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PROCEDE DE PRODUCTION MASSIVE ET DE TRAITEMENT DE VIRUS PATHOGENES
ET DES SUBSTANCES'QUI LES ACCOMPAGNENT.
Le principe de la préparation des vaccins spécifiques contre les maladies à virus filtrables ou ultra virus de l'homme et des animaux, rend nécessaire la production massive de ces virus. Or, ceux-ci ne se cultivent que dans ou en présence de cellules vivantes, aussi s'efforce-t-on d'obte- nir leur culture, plus ou moins abondante de diverses manières : - culture in vivo, c'est-à-dire chez les animaux; - culture in vitro, c'est-à-dire dans des milieux de culture ar- tificiels ou naturels, convenablement préparés contenant des cellules vivan- tes qui sont elles-mêmes en culture ou en survie et dans lesquels les virus se multiplient; - culture in ovo, c'est-à-dire dans des embryons de.poulet en développement dans l'oeuf; - ou bien encore culture dans des organes ou dans de grands foe- tus mis en survie par inoculation artificielle.
Mais ces méthodes n'ont, en général, qu'un rendement assez limi- té et dans certains cas insuffisant. Les méthodes de culture in vitro et in ovo, principalement, outre qu'elles peuvent fournir des virus accompagnés de protéines étrangères à l'espaèce à laquelle on les destine, et de ce fait être plus ou moins dangereuses, ont surtout le défaut grave de provoquer des variations des propriétés spécifiques des virus, ce qui peut rendre ceux-ci inutilisables.
Un exemple de virus que l'on cherche à produire en grande quan- tité est, par exemple, celui de la fièvre aphteuse.
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Dans ce cas particulier, c'est en général à partir des aphtes qui apparaissent.sur la langue et les muqueuses de la gueule qu'on recueille le virus qui sert à la fabrication du vaccin antiaphteux, après broyage, adsorp- tion sur alumine et atténuation par le formol à une température convenable.
Mais une vache artificiellement infectée puis sacrifiée pour permettre une récolte totale de virus, ne fournit, en moyenne,que 40 à 70 gr de virus; pour que la récolte soit légèrement plus abondante, il est nécessaire de sa- crifier des animaux spécialement sélectionnés. Le prix de revient'du virus destiné à la production du vaccin est donc élevé. De plus, le virus est ob- tenu souvent en quantité insuffisante. En outre, il s'agit d'un produit vi- rulent souillé de divers microbes. C'est pour ces raisons principalement, que l'on a cherché à obtenir la culture massive du virus aphteux.
On s'est adres- sé alors à d'autres sources provenant de l'espèce bovine: sang, salive dont on excite la sécrétion par des drogues, diverses autres sécrétions, culture in vivo du virus aphteux associé à un autre virus (virus de la vaccine) ce qui donne une pulpe de deux virus mélangés, etc...
D'autres cultures-in vivo ont été pratiquées chez différentes espèces animales: porcine, ovine, rongeurs de laboratoires, parfois en pré- parant spécialement l'animal; inoculation concomitante d'un virus d'une autre sorte, production d'un oedème réactionnel par substances irritantes ou une infection, inoculation dans les tissus d'un cancer greffé chez le cobaye, dans le poumon de lapin modifié par une autre infection ou par des troubles circulatoires provoqués, ou diverses réactions, etc... Mais dans toutes ces tentatives de culture in vivo, le rendement en virus est assez faible, va- riable et aléatoire; de plus chez les espèces différentes de l'espèce bovi- ne, le virus aphteux subit des modifications non désirables en ce qui con- cerne la préparation de vaccins pour les bovins.
On s'est efforce aussi d'obtenir la production massive du virus aphteux par la culture in vitro, soit la culture sur lambeaux de la muqueuse de la langue de bovins adultes après désinfection, dans un milieu de culture principalement artificiel, soit la culture sur petits fragments de peau de foetus de vache dans un milieu naturel, ayant la valeur d'un dialysat, li- quide céphalorachidien ou liquide amniotique de vache.
Ces deux procédés permettent d'obtenir la culture du virus aph- teux en assez grande quantité; on peut craindre toutefois,' que la multipli- cation du virus hors de l'organisme ne nuise à ses propriétés, tôt ou tard.
C'est à cause de tous les inconvénients et de toutes les diffi- cultés signalées ci-dessus -que la source principale du virus aphteux en vue de la fabrication du vaccin antiaphteux dans les divers pays, est essentiel- lement représentée par les aphtes obtenus à la suite d'inoculations de virus aphteux dans la muqueuse linguale de la vache. C'est à partir de la source principale représentée par les aphtes et de quelques autres sources, que le vaccin antiaphteux est préparé par adsorption sur alumine et atténuation par le formol et la chaleur, ou par d'autres antiseptiques, ou par des agents physiques, comme les rayons ultra-violets, etc... Mais ce vaccin liquide ne peut être desséché, ou même être conservé autrement qu'au froid, à quelques degrés centigrades, sans perdre ses propriétés.
Puisque la récolte des aphtes est forcément limitée, on cherche surtout à préparer un vaccin antiaphteux qui utilise le moins possible de matière virulente, par exemple en ajoutant au virus certaines substances, comme des protamines ou autres. Mais cette économie de matière virulente ne résoud pas pour autant le problème général de la production massive des vi- rus.
Il n'existe donc pas actuellement de procédé de production en très grande quantité du virus aphteux, chez l'espèce sensible à laquelle le vaccin antiaphteux est surtout destiné, c'est-à-dire l'espèce bovine, un tel procédé de culture massive in vivo devant naturellement conserver au vi-
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rus aphteux toute sa virulence et ses propriétés spécifiques et toutes les qualités nécessaires à la production d'un vaccin efficace et devant permet- tre même de préparer un vaccin qui puisse être conservé à l'état sec. Or ce qui vient d'être dit pour le virus aphteux vaut pour d'autres virus qui sont pathogènes pour l'homme et pour les animaux.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir ces virus spécifi- ques très, virulents en très grande quantité, par plusieurs kilogrammes, avec les substances qui les accompagnent et permet aussi d'atténuer ou de suppri- mer leur pouvoir pathogène puis de les préparer à l'état sec s'il en est be- soin.
Il est bien entendu d'ailleurs que ce procédé est général et ap- plicable à des virus divers des animaux et de l'homme.
Il consiste à provoquer chez l'animal réceptif le développement en grande masse du tissu ou le virus que l'on veut cultiver se multiplie élec- tivement, ensuite à infecter l'animal par ce virus, soit par inoculation dans cette masse tissulaire élective néoformée ou dans une autre région, soit par contage, puis à prélever la masse virulente au moment choisi et à la traiter convenablement. De nombreux virus filtrables, en effet, ne se multiplient abondamment et ne conservent leurs caractères que dans les cellules de leurs tissus d'élection: tissus épithéliaux, nerveux, etc... Ils peuvent avoir une électivité stricte pour certains tissus et non pour d'autres. En outre cer- tains tissus électifs favorisent plus que d'autres la production de substan- ces assurant les mécanismes de l'immunisation.
Le procédé utilise précisé- ment cette électivité tissulaire de nombreux virus, et au lieu de provoquer seulement une masse réactionnelle quelconque et indéterminée chez l'animal réceptif pour tenter d'augmenter la récolte du virus inoculé, comme ont fait divers chercheurs, il crée les conditions mêmes de milieu tissulaire'spéci- fique que le virus exige pour sa multiplication abondante et la conservation de ses caractères.
D'une manière générale, les tissus d'électivité du virus consi- déré sont prélevés aseptiquement au foetus ou même à l'adulte de la même es- pèce, ou occasionnellement à une autre espèce plus ou moins proche et elle- même réceptive. Ces tissus sont convenablement fragmentés et dilués, puis la suspension tissulaire ainsi préparée est implantée chez l'animal sensi- ble, en un endroit approprié sous la peau, dans la cavité abdominale, pleura- le, etc... Cette suspension de tissus spécifiques s'organise rapidement en une masse de néformation, tout en provoquant des réactions importantes de la part de l'hôte.
Il se constitue ainsi ce que l'on peut nommer un embryone spécifique, constitué seulement par les tissus normaux d'élection du virus: par exemple tissus épithéliaux; et parmi eux, ceux de tel organe et non tel autre, lorsque les affinités du virus que l'on veut cultiver sont très étroi- tes. Le liquide utilisé pour réaliser la suspension tissulaire destinée à être implantée chez l'animal réceptif peut être constitué totalement ou par- tiellement par le liquide amniotique baignant le foetus dans l'utérus, ce liquide étant prélevé aseptiquement. Le liquide amniotique peut être emplo- yé tel, ou après préparation, purification ou adjonctions convenables.
L'utilisation d'un tel liquide au lieu d'eau à un pH convenable, augmente la masse de matière dans laquelle le virus prolifère.
La suspension tissulaire implantée chez l'animal peut être con- stituée non seulement par la peau du foetus, les muqueuses de la gueule, et d'une façon générale toutes les parties déjà précisées, mais également pour tous organes épithéliaux ou non.Au. moment choisi, après quelques jours, le virus est inoculé à l'animal, soit par voie élective, soit ou en même temps dans cette masse, que l'on peut rendre énorme, du poids de plusieurs kilo- grammes chez les grands animaux de boucherie, comme la vache par exemple. Le virus se trouve directement dans son milieu tissulaire d'élection, tissu qui est du reste lui-même en pleine culture, de sorte que le virus se multiplie
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très activement en gardant, ou même en augmentant sa virulence.
En outre, cer- taines substances chimiques peuvent être ajoutées au liquide de dilution du virus, de façon à exalter sa virulence et à favoriser sa culture et le déve- loppement de produits utiles à l'immunisation. On peut même ajouter des agents biologiques, comme certaines bactéries convenablement choisies. Ces substan- ces ou agents favorables peuvent être ajoutés aussi à la suspension tissu- laire d'implantation. Si cela est indiqué l'animal infecté est placé dans une enceinte.à température convenable, par exemple refroidie.
Cette masse virulente 'est facilement prélevée après un délai con- venable et elle représente une récolte de virus qui peut correspondre, pour un seul animal, à celle que donneraient normalement, dans leurs'propres tis- sus électifs, des dizaines, voir des centaines des mêmes animaux. La matière virulente ainsi obtenue très facilement en quelques jours, avec toutes ses qualités et avec toutes les substances qui l'accompagnent et avec une abon- dance encore jamais atteinte, est alors traitée convenablement de façon à être transformée en vaccin par exemple, ou en masse d'injection à l'animal pour l'obtention d'un antisérum.
Elle peut être utilisée telle après broyage appro- prié, ou bien le virus peut être extrait par divers moyens physicochimiques; finalement la masse virulente est adsorbée, si cela est indiqué, sur des sub- stances appropriées puis sa virulence est atténuée par divers agents physi- ques, chimiques ou biologiques.
Le procédé selon l'invention réside donc dans la culture massive des virus, in vivo, sur embryomes spécifique, avec préparation et atténuation convenable de la masse virulente, y compris, si cela est indiqué, sa dessica- tion, par sublimation dans le vide à basse température ou lyophilisation.
Toutefois dans certains cas l'atténuation peut ne pas être nécessaire.
Dans le but de décrire le procédé selon l'invention avec plus de détails, on va prendre dans la suite le cas de la préparation du virus de la fièvre aphteuse, mais ce procédé est applicable aussi bien, avec des varian- tes appropriées, à la production massive et à la préparation de divers virus pathogènes des animaux et de l'homme.
Les temps essentiels sont la préparation et l'implantation de la suspension tissùlaire spécifique, l'inoculation du virus, la récolte et la préparation de la matière virulente.
La suspension tissulaire est essentiellement constituée par des tissus épithéliaux de même espèce, prélevés aseptiquement aux foetus de va- ches abattues,,par exemple, dans les grands abattoirs. Les utérus pleins, obtenus sans précautions spéciales sont lavés, essuyés, puis désinfectés convenablement par un badigeonnage à la teinture d'iode par exemple. Ils sont ensuite ouverts aseptiquement et le foetus prélevé. Toute la peau des foe- tus de taille convenable, encore glabres,, les muqueuses de la gueule, la langue sont prélevés. On peut y ajouter des cordons ombilicaux, des thymus , des testicules, et même au besoin des poumons, ces organes pouvant être pris sur des foetus de grande taille, même près du terme.
Tous ces organes sont coupés en fragments et ceux-ci lavés dans un liquide physiologique conve- nable de façon à les débarrasser autant que possible de leur sang. Les pou- mons en particulier ne doivent être pris qu'après avoir saigné les grands foetus et au besoin fait passer un courant de liquide physiologique dans leurs vaisseaux pour en chasser tout le sang. Des thymus, des poumons et d'autres organes des animaux jeunes et adultes peuvent être utilisés mais les précau- tions de l'élimination du sant et d'aseptie sont plus difficiles.
Si l'on utilise des organes de l'adulte qui sont naturellement souillés, comme la muqueuse de la langue, la muqueuse du rumen etc... et qui constituent de bons milieux de culture, il convient de les préparer et de les désinfecter convenablement par des antiseptiques, des substances anti- bactériennes comme des antibiotiques etc... Ces organes peuvent être stockés quelque temps au froid,avant d'être utilisés. Les fragments d'organes, sont
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passés aseptiquement dans un hache-viande qui les réduit en pulpe fine. Cel- le-ci est diluée convenablement, par exemple de moitié, avec un liquide phy- siologique apyrogène et stable, comportantun système-tampon, et de pH con- venable, pH 8,2 par exemple, de sorte que la suspension tissulaire qui est elle-même acide, soit ramenée à un pH situé approximativement vers pH 6,5.
A cette suspension ainsi préparée aseptiquement, on peut ajouter, à dose con- venable, des produits antibactériens, comme ceux appelés antibiotiques, par exemple.
Cette suspension est alors injectée à la vache, animal sensible dans l'exemple choisi. L'implantation de la suspension tissulaire se fait aseptiquement, soit sous la peau que l'on peut au préalable raser et large- ment décoller par insufflation d'air stérile, ou dans la cavité abdominale, par injection intrapéritonéale. Les vaches en bonne santé supportent de tel- les implantations aseptiques de plusieurs litres, sans inconvénients. Il est possible, d'implanter aussi une telle suspension provenant de tissus de l'es- pèce bovine dans un hôte d'espèce sensible, mais différente, le porc par exemple.
L'infection par le virus aphteux se fait quelques jours après l'implantation, par exemple 3 ou4. A ce moment l'embryome spécifique s'est organisé, les cellules altérées sont en voie d'élimination, les autres sont en multiplication, le pH est celui du milieu intérieur de la vache. La dose convenable de virus préalablement titrée est diluée dans une quantité appro- priée de liquide physiologique tamponné et inoculée dans l'embryome même, sous la peau, en des points multiples, ou dans la cavité abdominale. En même temps la vache peut recevoir une inoculation virulente dans la muqueuse de la langue, ce qui est le procédé classique de transmission expérimentale de la fièvre aphteuse. chez cet animal, ou être infectée par une autre voie ou par contage à partir d'un animal déjà atteint de la maladie.
Selon les cas d'inoculation par-un procédé classique, ou la transmission de la maladie par contage naturel peut dispenser de l'inocu- lation dans la masse de l'embryome.
Cette inoculation virulente dans la muqueuse de la langue permet de suivre très facilement l'évolution sur la vache inoculée et de recueillir l'embryome virulent au moment le plus favorable.
Il est possible, en outre, d'exalter la virulence du virus en lui associant ou en lui fournissant, selon l'invention, certaines substan- ces du type des polysaccharides qui font partie du métabolisme normal et que l'on trouve en abondance dans des tissus comme l'épiderme, les muqueuses, les cartilages, les tissus sécréteurs de mucines, etc... : acide hyaluronique et ses esters sulfuriques, tels que ceux nommés, chondroïtine sulfurique, mu- coïtine sulfurique et les corps qui en dérivent. C'est ainsi que des extraits appropriés de ces tissus et tout simplement l'héparine que l'on se procure très facilement,maintenant, et qui est une substance riche en ester sulfuri- que (micoitine sulfurique) exalte notablement, à faible dose, la culture et la virulence.
On peut employer de même des mucines dont le groupe prosthéti- que est aussi l'acide micoitine sulfurique. -Les extraits convenables ou l'hé- parine, ou des mucimes, peuvent être ajoutés simplement au'liquide de dilution du virus lors de l'inoculation, ou être injectés dans l'embryome spécifique avant ou après.
On peut encore associer au virus dans le liquide de dilution, ou injecter dans l'embryome, d'autres substances ou des agents biologiques susceptibles de favoriser soit la culture du virus, soit le développement des substances favorisant ultérieurement les mécanismes et l'immunisation contre l'infection provoquée par ce virus: notamment certains microbes conve- nablement choisis,isolés ou non des tissus des aphtes qui se développent sur la lange des animaux atteints de fièvre aphteuse et pouvant même amener un certain degré de nécrobiose.
La maladie se développe et toute la masse de l'embryome spécifi-
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que sert de inilie , de culture extrêmement favorable au virus aphteux. Cette masse est prélevée aseptiquement au moment convenable, déterminé par l'évolu- tion de la maladie, d'après les aphtes, la courbe thermique et le but à at- teindre, des prélèvements pouvant être faits tardivement alors que la virulen- ce est déjà atténuée par les réactions de défense de l'organisme.
La vache ainsi préparée donne une récolte de matière virulente en général supérieure à la quantité de suspension tissulaire qu'on lui a in- jecté. L'implantation, provoque, en effet, une réaction des tissus de l'ani- mal et une secrétion abondante de sérosité. C'est ainsi que sous la peau l'embryome spécifique détermine un très volumineux oedème, dans la péritoine il provoque la sécrétion de plusieurs litres de liquide d'ascite, etc.. Tout ce matériel est hautement virulent, il convient de le prélever en le souil- lant le moins possible de sang. On peut récolter par exemple, très facilement, en quelques jours, 5 Kgs ou beaucoup plus de matière très virulentes, chez une seule vache, cette matière communiquant la maladie par inoculation à d'au- tres vaches, à la dilution de 10-3,par exemple, ce qui correspond à une quan- tité formidable de virus.
Les tissus virulents que l'on a prélevé sont alors convenablement préparés, aseptiquement. Ils sont vérifiés et fragmentés, les graisses, les tissus fibreux ou sanglants sont rejetés. Les fragments sont pulpés au hache viande, puis broyés aussi complètement que possible c'est-à-dire jusqu'au bro- yage des cellules elles-mêmes, qui les constituent. Pour cette opération. qui se fait à basse température, divers broyeurs-émulsionneurs à grande vitesse, homogénéisateurs peuvent être utilisés, en association ou non avec l'action de la congélation et de la décongélation,qui peut faire éclater les cellules, avec celles des ultrasons ou d'autres actions encore.
Finalement le broyat cellulaire est mélangé aux liquides virulents recueillis chez l'animal en me- me temps que les tissus virulents : liquided'oedème, liquide d'ascite, etc... le tout est sommairement filtré sur une gaze, par exemple, ou légèrement con- trifugé pour éliminer les restes fibreux s'il y en a, on obtient alors le broyat virulent brut, de pH un peut alcalin (pH 8,3 par exemple). Ce broyat est ensuite convenablement traité, selon le but cherché. Il peut être uti- lisé tel ou au contraire servir de matière d'extraction pour des fractions séparées. Toutes les opérations sont effectuées aseptiquement et à basse tem- pérature.
On peut, notamment, extraire la fraction désoxyribonucléo-protéi- que par l'action du chlorure de sodium concentré (la concentration moléculai- re ou deux fois moléculaire, et précipitation par l'eau distillée) et la frac- tion ribonucléoprothéique par acidification. Les nucléoprotéines totales (iesoxy-ribonucléoprotéines et ribonucléoprotéines), associées à d'autres protéines peuvent être précipitées aussi par une solution de chlorure de cé- rium ou de lanthane, stérilisée par filtration et diluée convenablement.
La fraction des globulines (notamment les ) globulines) peut être précipitée paraddition à froid d'alcool éthylique a 50 , jusqu'au titre de 25 . La précipitation de la totalité des protéines peut se faire par un mélange d'alcool à 96 et de dioxane pur par exemple,.à parties égales, dans la proportion de trois parties de ce mélange pour une de broyat brut par exem- ple. La précipitation par l'acétone ou le sulfate d'ammonium ou d'autres corps peut aussi se faire, mais elle est difficilement complète, en outre la dilution et le relargage tendant à provoquer une dissociation nuisible des complexes protéiques.
Naturellement, d'autre procédés d'extraction de diverses frac- tions peuvent être employés. Les diverses fractions peuvent ensuite être con- servées par dessication à basse température (lyophilisation).
Le,broyat brut concentré ou dilué par un liquide physiologique tamponné de pH convenable ou les fractions actives qui ont été extraites peu- vent ensuite être préparées selon le but à atteindre. On peut par exemple, les adsorber sur un corps adsorbant, atténuer leur virulence, puis les lyophi- liser.
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L'adsorption, s'il convient de la faire, selon le but cherché peut.être pratiquée selon la méthode classique, sur gel d'alumine. Mais on peut aussi obtenir une bonne adsorption en mélangeant convenablement le broyat virulent ou les extraits qui en proviennent, avec des préparations composées de gomme arabique ou autres gommes solubles dans l'eau,d'empois d'amidon ou de glycogène, ou autres glucides, le tout amené à un pH con- venable, par exemple légèrement alcalin, par un système tampon de glycocol- le et de soude. Les quantités respectives de ces divers corps peuvent va- rier selon les besoins.
Bien entendu, d'autres préparations adsorbantes peuvent être utilisées, poluvinulpyrrolidone ou autres substances organi- ques ou minérales ou biologiques etc.. ou encore des préparations de gomme arabique avec un système tampon comme il vient d'être dit, auxquels on ajou- te une faible quantité de solution alcoolique de gomme mastic; il se pro- duit un fLoculat très homogène, adsorbant, qui peut être dessèche sous for- me de fragments n'adhérant pas au verre, et-:,qui peuvent se dissoudre rapide- ment dans l'eau. Toutes ces préparations sont nàturellement aseptiques.
Toutefois, dans le broyat burt, il existe, outre les nucléopro- téines virulentes, une quantité importante de protéines et d'autres corps, en association ou non avec le virus. Ces corps ont une grande importance en ce qui concerne le développement des mécanismes de l'immunisation. Cet ensemble, non dissocié, constitue par'lui-même, à l'égard du virus, un com- - plexe adsorbant naturel, dont il peut y avoir intérêt à respecter l'intégri- té.
Un adsorbant donnant d'excellents résultats est constitué par de la salive. S'il s'agit par exemple de traiter des virus de la fièvre aph- teuse en vue de fabriquer un vaccin, on prélève en grande quantité la sali- ve d'animaux atteints ou non de fièvre aphteuse, de vaches par.exemple. On active la secrétion salivaire de ces animaux en leur injectant une faible quantité de pilocarpine. La salive recueillie de façon convenable, est ni nécessaire, clarifiée par décantation, centrifugation ou.filtration.
Cette salive est préservée de l'infection par des micro-organis- mes, par l'adjonction d'une faible dose d'un antibactérien, antibiotiques, sulfamides ou antiseptiques. Les antiseptiques utilisables sont relative- ment nombreux et on peut citer par exemple le tricrésol, les crésols isomè- res, l'acide phénique, le formol, le thymol ou des dérivés d'ammonium qua- ternaires, des dérivés de l'acide p-oxybenzoïque, de l'acide p-chloroben- zoïque, etc... Ces divers antiseptiques peuvent être utilisés seuls ou en association. La salive peut, en outre, être stérilisée par action physique, chauffage approprié, irradiation ultra-violette, associée ou non à l'ac- tion de corps chimiques.
La salive qui constitue un excellent adsorbant est mélangée au produit virulent que celui-ci proviennent, soit des enbriyomes spécifiques, soit de toute autre source de virus, des aphtes par.exemple.La salive n'est pas utilisée elle-même comme source de virus.
L'utilisation de la salive, qu'elle provienne d'un animal sain ou atteint de la fièvre aphteuse, est particulièrement intéressante, car, non seulement elle intervient par sa propriété adsorbante, mais encore elle exerce pendant la dessication ou la lyophilisation, une action de protec- tion des propriétés du virus, notamment des propriétés anti-géniques du virus vaccin ou des fractions extraites à partir de la matière virulente.
La salive peut,.en outre être utilisée comme liquide de dilution du vaccin sec lorsque l'on veut injecter ce,vaccin a un animal. La salive utilisée comme liquide de dilution peut être anti-septisée ou stérilisée par un chauffage approprié.
En outre les préparations adsorbantes peuvent être utilisées seules ou en association avec des.corps dont l'un des plus intéressants est la glycérine qui coopère à la protection des virus vaccins.
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Après lyophilisation, on obtient une matière sèche mais légère- ment onctueuse grâce à la présence de la glycérine.
L'atténuation de la matière virulente, soit non dissociée à l'é- tat de complexe naturel, ou de ses diverses fractions peut être faite selon les méthodes classiques, par l'action de divers antiseptiques à dose, durée, et température convenables, par exemple la formaldéhyde ou par l'action d'a- gents physiques seuls, température, irradiation ultra-violette, etc...
Mais d'autres procédés sont, selon l'invention, encore applicables, c'est ainsi que le dioxane pur, ou les mélanges d'alcool éthylique et de dio- xane pur, dont il a été parlé, peuvent, dans des conditions convenables, at- ténuer suffisamment la virulence, dans des broyats virulents, ou des broyats d'aphtes si l'on s'adresse à cette source classique de virus aphteux tout en .ménageant les propriétés immunisantes. De même, certaines substances chimi- ques qui existent dans les organismes, comme résultat de processus de dégra- dations en zymatiques, sont d'un grand intérêt pour l'atténuation des virus.
C'est ainsi que les polysaccharides qui existent normalement en abondance dans certains tissus,et notamment la peau, et dont il a été parlé plus haut et dont certains activent la virulence et la culture du virus, peuvent libé- rer comme produits de dégradation, sous l'action de certains enzymes, comme des enzymes mucolytiques ou autres ou par autre hydrolyse, des substances qui inactivent ou neutralisent la matière virulente. C'est le cas par exemple, de l'acide d-glycuronique ou de certains de ses dérivés (d-glucurone par exemple) et de la glucosamine ou de ses dérivés: N-acétyl-de-glucosanine ou simplement du chlorhydrate de glucosamine par exemple, corps pratiquement non toxiques dans l'emploi envisagé.
Il suffit donc d'ajouter ces corps, no- tamment le chlorydrate de glucosamine, à la matière virulente, à concentra- tion, durée et température convenables pour l'atténuer ou la neutraliser suf- fisamment. De tels corps comme la glucosamine ou ses dérivés, ou la d-glucu- rone, ou l'acide d-glycuronique, ou autres corps voisins ou qui en dérivent, peuvent être ajoutés de façon convenable aux préparations de matière viru- lente et d'adsorbat, dont il a été parlé, et atténuer suffisamment la viru- lence. Ces corps qui appartiennent au métabolisme de l'organisme peuvent agir aussi de façon analogue sur d'autres sources de matière virulente, par exem- ple les aphtes dont on se sert classiquement comme source de virus aphteux.
Il est à remarquer, d'ailleurs, que les gommes, et notamment la gomme arabi- que, qui sont employées dans ces préparations contiennent divers glucides, notamment des pentoses et un acide uronique, l'acide glycuronique, et peu- vent contribuer, dans certaines conditions, à l'atténuation de la virulence.
De plus, des préparations convenables de ces corps chimiques biologiques qui atténuent ou neutralisent le virus, et des adsorbants, dont il a été par- lé,ou d'autres adsorbants injectables, constituent des préparations-retard, lentement résorbées, et pouvant provoquer des réactions favorables à l'éta- blissement de l'immunité. Enfin la virulence peut être atténuée par les mé- canismes biologiques de défense de l'organisme en cas de prélèvements tar- difs de la masse tissulaire.
L'atténuation de la matière virulente peut être faite non seule- ment en utilisant les corps ou produits déjà cités, mais également en utili- sant un ou plusieurs des corps, tels que du tricrésol ou des crésols isomères ou des dérivés d'ammonium quaternaires, ou des dérivés d'acide p-oxybenzoique ou d'acide p-chlorobenzoïque ou de l'acide phénique, etc... L'action d'un ou de plusieurs antiseptiques peut être combinée à celle d'agents physiques tels qu'un chauffage ménagé, une irradiation ultra-violette etc...
On peut également-employer'pour atténuer la matière virulente, des corps tels que divers acides uroniques l'acide galacturonique ou autre, ou encore l'acide gluconique, ou des corps qui en dérivent.
La matière virulente, non souillée de bactéries d'infection ba- nale, obtenue par kilogramme en quelques jours, préparée, adsorbée ou 'non, atténuée comme il a été dit, peut alors être conservée, soit à l'état liqui-
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de, en solution, soit être desséchée par sublimation sous vide à basse tempé- rature, par lyophilisation. On peut alors la préparer en poudre ou en compri- més et la conserver par exemple en tubes scellés, sous vide ou sous azote.
Enfin, la lyophilisation, c'est-à-dire la sublimation permettant la dessication, est de préférence faite après adjonction de corps protec- teurs, et en particulier des protecteurs déjà cités plus haut, c'est-à-dire la salive en association ou non à d'autres corps tels que des gommes: gomme arabique, etc...
La matière virulente obtenue peut aussi être utilisée après avoir été plus ou moins atténuée, comme masse d'injection à l'animal de façon à pro- duire chez celui-ci, dans le sang et dans d'autres liquides, des substances spécifiques ou anticorps. De tels sérums contenant des anticorps ou antisérum sont destinés à protéger temporairement d'autres animaux contre la maladie provoquerpar le virus.
Bien entendu l'invention n'est pas limitée par les détails de rai- se en oeuvre du procédé, qui ont été décrits en prenant comme exemple parti- culier celui de la fièvre aphteuse. On pourrait les modifier ou ne pas les pren- dre tous sans sortir du cadre de l'invention qui est applicable à la produc- tion massive et au traitement de diverses matières virulentes.
On choisira les tissus à implanter d'après les affinités particu- lières du virus que l'on veut produire et l'on injectera s'il en est besoin, des substances favorisantes, différentes selon les cas, par exemple pour.cer- tains virus diffusibles, la choline, la guanidine, etc...
REVENDICATIONS.
1. - Un procédé de production massive et de traitement de virus pathogènes et des substances qui les accompagnent, caractérisé en ce que le procédé consiste à provoquer chez un animal réceptif, le développement en mas- ses importantes de tissus où le virus que l'on désire produire se multiplie électivement,puis au moment opportun l'infection virulente est transmise à l'animal par inoculation ou contage et la masse de tissus devenue virulente est prélevée après un temps déterminé, cette masse est ensuite traitée se- lon le but cherché.
2. - Un procédé selon 1, caractérisé en ce que les tissus dans lesquels le virus se multiplie d'une façon élective sont prélevés aseptique- ment au foetus ou à l'adulte d'un animal de même espèce ou d'une espèce ré- ceptiveplus ou moins proche de l'animal réceptif sur lequel doit être déve- loppée la masse importante de tissus.
3. - Procédé selon 1, caractérisé en ce que les tissus provenant d'un foetus ou d'un adulte sont fragmentés dilués et additionnés d'antibio- tiques si nécessaire, puis la suspension tissulaire obtenue est implantée chez l'animal réceptif en un endroit approprié de celui-ci, dans le cas de fièvre aphteuse par exemple de l'implantation se fait principalement sous la peau ou dans la cavité péritonéale.
4. - Procédé selon 1, caractérisé en ce que le liquide utilisé pour réaliser la suspension tissulaire destinée à être implantée chez l'ani- mal réceptif, est constitué en tout ou partie par le liquide amniotique baignant les foetus dans l'utérus, ce liquide étant prélevé aseptiquement et utilisé tel -que.,ou après purification, traitement, ou adjonctions conve- nables.
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