BE1030911B1 - Composition de dégradation des biofilms - Google Patents

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Abstract

Composition de dégradation de biofilm comprenant une DNAse, utilisations de celles-ci et procédé de dégradation des biofilms comprenant l'application de cette composition.

Description

COMPOSITION DE DÉGRADATION DES BIOFILMS
Domaine technique
La présente invention se rapporte à une composition de dégradation des biofilms comprenant une DNAse spécifique.
L'art antérieur
Dans de nombreux domaines d'activités comme les secteurs agroalimentaires, les collectivités, les secteurs médicaux et vétérinaires, les industries cosmétiques, le secteur pharma, «life science» ou de la biotechnologie, des contaminations problématiques dues à la présence de microorganismes sont observées très fréquemment.
Ces biofilms peuvent être traités de différentes manières, mais il reste difficile de s'assurer que le traitement qui va être appliqué sera efficace. En particulier, des molécules biocides ou antibiotiques, qui sont connues pour détruire des bactéries sous forme planctonique, sont bien souvent inefficaces contre ces mêmes bactéries sous forme de biofilm.
En outre, en pratique, et contrairement au laboratoire, la composition d'un biofilm contaminant une surface est très généralement inconnue.
Finalement, les applications dons le domaine de l'agroalimentaire ou médical, voire pour une production GMP (Good
Manufacturing Practice) imposent des contraintes quant aux composés qui peuvent être utilisés, ce qui complique le traitement des biofilms. A titre d'exemple, les tuyauteries sont difficiles à désinfecter du fait d'un accès moindre. De même les instruments médicaux, tels les endoscopes, sont difficiles à désinfecter, du fait (i) de leur surface, qui présente de nombreuses irrégularités, et (ii) de l'impossibilité d'y appliquer de nombreux traitement usuels physiques ou chimiques, tels que des traitements thermiques, des produits qui les endommageraient ou seraient incompatibles avec l'usage ultérieur chez un patient.
Différents types d'enzymes ont été testées et utilisées avec succès pour la dégradation des biofilms. Cependant, certains biofilms ne sont pas déstructurés convenablement avec une seule activité enzymatique, alors que des mélanges d'enzymes, en particulier lorsqu'il y a des protéases, ne permettent pas nécessairement des compositions liquides qui soient stables au cours du temps. En outre, comme ce sera décrit ci-dessous, pour un biofilm de composition donnée, les inventeurs ont noté que les compositions enzymatiques actuelles présentaient trop souvent des variations importantes en termes d'efficacité, ce qui complique le travail pour arriver à une formulation optimale.
La demande de brevet WO2022079318 décrit l'utilisation d'une nucléase particulière (Denarase), avec une efficacité accrue.
Le brevet US10954497 décrit une catégorie de DNAses HNH ayant un motif GYS et leur efficacité lorsqu'elles sont formulées pour la destruction de biofilms.
Bref résumé de l'invention
La présente invention porte sur une composition liquide pour la prévention ou l'élimination d'un biofilm, comprenant un ou plusieurs agent{(s) tensioactif(s), un ou plusieurs agent(s) séquestrant(s) et une phosphodiestérase ayant une activité désoxyriponucléase (DNAse), ladite DNAse étant une ou plusieurs DNAse(s) de type HNH et/ou possédant au moins 95% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO :13 (ou SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO :18).
La présente invention porte en outre sur l'utilisation de cette composition pour l'élimination d'un biofilm comprenant une bactérie lactique choisie parmi Lacobacillus sp, Pediococcus sp, Lactococcus sp.
Streptococcus sp, Teragenococcus sp, Leuconostoc sp, Oenococcus sp,
Bifidobacterium sp, et/ou Listeria monocytogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, et/ou Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Escherichia col, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Staphylococcus epidermidis ou Clostridium sp.
La présente invention porte aussi sur cette composition liquide (pour un usage pharmaceutique) pour l'élimination d'un biofilm présent sur un tissus d'un patient, ledit tissus étant de préférence la cavité buccale, une muqueuse, une plaie ou en contact avec un implant.
La présente invention porte aussi sur un procédé pour l'élimination d'un biofilm sur une surface comprenant l'application sur ladite surface de cette composition liquide.
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
Les inventeurs ont cherché à améliorer les compositions contre les biofilms, en particulier pour obtenir des compositions dont le spectre d'activité est suffisamment large et constant, et qui assure une réduction considérable du nombre de microorganismes protégés par le biofilm.
Pour ce faire, les inventeurs ont identifié une DNAse qui est particulièrement efficace contre certains types de biofilms.
En outre, selon les biofilms, cette DNAse est très efficace, soit seule, soit en synergie avec d'autres activités enzymatiques.
De plus, les inventeurs ont réussi à formuler cette DNAse de manière à ce qu'elle conserve son activité, y compris au cours du temps (même en présence d'une protéase dans la composition ou d'agents séquestrants), ce qui permet tout d'abord une logistique commerciale raisonnable entre le temps où la composition liquide (aqueuse) est formulée et le moment où elle sera utilisée.
La composition selon l'invention est de préférence utilisée sur des surfaces. Dans le contexte de la présente invention, la terminologie « surface » est de préférence entendue au sens large, donc y compris la surface interne d'une tuyauterie, ou encore des surfaces de dispositifs médicaux réutilisables en particulier des endoscopes et des instruments chirurgicaux.
En effet, les inventeurs ont testé l'effet de cette DNAse seule, par rapport à d'autres nucléases connues pour leur activité remarquable, telle que la Denarase (comme dans WO2022079318), et l'effet de cette
DNASse en synergie avec d'autres enzymes, soit dans un mélange, soit en application séquentielle, et ont remarqué une efficacité accrue ou plus constante, selon le type de biofilm à traiter. En effet, à leur surprise, les inventeurs ont comparé, dans des conditions de laboratoires bien contrôlées, l'effet sur des biofilms des compositions (protéase+ amylase+ ipase+ détergent+ séquestrant doux) sans cette DNAse et des mêmes compositions avec la DNAse de l'invention et, dans le cas des composition sans cette DNAse, ils ont parfois noté des bons résultats et parfois des résultats médiocres, alors que les compositions enrichies avec la DNAse de la présente invention ont toujours montré des très bons résultats. Ainsi, il a fallu de nombreux tests, et répétés de nombreuses fois, pour identifier clairement l'effet de la DNAse de la présente invention, et les résultats montrés ci-dessous sont parmi les plus spectaculaires.
Listage des séquences
Les séquences | à 11, ainsi que de 14 à 18 reprennent des
DNAses selon l'invention. Il s'agit de DNAses du type HNH. 5 La séquence 12 est la séquence consensus dans sa compréhension la plus large.
La séquence 13 est une séquence consensus incorporant des acides aminés préférés à des positions clés, surtout dans la partie centrale de l'enzyme.
Au niveau des séquences 12 et 13, les acides aminés pouvant faire l'objet de variation sont mentionnés sous la lettre « X » et leur structure est reprise ci-dessous. Certaines positions sont préférentiellement occupées par des acides aminés précis, ce qui est également listé ci- dessous :
SEQ ID NO :12
XPXXXPSKXXXQXOLXXLXVXXEXXMXGYSRXXFPHWXXQGXGCXTRQOXVLXRDADXXSG
XCPXTXGXWYSYXDGXXXXXPSXXDXDHXVPLAEAWRSGASSWXTXXRXXFANDLXGXQL
TAVXASXNRXKGDODPSTWXPXRXXAXCXYXKXWXXTKXXXXLXLOSXEKXXLXXMLXXC
XY
SEQ ID NO:13
LPPGTPSKSXAQSOLNALXVXXEXSMTGYSRXXFPHWSSQOGGGCDTROVVLKRDADXXSG
XCPVTSGKWYSYFDGXXFTNPSDLDIDHIVPLAEAWRSGASSWTTSKRXXFANDLNGPQL
TAVXASXNRXKGDODPSTWQPPRAAARCAYSKWWISTKYKWGLSLQSXEKXXLXXMLXXC
AY
1:L, F, LT, P ; de préférence L ou |, de préférence L ; 3: P, S; de préférence P ; 4: G, E, V, de préférence G, V, de préférence, G ; 5:T, |; de préférence T; 9 S, A, de préférence S; 10. (séquences 12 et 13). A, E, Q, T, de préférence E, Q; 11. A, S; de préférence A; 13. S, T; de préférence S; 16. N, D; de préférence N; 17 A, S, G; de préférence A, S; 19 (séquences 12 et 13). T, A; de préférence T;
21 (séquences 12 et 13). K, Q; de préférence K; 22 (séquences 12 et 13). A, P, T, S; de préférence P ou S$; 24 (séquences 12 et 13). D, S, G; de préférence D ; 25. P, T, A, S; de préférence P, S ;
27.T,S; de préférence T ; 32. (séquences 12 et 13). D, N; 33. (séquences 12 et 13). L, H, K; 38. N, S, LT; 39. 5, G, de préférence S ;
42.S,G,N; 45. D, N; 49. |, L, V, M; 52.Q,K: 57 (séquences 12 et 13), Y, S: de préférence Y:
58 (séquences 12 et 13). Y, F, de préférence Y au moins un résidu Y aux positions 57/58, de préférence les positions 57 et 58 sont occupées par 2 résidus Y ;
59.5, T; de préférence S ; 61 (séquences 12 et 13). N, A, T, S, D; de préférence A;
64.V,T; de préférence V;
66.5, T; de préférence S; 68. R, K, S; de préférence R, K; 73. F, Y; 76 (séquences 12 et 13). |, V; 77 (séquences 12 et 13). VL, T, K; 78. V, F; 79.7, Y; 80. S, D, N; de préférence S ; 83. E, D, N; de préférence E, D; 84.1,L; 86. |, V; de préférence 89. |, V; de préférence |; au moins 1 | aux positions 86/89 ; 104. S, T; de préférence T; 106. E, S, Q, A, T; 107. K, Q; de préférence K ; 109. (séquences 12 et 13). E, K, Q, R; de préférence Q ou R, de préférence R 110. (séquences 12 et 13). E, S, A, N, D; de préférence N ou D, de préférence N 116.N,T, G, S; de préférence N, S ; 118. P, S, de préférence P; 124 (séquences 12 et 13). 5, T; 127 (séquences 12 et 13). T, S, V; de préférence S, V ; 130 (séquences 12 et 13). S, A; de préférence S; 140. Q, K de préférence GQ;
142. P, T; de préférence P; 144. A, V, S, Y; 145. A, G, S; de préférence G:; 147. R, H, K, A; de préférence R; 149. G, A; 151.S, A; de préférence A; 153. W, M; de préférence W; 155. |, V. de préférence |; 156. N, S; de préférence N; 159.H, Y, S; de préférence Y, H ; 160. R, V, K; de préférence R, K, de préférence R ; 161. W, Y; de préférence W; 162. D, G, N, de préférence G, D; 164. S, H, N; 168 (séquences 12 et 13). S, A; de préférence S; 171(séquences 12 et 13). 5, T, N; de préférence S; 172 (séquences 12 et 13). S, A, G, de préférence S, A; 174 (séquences 12 et 13). Q, E: de préférence Q: 175 (séquences 12 et 13). T, S, G; 178 (séquences 12 et 13). N, D; de préférence N; 179 (séquences 12 et 13). T, G, S; de préférence T, S, de préférence T; 181. S, A.
Ainsi, un premier objet de la présente invention porte sur une composition liquide pour la prévention ou l'élimination d'un biofilm, comprenant un ou plusieurs agent(s) tensioactif(s), un ou plusieurs agents séquestrants et une phosphodiestérase ayant une activité désoxyribonucléase (DNAse), ladite DNAse étant une ou plusieurs DNAse(s) de type HNH (ayant un motif
GYS) et/ou possédant au moins 95% d'identité avec l'une des séquences 1013, voire avec les DNAses des séquences 1 à 18.
De préférence ladite composition liquide comprend au moins 7% en poids d'eau, de préférence au moins 10% d'eau, ou encore au moins 20% d'eau. De préférence, dans cette composition, la [ou les) DNAse(s) possede(nt) au moins 95% d'identité avec l'une des séquences ] à 13, voire avec les DNAses des séquences 1 à 18.
Dans le contexte de la présente invention, l'identité se mesure de préférence par un alignement d'une séquence à tester avec une des séquences 1 à 13 (ou 1 à18) sur toute leur longueur (182 acides aminés).
Les paramètres par défaut de BLASTp sont avantageusement utilisés, tels qu'une matrice de type Blosumé2, un «mot » de taille 6, une pénalité de «gap» de 11 et une pénalité d'extension du «gap» de 1. Ainsi le pourcentage d'identité se calcule sans ambiguïté. Avantageusement, dans le calcul ci-dessus, un « gap » sera comptabilisé comme une seule différence, quelle que soit sa longueur.
De même, lorsqu'une DNAse est à comparer avec les séquences 12 et 13, un alignement global est réalisé comme décrit ci-dessus, et un acide aminé de la séquence à comparer qui serait identique aux variants des séquences 12 ou 13 listés aux différentes positions marquées du symbole «X» est comptabilisé comme identique. Par exemple une séquence à comparer serait alignée avec la séquence 12 ou 13. Si l'acide aminé de cette séquence à comparer à la position correspondant à la position 10 de la séquence 12 ou 13 est une alanine, celui-ci sera considéré comme identique.
Une séquence qui aurait une activité enzymatique équivalente, mais qui serait plus longue (ex. ajout de séquences pour la purification ou de séquences pour l'augmentation de la stabilité, voire même de séquence signal), ou plus courte, est également couverte par la présente invention, pour autant que l'enzyme en question reprenne au moins 95% d'une des séquences 1 à 13 (ou 1 à 18).
Alternativement, l'identité peut se déduire après un alignement global comme ci-dessus et en appliquant une tolérance de moins de 10, moins de 9, moins de 8, moins de 7, moins de 6, moins de 5, moins de 4, moins de 3 variations ou « gaps » entre une séquence cible et l'une quelconque des séquences 1 à 13 (ou 1 à 18).
Enzymes additionnels
Avantageusement, la composition comprend en outre une ou plusieurs activité(s) enzymatiques choisies parmi une (ou plusieurs) protéase, une laccase, une amylase, une lipase, une cellulase, une mannanase, une activité B-1,6-N-acetylhexosaminidase (Dispersine B} et un mélange de celles-ci, de préférence une protéase (voire plusieurs protéases} et/ou B- 1,6-N-acetylhexosaminidase (Dispersine B}, de préférence une protéase (voire plusieurs protéases) et/ou une B-1,6-N-acetylhexosaminidase (Dispersine B) et une autre enzyme, ou plusieurs autres enzymes, choisie (s) parmi une laccase, une amylase, une lipase, une cellulase et une mannanase.
Par exemple, une composition préférée comprend la DNAse décrite ci- dessus et une (ou plusieurs) protéases, une (ou plusieurs) amylase et une (ou plusieurs) cellulase.
Une composition préférée peut également comprendre la DNAse décrite ci-dessus et une autre nucléase, ainsi que, avantageusement, une protéase (voire une cellulase et/ou une amylase et/ou une seconde protéase).
Une ou plusieurs enzymes catalysant des réactions d'oxydo-réduction peuvent avantageusement être ajoutées.
En effet, même si l'addition de plusieurs activités enzymatiques présente des difficultés, en particulier au niveau de la stabilité, par exemple du fait des agents séquestrants (voir ci-dessous) ou de l'activité endogène de la protéase, les inventeurs ont remarqué qu'une présence de plusieurs activités enzymatiques différentes offrait un plus large spectre d'activité, ce qui est avantageux puisque, en général, la composition des biofilms à traiter est inconnue, voire les biofilms à traiter comprennent plusieurs éléments structurels différents : l'effet, déjà remarquable, de la DNAse de l'invention est encore renforcé par les activités enzymatiques additionnelles.
Autres composants
Le ou les agents tensioactifs ne sont pas particulièrement limités. Des agents tensioactifs, anioniques, neutres et/ou zwiterioniques peuvent être présents. Les inventeurs ont remarqué que des agents tensioactifs de type alkyl-polyglucoside fonctionnent bien, tout comme des tensioactifs zwitterionigues de type aminoxyde d'alkyle (ex. à 12 et/ou 14 et/ou 16 et/ou 18 carbones).
Lorsque la composition doit être appliquée à des surfaces verticales, par exemple un siphon, un tensioactif moussant est avantageusement incorporé. En outre, un agent renforçant le caractère moussant, tels que des dérivés de bétaine, et/ou des surfactants zwitterioniques ayant une amine quaternaire sont avantageusement ajoutés.
Typiquement ces agents tensioactifs sont présents en une teneur (finale) d'au moins 1%, en poids :volume. Avantageusement, leur teneur n'excède pas 15% (en poids:volume; somme des poids des tensioactifs : volume).
De préférence, dans la composition selon l'invention, le ou les agent(s) séquestrants est (sont) choisis dans le groupe constitué du citrate, de la carboxyméthylinuline, d'un phosphate, d'un phosphonate, et des dérives d'acides aminés (Glutomate et diacétate tétrasodique, GLDA ; le diacétate de méthylglycine trisodique, MGDA), l'iminodisuccinate de sodium ; IDS, du gluconate (ex. gluconate de sodium) et des mélanges de ceux-ci. De préférence le ou les agent(s) séquestrants est (sont) choisis dans le groupe constitué du citrate, de la carboxyméthylinuline, d'un phosphate, d'un phosphonate, du gluconate et des mélanges de ceux-
ci. II s'agit, de préférence, de séquestrants doux. Les inventeurs ont remarqué que ces séquestrants là n'interfèrent pas avec l'activité de la
DNAse de l'invention, ni avec celle des autres enzymes listés ci-dessus (lorsqu'ils sont présents).
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend en outre du glycérol et/ou du monopropylène glycol. Les inventeurs ont remarqué que ce type de molécules augmentait la stabilité de Ia composition selon l'invention. Une teneur avantageuse est d'environ 5 à 30% en poids du glycérol et/ou du monopropylène glycol:volume de la solution, de préférence 7 à 15% [poids :volume], tel que de 8 à 12 % (poids:volume), soit environ 10%+0,5% (poids de glycérol et/ou du monopropylène glycol:volume). Du sorbitol peut également être incorporé dans le même but. Cependant, lorsque la composition est destinée à une administration à un patient (implant, muqueuses des systèmes digestifs ou respiratoires), celle-ci, avantageusement, ne comprend pas de glycérol ni de monopropylène glycol, ou en tout cas moins de 5%, voire moins de 1%, ou encore moins de 0,1% (poids du glycérol et/ou du monopropylène glycol : volume de la composition).
Réciproquement, ou en complément, la composition liquide selon l'invention comprend (outre le glycérol et/ou le monopropylène glycol) avantageusement de l'eau, par exemple au moins 5% en poids, de préférence au moins 10% en poids.
En outre, avantageusement, la composition liquide selon l'invention est présente selon une formulation concentrée, qui est diluée (ex. 10 fois, 100 fois, ou plus) dans de l'eau juste avant usage.
Certaines compositions sont toutefois avantageusement directement formulées «prêtes à l'emploi»: par exemple les compositions comprenant des agents tensioactifs moussants (ex. comme décrit ci- dessus pour le traitement des siphons) ; une description plus détaillée de ceci sera fournie ci-dessous, Parmi les tensioactifs moussants, l'on retrouve ceux qui ont une valeur « HLB » (Hydrophilic-ipophilc-Balance} comprise entre 3 et 8. Alternativement, plusieurs surfactants anioniques ou zwitterionigues peuvent être utilisés, de préférence en synergie avec un dérivé de bétaine, tel que le 1-propanaminium, 3-amino-N- (carboxymethyl)-N,N-dimethyl-, N-acyle (lacyle étant une chaine hydrocarbonnée à nombre pair de carbones, par exemple 18),
De même, avantageusement, la composition selon l'invention comprend en outre un agent conservateur, de préférence un isothiazolinone tel que la Benzisothiazolinone, ou le (2-)phénoxyéthanol. Réciproquement, les compositions destinées à être administrées à un patient (implant, muqueuses des systèmes digestifs ou respiratoires) ne comprennent avantageusement pas d'agent conservateur.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend au moins 40% (en volume :volume) en eau. Il s'agit d'une composition qui ne doit pas trop être diluée avant l'emploi. Par contre, une teneur trop élevée en eau risque de nuire à la stabilité de la composition au cours du temps.
Un autre aspect connexe de la présente invention porte sur une composition (avec au moins une DNAse de type HNH et/ou ayant au moins 95% d'identité sur toute la séquence avec une quelconque des
Séquences 1 à 13, ou 1 à 18) « prête à l'emploi», comprenant au moins 90%, voire même au moins 95% d'eau (poids de l'eau :poids de lo composition) et de 1 à 10 % (par exemple de 2 à 5%) des autres composants (somme des poids des composants autres que l'eau: poids total de la composition) : Ia DNA selon l'invention, les éventuelles autres enzymes (de préférence une ou plusieurs protéase; amylase, éventuellement une lipase, voire même les autres enzymes décrites ci- dessus), un agent séquestrant et un ou plusieurs tensioactifs, voire un ou plusieurs composé de charge (carrier) si présent.
De préférence une telle composition « prête à l'emploi comprend » un tensioactif moussant et/ou un dérivé de bétaine tel que décrit ci-dessus.
Un autre aspect connexe de la présente invention porte sur l'utilisation de
Ia composition selon l'invention (avec au moins une DNAse de type HNH et/ou ayant au moins 95% d'identité sur toute la séquence avec une quelconque des Séquences 1 à 13, ou 1 à 18) pour l'élimination d'un biofilm comprenant une bactérie lactique choisie parmi Lacobacillus sp,
Pediococcus sp, Lactococcus sp. Streptococcus sp, Teragenococeus sp,
Leuconostoc sp, Oenococcus sp, Bifidobacterium sp, et/ou
Listeria sp (ou L. monocytogenes), Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus sp. (B. cereus, B. subtilis) et/ou Pseudomonas sp. (ex. Pseudomonas fluorescens ou Pseudomonas aeruginosa), Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundi,
Staphylococcus epidermidis, Clostridium sp.
En effet, dans le cas des biofilms comprenant les microorganismes listés ci- dessus, les inventeurs ont noté la supériorité de la DNAse selon l'invention par rapport à d'autres nucléases, mêmes des nucléases considérées comme excellentes, cette supériorité est mesurée soit seule, soit en synergie avec d'autres activités enzymatiques.
Un autre aspect connexe de la présente invention porte sur une composition (pharmaceutique) comprenant la DNAse (ou plusieurs
DNAses) selon l'invention (avec au moins une DNAse de type HNH et/ou ayant au moins 95% d'identité sur toute la séquence avec une quelconque des Séquences 1 à 13, ou 1 à 18) pour l'élimination d'un biofilm présent sur un tissus d'un patient, ledit tissus étant de préférence la cavité buccale, une muqueuse, une plaie, ou en contact avec un implant.
Dans le contexte de la présente invention, la terminologie « muqueuse » porte de préférence sur une muqueuse choisie parmi les muqueuses de l'appareil respiratoire (fosses nasales, bronches), de l'appareil uro-génital, et du système digestif.
De préférence, ce biofilm présent sur le tissu d'un patient comprend
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, et/ou
Staphylococcus epidermidis.
Avantageusement, cette composition pharmaceutique est produite selon les normes « GMP », ce qui signifie que les composés sont choisis pour ne pas causer d'effets délétères au patient (ex., surtout pour les implants oules muqueuses des système digestif ou respiratoire, le Moins possible de glycérol ou de propylène glycol ; le moins possible d'agent conservateur ou autre agent toxique pour le patient), et que les étapes de production obéissent à un protocole strict et validé par des autorités indépendantes (autorités sanitaires, comités d'éthique des hôpitaux,…).
Un autre aspect connexe de la présente invention porte sur un procédé pour l'élimination d'un biofilm sur une surface comprenant l'application sur cette surface de la composition liquide selon l'invention, comprenant la DNAse (ou plusieurs DNAses) selon l'invention (avec au moins une
DNAse de type HNH et/ou ayant au moins 95% d'identité sur toute la séquence avec une quelconque des Séquences 1 à 13, ou 1 à 18).
Une variante de ce procédé est particulièrement avantageuse pour le traitement d'instruments médicaux, dans lequel l'instrument médical est traité avec la composition liquide selon la présente invention comprenant la DNAse décrite ci-dessus (souvent en synergie avec un ou plusieurs agents tensioactifs, un agent séquestrant et d'autres activités enzymatiques décrites ci-dessus, en particulier, une protéase, mais aussi une amylase, voire même au moins une quatrième enzyme}, puis l'instrument est rincé, puis désinfecté à l'aide d'une molécule biocide, par exemple l'acide peracétique. Ensuite, si l'instrument médical est de composition délicate, par exemple, un endoscope, celui-ci est simplement séché. Au contraire, si l'instrument peut être soumis à un traitement thermique stérilisant (ex. instruments chirurgicaux), ce dernier est avantageusement réalisé en plus. Un traitement thermique stérilisant est, de préférence, un traitement dans une autoclave à une température supérieure à 100°C et à une pression supérieure à 1 bar, l'atmosphère étant avantageusement saturée en eau. Un autre traitement thermique stérilsant avantageux est la pasteurisation.
Exemples
Deux biofilms différents ont été testés de manière à rencontrer une diversité de microorganismes : un biofilm constitué de
Lactococcus lactis et un biofilm constitué de Pseudomonas fluorescens.
Ces biofilms ont été générés par application des suspensions bactériennes sur gélose à 37°C dans des plaques multipuits (24 puits), pendant 48h (Pseudomonas) ou 24h (Lactococcus). La quantification des microorganismes se fait par spectrométrie, ici à 590 nm (570 nm est également OK) suite à une coloration au « Crystal Violet ».
Différentes conditions sont prévues par plaque, ce qui est schématisé dans le Tableau 1 ci-dessous :
Témoin Témoin Témoin Témoin | Témoin Témoin positif positif positif négatif | négatif négatif
Cip Cip + Cip + A1+10 | Al+10+ Al +10+
Denarase DNAse Denarase DNAse
Cip Cip + Cip + A1+10 | Al+10+ Al +10+
Denarase DNAse Denarase DNAse
Cip Cip + Cip + A1+10 | Al+10+ Al +10+
Denarase DNAse Denarase DNAse
Tableau 1 : aperçu des différentes conditions pour les tests.
Chaque condition est donc en triple.
Les bactéries sont ensemencées dans tous les puits, sauf pour les «témoins négatifs ».
Toutes les solutions sont stériles et elles sont ajoutées très délicatement pour ne pas causer de perturbations mécaniques aux biofilms.
Les puits des conditions « Témoin positif » et « Témoin négatif » ont été incubés avec 1 ml de sérum physiologique.
Les autres puits ont été incubés pendant 30 minutes à 45°C avec 1 ml des solutions (les pourcentages ci-dessous sont en poids :volume) suivantes :
Biorem-CIP (Realco) : 1% ;
Denarase et DNAse : 0,01% des solutions enzymatiques, de manière à assurer une activité normalisée ;
Biorem Al +10: les solutions vendues par Realco, diluées à 0,25% (Al) et 0,05% (Biorem 10). Ces solutions comprennent des détergents/agents tensioactifs (>1% de C6 alkyl-glucoside), séquestrants
(un phosphonate ; > 15%), et plusieurs activités enzymatiques, dont une protéase, une amylase et une laccase.
Biorem CIP contient également des détergents/tensioactifs (>1% de C6 alkyl-glucoside), des séquestrants (>1% de citrate de sodium), et un agent dispersant et plusieurs activités enzymatiques, dont une protéase, une amylase et une laccase. La composition a été appliquée a 1%.
Les composés Biorem sont également décrits, par exemple dans la demande de brevet WO2012048758A1 ainsi que dans les brevets correspondants.
Ensuite les puits sont délicatement vidés en prenant soin de ne retirer ni les biofilms ni leurs fragments. Après un rinçage à l'eau physiologique, la plaque contenant les biofilms est séchée à l'étuve pendant une heure à 45°C. Une fois le biofilm séché, le Crystal violet (0,1%) est ajouté pour une incubation de 15 minutes à température ambiante qui est suivie de trois ringages à l'eau distillée. Enfin, les puits sont remplis d'acide acétique à 44% pour une incubation d'une heure à température ambiante. La mesure d'absorbance à 590 nm peut désormais être effectuée. Si les concentrations en Crystal violet sont trop importantes et quelle spectrophotomètre sature alors une dilution par dix est réalisée.
Les résultats pour Lactococcus lactis sont repris dans le
Tableau 2 ci-dessous :
CIP Cip + Cip + Al +10 Al+10+ A1+10+
Denarase DNAse Denarase DNASE 59,4% 61,1% 63,7% 55,2%
49,9% 53,8% 65,1% 10,4% 61,1%
Tableau 2: efficacité des différentes nucléases pour la destruction des biofilms constitués de Lactococcus lactis et synergie avec une composition enzymatique.
Les inventeurs ont testé en outre, dans une autre série d'expériences, l'effet de Ia DNAse seule ou de la Denarase seule, et ont observé une très bonne efficacité de la DNAse seule sur Lactococcus lactis, qui est encore augmentée d'environ 20% par le Biorem, alors que la Denarase seule n'a qu'une activité marginale.
Les résultats pour Pseudomonas fluorescens sont repris dans le
Tableau 3 ci-dessous :
CIP Cip + Cip + A1 +10 Al +10+ A1+10+
Denarase DNAse Denarase DNASE 84,4% 71,8% 75,5% 19,0% 44,1% 70,0% 81,3% 13,6% 69,7% 13,0% 42,7% 66,3% 71,0% 70,5% 73,5% 17,0% 16,8% 63,4%
Tableau 3: efficacité des différentes nucléases pour la destruction des biofilms constitués de Pseudomonas fluorescens et synergie avec une composition enzymatique.
Comme pour L. lactis, les inventeurs ont testé dans une seconde série d'expériences l'effet de la DNAse seule et ont observé une forte activité de la DNAse seule, qui est quelque peu augmentée par le
Biorem.
De ceci, les inventeurs concluent que la DNAse de l'invention est clairement supérieure, surtout en synergie avec les conditions moins intenses du Biorem A1+10, par rapport au Biorem CIP. De manière avantageuse, pour le Lactococcus lactis, où l'efficacité du Biorem CIP est un peu moins marquée, la synergie avec la DNAse est mieux mise en évidence.
Une autre série d'expériences a été pratiquée en synergie avec d'autres composition enzymatiques (Enzimed Prevent, qui comprend une protéase, une cellulase, une amylase et une mannanase ; les 2 premières colonnes des tableaux ci-dessous, sans ou avec la DNAse de la présente invention), et une comparaison a été réalisée avec d'autres compositions commerciales : des compositions détergentes alcalines avec une activité protéase (3° colonne ; DAP), soit un cocktail dégraissant enzymatique, deux formulations commerciales distinctes (4° et 5° colonne ; DE1 et DE2), un détergent désinfectant multienzymatique contenant un ammonium quaternaire (6° colonne ; DMQ) ou une composition de désinfection non- enzymatique des endoscopes (7° colonne ; DME). Les compositions ont été testées à une concentration de 0,5%.
Le biofilm de l'espèce à tester est formé dans une plaque 96 puits. Les détergents enzymatiques sont ensuite dilués à leur concentration d'usage dans de l'eau de dureté standard (eau déminéralisée) et incubée sur le biofilm pendant Ih à 37°C. La quantité de biomasse restante après traitement et lavage du biofilm est ensuite évaluée par une coloration au cristal violet (solution 2% de sigma).
Ce test est réalisé sur des souches de référence en plaques de 96 puits, à savoir : $. aureus ATCC33591 : 24h biofilm (TGN)
E. coli ATCC25922: 48h biofilm ( LB)
P. aeruginosa ATCC27853 et PAO1: 48h biofilm (TGN)
Solutions:
TGN (TSB+1% glucose+2% NaCl)
LB (pour E.coli)
Eau «distillée » : stérilisée par filtration (0,22 micron}, contenant au final 1.25 MM MgCl2, 2.5 MM CaCl2, 3.33 MM NaHCO3.
Cristal violet à 2% (Cristal violet solution, Sigma-Aldrich, ref : HT90132-1L)
Acide acétique 66% (acid Acétique glacial 100%, ref : K48283163635,
Milipore)
Boites de Tryptic soy agar (TSA ; BD benelux — ref 254086)
Les solutions ont été préchauffées à 37°C, de manière à éviter des chocs thermiques aux biofilms.
Méthode :
JO : Lancer une culture « overnight ». 5mI TGN + 20 ul des bactéries. Incuber 18H a 37°C sous agitation lente, 130rom
J1 : Préparation
Ajouter 200 ml de l'inoculum (DO 0,05) dans chaque puit d'une plaque 96-puit en suivant le plan de plaque (VWR).
Faire Un test de non-contamination de la préculture liquide
Strier la preculture sur une boite TSA. Incuber toute la nuit @37°C
Le lendemain, s'assurer qu'il n'y a pas de contamination.
Croissance du biofilm :
Pour S. aureus 24h @37°C
Incuber la plaque à 37°C pendant 24h dans une boite fermée afin d'éviter l'évaporation. Noter le temps pour avoir un biofilm de 24h exactement.
Pour E. coli: 48h avec changement du milieu après 24h @37°C: - Incuber la plaque à 37°C pendant 24h dans une boite fermée afin d'éviter l'évaporation (LB pas TGN). - Retirer délicatement le milieu par pipetage - Rajouter 200 ul de LB préchauffé - Incuber pour 24h de plus @37°C dans une boite fermée afin d'éviter l'évaporation.
Pour P. aeruginosa : 48h @37°C - Incuber la plaque à 37°C pendant 48h dans une boite fermée afin d'éviter l'évaporation. Noter bien le temps pour avoir un biofilm de 48h exactement.
J2 : Apres croissance du biofilm
Vider le milieu de culture des plaques de biofilm par aspiration, en évitant de toucher le biofilm
Rincer les plaques | X avec du PBS stérile préchauffé (retirer le PBS après 30 sec)
Traitement enzymatique : - Préparer les solutions enzymatiques aux concentrations voulues selon le protocole de préparation annexe
- Ajouter 230 ul des solutions enzymatiques dans des plaques 96- puits vides selon le plan de plaque - Chauffer ces plaques dans un bain-marie à 37°C ou dans l'étuve pendant 15 min - Transférer 200 ul d'enzymes chauffées dans les puits les plaques 96 puits comprenant les biofilms en pipetant horizontalement - Incuber les plaques à 37°C pendant 1h - Vider les enzymes des plaques traitées par aspiration - Rincer les plaques 2X avec du PBS stérile préchauffé, entre chaque étape, retirer le PBS par aspiration
Coloration de la biomasse au cristal violet : - Sécher les plaques au four à 60°C pendant une nuit afin de fixer le biofilm - Ajouter 200 mil de solution de cristal violet 2% dans les plaques (dont le contrôle négatif) - Incuber les plaques à température ambiante pendant 15 min - Vider les plaques et les rincer au moins 5X à l'eau distillée - Égoutter les plaques pendant quelques minutes afin d'éliminer l'eau de rinçage des puits - Ajouter 200 ul d'acide acétique 66% dans les plaques (dont le contrôle négatif) - Incuber les plaques à température ambiante pendant au moins 1h - Mesurer les valeurs d'absorbance au spectramax (570nm) et réaliser des dilutions ds de l'acide acétique si certaines valeurs de la plaque sont > 2
Prevent me an Jm Je mn [5 Je Jen Jen Jan Je
Prevent DNase DE1 DE2 mee (5 ae jn Jan je Je
Prevent DNase DE1 DE2
SE EE
Prevent DNase DE1 DE2 venne [Meme | Moyenne | Mevenne | Mivenne evene | Mevenne
Expérience 1 aa TT TTT
LER || [a [ae [en as TT TT
KK | [ee
CE
53,29% 62,40% 60,64% 42,40% 15,05% -97,71% -53,69%
Expérience 2 aa] TT TT pres [ee [es ae [se ars TTT ea [Gan [ren [aan oa [aen [ee en |L aan aa [aa [an [maen [an [oa
Ainsi, le produit Enzimed Prevent seul est efficace de manière constante contre E. coli et P. aeurginosa, mais son efficacité contre S. aureus est variable. Cependant, cette composition Enzimed enrichie avec la DNAse de la présente invention montre une activité accrue systématiquement,
et constante, même contre S. aureus.
Les autres compositions nettoyantes ou même désinfectantes sont moins efficaces et parfois même non efficace du tout sur les biofilms testés.

Claims (15)

REVENDICATIONS
1. Une composition liquide pour la prévention ou l'élimination d'un biofilm, comprenant un ou plusieurs agent(s) tensioactif(s), un ou plusieurs agent(s) séquestrant{s) et une phosphodiestérase ayant une activité désoxyribonucléase (DNAse), ladite DNAse étant une ou plusieurs DNAse(s) de type HNH et/ou possédant au moins 95% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO :13.
2. La composition selon la revendication 1 dans laquelle la DNAse possède au moins 95% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 13.
3. La composition selon la revendication 1 ou 2 comprenant en outre une ou plusieurs activité(s) enzymatiques choisies parmi une protéase, une laccase, une amylase, une lipase, une cellulase, une mannanase, une activité B-1,6-N-acetylhexosaminidase (Dispersine B) et un mélange de celles-ci, de préférence une protéase et/ou B- 1,6-N-acetylhexosaminidase (Dispersine B).
4 La composition selon une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le ou les agent(s) séquestrants est (sont) choisis dans le groupe constitué du citrate, de la carboxyméthylinuline, d'un phosphate, d'un phosphonate, le Glutamate et diacétate tétrasodique (GLDA), le diacétate de méthylglycine trsodique (MGDA), l'iminodisuccinate de sodium (IDS), un gluconate et des mélanges de ceux-ci.
5. La composition selon une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre du glycérol et/ou du monopropylène glycol, de préférence entre 5 et 30% (poids :volume).
6. La composition selon une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un agent conservateur, de préférence un isothiazolinone tel que la Benzisothiazolinone, ou un phénoxyéthanol.
7. La composition selon une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins 7 % en eau (poids :volume).
8 La composition selon une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins 60% en eau (poids :volume), de préférence ladite composition comprenant en outre la B-1,6-N- acetylnexosaminidase (Dispersine B).
9. La composition selon une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins 90% en eau (poids :volume) et un tensioactif moussant.
10.Utilisation de la composition selon une quelconque des revendications précédentes pour l'élimination d'un biofilm comprenant une bactérie lactique choisie parmi Lacobacillus sp, Pediococcus sp, Lactococcus sp. Streptococcus sp, Teragenococcus sp, Leuconostoc sp, Oenococcus sp, Bifidobacterium sp, et/ou Listera monocytogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, et/ou Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundi, Staphylococcus epidermidis ou Clostridium sp.
11.Une composition liquide selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 9 pour l'élimination d'un biofilm présent sur un tissus d'un patient, ledit tissus étant de préférence la cavité buccale, une muqueuse, une plaie ou en contact avec un implant.
12.Un procédé pour l'élimination d'un biofilm sur une surface comprenant l'application sur ladite surface de la composition liquide selon une quelconque des revendications précédentes | à
9.
13.Le procédé selon la revendication 12 dans lequel la surface est la surface interne et/ou la surface externe d'un endoscope et comprenant en outre l'application d'un désinfectant auxdites surfaces.
14.Le procédé selon la revendication 12 dans lequel la surface est celle d'un instrument chirurgical et comprenant en outre l'application d'un désinfectant sur ladite surface, puis l'application d'un traitement thermique stérilisant.
15.Le procédé selon la revendication 13 ou 14 dans lequel le désinfectant est l'acide peracétique.
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