FR3118058A1 - Souche de bacillus pumilus presentant un fort antagonisme vis-a-vis de pathogenes de surface - Google Patents
Souche de bacillus pumilus presentant un fort antagonisme vis-a-vis de pathogenes de surface Download PDFInfo
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Abstract
L’invention concerne une souche de Bacillus pumilus présentant une activité antagoniste vis-à-vis de pathogènes de surface. Figure abrégé : Fig. 1
Description
Domaine technique de l’invention
L’invention concerne une souche deBacillus pumilusqui présente une activité antagoniste d’intérêt vis-à-vis de microorganismes pathogènes, en particulier des bactéries pathogènes de surface, une composition nettoyante, assainissante ou détergente comprenant ladite souche, et leur utilisation pour nettoyer et/ou protéger de la contamination des surfaces.
Arrière-plan technologique
L’industrie de la détergence fait face aujourd’hui à un défi constant pour satisfaire aux exigences et aux normes relatives à la propreté et à l’hygiène.
Les produits actuels de nettoyage et de désinfection des surfaces ont montré leur limite, notamment dans la lutte contre la recontamination des surfaces par des agents pathogènes. En effet, les produits traditionnellement employés pour la désinfection des surfaces n’ont qu’un effet transitoire puisqu’ils assurent uniquement l’élimination des bactéries déjà en place sans empêcher une recontamination rapide des surfaces par des agents pathogènes.
En outre, les produits désinfectants classiques ont le désavantage d’être des produits dangereux (risque irritant, corrosif…) contenant des molécules toxiques pour l’homme et l’environnement (produits chlorés, ammoniums quaternaires, glutaraldéhyde…). De plus, ces produits sont difficilement biodégradables.
Par ailleurs, les agents chimiques contenus dans ces produits de désinfection peuvent réagir avec d’autres molécules utilisées dans le cadre du nettoyage, ce qui a pour conséquence une inhibition de leur activité désinfectante et potentiellement un risque toxique supplémentaire pour les utilisateurs.
Un autre inconvénient lié à l’utilisation des compositions désinfectantes traditionnelles à base de produits chimiques est le fait qu’ils nécessitent un temps de contact long avec la surface à nettoyer, pouvant aller jusqu’à 15 minutes. Ainsi, leur efficacité est compromise dans le cas où ce temps n’est pas respecté.
En pratique, la législation est de plus en plus stricte concernant l’utilisation de ces produits de désinfection. Il y a donc une demande grandissante de la part des professionnels du nettoyage et des consommateurs pour utiliser des produits qui soient efficaces, mais plus sûrs pour l’homme et l’environnement.
Dans ce contexte, des solutions alternatives ont été recherchées. Ainsi, des produits de nettoyage utilisent une approche dite de "bio-contrôle", basée sur l'antagonisme compétitif entre des microorganismes probiotiques (non pathogènes) présents dans le produit qui colonisent les surfaces et d'autres espèces bactériennes potentiellement pathogènes.
Il existe sur le marché des produits utilisés pour le nettoyage et l’assainissement des surfaces dans lesquels des spores de bactéries du genreBacillussont associés à une formulation détergente. Par exemple, plusieurs études réalisées en milieu hospitalier (Vandini A.et al., 2014, PLoS One, 9(9) : e108598 ; Caselliet al., 2016, PLoS One, 11(2): e0148857) présentent des résultats d’inhibition du développement de bactéries pathogènes sur des surfaces grâce à l’utilisation d’un produit commercialisé par la Société CHRISAL contenant des spores deB. subtilis,B. megateriumetB. pumilus. Cependant, aucune donnée ne permet l’identification des souches bactériennes utilisées ou encore ne révèle leur efficacité lorsque chaque souche, prise isolément, est mise en œuvre sur les pathogènes de surface cibles.
D’autres documents décrivent l’utilisation de spores bactériennes du genreBacillusdans des compositions de nettoyage, comme par exemple :
Le document WO97/25865 décrit l’utilisation de spores deBacillus(B. licheniformis,B. subtilis,B. polymyxa,B. amyloliquefaciens,B. pasteuriiet/ouB. laevolacticus) dans une formulation détergente.
Les documents WO2010/014715 et WO2010/006235 visent spécifiquement une souche deB. amyloliquefacienset une souche deB. velezensispour prévenir et/ou réduire la formation de biofilm pathogène sur les surfaces.
Le document WO2017/074485 décrit une composition détergente ayant la propriété d’éliminer ou de prévenir la présence de pathogènes et de biofilms sur les surfaces et qui contient au moins une bactérie du genreBacillus. En pratique, des mélanges de différentes espèces sont testés.
Le document WO2012/042220 décrit un procédé de nettoyage de surfaces qui comprend l’utilisation d’une composition aqueuse comprenant des spores d’au moins une souche deBacillusde classe 1 (en pratique un mélange deB. circulans,B. megateriumetB. sphaericus), un terpène et un ou plusieurs surfactants.
Le document WO2019/110811 décrit des compositions détergentes ayant la propriété d'inhibition spécifique de la croissance de pathogènes ou d'indésirables, dans laquelle la bactérie utilisée estB. amyloliquefaciensouB. velezensis.
Le document WO2010/028460 décrit un procédé pour le traitement préventif d'une surface abiotique dans un environnement domestique ou médical, au moyen d'une solution aqueuse non détergente contenant un mélange de bactéries du genreBacillus.
Il ressort de ce qui précède qu’il existe un besoin évident de nouvelles solutions techniques pour assurer une protection des surfaces vis-à-vis du développement des microorganismes pathogènes présents sur ces surfaces, c’est-à-dire permettant d’assurer un nettoyage et un assainissement efficaces de ces surfaces, tout en limitant, voire empêchant leur recontamination.
Description de l’invention
Le Demandeur a isolé une nouvelle souche deBacillus pumilusprésentant de nombreuses propriétés intéressantes dans le cadre du nettoyage des surfaces, notamment une activité antagoniste remarquable, à la fois dans son intensité et son spectre d’action.
A noter que l'utilisation de souches deB. pumilusen tant qu’ingrédient probiotique a déjà été décrite en relation avec l'industrie des aliments destinés à améliorer la santé animale. A titre d’exemple, le document WO2019/002476 décrit une soucheBacillus pumilusDSM32539 et son utilisation comme probiotique alimentaire pour inhiber la colonisation intestinale par des bactéries pathogènes dans des élevages de porcs et de volailles.
De souches deB. pumilusont également fait l’objet d’études afin d’isoler des composés antibactériens (Chuet al., 2019, Applied Microbiology and Biotechnology, 103 : 8375-81 ; Sagesseet al., 2018, Mar. Drugs, 16(6) : 180). Ces études ont révélé une grande hétérogénéité dans leur activité inhibitrice vis-à-vis de pathogènes.
Définitions
Les définitions ci-dessous correspondent au sens généralement utilisé dans le contexte de l’invention et sont à prendre en compte, à moins qu’une autre définition ne soit explicitement indiquée.
Au sens de l’invention, les articles « un » et « une » sont utilisés pour se référer à une ou à plusieurs (par exemple à au moins une) unités de l'objet grammatical de l'article. A titre d'exemple, « un élément » désigne au moins un élément, c’est-à-dire un élément ou plus.
Les termes « environ » ou « approximativement », utilisés en référence à une valeur mesurable telle qu'une quantité, une durée, et autres valeurs analogues, doivent être compris comme englobant des incertitudes de mesure de ± 20% ou de ± 10%, préférentiellement de ± 5%, encore plus préférablement de ± 1%, et de manière particulièrement préférée de ± 0,1% de la valeur spécifiée.
Intervalles: tout au long de la présente description, les différentes caractéristiques de l'invention peuvent être présentées sous forme d’intervalle de valeurs. Il doit être compris que la description de valeurs sous forme d’intervalle a uniquement pour finalité de rendre la lecture plus simple et ne doit pas être interprétée comme une limitation rigide de la portée de l'invention. En conséquence, la description d'un intervalle de valeurs devrait être considérée comme divulguant spécifiquement tous les intervalles intermédiaires possibles ainsi que chacune des valeurs au sein de cet intervalle. Par exemple, la description d'un intervalle allant de 1 à 6 devrait être considérée comme décrivant spécifiquement chacun des intervalles qu’il comprend, tels que les intervalles allant de 1 à 3, de 1 à 4, de 1 à 5, de 2 à 4, de 2 à 6, de 3 à 6, etc., ainsi que chacune des valeurs dans cet intervalle, par exemple, 1 ; 2 ; 2,7 ; 3 ; 4 ; 5 ; 5,3 et 6. Cette définition vaut indépendamment de la portée de l’intervalle.
Le terme « isolé » doit être compris dans le contexte de l’invention comme synonyme de retiré ou extrait de son environnement ou état naturel. Par exemple, une souche de bactérie ou un peptide isolé est une souche de bactérie ou un peptide extrait de l’environnement naturel dans lequel on le trouve habituellement, qu’il s’agisse d’une plante ou d’un animal vivant par exemple. Ainsi, une souche de bactérie ou un peptide naturellement présent dans un animal vivant n’est pas une souche de bactérie ou un peptide isolé au sens de l’invention, tandis que la même souche de bactérie ou peptide, partiellement ou complètement séparé des autres éléments présents dans son contexte naturel, est quant à lui « isolé » au sens de l’invention. Une souche de bactérie ou un peptide isolé peut exister sous une forme substantiellement purifiée, ou peut exister dans un environnement non natif tel que, par exemple, une cellule hôte.
Les termes « codant » ou « codant pour », « code » ou « code pour » se réfèrent à la propriété inhérente aux séquences spécifiques de nucléotides dans un polynucléotide, tel qu'un gène, un ADNc ou un ARNm, à servir de matrice pour la synthèse d'autres polymères et macromolécules dans des processus biologiques, ayant soit une séquence définie de nucléotides (par exemple ARNr, ARNt et de l'ARNm), ou une séquence définie d'acides aminés, et les propriétés biologiques qui en découlent. Ainsi, un gène code pour une protéine si la transcription et la traduction de l'ARNm correspondant à ce gène produisent la protéine dans une cellule ou un autre système biologique. Tant le brin codant, dont la séquence nucléotidique est identique à la séquence d'ARNm et qui est généralement décrite dans les listages de séquences et bases de données, que le brin non codant, utilisé comme matrice pour la transcription d'un gène ou de l'ADNc, peuvent être désignés comme codant pour la protéine ou un autre produit de ce gène ou ADNc.
Sauf indication contraire, au sens de l’invention, une « séquence de nucléotides codant une séquence d'acides aminés » désigne toutes les séquences nucléotidiques qui codent la séquence d'acides aminés, y compris les séquences de nucléotides dégénérées permettant d’obtenir ladite séquence d’acide aminés. Ceci vise tout particulièrement les séquences dites optimisées dans lesquelles les modifications ont pour but d’améliorer la stabilité et la transcription de l’ARN ou encore de permettre la production de la protéine dans un hôte spécifique. La séquence nucléotidique qui code pour une protéine ou un ARN ou un ADNc peut éventuellement comprendre des introns.
Le terme « polynucléotide » tel qu'utilisé dans le contexte de l’invention est défini comme une chaîne de nucléotides. En outre, les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides. Ainsi, les termes acides nucléiques et polynucléotides tels qu’utilisés dans le cadre de l’invention sont interchangeables. Il est bien connu dans le domaine de la biologie moléculaire et du génie génétique que les acides nucléiques sont des polynucléotides, qui peuvent être hydrolysés en monomères. Les nucléotides sous forme monomère peuvent être hydrolysés en nucléosides. Tel qu'utilisé dans le contexte de l’invention, le terme polynucléotide désigne, à titre non limitatif, tout type de molécules d'acides nucléiques, c’est-à-dire les molécules d’acides nucléiques pouvant être obtenues par tout moyen disponible dans la technique, y compris par des moyens recombinants, à savoir le clonage de séquences d'acides nucléiques à partir d'une bibliothèque recombinante ou le génome d’une cellule, en utilisant des technologies de clonage ordinaire telle la PCR, ou par synthèse.
Dans le contexte de l’invention, les abréviations suivantes sont utilisées pour les bases d'acide nucléique les plus courantes. « A » se réfère à l'adénosine, « C » se réfère à la cytosine, « G » désigne la guanosine, « T » désigne la thymidine, et « U » se réfère à l'uridine.
Au sens de l’invention, les termes « peptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés de manière interchangeable et font référence à un composé constitué de résidus d'acides aminés liés de manière covalente par des liaisons peptidiques. Une protéine contient par définition au moins deux acides aminés, sans limitation quant au nombre maximum d'acides aminés. Les polypeptides comprennent indifféremment plusieurs peptides et/ou protéines, lesquels comprennent eux-mêmes deux acides aminés ou plus reliés les uns aux autres par des liaisons peptidiques. Tel qu'il est utilisé ici, le terme se réfère à la fois à des chaînes courtes, qui sont également couramment désignées dans la technique comme des peptides, des oligopeptides et oligomères par exemple, et à des chaînes plus longues, qui sont généralement désignées dans la technique comme des protéines, dont il existe de nombreux types. Les « polypeptides » comprennent, par exemple, des fragments biologiquement actifs, des polypeptides substantiellement homologues, des oligopeptides, des homomères, des hétéromères, des variants de polypeptides, des polypeptides modifiés, des dérivés, des analogues, des protéines de fusion, entre autres. Les polypeptides comprennent des peptides naturels, des peptides recombinants, des peptides synthétiques, ou une combinaison de ceux-ci.
Les termes « homologue » et « identique » se réfèrent à la similarité de séquence ou l'identité de séquence entre deux polypeptides ou entre deux molécules d'acide nucléique. Quand une position dans chacune des deux séquences comparées est occupée par la même base ou sous-unité monomère d'acide aminé (par exemple, lorsqu’une position dans chacune des deux molécules d'ADN est occupée par une adénine), alors les molécules sont homologues ou identiques pour cette position. Le pourcentage d’identité entre deux séquences est fonction du nombre de positions correspondant partagées par les deux séquences, et correspond à ce nombre divisé par le nombre de positions comparées et multiplié par 100. Par exemple, si 6 sur 10 des positions dans deux séquences appariées sont identiques, alors les deux séquences sont identiques à 60%. En règle générale, la comparaison est effectuée en alignant les deux séquences de façon à donner une homologie/identité maximale.
Comme déjà dit, le Demandeur a identifié un microorganisme, en l’occurrence une nouvelle souche de bactérie de l’espèceBacillus pumilus, qui présente une activité antagoniste au moins vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae. A la connaissance du Demandeur, il s’agit de la première souche deB. pumilusayant un spectre large d’antagonisme vis-à-vis d’au moins ces trois familles de bactéries connues pour être des pathogènes susceptibles d’être présentes sur des surfaces à nettoyer.
Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention concerne une souche deBacillus pumilusprésentant une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux trois familles suivantes :Staphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae, avantageusement appartenant au moins aux trois genres suivants :Staphylococcus,EscherichiaetListeria.
Selon un mode de réalisation particulier, il s’agit de la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 01 juillet 2020, sous le numéro I-5531.
La présente invention concerne également les souches dérivées de la souche I-5531. Dans le cadre de l’invention, on entend par « dérivé » ou « mutant » ou « variant » toute souche qui diverge de la souche I-5531 du point de vue génomique en raison de mutation(s) pouvant résulter de mutations spontanées ou d’une mutagénèse aléatoire ou dirigée. De telles mutations peuvent aussi bien correspondre à des délétions, à des modifications ponctuelles (une ou plusieurs bases) qu’à l’introduction de séquences exogènes par génie génétique. De telles mutations peuvent être silencieuses ou non. Dans le cas de mutations non silencieuses, une souche dérivée selon l’invention présente au moins une des caractéristiques de la souche I-5531 telles que décrites ci-dessous, avantageusement toutes ces caractéristiques. Par conséquent, une souche dérivée présente avantageusement le même phénotype que la souche I-5531. De manière préférée selon l’invention, une souche dérivée présente une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux trois familles suivantes :Staphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae.
Les souches deB. pumilusselon l’invention appartiennent à la classe 1 selon la directive européenne 2000/54/CE visant les microorganismes n’ayant jamais été décrits comme agent de causalité de maladies chez l’homme et qui ne présentent aucun danger pour l'environnement. Elles possèdent également le statut QPS (présomption d’innocuité reconnue) selon l’EFSA (Autorité Européenne Sanitaire des Aliments) et le statut GRAS (« Generally Recognized As Safe ») selon la FDA (Food and Drug Administration).
L’appartenance des souches de l’invention à l’espèceB. pumilusressort par exemple du séquençage de marqueurs phylogéniques caractéristiques, avantageusement de l’ADN ribosomique 16S, des gènesgyrBetgroEL. Ainsi et selon un mode de réalisation particulier, une souche selon l’invention présente :
- la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence partielle de l’ADNr 16S, ou une séquence ayant au moins 95%, 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec SEQ ID NO : 1, avantageusement 100% d’identité ; et/ou
- la séquence SEQ ID NO : 2 correspondant à la séquence partielle du gènegyrB, ou une séquence ayant au moins 95%, avantageusement au moins 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec SEQ ID NO : 2 ; et/ou
- la séquence SEQ ID NO : 3 correspondant à la séquence partielle du gènegroELou une séquence ayant au moins 95%, avantageusement au moins 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec SEQ ID NO : 3.
- la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence partielle de l’ADNr 16S, ou une séquence ayant au moins 95%, 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec SEQ ID NO : 1, avantageusement 100% d’identité ; et/ou
- la séquence SEQ ID NO : 2 correspondant à la séquence partielle du gènegyrB, ou une séquence ayant au moins 95%, avantageusement au moins 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec SEQ ID NO : 2 ; et/ou
- la séquence SEQ ID NO : 3 correspondant à la séquence partielle du gènegroELou une séquence ayant au moins 95%, avantageusement au moins 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec SEQ ID NO : 3.
Avantageusement, une souche selon l’invention présente les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, ou des séquences ayant au moins 95%, avantageusement au moins 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec celles-ci.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, une souche selon l’invention présente une séquence génomique ayant au moins 95%, avantageusement au moins 96%, 97%, 98%, 99% voire 99,5% ou même 99,9% d’identité avec la séquence génomique de la souche I-5531.
Conformément à l’appartenance des souches de l’invention à l’espèceB. pumilus,celles-ci sont avantageusement capables de croître dans des conditions anaérobies et aérobies, sur des milieux riches classiques contenant des peptones et hydrolysats de protéines animales ou végétales, des extraits de levures et du sel, ou sur des milieux spécifiques pour la culture de souches de typeBacillusbien connus de l’homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation particulier, une souche selon l’invention est capable de sporuler ou former des spores, par exemple après culture dans un milieu favorisant la sporulation tel que le milieu Difco Sporulation Medium (DSM).
Une caractéristique essentielle d’une souche deB. pumilusselon l’invention réside dans son activité antagoniste vis-à-vis de pathogènes de surface. Dans le cadre de l’invention, les termes « activité antagoniste », « antagonisme » ou « pouvoir antagoniste » ont une signification équivalente. Ils visent la capacité de la souche à réduire voire inhiber la croissance et/ou l'activité d’un microorganisme différent, avantageusement un pathogène de surface. Cette action peut s’exercer par production et sécrétion de molécules inhibitrices (bactériocines, antibiotiques, toxines…) et/ou par compétition. Par « compétition », on entend une relation de concurrence entre des microorganismes lorsque ceux-ci dépendent de l’utilisation de la même ressource (nutriments) et/ou d’un même territoire/espace, réduisant ainsi la disponibilité de nutriments et/ou espace pour chacun des compétiteurs, sans qu’il y ait nécessairement une interaction directe entre les microorganismes en compétition. En pratique, la souche bactérienne selon l’invention va occuper le terrain en consommant les matières organiques qui vont s’accumuler après le nettoyage et/ou produire des molécules antagonistes qui vont empêcher les « mauvaises » bactéries de s’installer, assurant ainsi un effet à long terme.
Dans le cadre de l’invention, les surfaces à nettoyer sont avantageusement des surfaces inertes, par exemple comprenant ou constitué d’un matériau choisi dans la liste suivante : un polymère ou copolymère tel que du polychlorure de vinyle (PVC), de la faïence, de l’inox, du verre.
Des pathogènes de surface sont des microorganismes, en particulier des bactéries, appartenant avantageusement aux familles suivantes :Staphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae.
Avantageusement, la souche deB. pumilusselon l’invention présente une activité antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes du genre bactérien suivant :Staphylococcus,EscherichiaetListeria.
Selon un mode de réalisation particulier, des espèces bactériennes pathogènes visées sont :Staphylococcus warneri(par exemple ATCC 27836),Staphylococcus epidermis(par exemple ATCC 12228),Staphylococcus hominis(par exemple ATCC 700236),Staphylococcus aureus(par exemple SA 1199),Escherichia coli(par exemple W3110 ou DSM1058) etListeria monocytogenes(par exemple CIP 82.110).
De tels microorganismes sont appelés pathogènes dans la mesure où ils sont potentiellement dangereux pour la santé humaine en cas d’inhalation, de contact ou d’ingestion par exemple. Ainsi, une souche deB. pumilusselon l’invention peut être considérée comme un probiote ou une souche probiotique, avantageusement une souche probiotique de surface.
L’activité antagoniste d’un microorganisme, en particulier de la souche deB. pumilusselon l’invention, peut être mise en évidence par différentes techniques connues de l’homme du métier.
Comme il ressort des exemples ci-dessous (exemple 1.6.1), cette activité peut être mise en évidence par la formation d’un halo d’antagonisme autour des colonies bactériennes testées en milieu solide. Ainsi et de manière préférée, on observe un halo d’au moins 2 mm, voire d'au moins 5 mm, avantageusement d’au moins 10 mm, encore plus avantageusement d’au moins 15 mm dans un essai d’antagonisme de diffusion sur disques en papier en milieu gélosé TSA (Trypto-Caséine Soja Agar) comprenant la souche pathogène, en particulier la souche SA 1199 deStaphylococcus aureus, la souche ATTCC 27836 deStaphylococcus warneri, la souche ATCC 12228 deStaphylococcusepidermis, la souche ATCC 700236 deStaphylococcus hominis, la souche W3110 ou DSM1058 d’Escherichia coli, ou encore la souche CIP 82.110 deListeria monocytogenes. Selon un mode de réalisation particulier, la souche selon l’invention présente une activité antagoniste, telle qu’évaluée par ce test sur milieu gélosé, au moins égale à celle de la souche I-5531 et/ou supérieure à celle des souches deB. pumilusDSM27Tet DSM361.
Alternativement et comme illustré à l’exemple 1.6.2, l’activité antagoniste de la souche selon l’invention peut être testée par des essais de compétition en co-culture sur milieu liquide, en suivant la croissance de la souche de l’invention et du pathogène.
Selon un mode de réalisation, la soucheB. pumilusselon l’invention possède des propriétés antagoniste, antibactérienne, antibiotique, bactériostatique, bactéricide et/ou sporicide vis-à-vis de bactéries pathogènes issues des familles bactériennesStaphylococcaceaeet/ouEnterobacteriaceaeet/ouListeriaceae,avantageusementStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae.
Selon un autre mode de réalisation, la soucheB. pumilusselon l’invention présente une activité antagoniste vis-à-vis d’au moins une bactérie pathogène issue des famillesStaphylococcaceaeet/ouEnterobacteriaceaeet/ouListeriaceae, avantageusement vis-à-vis d’au moins une bactérie pathogène issue des genres bactériensStaphylococcuset/ouEscherichiaet/ouListeria, de préférence vis-à-vis des espècesStaphylococcus warneriet/ouStaphylococcus epidermiset/ouStaphylococcus hominiset/ouStaphylococcus aureuset/ouEscherichia coliet/ouListeria monocytogenes.
Selon d’autres modes de réalisation, une souche deB. pumilusselon l’invention, en particulier la souche I-5531 ou une souche dérivée de celle-ci, présente au moins une des caractéristiques suivantes :
Unesensibilité aux antibiotiques ou antimicrobienscompatible avec les exigences de l’EFSA (Guide pour l'évaluation de la sensibilité bactérienne aux antimicrobiens EFSA Journal 2012; 10 (6): 2740 4) en relation avec lesBacilli. Ceci permet de diminuer le risque de propagation de gènes de résistance aux antibiotiques à des pathogènes de surface. Ainsi, de manière avantageuse et comme démontré pour la souche I-5531 (exemple 1.3), la soucheB. pumilusselon l’invention est sensible aux antibiotiques suivants : ampicilline, vancomycine, gentamicine, érythromycine, clindamycine, kanamycine, streptomycine, chloramphénicol et tétracycline. Encore plus avantageusement, elle présente une concentration minimale inhibitrice (CMI) inférieure ou égale, avantageusement inférieure à 4 mg/L pour la vancomycine, la gentamicine, l'érythromycine et la clindamycine, et à 8 mg/L pour la kanamycine, la streptomycine, le chloramphénicol et la tétracycline. Ainsi et selon un mode de réalisation particulier, la souche selon l’invention présente une sensibilité aux antibiotiques, notamment à ceux listés ci-dessus, au moins égale à celle de la souche I-5531 et/ou supérieure à celle de la souche deB. pumilusDSM361, en particulier vis-à-vis du chloramphénicol.
Unecapacité à croitre en milieu salin. Comme démontré dans les exemples ci-dessous (exemple 1.4), la souche I-5531 et donc les souches deB. pumilusselon l’invention sont capables de croître en présence de concentrations élevées en sels, en particulier en NaCl, en l’occurrence pouvant atteindre 100 g/L (10%) notamment en milieu Difco Sporulation Medium modifié (DSM + 5 g/L glucose). Selon un mode de réalisation particulier, la souche selon l’invention présente une croissance en présence de fortes concentrations en sels, notamment en présence d’au moins 10 g/L (1%), par exemple 50 g/L (5%) voire 100 g/L (10%) de NaCl, non affectée (comparable à celle observée en l’absence de sel) et/ou au moins égale à celle de la souche I-5531 et/ou supérieure à celle de la souche deB. pumilusDSM27T.
Unecapacité à adhérer sur une surface inerte et à l’envahir. Comme il peut être testé dans les conditions de l’exemple 1.5, les souches deB. pumilusselon l’invention présentent avantageusement une capacité d’adhérer sur une surface inerte, par exemple en polychlorure de vinyle (PVC) ou en faïence, au moins égale à celle de la souche I-5531 et/ou supérieure à celle de la souche deB. pumilusDSM27T. Par ailleurs, cette adhérence est observée au moins pendant 24 heures, voire même pendant plusieurs jours. Une souche selon l’invention est en outre capable de se développer et de survivre sur des surfaces inertes pendant plusieurs jours. Cette propriété peut être mise en évidence dans un essai sur gélose TSA, à savoir par la mesure de l’étendue du développement des colonies en dehors d’un disque de papier inoculé à l’aide de ladite souche. Ainsi et de manière avantageuse, la souche deB. pumilusselon l’invention a la capacité d’envahir une surface gélosée autour d’un disque de papier préalablement inoculé d’au moins 2 mm, voire d'au moins 5 mm, avantageusement d’au moins 10 mm, encore plus avantageusement d’au moins 15 mm dans un essai sur gélose TSA. Préférentiellement, cette capacité est au moins égale à celle de la souche I-5531 et/ou supérieure à celle des souches deB. pumilusDSM27Tet DSM361.
Selon un autre aspect, l’invention concerne une préparation extracellulaire obtenue à partir d’une culture de la souche deB. pumilusselon l’invention, pouvant correspondre à un surnageant brut de culture, un surnageant filtré de culture, des molécules obtenues à partir de ces surnageants telles que des peptides et/ou des lipopeptides, avantageusement purifiées selon les techniques connues de l’homme du métier.
Comme démontré dans les exemples, une telle souche peut être utilisée pour la préparation d’une composition nettoyante, assainissante et/ou détergente.
Ainsi et selon un autre aspect, l’invention concerne une composition comprenant une souche deB. pumilustelle que décrite précédemment, en particulier :
- une souche deB. pumilusprésentant une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae; ou
- la souche I-5531 ; ou
- une souche dérivée de la souche I-5531 et ayant conservé une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae.
- une souche deB. pumilusprésentant une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae; ou
- la souche I-5531 ; ou
- une souche dérivée de la souche I-5531 et ayant conservé une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae.
De manière avantageuse, la composition selon l’invention est une composition nettoyante, assainissante et/ou détergente. Le terme « nettoyante » fait référence à l’utilisation d’une telle composition pour le nettoyage de surfaces, en particulier de surfaces inertes. Le terme « assainissante » fait référence au fait qu’en raison de la présence de la souche selon l’invention dans la composition, l’application d’une telle composition permet de protéger les surfaces du développement de pathogènes de surface, en particulier de bactéries pathogènes appartenant au moins aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae. Le terme « détergente » fait référence au fait que la composition comprend, outre la souche selon l’invention, au moins un agent détergent présentant des propriétés tensioactives.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l’invention comprend la souche deB. pumilusse présentant sous forme de spores et/ou de cellules végétatives et/ou de cellules qui sont en phase transitoire de sporulation. Selon un mode de réalisation avantageux, la souche se présente sous forme de spores.
Avantageusement, la souche deB. pumilusde l’invention représente entre 105UFC/ml et 1012UFC/ml de ladite composition, avantageusement entre 106et 109UFC/ml, de préférence entre 107et 108UFC/ml, par exemple de 106à 108UFC/ml. Dans le reste de la description, l’abréviation UFC signifie « unité formant colonie ». Les termes « UFC » et « bactérie » peuvent être utilisés de manière interchangeable.
La souche deB. pumilusou la préparation extracellulaire selon l’invention peut être obtenue en cultivant les souches de la présente invention selon des méthodes bien connues de l’homme du métier, par exemple par fermentation liquide en mode batch, fed-batch ou culture continue ou par fermentation à l'état solide en utilisant les milieux de culture classiques, de sporulation ou non, bien connus de l’homme du métier comme par exemple le milieu suivant : peptone à 5 g/L, extrait de viande à 3 g/L et sulfate de manganèse (MnSO4, H2O) à 10 mg/L.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules et/ou spores bactériennes, voire les extraits extracellulaires, présents dans les milieux de culture peuvent être utilisés directement, concentrés ou purifiés par des méthodes conventionnelles, telles que la centrifugation, la filtration, l'évaporation ou par précipitation en utilisant par exemple des solvants ou du sulfate d’ammonium.
Ainsi et dans un mode de réalisation particulier, pour éliminer le milieu de culture résiduel, les cellules bactériennes, avantageusement sporulées, de la souchede B. pumilusselon l’invention sont lavées dans de l’eau plus ou moins purifiée ou dans un tampon neutre bien connu de l’homme du métier, comme par exemple un tampon phosphate de type tampon phosphate salin (ou PBS comprenant : NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/L, Phosphate disodique 1,44 g/L et phosphate monopotassique 0,24 g/L) ou dans une solution saline à 9 g/L.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend comme seul microorganisme, avantageusement comme seule souche probiotique, avantageusement comme seule souche probiotique de surface, la souche deB. pumilustelle que définie précédemment. En d’autres termes, une composition selon l’invention peut ne contenir aucun autre microorganisme, en particulier aucune autre bactérie. Selon un mode de réalisation avantageux, une composition selon l’invention ne contient pas d’autres bactéries du genreBacillus.
Selon un mode de réalisation alternatif, la composition comprend, outre la souche selon l’invention, au moins un autre microorganisme, par exemple une autre souche probiotique notamment de surface et/ou alimentaire, en particulier une bactérie. Notamment, une autre souche probiotique peut être une souche de typeBacillusdifférente de celle de l’invention se présentant avantageusement sous forme sporulée, une souche deLactobacillus(L.), dePediococcus(P.), d’Enterococcus(E.) ou leurs mélanges.
A titre d’exemple, une autre souche probiotique peut être choisie dans la liste suivante :B. licheniformis,B. amyloliquefaciens,B. megaterium,B. subtilis,B. polymyxa,B. lentus,B. pumilusdifférente de celle de l’invention,B. velezensis,B. mojavensis,B. sphaericus,B. smithii,B. laterosporus,B. coagulans,B. alevi,B.cereus,B. badius,B. thuringiensis,B. pasteurii,B. laevolacticus, B. circulans,L. plantarum,L. reuteri,L. rhamnosus,L. casei, P. acidilactici,P. pentosaceus,E. faecium.
Selon un mode de réalisation particulier, une telle souche est sous une forme libre ou encapsulée pour être plus résistante, notamment pour les bactéries lactiques du genreLactobacillus,Pediococcuset/ouEnterococcus.
De manière préférée, la composition selon l’invention comprend en outre au moins un composé compatible avec les autres composants de la composition, avantageusement au moins avec la souche selon l’invention. Un tel composé peut être sélectionné dans la liste suivante : un tensioactif (ou surfactant), un conservateur, un parfum, un séquestrant, un texturant, une cire, un gélifiant, un abrasif, un colorant, un correcteur d’acidité, une base, un polymère, une résine, un agent anti-mousse, un solvant, de l‘eau, un agent de stabilisation, un épaississant et une enzyme, par exemple une lipase ou une protéase.
En relation avec la préparation de compositions détergentes, la composition selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs tensioactifs choisis parmi:
- un tensioactif d’origine microbienne, par exemple un biosurfactant préférentiellement de type rhamnolipide, surfactine, sophorolipide, un lipide de mannosylérythritol, un lipide de tréhalose ou tout autre tensioactif d’origine microbiologique obtenu par un procédé biotechnologique ;
- un tensioactif d’origine végétale ou pétrochimique comme un alkylpolyglycoside, un alcool gras éthoxylé, un ester d’acide gras et de glycérol, un laurylsulfate de sodium, un sulfonate d’alkylbenzene linéaire, un acide carboxylique, ou un savon, préférentiellement mais pas obligatoirement choisi en fonction de sa faible toxicité pour l’homme et de son faible impact sur l’environnement ; ou
- leurs mélanges.
- un tensioactif d’origine microbienne, par exemple un biosurfactant préférentiellement de type rhamnolipide, surfactine, sophorolipide, un lipide de mannosylérythritol, un lipide de tréhalose ou tout autre tensioactif d’origine microbiologique obtenu par un procédé biotechnologique ;
- un tensioactif d’origine végétale ou pétrochimique comme un alkylpolyglycoside, un alcool gras éthoxylé, un ester d’acide gras et de glycérol, un laurylsulfate de sodium, un sulfonate d’alkylbenzene linéaire, un acide carboxylique, ou un savon, préférentiellement mais pas obligatoirement choisi en fonction de sa faible toxicité pour l’homme et de son faible impact sur l’environnement ; ou
- leurs mélanges.
Les tensioactifs utilisés dans le cadre de l’invention peuvent être des tensioactifs de type anionique, cationique, amphotère ou non ionique.
Selon un mode de réalisation particulier, le conservateur présent dans une composition selon l’invention, permettant de stabiliser la composition sans endommager les bactéries probiotiques, peut être du benzoate de sodium, du sorbate de potassium, des molécules de type isothiazolinone, du propylène glycol, du phénoxyéthanol ou leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation particulier, le séquestrant mis en œuvre dans une composition selon l’invention est l’EDTA, le citrate de sodium ou leur mélange.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’abrasif mis en œuvre dans une composition selon l’invention est du carbonate de calcium, du carbonate de magnésium ou leur mélange.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le correcteur d’acidité mis en œuvre dans une composition selon l’invention est l’acide lactique, l’acide malique, l’acide citrique, l’hydroxyde de sodium ou leurs mélanges.
Selon un autre mode de réalisation particulier, un épaississant comme le xanthane ou l’alcool polyvinylique ou tout autre agent de stabilisation qui empêche la redéposition de la souche bactérienne peut être ajouté à une composition selon l’invention.
La composition selon l’invention peut se présenter sous toutes les formes normalement utilisées pour une application sur une surface inerte, par exemple sous forme concentrée ou diluée, liquide ou poudre. Ainsi, la composition selon l’invention peut se présenter sous la forme de solution, bain de trempage, vapeur, spray pour pulvérisation, projection, chiffon ou tampon ou lingette imprégné…
Avantageusement, la composition selon l’invention se présente sous la forme d’une solution aqueuse, avantageusement une solution prête à l’emploi ou une solution concentrée à diluer. Une solution aqueuse se définit comme une solution dans laquelle l’eau constitue le solvant majoritaire. Une telle composition peut également contenir une quantité moindre d’un autre solvant que l’eau, capable de s’évaporer après application de la composition sur la surface à nettoyer favorisant ainsi son séchage, avantageusement un solvant végétal comme par exemple l’isopropanol ou l’éthanol.
Des exemples de formulation d’une composition selon l’invention sont présentés dans les tableaux 6 et 7 ci-dessous. Comme démontré dans les exemples, de telles compositions assurent la tenue dans le temps (au moins 1 an) d’une souche selon l’invention (exemple 2.2), tout en préservant sa capacité à adhérer sur une surface inerte pendant plusieurs jours (exemple 2.3) et à protéger une telle surface de la contamination par des pathogènes (exemple 2.4).
Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation de la souche deB. pumilusselon l’invention ou de la composition selon l’invention pour contrôler, inhiber et/ou prévenir la prolifération, sur une surface inerte, de bactéries pathogènes appartenant notamment aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeouListeriaceae, avantageusement de bactéries pathogènes appartenant aux genresStaphylococcuset/ouEscherichiaet/ouListeria,de préférence des bactéries pathogènes appartenant aux espècesStaphylococcus warneriet/ouStaphylococcus epidermiset/ouStaphylococcus hominiset/ouStaphylococcus aureuset/ouEscherichia coliet/ouListeria monocytogenes.
Avantageusement, l’invention concerne l’utilisation de la souche deB. pumilusselon l’invention ou de la composition de l’invention pour contrôler, inhiber et/ou prévenir la prolifération, sur une surface inerte, d’au moins des bactéries pathogènes appartenant aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae, avantageusement appartenant au genreStaphylococcus,Escherichia et Listeria, de préférenceStaphylococcus warneri,Staphylococcus epidermis,Staphylococcus hominis,Staphylococcus aureus,Escherichiacoli, etListeria monocytogenes.
Selon un mode de réalisation particulier, la surface inerte est une surface de collectivité, par exemple hôpitaux, crèches ou encore établissements d'hébergement pour personnes âgées, ou une surface d’un établissement public ou privé, par exemple supermarché ou encore entreprise.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé pour nettoyer et/ou protéger de la contamination une surface, avantageusement une surface inerte, notamment vis-à-vis des bactéries pathogènes appartenant aux famillesStaphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae. En pratique, un tel procédé comprend l’application sur la surface de la souche deB. pumilusselon l’invention ou de la composition selon l’invention, avantageusement à hauteur de 105à 107UFC/m2de surface.
Selon l’invention, la souche deB. pumilusou la composition peut être appliquée selon les procédures habituelles d’assainissement des surfaces inertes en complément ou en remplacement de procédures de désinfection connues de l’homme du métier. Selon un mode de réalisation particulier, cette application est réalisée à l’aide de lingettes non tissées ou de microfibres.
Comme démontré dans les exemples, le procédé selon l’invention, et donc l’utilisation de la souche deB. pumilusou de la composition selon l’invention, permet de protéger des surfaces inertes de la contamination par des bactéries pathogènes, avec un effet durable jusqu’à au moins 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours voire au moins 5 jours.
La manière dont l’invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif, à l’appui de la figure annexée.
Description des figures
Exemples de réalisation
Exemple 1 : Souche probiotique selon l’invention
1. Souche
La présente étude a été réalisée à l’aide d’une souche isolée à partir de sédiments marins et déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro I-5531 en date du 01 juillet 2020.
2. Séquençage
Un séquençage partiel de marqueurs phylogéniques, à savoir de l’ADN ribosomique 16S (SEQ ID NO : 1), et des gènesgyrB(SQ ID NO : 2) etgroEL(SEQ ID NO : 3), a permis de déterminer que la souche I-5531 appartient à l’espèceBacillus pumilus.
3. Sensibilité aux antibiotiques
3.1. But de l’étude
L’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA) via le groupe scientifique sur les additifs utilisés en alimentation animale (groupe FEEDAP) a défini pour les souches bactériennes de typeBacillus, les concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour certaines substances antibiotiques, aussi nommées antimicrobiens, telles que : ampicilline, vancomycine, gentamicine, kanamycine, streptomycine, érythromycine, clindamycine, tétracycline et chloramphénicol (Guide pour l'évaluation de la sensibilité bactérienne aux antimicrobiens, EFSA Journal 2012; 10(6): 2740). La CMI correspond à la plus petite concentration en antibiotique capable d’inhiber la croissance bactérienne. Pour chaque couple souche bactérienne/antibiotique il existe un seuil à partir duquel la bactérie est dite résistante (voir tableau 1).
Ces antimicrobiens correspondent à une gamme pertinente d'antimicrobiens d'importance humaine et vétérinaire. Pour être utilisé comme probiotique de surface, il est donc conseillé de se conformer aux exigences de l’EFSA en termes de résistance aux antibiotiques. Sachant que certaines souches deBacillus pumilusne répondent pas aux exigences de l’EFSA, comme par exemple la soucheBacillus pumilusDSM361 présentant un CMI de 16 mg/L vis-à-vis du chloramphénicol, la sensibilité d’une souche probiotique selon l’invention, à savoir la souche CNCM I-5531, vis-à-vis des antibiotiques définis par le groupe FEEDAP a donc été testée.
3.2. Conditions de culture
Pour les tests de sensibilité aux antibiotiques, la souche I-5531 est, dans un premier temps, cultivée en liquide sur milieu Mueller-Hinton II (MHII) pendant 18 heures. La culture obtenue est alors diluée au 1/100èmeou au 1/20èmeet incubée à 37°C sous agitation pendant au moins 3 heures. Lorsque la densité optique (DO) de la culture mesurée à 600 nm atteint 0,5-0,7, une suspension bactérienne à 1.106UFC/ml est réalisée et 100 μl de cette suspension sont déposés dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 100 μl d’un gradient de concentration en antibiotique (0,25-64 mg/L). La concentration finale en bactéries par puits est de 5.105UFC/ml. Le gradient de concentration est obtenu en réalisant des dilutions successives (au 1/2). La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 18 à 24 heures.
Après incubation, 50 μl d’une solution d’iodonitrotetrazolium chloride (INT) à 0,2 mg/ml sont déposés dans chaque puits. La lecture est réalisée après 30 minutes d’incubation à température ambiante. L’INT est réduit par les déshydrogénases bactériennes, donnant une coloration rouge dans les puits contenant les bactéries vivantes. L’absorbance de chaque puit est alors mesurée en utilisant un lecteur microplaque INFINITE PRO 200 (TECAN). Un seuil d’absorbance est calculé qui permet de déterminer la valeur de DO à partir de laquelle il y a une croissance bactérienne.
3.3. Résultats
Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Ces données montrent que la souche I-5531 répond aux exigences de l’EFSA (valeurs FEEDAP) en termes de sensibilité aux antibiotiques.
4. Croissance en présence d’une forte concentration en NaCl
Il a été constaté que la souche I-5531 est capable de croître dans des conditions anaérobies et aérobies, sur des milieux riches classiques contenant des peptones et hydrolysats de protéines animales ou végétales, des extraits de levure ou sur des milieux spécifiques pour la culture de souches de typeBacillus.
Le présent essai a pour but de montrer le comportement de cette souche en milieu salin. Il compare la croissance de la souche I-5531 et de la souche DSM27T(souche type deBacillus p umilus) sur le milieu Difco Sporulation Medium modifié (DSM + 5 g/L glucose) en présence de NaCl 100 g/L (10%). La mesure de la DO à 600 nm (DO600) permet de quantifier la croissance des microorganismes après 24 h de culture.
Les résultats de l’essai sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
Il ressort de ces résultats que, sur le milieu DSM modifié, en présence de 10% de NaCl, la croissance de la souche I-5531 en 24 h est identique à celle sur milieu sans NaCl. Pour la souche DSM27T, la croissance est fortement ralentie en présence de 10% de NaCl et atteint au bout de 24 h une densité optique environ 3 fois moins importante que sur le milieu sans NaCl.
5. Capacité d’adhésion sur surfaces inertes
Tous les tests sont réalisés en conditions stériles sur des surfaces 5 x 5 cm stérilisées par autoclavage (15 min à 121°C) et placées dans des boîtes de Pétri stériles de 90 mm. La souche I-5531 est comparée à la souche type deBacillus pumilusDSM27T.
Les suspensions bactériennes probiotiques sporulées sont préparées à partir d’une culture de 4 jours à 30°C sous agitation dans un milieu favorisant la sporulation (DSM).
5 mL de suspension bactérienne à une concentration donnée (1.104bactéries probiotiques/mL) sont déposés sur la surface PVC ou faïence. Celles-ci sont mises à incuber 30 min pour laisser le temps aux bactéries de sédimenter et d’adhérer aux surfaces. Le surplus de la solution bactérienne est ensuite retiré pour obtenir une surface complètement sèche.
La surface est ensuite mise à incuber 24 h à température ambiante, sous poste de sécurité microbiologique.
Des boîtes contact (milieu TSA) sont ensuite appliquées après 24 h sur les surfaces à tester. Elles sont maintenues en place pendant 10 secondes avec une pression constante.
L’adhérence de chaque souche sur les différentes plaques est évaluée après comptage des colonies présentes sur les boîtes contact. Les résultats obtenus sont regroupés sur le tableau 3 ci-dessous.
Les résultats montrent que la souche I-5531 est capable d’adhérer aussi bien sur les plaques de PVC que de faïence. En outre, il révèle que la souche de l’invention adhère plus efficacement sur ces deux types de surface que la souche de référence DSM27T(2 à 12 fois plus de bactéries adhérées sur la surface).
6. Efficacité d’antagonisme
6
.1
. Test d’antagonisme sur milieu solide
gélosé
L’efficacité d’antagonisme de la souche I-5531 vis-à-vis de plusieurs pathogènes de surface cibles (Eschericha coli,Listeria monocytogenes,Staphylococcus aureus,Staphylococcus warneri,Staphylococcus epidermisetStaphylococcus hominis) a été évalué sur surface gélosée et comparée à celle des souches type deBacillus pumilusDSM27Tet DSM361.
Une culture de nuit de la souche pathogène est diluée dans du milieu Trypto-Caséine Soja Bouillon (TSB) et déposée sur boîte de Pétri 90 mm contenant un milieu Trypto-Caséine Soja Agar (TSA) de sorte à obtenir des tapis cellulaires par boîte de 105UFC deE . coli(W3110 ou DSM1058), 5.105 UFC deListeria monocytogenes(CIP 82.110), 106UFC deS. aureus(SA 1199),S. warneri(ATCC 27836),S. epidermis(ATCC 12228) ou encoreS. hominis(ATCC 700236).
Les géloses sont ensuite mises à sécher sous hotte à température ambiante pendant 1 h.
Des disques en papier sont alors placés stérilement sur la gélose. 15 µl d’une culture de nuit de la souche probiotique (I-5531, DSM27Tou DSM361) sont ensuite déposés sur les disques. La concentration bactérienne des cultures est ajustée par dilution dans un milieu TSB pour que chaque dépôt contienne exactement la même quantité de bactéries : 107de microorganismes probiotiques par disque de papier (I-5531, DSM27Tou DSM361).
Après 24 h d’incubation à la température optimale de culture du pathogène (30°C pourStaphylococcus; 37°C pourE.coli ; 30°C pourListeria monocytogenes), la présence d’un halo d’antagonisme de croissance d’au moins 2 mm autour des souches probiotiques (I-5531, DSM 27Tet DSM361) atteste de l’effet antagoniste de surface sur les pathogènes testés.
A titre d’exemple, les résultats obtenus pour les souches DSM27T, DSM361 et I-5531 vis-à-vis de la souche S. warneri (ATCC 27836) sont présentés à la . La zone d’antagonisme observée autour de la souche I-5531 démontre que les bactéries pathogènes ne peuvent pas se développer autour des colonies de cette souche. Les résultats confirment également la capacité de la souche I-5531 à envahir une surface gélosée autour d’un disque de papier préalablement inoculé, de manière bien supérieure à ce qui est observé avec les souches DSM27T et DSM361.
Le tableau 4 ci-dessous récapitule les mesures de halos d’antagonisme de croissance de différents pathogènes observés autour des souches probiotiques sur des surfaces gélosées.
Les résultats montrent que la souche I-5531 est capable d'inhiber très efficacement, sur une surface gélosée, la croissance à la fois deS. aureus,S. warneri,S. epidermis,S. hominis,E. colietListeria monocytogenes. Ces résultats d’efficacité ne sont pas retrouvés pour les deux autres souches deB . pumilusDSM27Tet DSM361 qui présentent un spectre d’antagonisme et/ou une efficacité d’antagonisme bien inférieurs.
6
.2. Essais de compétition en co-culture sur milieu liquide
L’efficacité d’antagonisme de la souche I-5531 a été évaluée vis-à-vis de la souche pathogèneS . warneri(ATCC 27836) à l’aide de tests de co-culture en milieu liquide.
Les précultures de nuit sur milieu Luria-Bertani (LB) des souchesB . pumilusI-5531 etS . warnerisont utilisées pour ensemencer des essais de culture pure ou de co-culture sur le même milieu (dilution respectivement au 1/1000èmeet au 1/100ème). Le dénombrement réalisé au démarrage des essais montre que les fioles LB de 20 ml contiennent 1,6.104UFC/ml de la souche probiotique et 2,6.105UFC/ml de la soucheS . warneri.
Après croissance pendant 24 h à 30°C sous agitation, le dénombrement des fioles essais et témoins est réalisé sur LB-agar. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau 5 ci-dessous.
Les résultats montrent qu’après 24 h d’incubation à 30°C sous agitation de la co-culture, la soucheS. warnerin’a pas démarré sa croissance lorsqu’elle est en présence de la souche I-5531 (<1.105UFC /ml au lieu de 1,9.109UFC /ml en l’absence de la souche I-5531). La présence de la soucheB. pumilusselon l’invention empêche donc la souche pathogèneS. warneride se développer sur milieu riche à sa température optimale de croissance.
Exemple 2 : Formulation nettoyante selon l’invention
1. Exemples de formulation
L’invention concerne également l’utilisation de la souche I-5531 telle que décrite dans l’exemple 1 dans une formulation nettoyante, assainissante et/ou détergente pour protéger les surfaces du développement de bactéries pathogènes. Deux exemples de formulations nettoyantes prêtes à l’emploi sont présentés dans les tableaux 6 et 7 ci-dessous.
2. Tenue de la souche dans une formulation détergente
Pour garantir la présence des bactéries sur le long terme et donc leur tenue dans une formulation détergente selon l’invention, un dénombrement dans une telle formulation (selon le Tableau 6) prête à l’emploi (PAE) stockée à 20°C est réalisé après 1 an de conservation.
Les résultats de stabilité dans le temps sont présentés dans le tableau 8 ci-dessous et confirment la tenue de la souche I-5531 dans la formulation détergente.
3. Adhésion et survie du
probiotique
sur les surfaces PVC et faïence après nettoyage avec des formulations nettoyantes de l’invention à l’aide d’une microfibre.
Tous les tests sont réalisés en conditions stériles sous poste de sécurité microbiologique. Les microfibres utilisées sont stérilisées par autoclavage à 121°C pendant 15 min.
Deux formulations de nettoyage sont utilisées pour ces essais : une formulation nettoyante prête à l’emploi (PAE ; voir Tableau 6) contenant 1.107bactéries probiotiques/mL et une formulation nettoyante équivalente concentrée contenant 1.108bactéries probiotiques/mL et diluée à 1 % pour ce test (soit 1.106bactéries probiotiques/mL).
Les essais sont réalisés sur des surfaces 5 x 5 cm stérilisées par autoclavage (15 min à 121°C) et placées dans des boîtes de Pétri stériles de 90 mm.
Les surfaces (carreaux de faïence ou dalles PVC) sont nettoyées (5 passages successifs) à l’aide d’une microfibre imbibée d’une solution probiotique PAE ou d’une solution concentrée à diluer à 1% comprenant la souche I-5531.
Après 30 min de séchage, la surface est mise à incuber 24 h ou 5 jours à température ambiante sous poste de sécurité microbiologique.
Des boîtes contacts sont ensuite appliquées sur les surfaces et mises à incuber dans une étuve pendant 24 h à la température optimale de croissance du probiotique.
Le comptage bactérien obtenu sur les boîtes contact permet de mettre en évidence le niveau d’adhérence des bactéries aux surfaces.
Un neutralisant (à base de lécithine de soja) est systématiquement utilisé pour la préparation des boîtes contact afin de neutraliser l’action inhibitrice éventuelle des tensioactifs présents dans la formulation nettoyante.
Les résultats obtenus pour le comptage des boîtes contacts sur plaques de PVC et faïences sont regroupés dans le tableau 9 ci-dessous.
Ces résultats montrent que le nettoyage de plusieurs surfaces cibles (PVC ou faïence), à l’aide d’une microfibre, avec des compositions de l’invention, sous forme prête à l’emploi ou concentrée (diluée à 1 %), permet de déposer plus de 300 bactéries probiotiques pour 25 cm2de surface.
4. Capacité des formulations nettoyantes de l’invention à protéger les surfaces de la contamination par des pathogènes cibles
Les tests sont réalisés dans les mêmes conditions que précédemment (exemple 2.3).
Une formulation nettoyante prête à l’emploi (PAE) contenant 1.107bactéries probiotiques/mL (I-5531) est utilisée pour ces essais.
Les essais sont réalisés avec des souches pathogènes résistantes à certains antibiotiques pour pouvoir les distinguer, sur les surfaces, des bactéries probiotiques non résistantes (I-5531). La soucheStaphylococcus aureusutilisée (SA 1199) est résistante à 34 mg/L de streptomycine et la soucheEscherichia coliutilisée (W3110) est résistante à 68 mg/L de vancomycine.
Les suspensions bactériennes des souches pathogènes sont préparées à partir de cellules obtenues d’une culture de nuit diluée dans un milieu TSB.
30 min, 24 h ou 5 jours après avoir nettoyé les surfaces avec la formulation nettoyante de l’invention, 5 mL de suspension bactérienne pathogène à une concentration donnée (105à 108bactéries pathogènes/mL selon la surface à tester) sont déposés sur la surface PVC ou faïence.
Ces surfaces sont mises à incuber 30 min supplémentaires pour laisser le temps aux bactéries de sédimenter et d’adhérer aux surfaces. Le surplus de la solution pathogène est retiré à l’aide d’une micropipette pour obtenir une surface complètement sèche.
Des boîtes contact sont ensuite appliquées après 24 h sur les surfaces et sont mises à incuber dans une étuve pendant 24 h à la température optimale de croissance de la bactérie pathogène.
Le comptage bactérien obtenu sur les boîtes contact met en évidence le niveau de contamination bactérienne sur les surfaces.
Un neutralisant (à base de lécithine de soja) est systématiquement utilisé pour la préparation des boîtes contact afin de neutraliser une éventuelle action inhibitrice des tensioactifs présents dans la formulation nettoyante.
Selon le pathogène testé, un antibiotique (streptomycine ou vancomycine) est ajouté dans les boîtes contact.
Pour valider les résultats obtenus, trois essais « témoin » sont réalisés :
- Témoin 1 : suspension bactérienne pathogène sur la surface sans application de la formulation nettoyante ;
- Témoin 2 : nettoyage de la surface avec la formulation nettoyante sans application de la suspension bactérienne pathogène ; et
- Témoin 3 : application sur la surface de bactéries probiotiques (I-5531) remises en suspension dans de l’eau sans formulation détergente, puis ajout d’une suspension bactérienne pathogène.
- Témoin 1 : suspension bactérienne pathogène sur la surface sans application de la formulation nettoyante ;
- Témoin 2 : nettoyage de la surface avec la formulation nettoyante sans application de la suspension bactérienne pathogène ; et
- Témoin 3 : application sur la surface de bactéries probiotiques (I-5531) remises en suspension dans de l’eau sans formulation détergente, puis ajout d’une suspension bactérienne pathogène.
4.1. Essai sur plaques de PVC
Les résultats obtenus pour le comptage des boîtes contacts sur plaques de PVC en présence deStaphylococcus aureusSA 1199 sont présentés dans le tableau 10 ci-dessous. A noter que pour cette expérience, la quantité de pathogènes (S. aureusSA 1199) déposée sur la surface (5X5cm) est de 5.105UFC.
Ces résultats montrent que l’application de la formulation nettoyante selon l’invention permet de protéger la surface des plaques de PVC de la contamination parStaphylococcus aureusSA 1199.
Les résultats obtenus pour le comptage des boîtes contacts sur plaques de PVC en présence deEscherichia coliW3110 sont présentés dans le tableau 11 ci-dessous. A noter que pour cette expérience, la quantité de pathogènes (E. coliW3110) déposée sur la surface (5X5cm) est de 2,5.106UFC.
Ces résultats montrent que l’application d’une formulation nettoyante selon l’invention permet de protéger la surface des plaques de PVC de la contamination parEscherichia coliW3110.
4.
2. Essai sur plaques de faïence
Les résultats obtenus pour le comptage des boîtes contacts sur plaques de faïence en présence deStaphylococcus aureusSA 1199 sont présentés dans le tableau 12 ci-dessous. A noter que pour cette expérience, la quantité de pathogènes (S. aureusSA 1199) déposée sur la surface (5X5cm) est de 5.108UFC.
Ces résultats montrent que l’application d’une formulation nettoyante selon l’invention permet de protéger la surface des plaques de faïence de la contamination parStaphylococcus aureusSA 1199.
Les résultats obtenus pour le comptage des boîtes contacts sur plaques de faïence en présence deEscherichia coliW3110 sont présentés dans le tableau 13 ci-dessous. A noter que pour cette expérience, la quantité de pathogènes (E. coliW3110) déposée sur la surface (5X5cm) est de 4.108UFC.
Ces résultats montrent que l’application d’une formulation nettoyante selon l’invention permet de protéger la surface des plaques de faïence de la contamination parEscherichia coliW3110.
En conclusion, l’application d’une composition nettoyante selon l’invention (formulation détergente ou solution aqueuse) comprenant la souche probiotique deBacillus pumilusI-5531 permet de protéger les 2 types de surface (PVC et faïence) de la contamination par 2 types de pathogènes (S. aureusetE. coli).
Claims (10)
- Souche deBacillus pumilusprésentant une activité antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes appartenant au moins aux trois familles suivantes :Staphylococcaceae,EnterobacteriaceaeetListeriaceae, avantageusement appartenant au moins aux trois genres suivants :Staphylococcus,EscherichiaetListeria.
- Souche deB. pumilusselon la revendication 1, caractérisée en ce qu’il s’agit de la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 01 juillet 2020, sous le numéro I-5531, ou une souche dérivée de celle-ci présentant ladite activité antagoniste.
- Utilisation de la souche deB. pumilusselon la revendication 1 ou 2 dans une composition nettoyante, assainissante et/ou détergente.
- Composition comprenant la souche deB. pumilusselon la revendication 1 ou 2.
- Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la souche représente de 106à 108UFC/mL de la composition.
- Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce qu’elle ne comprend aucun autre microorganisme, en particulier aucun autre probiotique.
- Composition selon l’une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que la souche se présente sous forme de spores et/ou de cellules végétatives et/ou de cellules qui sont en phase transitoire de sporulation, avantageusement sous forme de spores.
- Composition selon l’une des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un composé sélectionné dans le groupe constitué de : un tensioactif, un conservateur, un parfum, un séquestrant, un texturant, une cire, un gélifiant, un abrasif, un colorant, un correcteur d’acidité, une base, un polymère, une résine, un agent anti-mousse, un solvant, de l‘eau, un agent de stabilisation, un épaississant et une enzyme.
- Composition selon l’une des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu’elle se présente sous la forme d’une solution aqueuse, avantageusement une solution prête à l’emploi ou une solution concentrée à diluer.
- Procédé pour nettoyer et/ou protéger de la contamination une surface comprenant l’application de la souche deB. pumilusselon la revendication 1 ou 2 ou de la composition selon l’une des revendication 4 à 9, avantageusement par application de 105à 107UFC/m2de surface.
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