenable utilisée pour la production de cellules de levu- re sur une base commerciale peut être utilisée.
Un des procédés les plus désira- bles emploie la levure Torulopsis utilis avec un milieu de fermentation carac- térisé par l'emploi de liqueur sulfitée résiduelle. Ce procédé a été décrit dans de nombreuses publications et des détails n'en sont pas nécessaires. La seule modification nécessaire pour accroître la teneur en 1-lysine libre des cellules de levure résultantes consiste à ajouter l'acide 5-formyl-2-oxovalérique au moins 1 heure avant la récolte des cellules. Il est bien entendu naturellement que les cellules de levure des familles Endomycetaceae et Cryptococcaceae et celles qui leur sont apparentées contiennent également des enzymes capables de convertir l'acide 5-formyl-2-oxovalérique en 1-lysine.
Ces cellules de levure, au moment de leur récolte, peuvent être mélangées avec des nourritures pour ani- maux de diverses sortes pour en accroître la teneur en lysine et rendre ces nourritures plus efficaces nutritivement pour l'homme et les animaux.
EXEMPLE 2
On place des portions du milieu synthétique décrit à l'exemple 1 dans des récipients en verre, certains contenant de plus diverses quantités d'aci- de alpha-amino-adipique (désigné également ici par AAA). Ces récipients de fermentation sont bouchés avec du coton et stérilisés à l'autoclave pendant 15 mm sous 1,05 kg/cm2 de pression de vapeur. On met en suspension des cultures en tube oblique sur malt-agar-agar, apportant des cultures de 24 à 28 h de cellules de levure en cours de croissance, dans 10 cc de solution saline physiologique stérile. On utilise cette suspension pour inoculer les récipients stériles que l'on fait alors incuber pendant 72 h à environ 24 sur un secoueur à va-et-vient.
Au bout de la période de fermentation, on passe à la vapeur la liqueur fermentée pendant 10 mm dans un autoclave ouvert pour interrompre la fermentation et li- bérer la 1-lysine libre des cellules. On centrifuge le liquide, on recueille la liqueur qui surnage et on analyse sa teneur en 1-lysine par la méthode indiquée à l'exemple 1,.Le résultat de cette série de fermentation est indiqué au tableau ci-dessous.
On prépare une autre série de récipients de fermentation contenant un milieu composé de 50 g de dextrose, 3,8 g de sulfate d'ammonium et 50 cc de liqueur de macération de mais (50 % de solides à sec) par litre et ajusté à pH 5,3 par l'acide phosphorique et on conduit des fermentations de la même manière.
Les résultats sont également indiqués au tableau suivant. La désignation CSL désigne le milieu liquide de macération de mais décrit ci-dessus et SYN désigne le milieu synthétique.
<Desc/Clms Page number 5>
TABLEAU'.11
EMI5.1
rrr¯rry""yr--rwwr-r¯¯¯-------------------..wrrn-----------y-----------
EMI5.2
<tb> Levure <SEP> milieu <SEP> dl-AAA <SEP> 1-lysine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> mg/cc
<tb>
EMI5.3
----------------------------------------------- r-------------
EMI5.4
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
EMI5.5
firme "Red Star Bakers" CSL aucun 0,20
EMI5.6
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5,0 <SEP> 1,15
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
EMI5.7
firme "Fleischmann's Bakers" CSL aucun oe22
EMI5.8
<tb> CSL <SEP> 5,0 <SEP> 1,3
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> Y-17 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,14
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 2,0 <SEP> 0,50
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 10,0 <SEP> 2,
71
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> Y-87 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,19
<tb>
EMI5.9
"" CSL- 2, 0 . 0, 75
EMI5.10
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 10,0 <SEP> 2,66
<tb>
EMI5.11
Saccharomyces tour-n3ér CSL aucun 0,06 Ti CSL leo 0,15
EMI5.12
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 3,0 <SEP> 0,30
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> Y-9 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,22
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 2,0 <SEP> 0,58
<tb> '" <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 10,0 <SEP> 3,12
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> ellipsoideus <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,010
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1,0 <SEP> 0,027
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> thermantitonium <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,004
<tb>
EMI5.13
SYN leo 03014
EMI5.14
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Y-900 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,48
<tb>
EMI5.15
" " " CSL 5,0 1,
75
EMI5.16
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Y-1082 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,39
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5,0 <SEP> 1,26
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> cremoris <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,07
<tb>
EMI5.17
" " 0 SYN 2, 0 0,49
EMI5.18
<tb> Torulopsis <SEP> s <SEP> haerica <SEP> SYN <SEP> ,aucun <SEP> 0,04
<tb> SYN <SEP> 2,0 <SEP> 0,19
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> pulcherrima <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,06
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 2,0 <SEP> 0,35
<tb>
<tb> Candida <SEP> tenius <SEP> SYN <SEP> aucun, <SEP> 0,04
<tb> " <SEP> SYN <SEP> 1,0 <SEP> 0,11
<tb>
<tb> Kloeckeria <SEP> brevis <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,009
<tb>
EMI5.19
-' SYN 1,0 ' 0, 021
<Desc/Clms Page number 6>
EXEMPLE 3
On prépare et on stérilise un milieu de fermentation contenant 0,4 % d'extrait de levure, 0,4 % de glucose,
1,0 % d'extrait de malt et de l'eau. A un groupe de ballons de fermentation, on ajoute suffisamment d'acide alpha-amino- adipique pour représenter 5 mg ce de milieu. On inocule alors les ballons par des cultures de cellules de levure en croissance et on laisse croître dans le milieu pendant 72 h avec agitation constante à 24 . Au bout de ce temps, on chauffe le contenu du ballon pour interrompre la fermentation et rompre les cel- lules de levure et en libérer la lysine libre.
On examine ensuite la liqueur surnageante pour en évaluer la teneur en 1-lysine avec les résultats suivants :
TABLEAU III A
EMI6.1
<tb> Levure <SEP> pas <SEP> de <SEP> AAA
<tb> précurseur <SEP> 5 <SEP> mg/cc
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> (non <SEP> identifiée) <SEP> 119 <SEP> 190
<tb>
EMI6.2
Eremasca.s fertilis 180 279 Nematospora pehaseo3,.
70 214 Endomycopsis fibulier 63 356 Saocharonorcodes ludmi 11 52 278 Eanseniospora valbyensis 199 220 8chiosaccharamyc.es pombe 143 463
EMI6.3
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidemtalis <SEP> 57 <SEP> 542
<tb>
<tb> Debaryomyces <SEP> menbranefaciens <SEP> 210 <SEP> 278
<tb>
<tb> Lipomyces <SEP> starkeii <SEP> 204 <SEP> 254
<tb>
Dans une démonstration semblable de l'aptitude des cellules de levure à convertir l'acide alpha-amino-adipique en 1-lysine , on prépare un milieu à 2 % de mélasses, 3 % d'extrait de malt, et de l'eau. A une série de ballons de fermentation, on ajoute de l'acide alpha-amino-adipique à raison de 5 mg par litre de milieu.
On conduit la fermentation comme ci-dessus, on analyse la liqueur surnageante pour sa teneur en 1-lysine, avec les résultats suivants :
TABLEAU III B.
EMI6.4
<tb>
Levure <SEP> Pas <SEP> de <SEP> AAA
<tb> précurseur <SEP> mg/cc
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> 58- <SEP> 74
<tb>
EMI6.5
Endomycopsis fibrzliger 43 253 Saccharomycodes 1 . ii 62 292 Hanse1!liospora valbyenses 145 292 Schizosacchar6e pombe 58 414 Schwaai.omyces occ;Í}d.entalis 60 369 Debaryomyces membruefacie1!lB 67 76
En plus des espèces précédentes, on a trouvé qualitativement que l'acide alpha-amiao-adipique peut être transformé en lysine par les levures suivantes.
Saccharomyces pastorianus ,Saccharomyces exigius
Saccharomyces ilicis
Saccharomyces monacensis
Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces albus
<Desc/Clms Page number 7>
Saccharomyces sake
Saccharomyces turbidans
Saccharomyces fragilis
Saccharomyces chodati
Saccharomyces aromaticus
Saccharomyces lactis
Saccharomyces behrensianus
Saccharomyces spiritus-vini
Torulopsis lactis
Zygosaccharomyces fragilis
Candida rugosa
Candida flareri
Candida lipolytica
Candida pulcherrima
Candida reukaufi
Candida tenuis Nematospora phaseoli
Sporobolomyces sp.
Dematium sp.
En plus de ces levures particulières, un grand nombre de levures non identifiées sont également capables de convertir l'acide alpha-amino-adipique en 1-lysine. De ces résultats, il apparaît que pratiquement toutes les levures ont cette capacité d'effectuer cette conversion dans des conditions favorables.
EXEMPLE 4
Les exemples précédents 2 et 3 illustrent la conversion de l'acide alpha-amino-adipique en 1-lysine par un grand nombre d'espèces différentes de cellules de levure des familles Endomycetaceae et Cryptococcaceae, tandis qu' elles sont en cours de croissance dans un milieu nutritif. Des études supplé- mentaires montrent que l'acide alpha-amino-adipique peut être transformé en 1-lysine par des cellules au repos sans qu'il soit nécessaire d'ajouter l'acide d'alpha-amino-adipique aux cellules en cours de fermentation.
Dans une telle expérience, on a fait croître une espèce de Saccharo- myces Y-9 dans un milieu nutritif convenable, on a recueilli les cellules de levure par centrifugation, on les a lavé deux fois à l'eau distillée et finalement, on les a mis en suspension dans un tampon au citrate 0,1 M à un pH de 5,2, la suspension contenant 5 % en poids (à sec) de cellules de levure. A chacun d'une série de béchers, on a ajouté 10 mg de sulfate d'ammonium, 50 mg de glucose, 0,3 mg de pyridoxal et une quantité de cellules de levure en suspension comme préparées ci-dessus. A certains des béchers, on a également ajouté 5 mg d'acide dl-alpha-amino-adipique et on a complété le volume à 3 cc avec de l'eau et on a ajusté le pH à 5,2 avec le tampon au citrate.
On a alors placé les béchers sur une secoueuse, et on a incubé à 30 en secouant. On a prélevé les échantil- lons au bout de 30 mn et de 3 h, on les a dilué à 3 cc avec de l'eau et on les a passé à la vapeur pendant 10 mn pour interrompre la fermentation et rompre les cellules de levure pour libérer la 1-lysine libre. On a alors centrifugé le liquide et déterminé la teneur en 1-lysine par essai micro biologique.
Les résul- tats de cette série de démonstrations sont indiqués au tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 8>
TABLEAU IV
EMI8.1
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> dl-AAA <SEP> Temps <SEP> d'in- <SEP> lysine
<tb> Ballon <SEP> levure <SEP> (poids <SEP> mg/ballon <SEP> cubation <SEP> Y/ballon
<tb> à <SEP> sec) <SEP> (h)
<tb>
<tb> 1 <SEP> 16,8 <SEP> - <SEP> 0,5 <SEP> 85
<tb> 2 <SEP> 16,8 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 260
<tb> 3 <SEP> 50,4 <SEP> - <SEP> 0,5 <SEP> 285
<tb> 4 <SEP> 50,4 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 820
<tb> 5 <SEP> 16,8 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 865
<tb> 6 <SEP> 50,4 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 1005
<tb>
EXEMPLE 5
Dans d'autres expériences ,
on a montré que l'addition du précurseur n'augmente pas notablement le nombre ou le poids des cellules de levure qui se forment dans une fermentation donnée pas plus que la présence du précurseur n'accroît notablement la teneur en 1-lysine de la protéine de la cellule de levure. D'autre part, le précurseur augmente considérablement la présence de lysine libre dans la cellule de levure ainsi que dans le milieu de fermentation en dehors des cellulesde levure.
Dans une telle expérience, on fait fermenter 15 ce du milieu de fer- mentation à la liqueur de macération de mais décrit à l'exemple 1, avec une culture de Saccharomyces Y-9 comme utilisée précédemment. Certains des ballons contiennent 2 mg/cc d'acide dl-amino-adipique, d'autres contiennent 10 mg/cc d'acide amino-adipique et d'autres ne contiennent aucun précurseur. On laisse les cellules de levure provoquer la fermentation aérobie de ce milieu à tempéra- ture ambiante sur une secoueuse à va-et-vient. On prélève des échantillons des ballons après des périodes de 24,48 et 72 h. On examine la teneur en 1-lysine de la liqueur surnageante. On passe la liqueur de fermentation et les cellules de levure à la vapeur pour libérer la lysine libre des cellules, et on analyse la teneur en 1-lysine libre de la liqueur surnageante.
Les résultats de cette série d'expériences sont donnés au tableau ci-dessous.
TABLEAU V
EMI8.2
<tb> Lysine <SEP> [gamma]/Ml.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Temps <SEP> d'incubation, <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dl-AAA <SEP> 24 <SEP> extra- <SEP> 48 <SEP> extra- <SEP> 72 <SEP> extra-
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> Total <SEP> Cellulaire <SEP> Total <SEP> Cellulaire <SEP> Total <SEP> Cellulaire
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aucun <SEP> 96 <SEP> 48 <SEP> 118 <SEP> 58 <SEP> 216 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 320 <SEP> 84 <SEP> 552 <SEP> 106 <SEP> 580 <SEP> 118
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 1260 <SEP> 403 <SEP> 2580 <SEP> 140 <SEP> 3120 <SEP> 160
<tb>
Ainsi qu'on le voit d'après ce qui précède, une quantité notable de 1-lysine libre est à l'extérieur des cellules de levure dans le milieu de fermentation et naturellement une quantité plus grande encore est dans la cellule elle-même.
EXEMPLE 6
On place dans des fioles Erlenmeyer de 125 cc des portions de 15 ce du milieu synthétique décrit à l'exemple 1. On prépare un certain nombre de ces fioles, certaines contement de plus des quantités variables d'acide alpha-céto-
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adipique (désigné également par KAA). On bouche ces flacons avec du.coton et on les stérilise à l'autoclave pendant 15 mn à 1,05 kg/cm2 de pression de vapeur.
On met en suspension des cultures en tube oblique sur malt-agar-agar véhiculant des cultures de 24 à 28 h de cellules de levure en cours de croissance (Saccha- romyces cereviseae) dans 10 cc de solution saline physiologique stérile. On utilise 0,3 cc de cette suspension pour inoculer les fioles Erlenmeyer stériles.
On incube alors les fioles bouchées avec du coton pendant 72 h à 24 environ sur une secoueuse à va-et-vient. Au bout de cette période de fermentation, on passe les fioles à la vapeur pendant 10 mn dans un autoclave ouvert pour inter- rompre la fermentation. On centrifuge le contenu des fioles, on recueille la liqueur surnageante et on analyse sa teneur en 1-lysine par la méthode micro- biologique indiquée à l'exemple 1. Les résultats de cette série de fermentations sont indiqués au tableau ci-dessous.
On conduit de la même manière une autre série de fermentations en utilisant un milieu composé de 50 g de dextrose, 3,8 g de sulfate d'ammonium et 50 cc de liqueur de macération de mais (à 50 % de solides à sec) et ajusté à pH 5,3 par l'acide phosphorique. Les résultats de cette série de fermentations sont également indiqués au tableau suivant.
TABLEAU VI
EMI9.1
<tb> Production <SEP> de <SEP> lysine <SEP> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> KAA <SEP> par <SEP> croissance <SEP> de <SEP> levures <SEP> en <SEP> milieu
<tb>
<tb>
<tb> synthétique <SEP> ou <SEP> en <SEP> milieu <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> milieu <SEP> liqueur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KAA <SEP> ajouté <SEP> milieu <SEP> synthétique <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> [gamma]/cc <SEP> % <SEP> conversion <SEP> [gamma]/cc <SEP> % <SEP> conversion
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aucun <SEP> 45 <SEP> -- <SEP> 200 <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,3 <SEP> 265 <SEP> 88 <SEP> -- <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb> 0,6 <SEP> 500 <SEP> 83--
<tb>
<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 558 <SEP> 56 <SEP> -- <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb> 3,
0 <SEP> 833 <SEP> 27-- <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb> 5,0 <SEP> 324 <SEP> 5,4 <SEP> 4210 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb> 10, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> -- <SEP> 4210 <SEP> 42
<tb>
Ainsi qu'on le voit d'après ces résultats, l'acide alpha-céto-adipi- que est converti à raison de 88 % dans le milieu synthétique quand le taux d'a- cide est de 0,3 mg/cc de fermentation et à raison de 84 % dans le milieu de li- queur de macération de mais quand le taux d'acide est de 5 mg/cc. Comme on le verra également, la production de lysine est considérablement accrue par rapport à ce qu'on obtient sans l'emploi de l'acide céto-adipique comme précurseur, ce qui montre la conversion de l'acide alpha-céto-adipique en lysine comme résultat de la fermentation.
EXEMPLE 7
On conduit une série de fermentations en utilisant les mêmes milieux de fermentation que dans l'exemple précédent, et dans les mêmes conditions, la seule différence étant dans les espèces de cellules de levure utilisées pour inoculer les milieux de fermentation. Les résultats de ces fermentations sont indiqués au tableau suivant. La désignation CSL indique que le milieu est le milieu à la liqueur de macération de mais comme décrit à l'exemple'1. Le terme SYN désigne l'emploi du milieu synthétique comme décrit à l'exemple 1.
<Desc/Clms Page number 10>
TABLEAU VII
EMI10.1
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> milieu <SEP> KAA <SEP> Rendement
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> en <SEP> lysine <SEP> mg/cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> firme <SEP> "Red <SEP> Star <SEP> Bakers" <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,20
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 1,56
<tb>
<tb>
<tb> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 2,98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> firme <SEP> "Fleischmann's <SEP> Bakers" <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,22
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> l <SEP> mg <SEP> 1,95
<tb>
<tb>
<tb> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,92
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> ellipsoideus <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,
010
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,103
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> thermantitonium <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,004
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,121
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces- <SEP> turbidans <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,008
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,185
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,008
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,165
<tb>
Dans une autre série de fermentationsconduites de la même manière, d'autres espèces de Saccharomyces à savoir le Saccharomyces aromaticus, le Saccharomyces spiritus, et le Saccharomyces logos, convertissent également l'acide alpha-céto-adipique en lysine en quantités notables.
EXEMPLE 8
On démontre l'aptitude des cellules de levure d'une famille différente à convertir l'acide alpha-céto-adipique en lysine dans des fermentations dans lesquelles on emploie plusieurs espèces de Torulopsis. On démontre cette aptitude à la fois dams le milieu synthétique et dans le milieu de liqueur de macération de mais comme décrit à l'exemple 1. Le milieu de fermentation contient différen- tes quantités d'acide alpha-oéto-adipique. Les résultats de cette étude sont indiqués dans le tableau suivant.
TABLEAU VIII
EMI10.2
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Milieu <SEP> Précurseur <SEP> mg/cc <SEP> Lysine <SEP> mg/cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> utilis
<tb>
<tb>
<tb> souche <SEP> NRRL <SEP> Y-900 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,48
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> utilis
<tb>
<tb>
<tb> souche <SEP> NRRL <SEP> 1082 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,39
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> utilis
<tb>
<tb>
<tb> souche <SEP> NRRL <SEP> 1084 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,46
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> cramoris <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,07
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,
37
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> sphaerica <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,04
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,68
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Dans des expériences supplémentaires utilisant des cellules de levures de la même famille Cryptococcacae on a trouvé que les levures d'autres souches, comprenant les espèces Rhodoturola glutinis et Candida lipolytica ont également l'aptitude de convertir l'acide alpha-céto-adipique en lysine dans le même type de fermentation et dans les mêmes conditions de fermentation que décrit ci- dessus. D'autres expériences encore indiquent que d'autres souches telles que la Kloeckeria peuvent convertir l'acide alpha-céto-adipique en lysine dans un processus de fermentation tel que décrit ci-dessus en quantité notable.
EXEMPLE 9
On a également examiné de nombreuses espèces de souches de la famille Endomycetaceae pour leur aptitude à produire de la lysine à partir d'acide alpha- céto-adipique comme précurseur.. Ces expériences ont été conduites avec divers substrats nutritifs différents mais étaient par ailleurs similaires aux fermen- tations décrites précédemment.
Dans une de ces séries d'expériences, le milieu de fermentation con- tenait comme éléments nutritifs 2 % de mélasses et 3 % d'extrait de malt. Après 72 heures de fermentation, on chauffe la masse de fermentation à la vapeur à 1000 pendant 10 minutes pour interrompre la fermentation et rompre les cellules de levure.
On analyse alors la liqueur surnageante pour la lysine avec les résul- tats suivants :
TABLEAU IX A
EMI11.1
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Lysine <SEP> pas <SEP> de <SEP> [gamma]/Ml <SEP> 5 <SEP> mg/cc <SEP> KAA
<tb>
<tb>
<tb> précurseur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> 58 <SEP> 426
<tb>
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 78 <SEP> 505
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomycopsis <SEP> fibuliger <SEP> 43 <SEP> 557
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomycodes <SEP> ludwigii <SEP> 62 <SEP> 385
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 58 <SEP> 958
<tb>
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 60 <SEP> 565
<tb>
Dans une autre série de fermentations, le milieu de fermentation contenait 0,4 % d'extrait de levure, 0,4 % de glucose et 1,0 % d'extrait de malt.
Les résultats sont indiqués ci-dessous.
TABLEAU IX B
EMI11.2
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Lysine <SEP> pas <SEP> de <SEP> [gamma]/Ml
<tb>
<tb> précurseur <SEP> 5 <SEP> mg/cc <SEP> KAA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 70 <SEP> 853
<tb>
<tb> Endomycopsis <SEP> fibuliger <SEP> 63 <SEP> 284
<tb>
<tb> Saccharomycodes <SEP> ludwigii <SEP> 52 <SEP> 310
<tb>
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 143 <SEP> 758
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 57 <SEP> 185
<tb>
Dans une autre série de fermentations, le milieu contenait 5 % de cérélose (qualité technique de dextrose), 5 % de liqueur de macération de mais et 0,5 % de sulfate d'ammonium.
Les résultats sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 12>
TABLEAU IX C
EMI12.1
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Lysine <SEP> pas <SEP> de <SEP> [gamma]/Ml
<tb> précurseur <SEP> 5 <SEP> mg/cc <SEP> KAA
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 108 <SEP> 351
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 44 <SEP> 116
<tb> Lipomyces <SEP> starkeii <SEP> 155 <SEP> 314
<tb>
Comme on le voit par ce qui précède, la conversion de l'acide alpha- céto-adipique en lysine varie considérablement suivant la nature du milieu nutri- tif.
EXEMPLE 10
On met en suspension environ 200 g de cellules de levure au repos (Saccharomyces cereviseae), vendue dans une épicerie sous la marque "Levure de Fleischmann's Baker" dans 1 litre d'eau et on mélange avec 1 litre d'une solu- tion aqueuse à 1,0 % d'acide alpha-céto-adipique. On tamponne le mélange à pH 4,5 avec de l'acide citrique 0,1 M et de la soude. On examine la teneur en ly- sine libre de la liqueur surnageante et d'un échantillon de cellules de levure rompues. On ne trouve pas de lysine. On place alors la suspension conte- nant les cellules au repos dams un récipient et on fait passer de l'air à tra- vers la solution à raison de 15 litres/mn pendant 23 heures à température am- biante. Au bout de ce temps, on trouve que les cellules de levure contiennent 2,4 g/l de lysine libre.
EXEMPLE 11
On répète le processus de l'exemple 10 ci-dessus, en ajustant le pH de la suspension aqueuse, initialement, à des valeurs de 3,0 à 8,5. Un peu de l'acide alpha-céto-adipique est converti en lysine dans tous les cas, mais on obtient les résultats optimum dans l'intervalle de pH de 3,0 à 5,0.
Bien quel'un des principaux avantages de la présente invention réside dans le fait que la totalité de la masse fermentée provenant de la fer- mentation puisse être ajoutée directement, avec séchage si on le désire, aux ali- ments pour animaux pour porter leur teneur en lysine à l'équilibre, ou que les cellules de levure séparées peuvent être utilisées pour complémenter les nour- ritures déficientesen lysine pour l'homme et les animaux, il peut être désira- ' ble de récupérer la lysine essentiellement pure du produit fermenté. On peut récupérer la teneur en 1-lysine de la liqueur fermentée de toute manière connue.
Un moyen efficace consiste à utiliser des résines d'échange d'ions ayant une affinité pour les amino-acides. Les liqueurs aqueuses contenant la 1-lysine, qu'elle provienne de la liqueur surnageante du fermentateur ou des cellules de levure hydrolysées contenant la lysine libre, est adsorbée sur une résine d'é- change d'ions appropriés puis soumise à l'élution, et l'éluat est raffiné pour obtenir la 1-lysine essentiellement pure.
Les cellules de levure qui ont été en contact avec l'acide 5-formyl- 2-oxovalérique ou avec l'acide alpha-céto-adipique sont caractérisées par une teneur extrêmement élevée en 1-lysine, de 10 % et plus, et semblent être une nouvelle forme de levure en raison de cette teneur élevée en 1-lysine libre. Cet- te propriété rend ces cellules de levures particulièrement précieuses pour com- plémenter les aliments pauvres en lysine provenant des céréales telles que le mais, l'avoine et le riz. Par exemple, la farine d'avoine est pauvre en 1-lysine et l'addition de quantités de lysine allant jusqu'à 0,4 % environ en poids a été recommandée.
Ceci est facilement réalisable après l'addition d'environ 4 % en poids, à sec, de cellules de levure contenant 10 % de lysine libre. Naturelle- ment, quand les cellules de levure contiennent de plus grandes quantités qu'il
<Desc/Clms Page number 13>
n'a été indiqué ci-dessus, la quantité de levure qu'il est nécessaire d'ajouter peut être considérablement réduite.
La quantité de lysine libre dans les cellules de levure peut être déterminée par la quantité d'acide organique qui est ajoutée à la fermentation qui produit les cellules de levure. De plus grandes quantités de 1-lysine ajou- tées à la fermentation, à savoir des quantités allant jusqu'à 2 %, conduisent à de des teneurs plus élevées en 1-lysine libre dans la levure et dans le milieu de fermentation où on peut l'isoler indépendamment de la 1-lysine libre et de la lysine liée aux protéines dans les cellules de levure. L'invention couvre donc l'emploi de quantités de précurseur aussi élevées que 2% en poids dans ce procédé.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de la 1-lysine, caractérisé en ce qu'on soumet à l'action des enzymes de la levure un acide organique choisi entre l'- acide 5-formyl-2-oxovalérique, l'acide alpha-amino-adipique et l'acide alpha- céto-adipique.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to the preparation of 1-lysine, an essential amino acid.
A number of foods, particularly those containing cereal grains, or products thereof, lack the essential amino acid, 1-lysine. Essential amino acids are those which are necessary for animals for their maintenance and growth. The animal body is not able to synthesize the amino acids necessary for the formation of animal protein. There are a large number of essential amino acids, and luckily most of the protein material is made out of a balance of these so that when that protein is consumed there is a Sufficient supply of suitable amino acids after digestion to replenish the protein material necessary for growth of the animals.
Although most of the protein material of animal origin contains an adequate balance of essential amino acids, and although some protein material of plant origin is suitable for the proper growth of animals, a large number of products foods lack the protein that would provide all the essential amino acids. This is particularly the case with proteins derived from the seeds of cereals such as rice, oats, and corn. Recently, it has become apparent that many foods consumed by animals, including humans, need to be supplemented with 1-lysine in order to provide an appropriate balance of essential amino acids for these foods to be. more effective for the maintenance and growth of the animal body.
Although 1-lysine can be prepared synthetically and by bacterial fermentation processes, these processes are very expensive and tend to limit the use of lysine as a dietary supplement. It was therefore desirable to develop an inexpensive method of preparing 1-lysine in a form suitable for addition to animal feed. The present invention provides such a method.
The process according to the invention for the preparation of 1-lysine
EMI1.1
consists in subjecting to the action of yeast enzymes an organic acid chosen from the group consisting of
EMI1.2
0 0 (I) 5-formYl-2-oxovaleric acid CHOH2GH2CH2COOOH NE2 (II) alpha-aminoadipic acid OOOHCH2CHCOOH 0 Il (III) alpha-ketoadipic acid 000HOH2CH2cH20COOH
Although it is known that 1-lysine can be prepared by certain microorganisms using certain particular precursors such as diaminopimelic acid, it is believed that it has never been discovered that yeast enzymes have the property of converting the aforementioned organic acids into 1-lysine in quantities far greater than those required by the yeast cell for its protein content.
In other words, 1-lysine can be extracted from the aqueous nutrient medium in which cells grow as well as from yeast cells without the need to hydrolyze the yeast protein to release the 1-. lysine. The amount of 1-lysine produced can be very high and since the above organic acids can be easily synthesized in unlimited quantities and at low cost, this new process provides a means of obtaining 1-lysine inexpensively and at low cost. unlimited quantities.
<Desc / Clms Page number 2>
One of the very important advantages of the invention arises from the fact that yeast has been grown on an industrial scale for many years as a source of animal food. It is therefore not necessary to develop any new technique or apparatus to obtain 1-lysine in an edible form. If desired, one can simply add all of the fermentation liquor resulting from the growth of yeast cells in a medium containing 5-formyl -2-oxovaleric acid to animal feed, without any treatment whatsoever. 'it is to increase the nutritional value of these foods thanks to the relatively large amounts of lysine contained in the whole fermentation mass.
This fermentation mass can be dried and packaged and sent anywhere, where it is needed. Alternatively, the yeast cells can be separated from the mass, washed and dried and used wherever yeast cells will be used as a food supplement. The new yeast obtained by the process of the invention is particularly effective from this point of view because, instead of containing only 3 to 4% of 1-lysine, most of which is bound in protein form, the new yeast cells prepared by the process which will be described below, may contain up to 20% of 1-lysine, most of which is in the form of free lysine.
Of course, if desired, the yeast cells of the present invention can be treated to release the lysine content therefrom and recover the free 1-lysine in substantially pure form in those cases where essentially lysine is needed. pure.
Although a preferred embodiment of the invention is to add one of the above organic acids to a yeast fermentation and allow it to be converted to 1-lysine by the yeast enzymes simultaneously with the production. new yeast cells, these enzymes contained in resting yeast cells can also convert this precursor into 1-lysine. All that is necessary in this embodiment of the invention is to mix this organic acid with yeast cells in an aqueous suspension and allow the enzymes contained in the yeast cells to effect the conversion, preferably by stirring and aerating. The mixture.
This conversion by the resting yeast cells takes place over a pH range of 2.5 to 8.5, preferably 3.0 to 5.0, and over a wide temperature range, for example 5. to 50. Noticeable conversion is achieved within 24 hrs at room temperature although the time period can range from as little as one hour to 48 hrs or more depending on pH, temperature, aeration rate, agitation and the like factors.
Another embodiment of the invention, which would not normally be used in the industrial manufacture of lysine, is to disrupt the yeast cells by physical or chemical means to release the enzymes they contain and to add the yeast cells. one of the above organic acids, so that it is converted into the desired 1-lysine by the enzymes in solution.
Although it has been stated above that the above organic acids are converted to 1-lysine by the action of yeast enzymes, it will be appreciated that the mechanism of the conversion is not known with certainty. In fact, it is possible that a mechanism other than the enzymatic action is involved. Based on experience, however, it appears that the conversion results from the enzymes, but by more than one step and probably several. It is of course understood therefore that the present invention is not bound by any theory. The fact is that the above organic acids are converted into 1-lysine by biosynthesis with excellent yield under the action of yeast cells.
The invention will be better understood from the following description with reference to the following examples.
<Desc / Clms Page number 3>
EXAMPLE 1 A synthetic medium is prepared with the following components:
EMI3.1
<tb> Ingredient <SEP> Synthetic <SEP> medium
<tb>
<tb> final <SEP> power <SEP> of the <SEP> middle <SEP> in <SEP> g / 1
<tb> dextrose <SEP> 50
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.3
<tb> MgSO4 <SEP> 0.1
<tb> <SEP> aspartic acid <SEP> 0.2
<tb> <SEP> glutamic acid <SEP> 0.2
<tb> (NH4) 2SO4 <SEP> 3.8
<tb> buffer <SEP> to <SEP> citrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> * <SEP> 50 <SEP> cc
<tb> vitamin <SEP> solution <SEP> ** <SEP> 10 <SEP> cc
<tb> water <SEP> for <SEP> 1 <SEP> liter
<tb>
* sodium citrate buffer 100 g sodium citrate
20 g citric acid water for 1 liter
EMI3.2
<tb> ** <SEP> vitamin <SEP> solution <SEP> Thiamine <SEP> 20,
0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> biotin <SEP> 0.2 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pyridoxine <SEP> 20.0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> calcium <SEP> pantothenate <SEP> 20.0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> inositol <SEP> 200.0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> nicotinic acid <SEP> 20.0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> water <SEP> for <SEP> 40 <SEP> cc
<tb>
Portions of the synthetic medium mentioned were placed in fermentation vessels and sterilized. To some, varying proportions of 5-formyl-2-oxovaleric acid are added aseptically as shown in the table below. Others serve as a control.
The fermentation vessels are inoculated with 24-28 hour cultures of growing yeast cells. The yeast strains Y-80 and Y-416 in the table are Saccharomyces cereviseae. Strains Y-3 and Y-4 are unmodified species of Saccharomyces. The fermentation vessels are incubated for 72 to about 24 hours in a reciprocating shaker. At the end of the fermentation period, the contents of the vessels are steamed to disrupt the yeast cells and release the free 1-lysine they contain.
The fermented liquor was centrifuged and the 1-lysine content of the supernatant liquor was analyzed by a microbiological method described by Steel et al. in Journal of Biological Chemistry, 177, page 533, (1949) e The results of this series of fermentation are shown in the table below.
TABLE I
EMI3.3
<tb> <SEP> STRAIN OF <SEP> YEAST
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Organic <SEP> acid <SEP> Y-80 <SEP> Y-3 <SEP> Y-4 <SEP> Y-146
<tb>
<tb>
<tb> [gamma] / cc <SEP> 1-lysine <SEP> [gamma] / cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> none <SEP> 42 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> - <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> 68- <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 250 <SEP> - <SEP> 29 <SEP> 22 <SEP> 62
<tb>
<tb>
<tb> 500 <SEP> 190 <SEP> 40 <SEP> 34 <SEP> 80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1500 <SEP> 136 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<Desc / Clms Page number 4>
The above results show that the yeast enzymes are able to convert 5-formyl-2-oxovaleric acid into 1-lysine.
A synthetic medium has been used to illustrate this property due to the fact that media containing natural substances contain a large number of different components, many of which serve as precursors of lysine. When preparing 1-lysine on a commercial basis with 5-formyl-2-oxovaleric acid as a precursor, the preferred practice would be to add to an amount of the fermentation medium an amount of precursor of up to 2%. approximately by weight and allow fermentation to proceed in a normal manner. Any suitable yeast fermentation used for the production of yeast cells on a commercial basis can be used.
One of the most desirable methods employs the Torulopsis yeast used with a fermentation medium characterized by the use of residual sulphite liquor. This process has been described in numerous publications and details are not necessary. The only modification needed to increase the free 1-lysine content of the resulting yeast cells is to add 5-formyl-2-oxovaleric acid at least 1 hour before harvesting the cells. It is naturally understood that the yeast cells of the Endomycetaceae and Cryptococcaceae families and those which are related to them also contain enzymes capable of converting 5-formyl-2-oxovaleric acid into 1-lysine.
These yeast cells, when harvested, can be mixed with animal feeds of various kinds to increase the lysine content and make these feeds more nutritious for humans and animals.
EXAMPLE 2
Portions of the synthetic medium described in Example 1 were placed in glass containers, some further containing varying amounts of alpha-amino-adipic acid (also referred to herein as AAA). These fermentation vessels are capped with cotton and autoclaved for 15 mm under 1.05 kg / cm2 of vapor pressure. Slant-tube cultures are suspended on malt-agar-agar, providing 24-28 hr cultures of growing yeast cells, in 10 cc of sterile physiological saline. This suspension is used to inoculate the sterile containers which are then incubated for 72 hours to about 24 hours on a reciprocating shaker.
At the end of the fermentation period, the fermented liquor is steamed for 10 mm in an open autoclave to interrupt the fermentation and release free 1-lysine from the cells. The liquid is centrifuged, the liquor which supernates is collected and its 1-lysine content is analyzed by the method indicated in Example 1. The result of this series of fermentation is shown in the table below.
Another set of fermentation vessels was prepared containing a medium composed of 50 g of dextrose, 3.8 g of ammonium sulfate and 50 cc of corn maceration liquor (50% dry solids) per liter and adjusted to pH 5.3 with phosphoric acid and fermentations are carried out in the same way.
The results are also shown in the following table. The designation CSL denotes the liquid corn maceration medium described above and SYN denotes the synthetic medium.
<Desc / Clms Page number 5>
TABLE '11
EMI5.1
rrr¯rry "" yr - rwwr-r¯¯¯ ------------------- .. wrrn ----------- y-- ---------
EMI5.2
<tb> Yeast <SEP> medium <SEP> dl-AAA <SEP> 1-lysine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mg / cc <SEP> mg / cc
<tb>
EMI5.3
----------------------------------------------- r-- -----------
EMI5.4
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> from <SEP> the
<tb>
EMI5.5
firm "Red Star Bakers" CSL none 0.20
EMI5.6
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 5.0 <SEP> 1.15
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> from <SEP> the
<tb>
EMI5.7
firm "Fleischmann's Bakers" CSL no oe22
EMI5.8
<tb> CSL <SEP> 5.0 <SEP> 1.3
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> Y-17 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.14
<tb> "<SEP>" <SEP> "<SEP> CSL <SEP> 2.0 <SEP> 0.50
<tb> "<SEP>" <SEP> "<SEP> CSL <SEP> 10.0 <SEP> 2,
71
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> Y-87 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.19
<tb>
EMI5.9
"" CSL- 2, 0. 0, 75
EMI5.10
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 10.0 <SEP> 2.66
<tb>
EMI5.11
Saccharomyces tour-n3er CSL none 0.06 Ti CSL leo 0.15
EMI5.12
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 3.0 <SEP> 0.30
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> Y-9 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.22
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 2.0 <SEP> 0.58
<tb> '"<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 10.0 <SEP> 3.12
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> ellipsoideus <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.010
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1.0 <SEP> 0.027
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> thermantitonium <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.004
<tb>
EMI5.13
SYN leo 03014
EMI5.14
<tb> Torulopsis <SEP> user <SEP> Y-900 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.48
<tb>
EMI5.15
"" "CSL 5.0 1,
75
EMI5.16
<tb> Torulopsis <SEP> user <SEP> Y-1082 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.39
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> "<SEP> CSL <SEP> 5.0 <SEP> 1.26
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> cremoris <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.07
<tb>
EMI5.17
"" 0 SYN 2, 0 0.49
EMI5.18
<tb> Torulopsis <SEP> s <SEP> haerica <SEP> SYN <SEP>, none <SEP> 0.04
<tb> SYN <SEP> 2.0 <SEP> 0.19
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> pulcherrima <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.06
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 2.0 <SEP> 0.35
<tb>
<tb> Candida <SEP> tenius <SEP> SYN <SEP> none, <SEP> 0.04
<tb> "<SEP> SYN <SEP> 1.0 <SEP> 0.11
<tb>
<tb> Kloeckeria <SEP> brevis <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.009
<tb>
EMI5.19
- 'SYN 1.0' 0, 021
<Desc / Clms Page number 6>
EXAMPLE 3
A fermentation medium containing 0.4% yeast extract, 0.4% glucose, is prepared and sterilized,
1.0% malt extract and water. To a group of fermentation flasks, enough alpha-amino-adipic acid is added to make up 5 mg cc of medium. The flasks are then inoculated with cultures of growing yeast cells and allowed to grow in the medium for 72 h with constant agitation at 24 h. At the end of this time, the contents of the flask are heated to stop fermentation and disrupt the yeast cells and release free lysine.
The supernatant liquor is then examined to evaluate the 1-lysine content with the following results:
TABLE III A
EMI6.1
<tb> Yeast <SEP> not <SEP> of <SEP> AAA
<tb> precursor <SEP> 5 <SEP> mg / cc
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> (not <SEP> identified) <SEP> 119 <SEP> 190
<tb>
EMI6.2
Eremasca.s fertililis 180 279 Nematospora pehaseo3 ,.
70 214 Fibular Endomycopsis 63 356 Saocharonorcodes ludmi 11 52 278 Eanseniospora valbyensis 199 220 8chiosaccharamyc.es pombe 143 463
EMI6.3
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidemtalis <SEP> 57 <SEP> 542
<tb>
<tb> Debaryomyces <SEP> menbranefaciens <SEP> 210 <SEP> 278
<tb>
<tb> Lipomyces <SEP> starkeii <SEP> 204 <SEP> 254
<tb>
In a similar demonstration of the ability of yeast cells to convert alpha-amino-adipic acid to 1-lysine, a medium is prepared of 2% molasses, 3% malt extract, and water. . To a series of fermentation flasks, alpha-amino-adipic acid is added at the rate of 5 mg per liter of medium.
The fermentation is carried out as above, the supernatant liquor is analyzed for its 1-lysine content, with the following results:
TABLE III B.
EMI6.4
<tb>
Yeast <SEP> Not <SEP> of <SEP> AAA
<tb> precursor <SEP> mg / cc
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> 58- <SEP> 74
<tb>
EMI6.5
Endomycopsis fibrzliger 43 253 Saccharomycodes 1. ii 62 292 Hanse1! liospora valbyenses 145 292 Schizosacchar6e pombe 58 414 Schwaai.omyces occ; Í} d.entalis 60 369 Debaryomyces membruefacie1! lB 67 76
In addition to the preceding species, it has been found qualitatively that alpha-amiao-adipic acid can be converted into lysine by the following yeasts.
Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces exigius
Saccharomyces ilicis
Saccharomyces monacensis
Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces albus
<Desc / Clms Page number 7>
Saccharomyces sake
Saccharomyces turbidans
Saccharomyces fragilis
Saccharomyces chodati
Saccharomyces aromaticus
Saccharomyces lactis
Saccharomyces behrensianus
Saccharomyces spiritus-vini
Torulopsis lactis
Zygosaccharomyces fragilis
Candida rugosa
Candida flareri
Candida lipolytica
Candida pulcherrima
Candida reukaufi
Candida tenuis Nematospora phaseoli
Sporobolomyces sp.
Dematium sp.
In addition to these particular yeasts, a large number of unidentified yeasts are also able to convert alpha-amino-adipic acid to 1-lysine. From these results, it appears that virtually all yeasts have this ability to effect this conversion under favorable conditions.
EXAMPLE 4
The preceding Examples 2 and 3 illustrate the conversion of alpha-amino-adipic acid to 1-lysine by a large number of different species of yeast cells of the Endomycetaceae and Cryptococcaceae families, while they are being grown in a nutrient medium. Further studies show that alpha-amino-adipic acid can be converted to 1-lysine by resting cells without the need to add alpha-amino-adipic acid to running cells. fermentation.
In such an experiment, a species of Saccharomyces Y-9 was grown in a suitable nutrient medium, the yeast cells were collected by centrifugation, washed twice with distilled water and finally, they were obtained. suspended in 0.1 M citrate buffer at pH 5.2, the suspension containing 5% by weight (dry) yeast cells. To each of a series of beakers, 10 mg of ammonium sulfate, 50 mg of glucose, 0.3 mg of pyridoxal and an amount of yeast cell suspension were added as prepared above. To some of the beakers, 5 mg of dl-alpha-amino-adipic acid was also added and the volume was made up to 3 cc with water and the pH adjusted to 5.2 with the citrate buffer. .
The beakers were then placed on a shaker, and incubated at 30 with shaking. Samples were taken after 30 min and 3 h, diluted to 3 cc with water, and steamed for 10 min to stop fermentation and disrupt yeast cells. to release free 1-lysine. The liquid was then centrifuged and the 1-lysine content determined by microbiological test.
The results of this series of demonstrations are shown in the following table:
<Desc / Clms Page number 8>
TABLE IV
EMI8.1
<tb> <SEP> dl-AAA <SEP> cells <SEP> In- <SEP> lysine <SEP> time
<tb> Flask <SEP> yeast <SEP> (weight <SEP> mg / flask <SEP> cubation <SEP> Y / flask
<tb> to <SEP> sec) <SEP> (h)
<tb>
<tb> 1 <SEP> 16.8 <SEP> - <SEP> 0.5 <SEP> 85
<tb> 2 <SEP> 16.8 <SEP> 5 <SEP> 0.5 <SEP> 260
<tb> 3 <SEP> 50.4 <SEP> - <SEP> 0.5 <SEP> 285
<tb> 4 <SEP> 50.4 <SEP> 5 <SEP> 0.5 <SEP> 820
<tb> 5 <SEP> 16.8 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 865
<tb> 6 <SEP> 50.4 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 1005
<tb>
EXAMPLE 5
In other experiments,
the addition of the precursor has not been shown to significantly increase the number or weight of yeast cells that form in a given fermentation nor does the presence of the precursor significantly increase the 1-lysine content of the protein of the yeast cell. On the other hand, the precursor considerably increases the presence of free lysine in the yeast cell as well as in the fermentation medium outside the yeast cells.
In such an experiment, 15 cc of the corn maceration liquor fermentation medium described in Example 1 was fermented with a culture of Saccharomyces Y-9 as previously used. Some of the balloons contain 2 mg / cc of dl-amino-adipic acid, some contain 10 mg / cc of amino-adipic acid, and others contain no precursor. The yeast cells are allowed to aerobically ferment this medium at room temperature on a reciprocating shaker. Samples were taken from the balloons after periods of 24, 48 and 72 h. The 1-lysine content of the supernatant liquor is examined. The fermentation liquor and yeast cells are steamed to release free lysine from the cells, and the free 1-lysine content of the supernatant liquor is analyzed.
The results of this series of experiments are given in the table below.
TABLE V
EMI8.2
<tb> Lysine <SEP> [gamma] / Ml.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Incubation time <SEP>, <SEP> hours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dl-AAA <SEP> 24 <SEP> extra- <SEP> 48 <SEP> extra- <SEP> 72 <SEP> extra-
<tb>
<tb>
<tb> mg / cc <SEP> Total <SEP> Cellular <SEP> Total <SEP> Cellular <SEP> Total <SEP> Cellular
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> none <SEP> 96 <SEP> 48 <SEP> 118 <SEP> 58 <SEP> 216 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 320 <SEP> 84 <SEP> 552 <SEP> 106 <SEP> 580 <SEP> 118
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 1260 <SEP> 403 <SEP> 2580 <SEP> 140 <SEP> 3120 <SEP> 160
<tb>
As can be seen from the above, a significant amount of free 1-lysine is outside the yeast cells in the fermentation medium and of course a still greater amount is in the cell itself.
EXAMPLE 6
15 cc portions of the synthetic medium described in Example 1 were placed in 125 cc Erlenmeyer flasks. A number of these flasks were prepared, some containing varying amounts of alpha-keto acid.
<Desc / Clms Page number 9>
adipic (also referred to as KAA). These vials are capped with cotton and autoclaved for 15 min at 1.05 kg / cm 2 vapor pressure.
Slant-tube cultures on malt-agar-agar carrying 24-28 hr cultures of growing yeast cells (Saccha-romyces cereviseae) were suspended in 10 cc of sterile physiological saline. 0.3 cc of this suspension is used to inoculate the sterile Erlenmeyer flasks.
The stoppered vials are then incubated with cotton for about 72 hours to 24 hours on a reciprocating shaker. At the end of this fermentation period, the flasks are steamed for 10 minutes in an open autoclave to stop the fermentation. The contents of the flasks were centrifuged, the supernatant liquor collected and its 1-lysine content analyzed by the microbiological method indicated in Example 1. The results of this series of fermentations are shown in the table below.
Another series of fermentations is carried out in the same way using a medium composed of 50 g of dextrose, 3.8 g of ammonium sulphate and 50 cc of corn maceration liquor (at 50% dry solids) and adjusted to pH 5.3 with phosphoric acid. The results of this series of fermentations are also shown in the following table.
TABLE VI
EMI9.1
<tb> Production <SEP> of <SEP> lysine <SEP> to <SEP> from <SEP> of <SEP> KAA <SEP> by <SEP> growth <SEP> of <SEP> yeasts <SEP> in <SEP > middle
<tb>
<tb>
Synthetic <SEP> or <SEP> in <SEP> medium <SEP> liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> middle <SEP> liquor
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KAA <SEP> added <SEP> synthetic <SEP> medium <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but
<tb>
<tb>
<tb> mg / cc <SEP> [gamma] / cc <SEP>% <SEP> conversion <SEP> [gamma] / cc <SEP>% <SEP> conversion
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> None <SEP> 45 <SEP> - <SEP> 200 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.3 <SEP> 265 <SEP> 88 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 0.6 <SEP> 500 <SEP> 83--
<tb>
<tb>
<tb> 1.0 <SEP> 558 <SEP> 56 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 3,
0 <SEP> 833 <SEP> 27-- <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 5.0 <SEP> 324 <SEP> 5.4 <SEP> 4210 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb> 10, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 4210 <SEP> 42
<tb>
As can be seen from these results, alpha-keto-adipic acid is converted at a rate of 88% in the synthetic medium when the level of acid is 0.3 mg / cc of fermentation and at a rate of 84% in the maize maceration liquor medium when the acid level is 5 mg / cc. As will also be seen, the production of lysine is considerably increased compared to that obtained without the use of keto-adipic acid as a precursor, showing the conversion of alpha-keto-adipic acid to lysine as a result of fermentation.
EXAMPLE 7
A series of fermentations are carried out using the same fermentation media as in the previous example, and under the same conditions, the only difference being in the species of yeast cells used to inoculate the fermentation media. The results of these fermentations are shown in the following table. The CSL designation indicates that the medium is the corn maceration liquor medium as described in Example 1. The term SYN denotes the use of the synthetic medium as described in Example 1.
<Desc / Clms Page number 10>
TABLE VII
EMI10.1
<tb> Culture <SEP> of <SEP> yeast <SEP> medium <SEP> KAA <SEP> Yield
<tb>
<tb>
<tb> mg / cc <SEP> in <SEP> lysine <SEP> mg / cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> from <SEP> the
<tb>
<tb>
<tb> firm <SEP> "Red <SEP> Star <SEP> Bakers" <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.20
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 1.56
<tb>
<tb>
<tb> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 2.98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> from <SEP> the
<tb>
<tb>
<tb> firm <SEP> "Fleischmann's <SEP> Bakers" <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.22
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> "<SEP> CSL <SEP> l <SEP> mg <SEP> 1.95
<tb>
<tb>
<tb> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3.92
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> ellipsoideus <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0,
010
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0.103
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> thermantitonium <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.004
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0.121
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces- <SEP> turbidans <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.008
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0.185
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.008
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0.165
<tb>
In another series of fermentations conducted in the same way, other species of Saccharomyces namely Saccharomyces aromaticus, Saccharomyces spiritus, and Saccharomyces logos, also convert alpha-keto-adipic acid to lysine in notable amounts.
EXAMPLE 8
The ability of yeast cells of a different family to convert alpha-keto-adipic acid to lysine is demonstrated in fermentations in which several species of Torulopsis are employed. This suitability was demonstrated both in the synthetic medium and in the corn maceration liquor medium as described in Example 1. The fermentation medium contained varying amounts of alpha-oeto-adipic acid. The results of this study are shown in the following table.
TABLE VIII
EMI10.2
<tb> Culture <SEP> of <SEP> yeast <SEP> Medium <SEP> Precursor <SEP> mg / cc <SEP> Lysine <SEP> mg / cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> used
<tb>
<tb>
<tb> strain <SEP> NRRL <SEP> Y-900 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.48
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3.70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> used
<tb>
<tb>
<tb> strain <SEP> NRRL <SEP> 1082 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.39
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3.76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> used
<tb>
<tb>
<tb> strain <SEP> NRRL <SEP> 1084 <SEP> CSL <SEP> none <SEP> 0.46
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3.18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> cramoris <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.07
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,
37
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> sphaerica <SEP> SYN <SEP> none <SEP> 0.04
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP>" <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0.68
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
In further experiments using yeast cells of the same Cryptococcacae family it was found that yeasts of other strains, including the species Rhodoturola glutinis and Candida lipolytica also have the ability to convert alpha-keto-adipic acid to lysine. in the same type of fermentation and under the same fermentation conditions as described above. Still other experiments indicate that other strains such as Kloeckeria can convert alpha-keto-adipic acid to lysine in a fermentation process as described above in significant amounts.
EXAMPLE 9
Many species of strains of the Endomycetaceae family have also been examined for their ability to produce lysine from alpha-keto-adipic acid as a precursor. These experiments were conducted with a variety of different nutrient substrates but were otherwise similar. to the fermentation described above.
In one of these series of experiments the fermentation medium contained 2% molasses and 3% malt extract as nutrients. After 72 hours of fermentation, the fermentation mass is steamed at 1000 for 10 minutes to stop the fermentation and disrupt the yeast cells.
The supernatant liquor for lysine was then analyzed with the following results:
TABLE IX A
EMI11.1
<tb> Culture <SEP> of <SEP> yeast <SEP> Lysine <SEP> not <SEP> of <SEP> [gamma] / Ml <SEP> 5 <SEP> mg / cc <SEP> KAA
<tb>
<tb>
<tb> precursor
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> 58 <SEP> 426
<tb>
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 78 <SEP> 505
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomycopsis <SEP> fibuliger <SEP> 43 <SEP> 557
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomycodes <SEP> ludwigii <SEP> 62 <SEP> 385
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 58 <SEP> 958
<tb>
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 60 <SEP> 565
<tb>
In another series of fermentations, the fermentation medium contained 0.4% yeast extract, 0.4% glucose and 1.0% malt extract.
The results are shown below.
TABLE IX B
EMI11.2
<tb> Culture <SEP> of <SEP> yeast <SEP> Lysine <SEP> not <SEP> of <SEP> [gamma] / Ml
<tb>
<tb> precursor <SEP> 5 <SEP> mg / cc <SEP> KAA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 70 <SEP> 853
<tb>
<tb> Endomycopsis <SEP> fibuliger <SEP> 63 <SEP> 284
<tb>
<tb> Saccharomycodes <SEP> ludwigii <SEP> 52 <SEP> 310
<tb>
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 143 <SEP> 758
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 57 <SEP> 185
<tb>
In another series of fermentations, the medium contained 5% cerelose (technical grade dextrose), 5% corn maceration liquor and 0.5% ammonium sulfate.
The results are as follows:
<Desc / Clms Page number 12>
TABLE IX C
EMI12.1
<tb> Culture <SEP> of <SEP> yeast <SEP> Lysine <SEP> not <SEP> of <SEP> [gamma] / Ml
<tb> precursor <SEP> 5 <SEP> mg / cc <SEP> KAA
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 108 <SEP> 351
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 44 <SEP> 116
<tb> Lipomyces <SEP> starkeii <SEP> 155 <SEP> 314
<tb>
As can be seen from the above, the conversion of alpha-keto-adipic acid into lysine varies considerably depending on the nature of the nutrient medium.
EXAMPLE 10
About 200 g of resting yeast cells (Saccharomyces cereviseae), sold in a grocery store under the brand name "Fleischmann's Baker's Yeast", are suspended in 1 liter of water and mixed with 1 liter of an aqueous solution. 1.0% alpha-keto-adipic acid. The mixture is buffered to pH 4.5 with 0.1 M citric acid and sodium hydroxide. The free lsine content of the supernatant and a sample of disrupted yeast cells is examined. There is no lysine. The suspension containing the resting cells is then placed in a container and air is passed through the solution at 15 liters / min for 23 hours at room temperature. At the end of this time, the yeast cells were found to contain 2.4 g / l of free lysine.
EXAMPLE 11
The procedure of Example 10 above is repeated, adjusting the pH of the aqueous suspension, initially, to values from 3.0 to 8.5. Some of the alpha-keto-adipic acid is converted to lysine in all cases, but optimum results are obtained in the pH range of 3.0 to 5.0.
Although one of the main advantages of the present invention is that all of the fermented mass resulting from the fermentation can be added directly, with drying if desired, to animal feeds to increase their content. in equilibrium lysine, or that the separated yeast cells can be used to supplement lysine deficient foods for humans and animals, it may be desirable to recover the essentially pure lysine from the fermented product. The 1-lysine content can be recovered from the fermented liquor in any known manner.
One effective way is to use ion exchange resins having affinity for amino acids. Aqueous liquors containing 1-lysine, whether from the supernatant liquor of the fermenter or from hydrolyzed yeast cells containing the free lysine, is adsorbed onto a suitable ion exchange resin and then eluted. , and the eluate is refined to obtain essentially pure 1-lysine.
Yeast cells which have been in contact with 5-formyl-2-oxovaleric acid or alpha-keto-adipic acid are characterized by an extremely high 1-lysine content of 10% and above and appear to be be a new form of yeast because of this high content of free 1-lysine. This property makes these yeast cells particularly valuable for supplementing low-lysine foods from cereals such as corn, oats and rice. For example, oatmeal is poor in 1-lysine and the addition of lysine amounts up to about 0.4% by weight has been recommended.
This is easily accomplished after adding about 4% by weight, dry, of yeast cells containing 10% free lysine. Naturally, when the yeast cells contain greater amounts than it
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has not been indicated above, the amount of yeast which needs to be added can be considerably reduced.
The amount of free lysine in yeast cells can be determined by the amount of organic acid that is added to the fermentation that produces the yeast cells. Larger amounts of 1-lysine added to the fermentation, i.e. amounts up to 2%, lead to higher levels of free 1-lysine in the yeast and in the fermentation medium where it is possible. isolate it independently from free 1-lysine and protein-bound lysine in yeast cells. The invention therefore covers the use of quantities of precursor as high as 2% by weight in this process.
CLAIMS
1. Process for the preparation of 1-lysine, characterized in that subjecting to the action of yeast enzymes an organic acid chosen from 5-formyl-2-oxovaleric acid, alpha-amino acid -adipic and alpha-keto-adipic acid.