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PROCEDE DE PRODUCTION MASSIVE ET DE TRAITEMENT DE VIRUS PATHOGENES
ET DES SUBSTANCES'QUI LES ACCOMPAGNENT.
Le principe de la préparation des vaccins spécifiques contre les maladies à virus filtrables ou ultra virus de l'homme et des animaux, rend nécessaire la production massive de ces virus. Or, ceux-ci ne se cultivent que dans ou en présence de cellules vivantes, aussi s'efforce-t-on d'obte- nir leur culture, plus ou moins abondante de diverses manières : - culture in vivo, c'est-à-dire chez les animaux; - culture in vitro, c'est-à-dire dans des milieux de culture ar- tificiels ou naturels, convenablement préparés contenant des cellules vivan- tes qui sont elles-mêmes en culture ou en survie et dans lesquels les virus se multiplient; - culture in ovo, c'est-à-dire dans des embryons de.poulet en développement dans l'oeuf; - ou bien encore culture dans des organes ou dans de grands foe- tus mis en survie par inoculation artificielle.
Mais ces méthodes n'ont, en général, qu'un rendement assez limi- té et dans certains cas insuffisant. Les méthodes de culture in vitro et in ovo, principalement, outre qu'elles peuvent fournir des virus accompagnés de protéines étrangères à l'espaèce à laquelle on les destine, et de ce fait être plus ou moins dangereuses, ont surtout le défaut grave de provoquer des variations des propriétés spécifiques des virus, ce qui peut rendre ceux-ci inutilisables.
Un exemple de virus que l'on cherche à produire en grande quan- tité est, par exemple, celui de la fièvre aphteuse.
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Dans ce cas particulier, c'est en général à partir des aphtes qui apparaissent.sur la langue et les muqueuses de la gueule qu'on recueille le virus qui sert à la fabrication du vaccin antiaphteux, après broyage, adsorp- tion sur alumine et atténuation par le formol à une température convenable.
Mais une vache artificiellement infectée puis sacrifiée pour permettre une récolte totale de virus, ne fournit, en moyenne,que 40 à 70 gr de virus; pour que la récolte soit légèrement plus abondante, il est nécessaire de sa- crifier des animaux spécialement sélectionnés. Le prix de revient'du virus destiné à la production du vaccin est donc élevé. De plus, le virus est ob- tenu souvent en quantité insuffisante. En outre, il s'agit d'un produit vi- rulent souillé de divers microbes. C'est pour ces raisons principalement, que l'on a cherché à obtenir la culture massive du virus aphteux.
On s'est adres- sé alors à d'autres sources provenant de l'espèce bovine: sang, salive dont on excite la sécrétion par des drogues, diverses autres sécrétions, culture in vivo du virus aphteux associé à un autre virus (virus de la vaccine) ce qui donne une pulpe de deux virus mélangés, etc...
D'autres cultures-in vivo ont été pratiquées chez différentes espèces animales: porcine, ovine, rongeurs de laboratoires, parfois en pré- parant spécialement l'animal; inoculation concomitante d'un virus d'une autre sorte, production d'un oedème réactionnel par substances irritantes ou une infection, inoculation dans les tissus d'un cancer greffé chez le cobaye, dans le poumon de lapin modifié par une autre infection ou par des troubles circulatoires provoqués, ou diverses réactions, etc... Mais dans toutes ces tentatives de culture in vivo, le rendement en virus est assez faible, va- riable et aléatoire; de plus chez les espèces différentes de l'espèce bovi- ne, le virus aphteux subit des modifications non désirables en ce qui con- cerne la préparation de vaccins pour les bovins.
On s'est efforce aussi d'obtenir la production massive du virus aphteux par la culture in vitro, soit la culture sur lambeaux de la muqueuse de la langue de bovins adultes après désinfection, dans un milieu de culture principalement artificiel, soit la culture sur petits fragments de peau de foetus de vache dans un milieu naturel, ayant la valeur d'un dialysat, li- quide céphalorachidien ou liquide amniotique de vache.
Ces deux procédés permettent d'obtenir la culture du virus aph- teux en assez grande quantité; on peut craindre toutefois,' que la multipli- cation du virus hors de l'organisme ne nuise à ses propriétés, tôt ou tard.
C'est à cause de tous les inconvénients et de toutes les diffi- cultés signalées ci-dessus -que la source principale du virus aphteux en vue de la fabrication du vaccin antiaphteux dans les divers pays, est essentiel- lement représentée par les aphtes obtenus à la suite d'inoculations de virus aphteux dans la muqueuse linguale de la vache. C'est à partir de la source principale représentée par les aphtes et de quelques autres sources, que le vaccin antiaphteux est préparé par adsorption sur alumine et atténuation par le formol et la chaleur, ou par d'autres antiseptiques, ou par des agents physiques, comme les rayons ultra-violets, etc... Mais ce vaccin liquide ne peut être desséché, ou même être conservé autrement qu'au froid, à quelques degrés centigrades, sans perdre ses propriétés.
Puisque la récolte des aphtes est forcément limitée, on cherche surtout à préparer un vaccin antiaphteux qui utilise le moins possible de matière virulente, par exemple en ajoutant au virus certaines substances, comme des protamines ou autres. Mais cette économie de matière virulente ne résoud pas pour autant le problème général de la production massive des vi- rus.
Il n'existe donc pas actuellement de procédé de production en très grande quantité du virus aphteux, chez l'espèce sensible à laquelle le vaccin antiaphteux est surtout destiné, c'est-à-dire l'espèce bovine, un tel procédé de culture massive in vivo devant naturellement conserver au vi-
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rus aphteux toute sa virulence et ses propriétés spécifiques et toutes les qualités nécessaires à la production d'un vaccin efficace et devant permet- tre même de préparer un vaccin qui puisse être conservé à l'état sec. Or ce qui vient d'être dit pour le virus aphteux vaut pour d'autres virus qui sont pathogènes pour l'homme et pour les animaux.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir ces virus spécifi- ques très, virulents en très grande quantité, par plusieurs kilogrammes, avec les substances qui les accompagnent et permet aussi d'atténuer ou de suppri- mer leur pouvoir pathogène puis de les préparer à l'état sec s'il en est be- soin.
Il est bien entendu d'ailleurs que ce procédé est général et ap- plicable à des virus divers des animaux et de l'homme.
Il consiste à provoquer chez l'animal réceptif le développement en grande masse du tissu ou le virus que l'on veut cultiver se multiplie élec- tivement, ensuite à infecter l'animal par ce virus, soit par inoculation dans cette masse tissulaire élective néoformée ou dans une autre région, soit par contage, puis à prélever la masse virulente au moment choisi et à la traiter convenablement. De nombreux virus filtrables, en effet, ne se multiplient abondamment et ne conservent leurs caractères que dans les cellules de leurs tissus d'élection: tissus épithéliaux, nerveux, etc... Ils peuvent avoir une électivité stricte pour certains tissus et non pour d'autres. En outre cer- tains tissus électifs favorisent plus que d'autres la production de substan- ces assurant les mécanismes de l'immunisation.
Le procédé utilise précisé- ment cette électivité tissulaire de nombreux virus, et au lieu de provoquer seulement une masse réactionnelle quelconque et indéterminée chez l'animal réceptif pour tenter d'augmenter la récolte du virus inoculé, comme ont fait divers chercheurs, il crée les conditions mêmes de milieu tissulaire'spéci- fique que le virus exige pour sa multiplication abondante et la conservation de ses caractères.
D'une manière générale, les tissus d'électivité du virus consi- déré sont prélevés aseptiquement au foetus ou même à l'adulte de la même es- pèce, ou occasionnellement à une autre espèce plus ou moins proche et elle- même réceptive. Ces tissus sont convenablement fragmentés et dilués, puis la suspension tissulaire ainsi préparée est implantée chez l'animal sensi- ble, en un endroit approprié sous la peau, dans la cavité abdominale, pleura- le, etc... Cette suspension de tissus spécifiques s'organise rapidement en une masse de néformation, tout en provoquant des réactions importantes de la part de l'hôte.
Il se constitue ainsi ce que l'on peut nommer un embryone spécifique, constitué seulement par les tissus normaux d'élection du virus: par exemple tissus épithéliaux; et parmi eux, ceux de tel organe et non tel autre, lorsque les affinités du virus que l'on veut cultiver sont très étroi- tes. Le liquide utilisé pour réaliser la suspension tissulaire destinée à être implantée chez l'animal réceptif peut être constitué totalement ou par- tiellement par le liquide amniotique baignant le foetus dans l'utérus, ce liquide étant prélevé aseptiquement. Le liquide amniotique peut être emplo- yé tel, ou après préparation, purification ou adjonctions convenables.
L'utilisation d'un tel liquide au lieu d'eau à un pH convenable, augmente la masse de matière dans laquelle le virus prolifère.
La suspension tissulaire implantée chez l'animal peut être con- stituée non seulement par la peau du foetus, les muqueuses de la gueule, et d'une façon générale toutes les parties déjà précisées, mais également pour tous organes épithéliaux ou non.Au. moment choisi, après quelques jours, le virus est inoculé à l'animal, soit par voie élective, soit ou en même temps dans cette masse, que l'on peut rendre énorme, du poids de plusieurs kilo- grammes chez les grands animaux de boucherie, comme la vache par exemple. Le virus se trouve directement dans son milieu tissulaire d'élection, tissu qui est du reste lui-même en pleine culture, de sorte que le virus se multiplie
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très activement en gardant, ou même en augmentant sa virulence.
En outre, cer- taines substances chimiques peuvent être ajoutées au liquide de dilution du virus, de façon à exalter sa virulence et à favoriser sa culture et le déve- loppement de produits utiles à l'immunisation. On peut même ajouter des agents biologiques, comme certaines bactéries convenablement choisies. Ces substan- ces ou agents favorables peuvent être ajoutés aussi à la suspension tissu- laire d'implantation. Si cela est indiqué l'animal infecté est placé dans une enceinte.à température convenable, par exemple refroidie.
Cette masse virulente 'est facilement prélevée après un délai con- venable et elle représente une récolte de virus qui peut correspondre, pour un seul animal, à celle que donneraient normalement, dans leurs'propres tis- sus électifs, des dizaines, voir des centaines des mêmes animaux. La matière virulente ainsi obtenue très facilement en quelques jours, avec toutes ses qualités et avec toutes les substances qui l'accompagnent et avec une abon- dance encore jamais atteinte, est alors traitée convenablement de façon à être transformée en vaccin par exemple, ou en masse d'injection à l'animal pour l'obtention d'un antisérum.
Elle peut être utilisée telle après broyage appro- prié, ou bien le virus peut être extrait par divers moyens physicochimiques; finalement la masse virulente est adsorbée, si cela est indiqué, sur des sub- stances appropriées puis sa virulence est atténuée par divers agents physi- ques, chimiques ou biologiques.
Le procédé selon l'invention réside donc dans la culture massive des virus, in vivo, sur embryomes spécifique, avec préparation et atténuation convenable de la masse virulente, y compris, si cela est indiqué, sa dessica- tion, par sublimation dans le vide à basse température ou lyophilisation.
Toutefois dans certains cas l'atténuation peut ne pas être nécessaire.
Dans le but de décrire le procédé selon l'invention avec plus de détails, on va prendre dans la suite le cas de la préparation du virus de la fièvre aphteuse, mais ce procédé est applicable aussi bien, avec des varian- tes appropriées, à la production massive et à la préparation de divers virus pathogènes des animaux et de l'homme.
Les temps essentiels sont la préparation et l'implantation de la suspension tissùlaire spécifique, l'inoculation du virus, la récolte et la préparation de la matière virulente.
La suspension tissulaire est essentiellement constituée par des tissus épithéliaux de même espèce, prélevés aseptiquement aux foetus de va- ches abattues,,par exemple, dans les grands abattoirs. Les utérus pleins, obtenus sans précautions spéciales sont lavés, essuyés, puis désinfectés convenablement par un badigeonnage à la teinture d'iode par exemple. Ils sont ensuite ouverts aseptiquement et le foetus prélevé. Toute la peau des foe- tus de taille convenable, encore glabres,, les muqueuses de la gueule, la langue sont prélevés. On peut y ajouter des cordons ombilicaux, des thymus , des testicules, et même au besoin des poumons, ces organes pouvant être pris sur des foetus de grande taille, même près du terme.
Tous ces organes sont coupés en fragments et ceux-ci lavés dans un liquide physiologique conve- nable de façon à les débarrasser autant que possible de leur sang. Les pou- mons en particulier ne doivent être pris qu'après avoir saigné les grands foetus et au besoin fait passer un courant de liquide physiologique dans leurs vaisseaux pour en chasser tout le sang. Des thymus, des poumons et d'autres organes des animaux jeunes et adultes peuvent être utilisés mais les précau- tions de l'élimination du sant et d'aseptie sont plus difficiles.
Si l'on utilise des organes de l'adulte qui sont naturellement souillés, comme la muqueuse de la langue, la muqueuse du rumen etc... et qui constituent de bons milieux de culture, il convient de les préparer et de les désinfecter convenablement par des antiseptiques, des substances anti- bactériennes comme des antibiotiques etc... Ces organes peuvent être stockés quelque temps au froid,avant d'être utilisés. Les fragments d'organes, sont
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passés aseptiquement dans un hache-viande qui les réduit en pulpe fine. Cel- le-ci est diluée convenablement, par exemple de moitié, avec un liquide phy- siologique apyrogène et stable, comportantun système-tampon, et de pH con- venable, pH 8,2 par exemple, de sorte que la suspension tissulaire qui est elle-même acide, soit ramenée à un pH situé approximativement vers pH 6,5.
A cette suspension ainsi préparée aseptiquement, on peut ajouter, à dose con- venable, des produits antibactériens, comme ceux appelés antibiotiques, par exemple.
Cette suspension est alors injectée à la vache, animal sensible dans l'exemple choisi. L'implantation de la suspension tissulaire se fait aseptiquement, soit sous la peau que l'on peut au préalable raser et large- ment décoller par insufflation d'air stérile, ou dans la cavité abdominale, par injection intrapéritonéale. Les vaches en bonne santé supportent de tel- les implantations aseptiques de plusieurs litres, sans inconvénients. Il est possible, d'implanter aussi une telle suspension provenant de tissus de l'es- pèce bovine dans un hôte d'espèce sensible, mais différente, le porc par exemple.
L'infection par le virus aphteux se fait quelques jours après l'implantation, par exemple 3 ou4. A ce moment l'embryome spécifique s'est organisé, les cellules altérées sont en voie d'élimination, les autres sont en multiplication, le pH est celui du milieu intérieur de la vache. La dose convenable de virus préalablement titrée est diluée dans une quantité appro- priée de liquide physiologique tamponné et inoculée dans l'embryome même, sous la peau, en des points multiples, ou dans la cavité abdominale. En même temps la vache peut recevoir une inoculation virulente dans la muqueuse de la langue, ce qui est le procédé classique de transmission expérimentale de la fièvre aphteuse. chez cet animal, ou être infectée par une autre voie ou par contage à partir d'un animal déjà atteint de la maladie.
Selon les cas d'inoculation par-un procédé classique, ou la transmission de la maladie par contage naturel peut dispenser de l'inocu- lation dans la masse de l'embryome.
Cette inoculation virulente dans la muqueuse de la langue permet de suivre très facilement l'évolution sur la vache inoculée et de recueillir l'embryome virulent au moment le plus favorable.
Il est possible, en outre, d'exalter la virulence du virus en lui associant ou en lui fournissant, selon l'invention, certaines substan- ces du type des polysaccharides qui font partie du métabolisme normal et que l'on trouve en abondance dans des tissus comme l'épiderme, les muqueuses, les cartilages, les tissus sécréteurs de mucines, etc... : acide hyaluronique et ses esters sulfuriques, tels que ceux nommés, chondroïtine sulfurique, mu- coïtine sulfurique et les corps qui en dérivent. C'est ainsi que des extraits appropriés de ces tissus et tout simplement l'héparine que l'on se procure très facilement,maintenant, et qui est une substance riche en ester sulfuri- que (micoitine sulfurique) exalte notablement, à faible dose, la culture et la virulence.
On peut employer de même des mucines dont le groupe prosthéti- que est aussi l'acide micoitine sulfurique. -Les extraits convenables ou l'hé- parine, ou des mucimes, peuvent être ajoutés simplement au'liquide de dilution du virus lors de l'inoculation, ou être injectés dans l'embryome spécifique avant ou après.
On peut encore associer au virus dans le liquide de dilution, ou injecter dans l'embryome, d'autres substances ou des agents biologiques susceptibles de favoriser soit la culture du virus, soit le développement des substances favorisant ultérieurement les mécanismes et l'immunisation contre l'infection provoquée par ce virus: notamment certains microbes conve- nablement choisis,isolés ou non des tissus des aphtes qui se développent sur la lange des animaux atteints de fièvre aphteuse et pouvant même amener un certain degré de nécrobiose.
La maladie se développe et toute la masse de l'embryome spécifi-
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que sert de inilie , de culture extrêmement favorable au virus aphteux. Cette masse est prélevée aseptiquement au moment convenable, déterminé par l'évolu- tion de la maladie, d'après les aphtes, la courbe thermique et le but à at- teindre, des prélèvements pouvant être faits tardivement alors que la virulen- ce est déjà atténuée par les réactions de défense de l'organisme.
La vache ainsi préparée donne une récolte de matière virulente en général supérieure à la quantité de suspension tissulaire qu'on lui a in- jecté. L'implantation, provoque, en effet, une réaction des tissus de l'ani- mal et une secrétion abondante de sérosité. C'est ainsi que sous la peau l'embryome spécifique détermine un très volumineux oedème, dans la péritoine il provoque la sécrétion de plusieurs litres de liquide d'ascite, etc.. Tout ce matériel est hautement virulent, il convient de le prélever en le souil- lant le moins possible de sang. On peut récolter par exemple, très facilement, en quelques jours, 5 Kgs ou beaucoup plus de matière très virulentes, chez une seule vache, cette matière communiquant la maladie par inoculation à d'au- tres vaches, à la dilution de 10-3,par exemple, ce qui correspond à une quan- tité formidable de virus.
Les tissus virulents que l'on a prélevé sont alors convenablement préparés, aseptiquement. Ils sont vérifiés et fragmentés, les graisses, les tissus fibreux ou sanglants sont rejetés. Les fragments sont pulpés au hache viande, puis broyés aussi complètement que possible c'est-à-dire jusqu'au bro- yage des cellules elles-mêmes, qui les constituent. Pour cette opération. qui se fait à basse température, divers broyeurs-émulsionneurs à grande vitesse, homogénéisateurs peuvent être utilisés, en association ou non avec l'action de la congélation et de la décongélation,qui peut faire éclater les cellules, avec celles des ultrasons ou d'autres actions encore.
Finalement le broyat cellulaire est mélangé aux liquides virulents recueillis chez l'animal en me- me temps que les tissus virulents : liquided'oedème, liquide d'ascite, etc... le tout est sommairement filtré sur une gaze, par exemple, ou légèrement con- trifugé pour éliminer les restes fibreux s'il y en a, on obtient alors le broyat virulent brut, de pH un peut alcalin (pH 8,3 par exemple). Ce broyat est ensuite convenablement traité, selon le but cherché. Il peut être uti- lisé tel ou au contraire servir de matière d'extraction pour des fractions séparées. Toutes les opérations sont effectuées aseptiquement et à basse tem- pérature.
On peut, notamment, extraire la fraction désoxyribonucléo-protéi- que par l'action du chlorure de sodium concentré (la concentration moléculai- re ou deux fois moléculaire, et précipitation par l'eau distillée) et la frac- tion ribonucléoprothéique par acidification. Les nucléoprotéines totales (iesoxy-ribonucléoprotéines et ribonucléoprotéines), associées à d'autres protéines peuvent être précipitées aussi par une solution de chlorure de cé- rium ou de lanthane, stérilisée par filtration et diluée convenablement.
La fraction des globulines (notamment les ) globulines) peut être précipitée paraddition à froid d'alcool éthylique a 50 , jusqu'au titre de 25 . La précipitation de la totalité des protéines peut se faire par un mélange d'alcool à 96 et de dioxane pur par exemple,.à parties égales, dans la proportion de trois parties de ce mélange pour une de broyat brut par exem- ple. La précipitation par l'acétone ou le sulfate d'ammonium ou d'autres corps peut aussi se faire, mais elle est difficilement complète, en outre la dilution et le relargage tendant à provoquer une dissociation nuisible des complexes protéiques.
Naturellement, d'autre procédés d'extraction de diverses frac- tions peuvent être employés. Les diverses fractions peuvent ensuite être con- servées par dessication à basse température (lyophilisation).
Le,broyat brut concentré ou dilué par un liquide physiologique tamponné de pH convenable ou les fractions actives qui ont été extraites peu- vent ensuite être préparées selon le but à atteindre. On peut par exemple, les adsorber sur un corps adsorbant, atténuer leur virulence, puis les lyophi- liser.
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L'adsorption, s'il convient de la faire, selon le but cherché peut.être pratiquée selon la méthode classique, sur gel d'alumine. Mais on peut aussi obtenir une bonne adsorption en mélangeant convenablement le broyat virulent ou les extraits qui en proviennent, avec des préparations composées de gomme arabique ou autres gommes solubles dans l'eau,d'empois d'amidon ou de glycogène, ou autres glucides, le tout amené à un pH con- venable, par exemple légèrement alcalin, par un système tampon de glycocol- le et de soude. Les quantités respectives de ces divers corps peuvent va- rier selon les besoins.
Bien entendu, d'autres préparations adsorbantes peuvent être utilisées, poluvinulpyrrolidone ou autres substances organi- ques ou minérales ou biologiques etc.. ou encore des préparations de gomme arabique avec un système tampon comme il vient d'être dit, auxquels on ajou- te une faible quantité de solution alcoolique de gomme mastic; il se pro- duit un fLoculat très homogène, adsorbant, qui peut être dessèche sous for- me de fragments n'adhérant pas au verre, et-:,qui peuvent se dissoudre rapide- ment dans l'eau. Toutes ces préparations sont nàturellement aseptiques.
Toutefois, dans le broyat burt, il existe, outre les nucléopro- téines virulentes, une quantité importante de protéines et d'autres corps, en association ou non avec le virus. Ces corps ont une grande importance en ce qui concerne le développement des mécanismes de l'immunisation. Cet ensemble, non dissocié, constitue par'lui-même, à l'égard du virus, un com- - plexe adsorbant naturel, dont il peut y avoir intérêt à respecter l'intégri- té.
Un adsorbant donnant d'excellents résultats est constitué par de la salive. S'il s'agit par exemple de traiter des virus de la fièvre aph- teuse en vue de fabriquer un vaccin, on prélève en grande quantité la sali- ve d'animaux atteints ou non de fièvre aphteuse, de vaches par.exemple. On active la secrétion salivaire de ces animaux en leur injectant une faible quantité de pilocarpine. La salive recueillie de façon convenable, est ni nécessaire, clarifiée par décantation, centrifugation ou.filtration.
Cette salive est préservée de l'infection par des micro-organis- mes, par l'adjonction d'une faible dose d'un antibactérien, antibiotiques, sulfamides ou antiseptiques. Les antiseptiques utilisables sont relative- ment nombreux et on peut citer par exemple le tricrésol, les crésols isomè- res, l'acide phénique, le formol, le thymol ou des dérivés d'ammonium qua- ternaires, des dérivés de l'acide p-oxybenzoïque, de l'acide p-chloroben- zoïque, etc... Ces divers antiseptiques peuvent être utilisés seuls ou en association. La salive peut, en outre, être stérilisée par action physique, chauffage approprié, irradiation ultra-violette, associée ou non à l'ac- tion de corps chimiques.
La salive qui constitue un excellent adsorbant est mélangée au produit virulent que celui-ci proviennent, soit des enbriyomes spécifiques, soit de toute autre source de virus, des aphtes par.exemple.La salive n'est pas utilisée elle-même comme source de virus.
L'utilisation de la salive, qu'elle provienne d'un animal sain ou atteint de la fièvre aphteuse, est particulièrement intéressante, car, non seulement elle intervient par sa propriété adsorbante, mais encore elle exerce pendant la dessication ou la lyophilisation, une action de protec- tion des propriétés du virus, notamment des propriétés anti-géniques du virus vaccin ou des fractions extraites à partir de la matière virulente.
La salive peut,.en outre être utilisée comme liquide de dilution du vaccin sec lorsque l'on veut injecter ce,vaccin a un animal. La salive utilisée comme liquide de dilution peut être anti-septisée ou stérilisée par un chauffage approprié.
En outre les préparations adsorbantes peuvent être utilisées seules ou en association avec des.corps dont l'un des plus intéressants est la glycérine qui coopère à la protection des virus vaccins.
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Après lyophilisation, on obtient une matière sèche mais légère- ment onctueuse grâce à la présence de la glycérine.
L'atténuation de la matière virulente, soit non dissociée à l'é- tat de complexe naturel, ou de ses diverses fractions peut être faite selon les méthodes classiques, par l'action de divers antiseptiques à dose, durée, et température convenables, par exemple la formaldéhyde ou par l'action d'a- gents physiques seuls, température, irradiation ultra-violette, etc...
Mais d'autres procédés sont, selon l'invention, encore applicables, c'est ainsi que le dioxane pur, ou les mélanges d'alcool éthylique et de dio- xane pur, dont il a été parlé, peuvent, dans des conditions convenables, at- ténuer suffisamment la virulence, dans des broyats virulents, ou des broyats d'aphtes si l'on s'adresse à cette source classique de virus aphteux tout en .ménageant les propriétés immunisantes. De même, certaines substances chimi- ques qui existent dans les organismes, comme résultat de processus de dégra- dations en zymatiques, sont d'un grand intérêt pour l'atténuation des virus.
C'est ainsi que les polysaccharides qui existent normalement en abondance dans certains tissus,et notamment la peau, et dont il a été parlé plus haut et dont certains activent la virulence et la culture du virus, peuvent libé- rer comme produits de dégradation, sous l'action de certains enzymes, comme des enzymes mucolytiques ou autres ou par autre hydrolyse, des substances qui inactivent ou neutralisent la matière virulente. C'est le cas par exemple, de l'acide d-glycuronique ou de certains de ses dérivés (d-glucurone par exemple) et de la glucosamine ou de ses dérivés: N-acétyl-de-glucosanine ou simplement du chlorhydrate de glucosamine par exemple, corps pratiquement non toxiques dans l'emploi envisagé.
Il suffit donc d'ajouter ces corps, no- tamment le chlorydrate de glucosamine, à la matière virulente, à concentra- tion, durée et température convenables pour l'atténuer ou la neutraliser suf- fisamment. De tels corps comme la glucosamine ou ses dérivés, ou la d-glucu- rone, ou l'acide d-glycuronique, ou autres corps voisins ou qui en dérivent, peuvent être ajoutés de façon convenable aux préparations de matière viru- lente et d'adsorbat, dont il a été parlé, et atténuer suffisamment la viru- lence. Ces corps qui appartiennent au métabolisme de l'organisme peuvent agir aussi de façon analogue sur d'autres sources de matière virulente, par exem- ple les aphtes dont on se sert classiquement comme source de virus aphteux.
Il est à remarquer, d'ailleurs, que les gommes, et notamment la gomme arabi- que, qui sont employées dans ces préparations contiennent divers glucides, notamment des pentoses et un acide uronique, l'acide glycuronique, et peu- vent contribuer, dans certaines conditions, à l'atténuation de la virulence.
De plus, des préparations convenables de ces corps chimiques biologiques qui atténuent ou neutralisent le virus, et des adsorbants, dont il a été par- lé,ou d'autres adsorbants injectables, constituent des préparations-retard, lentement résorbées, et pouvant provoquer des réactions favorables à l'éta- blissement de l'immunité. Enfin la virulence peut être atténuée par les mé- canismes biologiques de défense de l'organisme en cas de prélèvements tar- difs de la masse tissulaire.
L'atténuation de la matière virulente peut être faite non seule- ment en utilisant les corps ou produits déjà cités, mais également en utili- sant un ou plusieurs des corps, tels que du tricrésol ou des crésols isomères ou des dérivés d'ammonium quaternaires, ou des dérivés d'acide p-oxybenzoique ou d'acide p-chlorobenzoïque ou de l'acide phénique, etc... L'action d'un ou de plusieurs antiseptiques peut être combinée à celle d'agents physiques tels qu'un chauffage ménagé, une irradiation ultra-violette etc...
On peut également-employer'pour atténuer la matière virulente, des corps tels que divers acides uroniques l'acide galacturonique ou autre, ou encore l'acide gluconique, ou des corps qui en dérivent.
La matière virulente, non souillée de bactéries d'infection ba- nale, obtenue par kilogramme en quelques jours, préparée, adsorbée ou 'non, atténuée comme il a été dit, peut alors être conservée, soit à l'état liqui-
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de, en solution, soit être desséchée par sublimation sous vide à basse tempé- rature, par lyophilisation. On peut alors la préparer en poudre ou en compri- més et la conserver par exemple en tubes scellés, sous vide ou sous azote.
Enfin, la lyophilisation, c'est-à-dire la sublimation permettant la dessication, est de préférence faite après adjonction de corps protec- teurs, et en particulier des protecteurs déjà cités plus haut, c'est-à-dire la salive en association ou non à d'autres corps tels que des gommes: gomme arabique, etc...
La matière virulente obtenue peut aussi être utilisée après avoir été plus ou moins atténuée, comme masse d'injection à l'animal de façon à pro- duire chez celui-ci, dans le sang et dans d'autres liquides, des substances spécifiques ou anticorps. De tels sérums contenant des anticorps ou antisérum sont destinés à protéger temporairement d'autres animaux contre la maladie provoquerpar le virus.
Bien entendu l'invention n'est pas limitée par les détails de rai- se en oeuvre du procédé, qui ont été décrits en prenant comme exemple parti- culier celui de la fièvre aphteuse. On pourrait les modifier ou ne pas les pren- dre tous sans sortir du cadre de l'invention qui est applicable à la produc- tion massive et au traitement de diverses matières virulentes.
On choisira les tissus à implanter d'après les affinités particu- lières du virus que l'on veut produire et l'on injectera s'il en est besoin, des substances favorisantes, différentes selon les cas, par exemple pour.cer- tains virus diffusibles, la choline, la guanidine, etc...
REVENDICATIONS.
1. - Un procédé de production massive et de traitement de virus pathogènes et des substances qui les accompagnent, caractérisé en ce que le procédé consiste à provoquer chez un animal réceptif, le développement en mas- ses importantes de tissus où le virus que l'on désire produire se multiplie électivement,puis au moment opportun l'infection virulente est transmise à l'animal par inoculation ou contage et la masse de tissus devenue virulente est prélevée après un temps déterminé, cette masse est ensuite traitée se- lon le but cherché.
2. - Un procédé selon 1, caractérisé en ce que les tissus dans lesquels le virus se multiplie d'une façon élective sont prélevés aseptique- ment au foetus ou à l'adulte d'un animal de même espèce ou d'une espèce ré- ceptiveplus ou moins proche de l'animal réceptif sur lequel doit être déve- loppée la masse importante de tissus.
3. - Procédé selon 1, caractérisé en ce que les tissus provenant d'un foetus ou d'un adulte sont fragmentés dilués et additionnés d'antibio- tiques si nécessaire, puis la suspension tissulaire obtenue est implantée chez l'animal réceptif en un endroit approprié de celui-ci, dans le cas de fièvre aphteuse par exemple de l'implantation se fait principalement sous la peau ou dans la cavité péritonéale.
4. - Procédé selon 1, caractérisé en ce que le liquide utilisé pour réaliser la suspension tissulaire destinée à être implantée chez l'ani- mal réceptif, est constitué en tout ou partie par le liquide amniotique baignant les foetus dans l'utérus, ce liquide étant prélevé aseptiquement et utilisé tel -que.,ou après purification, traitement, ou adjonctions conve- nables.
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METHOD FOR MASSIVE PRODUCTION AND TREATMENT OF PATHOGENIC VIRUSES
AND THE SUBSTANCES 'ACCOMPANYING THEM.
The principle of the preparation of specific vaccines against diseases with filterable viruses or ultra virus of man and animals, necessitates the massive production of these viruses. However, these are only cultivated in or in the presence of living cells, so an effort is made to obtain their culture, more or less abundant in various ways: - culture in vivo, that is - that is to say in animals; - culture in vitro, that is to say in artificial or natural culture media, suitably prepared containing living cells which are themselves in culture or in survival and in which the viruses multiply; - culture in ovo, that is to say in embryos of chickens developing in the egg; - or even culture in organs or in large fetuses made to survive by artificial inoculation.
But these methods generally have only a fairly limited and in some cases insufficient yield. The methods of culture in vitro and in ovo, mainly, besides that they can provide viruses accompanied by proteins foreign to the species for which they are intended, and therefore be more or less dangerous, above all have the serious defect of cause variations in the specific properties of viruses, which can render them unusable.
An example of a virus which one seeks to produce in large quantities is, for example, that of foot-and-mouth disease.
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In this particular case, it is generally from the canker sores which appear on the tongue and the mucous membranes of the mouth that the virus which is used in the manufacture of the foot-and-mouth disease vaccine is collected, after grinding, adsorption on alumina and attenuation by formalin at a suitable temperature.
But a cow that is artificially infected and then sacrificed to allow a total harvest of virus, only provides, on average, 40 to 70 g of virus; so that the harvest is slightly more abundant, it is necessary to sacrifice specially selected animals. The cost price of the virus intended for the production of the vaccine is therefore high. In addition, the virus is often obtained in insufficient quantity. In addition, it is a virulent product contaminated with various microbes. It is for these reasons mainly, that one sought to obtain the massive culture of the foot-and-mouth disease virus.
We then turned to other sources from the bovine species: blood, saliva, the secretion of which is stimulated by drugs, various other secretions, in vivo culture of the foot-and-mouth virus associated with another virus ( vaccinia) which gives a pulp of two mixed viruses, etc.
Other in vivo cultures have been practiced in different animal species: porcine, ovine, laboratory rodents, sometimes with special preparation of the animal; concomitant inoculation of a virus of another kind, production of a reactive edema by irritants or an infection, inoculation in the tissues of a transplanted cancer in the guinea pig, in the rabbit lung modified by another infection or by circulatory disturbances caused, or various reactions, etc ... But in all these attempts at culture in vivo, the virus yield is quite low, variable and random; moreover, in species other than the bovine species, the foot-and-mouth disease virus undergoes undesirable changes in the preparation of vaccines for cattle.
Attempts have also been made to obtain the massive production of foot-and-mouth disease virus by in vitro culture, either culture on flaps of the tongue mucosa of adult cattle after disinfection, in a mainly artificial culture medium, or culture on small fragments of fetal cow skin in a natural environment, having the value of a dialysate, cerebrospinal fluid or amniotic fluid of cow.
These two methods make it possible to obtain the culture of the foot-and-mouth disease virus in fairly large quantities; it is feared, however, that the multiplication of the virus outside the organism will damage its properties sooner or later.
It is because of all the drawbacks and all the difficulties mentioned above that the main source of the foot-and-mouth disease virus for the manufacture of the foot-and-mouth disease vaccine in the various countries is essentially represented by the canker sores obtained. following inoculations of foot-and-mouth disease virus into the lingual mucosa of the cow. It is from the main source represented by canker sores and a few other sources that the foot-and-mouth disease vaccine is prepared by adsorption on alumina and attenuation by formalin and heat, or by other antiseptics, or by physical agents. , such as ultraviolet rays, etc ... But this liquid vaccine cannot be dried, or even be stored other than cold, at a few degrees centigrade, without losing its properties.
Since the harvest of canker sores is inevitably limited, the aim is above all to prepare a foot-and-mouth disease vaccine which uses as little virulent material as possible, for example by adding certain substances to the virus, such as protamines or others. But this saving of virulent material does not necessarily solve the general problem of the massive production of viruses.
There is therefore currently no method of producing very large quantities of the foot-and-mouth disease virus, in the susceptible species for which the foot-and-mouth disease vaccine is mainly intended, that is to say the bovine species, such a method of culture. massive in vivo that must naturally keep in the
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aphthous rus all its virulence and specific properties and all the qualities necessary for the production of an effective vaccine and which should even make it possible to prepare a vaccine which can be stored in a dry state. However, what has just been said for the foot-and-mouth disease virus applies to other viruses which are pathogenic for humans and for animals.
The method according to the invention makes it possible to obtain these very, virulent specific viruses in very large quantities, in several kilograms, with the substances which accompany them and also makes it possible to attenuate or eliminate their pathogenic power and then to remove them. prepare in a dry state if necessary.
It is of course understood, moreover, that this method is general and applicable to various viruses of animals and man.
It consists in causing in the receptive animal the development of a large mass of the tissue or the virus which one wants to cultivate multiplies itself electively, then in infecting the animal with this virus, or by inoculation into this elective tissue mass newly formed. or in another region, or by contage, then to remove the virulent mass at the time chosen and to treat it appropriately. Many filterable viruses, in fact, do not multiply abundantly and only retain their characters in the cells of their chosen tissues: epithelial, nervous tissues, etc. They can have a strict electivity for certain tissues and not for d 'other. In addition, certain elective tissues promote more than others the production of substances ensuring the mechanisms of immunization.
The process makes use of precisely this tissue electivity of many viruses, and instead of causing only some indeterminate reaction mass in the receptive animal in an attempt to increase the harvest of the inoculated virus, as various researchers have done, it creates the the very conditions of the specific tissue medium which the virus requires for its abundant multiplication and the preservation of its characters.
In general, the elective tissues of the virus in question are taken aseptically from the fetus or even from an adult of the same species, or occasionally from another more or less similar and itself receptive species. These tissues are suitably fragmented and diluted, then the tissue suspension thus prepared is implanted in the sensitive animal, in an appropriate place under the skin, in the abdominal cavity, pleural cavity, etc. This suspension of specific tissues quickly organizes into a mass of neformation, while eliciting strong reactions from the host.
What we can call a specific embryon is thus formed, consisting only of the normal tissues of choice for the virus: for example epithelial tissues; and among them, those of such and such an organ and not another, when the affinities of the virus to be cultivated are very close. The liquid used to make the tissue suspension intended to be implanted in the receptive animal can consist totally or partially of the amniotic fluid bathing the fetus in the uterus, this liquid being taken aseptically. The amniotic fluid can be used as such, or after suitable preparation, purification or additions.
The use of such a liquid instead of water at a suitable pH increases the mass of material in which the virus proliferates.
The tissue suspension implanted in the animal can be constituted not only by the skin of the fetus, the mucous membranes of the mouth, and in general all the parts already specified, but also for all epithelial organs or not. chosen moment, after a few days, the virus is inoculated into the animal, either electively, or or at the same time in this mass, which can be made enormous, weighing several kilograms in large animals of butcher's shop, like the cow for example. The virus is found directly in its tissue medium of choice, tissue which is itself in full culture, so that the virus multiplies
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very actively keeping, or even increasing its virulence.
In addition, certain chemicals can be added to the virus dilution liquid, so as to enhance its virulence and promote its cultivation and the development of products useful for immunization. It is even possible to add biological agents, such as certain suitably chosen bacteria. These favorable substances or agents can also be added to the implantation tissue suspension. If indicated, the infected animal is placed in an enclosure at a suitable temperature, for example cooled.
This virulent mass' is easily removed after a suitable delay and it represents a harvest of virus which may correspond, for a single animal, to that which would normally give, in their own elective tissues, dozens, or even hundreds. of the same animals. The virulent material thus obtained very easily in a few days, with all its qualities and with all the substances which accompany it and with an abundance never before attained, is then suitably treated so as to be transformed into a vaccine, for example, or into injection mass into the animal to obtain an antiserum.
It can be used as such after proper grinding, or the virus can be extracted by various physicochemical means; finally the virulent mass is adsorbed, if indicated, on suitable substances and then its virulence is attenuated by various physical, chemical or biological agents.
The method according to the invention therefore resides in the mass culture of the viruses, in vivo, on specific embryomas, with preparation and suitable attenuation of the virulent mass, including, if indicated, its drying, by sublimation in vacuum. at low temperature or lyophilization.
However, in some cases mitigation may not be necessary.
With the aim of describing the process according to the invention in more detail, the case of the preparation of the foot-and-mouth disease virus will be taken in the following, but this process is equally applicable, with appropriate variations, to the massive production and preparation of various pathogenic viruses of animals and man.
The essential times are the preparation and implantation of the specific tissue suspension, the inoculation of the virus, the harvest and the preparation of the virulent material.
The tissue suspension consists essentially of epithelial tissues of the same species, taken aseptically from the fetuses of slaughtered cows, for example, in large slaughterhouses. The full uteri, obtained without special precautions, are washed, wiped and then suitably disinfected by brushing with iodine tincture, for example. They are then opened aseptically and the fetus removed. All the skin of the fetuses of suitable size, still hairless, the mucous membranes of the mouth, the tongue are removed. We can add umbilical cords, thymi, testes, and even the lungs if necessary, these organs can be taken from large fetuses, even near term.
All these organs are cut into fragments and these are washed in a suitable physiological liquid so as to free them as much as possible of their blood. Lungs in particular should only be taken after bleeding large fetuses and, if necessary, passing a current of physiological fluid through their vessels to expel all the blood. Thymi, lungs and other organs of young and adult animals can be used, but the precautions of health elimination and aseptic are more difficult.
If we use adult organs which are naturally soiled, such as the mucous membrane of the tongue, the mucous membrane of the rumen, etc. and which constitute good culture media, they should be properly prepared and disinfected. by antiseptics, anti-bacterial substances such as antibiotics, etc. These organs can be stored in the cold for some time, before being used. Organ fragments, are
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passed aseptically in a meat grinder which reduces them to fine pulp. This is suitably diluted, for example by half, with a physiological non-pyrogenic and stable liquid, comprising a buffer system, and of suitable pH, for example pH 8.2, so that the tissue suspension which is itself acidic, or brought to a pH located approximately around pH 6.5.
To this suspension thus prepared aseptically, it is possible to add, in suitable doses, antibacterial products, such as those called antibiotics, for example.
This suspension is then injected into the cow, a sensitive animal in the example chosen. The tissue suspension is implanted aseptically, either under the skin which can be shaved beforehand and widely peeled off by insufflation of sterile air, or into the abdominal cavity, by intraperitoneal injection. Healthy cows tolerate such aseptic implantations of several liters without inconvenience. It is also possible to implant such a suspension originating from tissues of the bovine species in a host of a sensitive but different species, the pig for example.
Infection with foot-and-mouth disease occurs a few days after implantation, for example 3 or 4. At this moment the specific embryoma is organized, the altered cells are in the process of elimination, the others are multiplying, the pH is that of the internal environment of the cow. The proper dose of virus previously titrated is diluted in an appropriate amount of buffered physiological fluid and inoculated into the embryoma itself, under the skin, at multiple points, or into the abdominal cavity. At the same time the cow can receive a virulent inoculation into the mucous membrane of the tongue, which is the classic method of experimental transmission of foot-and-mouth disease. in that animal, or be infected by another route or by contagion from an animal already suffering from the disease.
Depending on the cases of inoculation by a conventional method, or the transmission of the disease by natural contagion may dispense with inoculation into the mass of the embryoma.
This virulent inoculation into the mucous membrane of the tongue makes it possible to very easily follow the development on the inoculated cow and to collect the virulent embryoma at the most favorable time.
It is also possible to enhance the virulence of the virus by associating with it or by supplying it, according to the invention, with certain substances of the type of polysaccharides which are part of the normal metabolism and which are found in abundance in the virus. tissues such as the epidermis, mucous membranes, cartilages, mucin-secreting tissues, etc ...: hyaluronic acid and its sulfuric esters, such as those named, sulfuric chondroitin, sulfuric mu-coitin and the bodies which derive from it. It is thus that appropriate extracts from these tissues and quite simply heparin, which is now very easily obtained, and which is a substance rich in sulfuric ester (sulfuric micoitine), notably exalts, in low doses, culture and virulence.
Similarly, mucins, the prosthetic group of which is also micoitine sulfuric acid, can be employed. The suitable extracts or heparin, or mucims, can be added simply to the virus dilution liquid upon inoculation, or be injected into the specific embryoma before or after.
It is also possible to combine with the virus in the dilution liquid, or inject into the embryoma, other substances or biological agents capable of promoting either the culture of the virus or the development of substances subsequently promoting the mechanisms and immunization against. infection caused by this virus: in particular certain suitably chosen microbes, whether or not isolated from the tissues of canker sores which develop on the swaddle of animals suffering from foot-and-mouth disease and which may even cause a certain degree of necrobiosis.
The disease develops and the entire mass of the specific embryoma
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that serves as an inilie, an extremely favorable culture for the foot-and-mouth virus. This mass is taken aseptically at the appropriate time, determined by the progress of the disease, according to the canker sores, the thermal curve and the goal to be reached, samples can be taken late when the virulence is already attenuated by the body's defense reactions.
The cow thus prepared gives a harvest of virulent material in general greater than the quantity of tissue suspension injected into it. Implantation causes, in fact, a reaction in the tissues of the animal and an abundant secretion of serum. This is how under the skin the specific embryoma determines a very large edema, in the peritoneum it causes the secretion of several liters of ascitic fluid, etc. All this material is highly virulent, it should be taken in soiling him with as little blood as possible. For example, we can harvest very easily, in a few days, 5 kg or much more of very virulent material, in a single cow, this material communicating the disease by inoculation to other cows, at the dilution of 10-3 , for example, which corresponds to a formidable amount of virus.
The virulent tissues which have been removed are then suitably prepared aseptically. They are checked and fragmented, fat, fibrous or bloody tissue is rejected. The fragments are pulped with a meat grinder, then crushed as completely as possible, that is to say until the cells themselves, which constitute them, are crushed. For this operation. which is done at low temperature, various high speed grinder-emulsifiers, homogenizers can be used, in combination or not with the action of freezing and thawing, which can burst cells, with those of ultrasound or of other actions still.
Finally, the cell homogenate is mixed with the virulent liquids collected from the animal at the same time as the virulent tissues: edema liquid, ascitic liquid, etc ... the whole is briefly filtered on a gauze, for example, or lightly conrifuged to remove the fibrous residues if there are any, the raw virulent ground material is then obtained, of slightly alkaline pH (pH 8.3 for example). This ground material is then suitably treated, depending on the desired goal. It can be used as such or, conversely, as an extractant for separate fractions. All operations are carried out aseptically and at low temperature.
It is possible, in particular, to extract the deoxyribonucleoprotein fraction by the action of concentrated sodium chloride (the molecular or twice molecular concentration, and precipitation with distilled water) and the ribonucleoprosthetic fraction by acidification. The total nucleoproteins (oxy-ribonucleoproteins and ribonucleoproteins), associated with other proteins can also be precipitated by a solution of cerium or lanthanum chloride, sterilized by filtration and diluted appropriately.
The fraction of globulins (in particular the) globulins) can be precipitated by cold addition of ethyl alcohol to 50, up to the titer of 25. The precipitation of all of the proteins can be effected by a mixture of 96 alcohol and pure dioxane, for example, in equal parts, in the proportion of three parts of this mixture to one of crude ground material, for example. Precipitation by acetone or ammonium sulphate or other substances can also take place, but it is hardly complete, moreover the dilution and the release tending to cause a detrimental dissociation of the protein complexes.
Of course, other methods of extracting various fractions can be employed. The various fractions can then be preserved by desiccating at low temperature (lyophilization).
The crude ground material concentrated or diluted with a buffered physiological liquid of suitable pH or the active fractions which have been extracted can then be prepared according to the purpose to be achieved. It is possible, for example, to adsorb them onto an adsorbent body, to attenuate their virulence, then to lyophilize them.
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The adsorption, if it should be done, depending on the desired goal can be performed according to the conventional method, on alumina gel. But one can also obtain a good adsorption by suitably mixing the virulent ground material or the extracts which come from it, with preparations composed of gum arabic or other gums soluble in water, starch or glycogen starch, or other carbohydrates. , the whole brought to a suitable pH, for example slightly alkaline, by a buffer system of glycocol- and sodium hydroxide. The respective amounts of these various substances may vary as required.
Of course, other adsorbent preparations can be used, poluvinulpyrrolidone or other organic or inorganic or biological substances, etc., or even gum arabic preparations with a buffer system as has just been said, to which we add a small amount of alcoholic gum mastic solution; a very homogeneous, adsorbent flocculate is produced which can be dried out in the form of fragments which do not adhere to the glass, and which can dissolve rapidly in water. All of these preparations are naturally aseptic.
However, in the burt ground product, besides the virulent nucleoproteins, there is a significant amount of proteins and other bodies, whether or not in association with the virus. These bodies are of great importance in the development of the mechanisms of immunization. This whole, which is not dissociated, constitutes in itself, with regard to the virus, a natural adsorbent complex, the integrity of which may be advantageous.
An adsorbent giving excellent results is saliva. If, for example, it is a question of treating foot-and-mouth disease viruses with a view to producing a vaccine, the saliva of animals with or without foot-and-mouth disease, for example cows, is taken in large quantities. The salivary secretion of these animals is activated by injecting them with a small amount of pilocarpine. Saliva collected in a suitable manner is neither necessary, clarified by decantation, centrifugation or filtration.
This saliva is preserved from infection by microorganisms, by the addition of a low dose of an antibacterial, antibiotics, sulfonamides or antiseptics. The antiseptics which can be used are relatively numerous and mention may be made, for example, of tricresol, isomeric cresols, carbolic acid, formalin, thymol or quaternary ammonium derivatives, derivatives of p acid. -oxybenzoic acid, p-chlorobenzoic acid, etc. These various antiseptics can be used alone or in combination. Saliva can, moreover, be sterilized by physical action, appropriate heating, ultraviolet irradiation, whether or not associated with the action of chemical bodies.
The saliva, which constitutes an excellent adsorbent, is mixed with the virulent product, whether the latter comes either from specific enbriyomas or from any other source of virus, such as canker sores. The saliva is not itself used as a source of virus.
The use of saliva, whether it comes from a healthy animal or one suffering from foot-and-mouth disease, is particularly advantageous because, not only does it intervene through its adsorbent property, but also it exerts during desiccation or lyophilization, a protective action of the properties of the virus, in particular the anti-gene properties of the vaccine virus or of the fractions extracted from the virulent material.
Saliva can furthermore be used as a liquid for diluting the dry vaccine when it is desired to inject this vaccine into an animal. Saliva used as a dilution liquid can be anti-sepsis or sterilized by suitable heating.
In addition, the adsorbent preparations can be used alone or in combination with des.corps, one of the most interesting of which is glycerin, which cooperates in the protection of vaccine viruses.
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After lyophilization, a dry but slightly creamy material is obtained owing to the presence of glycerin.
The attenuation of the virulent material, either undissociated in the state of a natural complex, or of its various fractions can be made according to conventional methods, by the action of various antiseptics at suitable dose, duration and temperature, for example formaldehyde or by the action of physical agents alone, temperature, ultraviolet irradiation, etc ...
But other processes are, according to the invention, still applicable, it is thus that the pure dioxane, or the mixtures of ethyl alcohol and of pure dio-xane, of which it has been spoken, can, under suitable conditions , sufficiently attenuate the virulence, in virulent ground, or ground of canker sores if one addresses this classical source of foot-and-mouth disease virus while at the same time controlling the immunizing properties. Likewise, certain chemicals which exist in organisms, as a result of processes of zymatic degradation, are of great interest for the attenuation of viruses.
It is thus that the polysaccharides which normally exist in abundance in certain tissues, and in particular the skin, and of which it was mentioned above and of which some activate the virulence and the culture of the virus, can release as degradation products, under the action of certain enzymes, such as mucolytic or other enzymes or by other hydrolysis, substances which inactivate or neutralize the virulent material. This is the case, for example, with d-glycuronic acid or some of its derivatives (d-glucurone for example) and glucosamine or its derivatives: N-acetyl-de-glucosanine or simply glucosamine hydrochloride for example, bodies practically non-toxic in the intended use.
It is therefore sufficient to add these substances, in particular the glucosamine hydrochloride, to the virulent material, at a suitable concentration, duration and temperature to attenuate or neutralize it sufficiently. Such substances, such as glucosamine or its derivatives, or d-glucurone, or d-glycuronic acid, or other bodies related or derived therefrom, may suitably be added to preparations of virulent material and of. 'adsorbate, which has been mentioned, and sufficiently attenuate the virulence. These bodies which belong to the metabolism of the organism can also act in a similar way on other sources of virulent material, for example the canker sores which are conventionally used as a source of foot-and-mouth virus.
It should be noted, moreover, that the gums, and in particular gum arabic, which are used in these preparations contain various carbohydrates, in particular pentoses and a uronic acid, glycuronic acid, and can contribute, under certain conditions, to attenuation of virulence.
In addition, suitable preparations of these biological chemicals which attenuate or neutralize the virus, and adsorbents, of which it has been referred, or other injectable adsorbents, are depot preparations which are slowly absorbed and which can cause damage. reactions favorable to the establishment of immunity. Finally, virulence can be attenuated by the organism's biological defense mechanisms in the event of late sampling of the tissue mass.
The attenuation of the virulent material can be done not only by using the substances or products already mentioned, but also by using one or more of the substances, such as tricresol or isomeric cresols or quaternary ammonium derivatives. , or derivatives of p-oxybenzoic acid or p-chlorobenzoic acid or carbolic acid, etc. The action of one or more antiseptics can be combined with that of physical agents such as careful heating, ultraviolet irradiation etc ...
It is also possible to use, to attenuate the virulent material, bodies such as various uronic acids, galacturonic acid or the like, or else gluconic acid, or bodies derived therefrom.
The virulent material, not soiled with bacteria of basal infection, obtained per kilogram in a few days, prepared, adsorbed or not, attenuated as has been said, can then be preserved, either in the liquid state.
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in solution or to be dried by sublimation under vacuum at low temperature, by lyophilization. It can then be prepared in powder or tablets and stored, for example, in sealed tubes, under vacuum or under nitrogen.
Finally, lyophilization, that is to say the sublimation allowing desiccation, is preferably carried out after the addition of protective bodies, and in particular of the protectors already mentioned above, that is to say the saliva in. association or not with other bodies such as gums: arabic gum, etc ...
The virulent material obtained can also be used after having been more or less attenuated, as a mass for injection into the animal so as to produce in the latter, in the blood and in other liquids, specific substances or antibody. Such sera containing antibodies or antiserum are intended to temporarily protect other animals against disease caused by the virus.
Of course, the invention is not limited by the details of the reason for carrying out the process, which have been described, taking as a particular example that of foot-and-mouth disease. All of them could be modified or not taken without departing from the scope of the invention which is applicable to the mass production and processing of various virulent materials.
We will choose the tissues to be implanted according to the particular affinities of the virus we want to produce and we will inject, if necessary, favoring substances, different depending on the case, for example for some. diffusible viruses, choline, guanidine, etc ...
CLAIMS.
1. - A process for the massive production and treatment of pathogenic viruses and the substances which accompany them, characterized in that the process consists in causing in a receptive animal, the development in large masses of tissues where the virus that the one wishes to produce multiplies electively, then at the opportune moment the virulent infection is transmitted to the animal by inoculation or contagion and the mass of tissues which have become virulent is removed after a determined time, this mass is then treated according to the desired goal .
2. - A method according to 1, characterized in that the tissues in which the virus multiplies in an elective manner are removed aseptically from the fetus or from the adult of an animal of the same species or of a re species. - ceptive more or less close to the receptive animal on which the large mass of tissues must be developed.
3. - Method according to 1, characterized in that the tissues from a fetus or an adult are fragmented, diluted and added with antibiotics if necessary, then the tissue suspension obtained is implanted in the receptive animal in a Appropriate place of it, in the case of foot-and-mouth disease for example the implantation is done mainly under the skin or in the peritoneal cavity.
4. - Method according to 1, characterized in that the liquid used to make the tissue suspension intended to be implanted in the receptive animal, consists entirely or part of the amniotic fluid bathing the fetuses in the uterus, this liquid being withdrawn aseptically and used as is, or after suitable purification, treatment, or additions.
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