BE1023966B1

BE1023966B1 - Utilisation d’adjuvants pour la prévention et/ou le traitement des maladies auto-immunes

Info

Publication number: BE1023966B1
Application number: BE2016/5935A
Authority: BE
Inventors: Sandra Morel; Charlotte Véronique Pouchy; Benoit Laurent Salomon; Nathalie Raoul Liliane Vanerheyde
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa; Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6); Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2017-09-26
Also published as: CA3008333A1; US20200261569A1; BR112018012126A2; JP2022058449A; EP3389709A1; BE1023966A1; JP7060507B2; JP2019504020A; GB201522329D0; WO2017102939A1; US11311618B2; CN109069619A; MX2018007408A

Abstract

L'invention fournit un adjuvant pour utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une maladie auto-immune.

Description

UTILISATION D'ADJUVANTS POUR LA PRÉVENTION ET/OU LE TRAITEMENT DES MALADIES AUTO-IMMUNES

Domaine technique

La présente invention concerne des adjuvants, en particulier l'utilisation d'adjuvants dans la prévention et/ou le traitement des maladies auto-immunes.

Arrière plan technique de l'invention

Dans de nombreux vaccins, les antigènes sont sous la forme de protéines purifiées ou sous-unitaires pour améliorer leur innocuité, mais cela se fait au détriment de l'immunogénicité qui diminue. Par conséquent, des réponses immunitaires adaptatives efficaces requièrent l'ajout d'adjuvants pour déclencher une inflammation précoce et activer les cellules présentatrices d'antigène. L'aluminium (alun) est largement utilisé comme adjuvant pour favoriser les réponses de type anticorps en induisant une réponse Th2. Les adjuvants MF59 à base de squalène et le système adjuvant (AS) 03 favorisent à la fois les réponses Thl et Th2 grâce à leur capacité à induire la libération des chimiokines et des cytokines, aboutissant au recrutement massif et à l'activation des cellules immunitaires. En ce qui concerne les adjuvants AS04 et AS01 à base de ligands des récepteurs de type Toll, ils induisent des réponses Thl et Th2 en activant directement les cellules de l'immunité innée.

Au-delà des effets sur les réponses effectrices, certaines études ont révélé des observations intrigantes et paradoxales de l'impact immunomodulateur de certains adjuvants sur les maladies auto-immunes. L'administration de l'adjuvant complet de Freund (CFA), utilisé seulement dans les vaccins vétérinaires, a induit une protection et la rémission d'un diabète de type 1 chez des souris diabétiques non obèses (Sadelain et al. (1990) Diabetes 39 : 583) . En outre, l'administration de lipopolysaccharides (LPS), un ligand naturel du TLR4 utilisé dans les essais de recherche pour les vaccins vétérinaires, a induit une protection contre une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle murin de sclérose en plaques (Buenafe et al. (2007) J. Neuroimmunol. 182 : 32) . Bien que ces observations soient intéressantes, le CFA et le LPS ne sont pas appropriés pour une utilisation chez les humains à cause de leur toxicité.

Les maladies auto-immunes sont provoquées par une réponse immunitaire dirigée contre des constituants des propres tissus du corps. Plus de 80 maladies auto-immunes sont connues. Des exemples de maladies auto-immunes comprennent, par exemple, la polyarthrite rhumatoïde (RA), le lupus érythémateux disséminé (lupus), l'affection abdominale inflammatoire (IBD), la sclérose en plaques (MS), le diabète sucré de type 1, le syndrome de Guillain-Barré, la maladie de Crohn et le psoriasis. Ces maladies sont pour la plupart chroniques et peuvent provoquer une morbidité et invalidité importantes. Le traitement des maladies auto-immunes est généralement basé sur une immuno-suppression. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans le traitement des maladies auto-immunes, il existe encore un besoin pour des produits et procédés améliorés, qui augmentent l'efficacité, réduisent les effets secondaires, sont faciles à administrer et sûrs, et qui peuvent être utilisés sur une longue durée ou même pour le traitement chronique de ces maladies. Résumé de 11 invention

Il a désormais été découvert de manière inattendue que AS01 et AS03, deux adjuvants ne contenant pas d'alun appropriés pour et autorisés pour une utilisation chez les humains, peuvent induire une prévention pratiquement totale d'une maladie auto-immune chez un modèle animal, ce qui justifie leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies auto-immunes chez les humains.

Par conséquent, dans un premier aspect, l'invention concerne un adjuvant pour l'utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie auto-immune, dans lequel l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.

Dans un aspect supplémentaire, il est proposé un procédé de prévention et/ou de traitement d'une maladie auto-immune, comprenant l'administration d'un adjuvant à un sujet, dans lequel l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.

Encore dans un autre aspect, l'invention se rapporte à l'utilisation d'un adjuvant dans la préparation d'un médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie auto-immune, dans laquelle l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.

Brève description des figures

Figure 1 : a, image représentative de ganglions lymphatiques poplités de drainage (DLN) 4 jours après l'injection sous-cutanée (pattes) d'adjuvants de vaccin, b, analyse classique par cytométrie en flux de cellules Treg. c, augmentation du pourcentage des cellules Foxp3+ parmi les lymphocytes CD4+, par rapport à des souris ayant reçu du PBS par injection, dans les pLN 4 jours et 7 jours après l'injection sous-cutanée d'adjuvants de vaccin. Données cumulées provenant de 3 expériences indépendantes, d, des cellules CD4+Foxp3-CD90.1+ ont été transférées de manière adoptive avant l'injection de l'adjuvant et l'induction de Foxp3 sur les cellules donatrices a été évaluée au jour 4 en tant que marqueur de lymphocytes pTreg. Il est présenté un exemple d'analyse d'induction de Treg après traitement par AS01. e,f, activité suppressive ex vivo de lymphocytes Treg purifié à partir de dLN de souris traitées par AS01 4 jours plus tôt. Données représentatives à un rapport de lymphocytes Treg/Tconv de 1 à 2 (e) et moyennes ± ETM à différents rapports de lymphocytes Treg/Tconv provenant de 4 expériences indépendantes (fj. Lymphocyte « Treg » signifie lymphocyte T régulateur et lymphocyte « Tconv » signifie lymphocyte T conventionnel.

Figure 2 : a, nombre absolu de lymphocytes CD45+ dans les dLN 4 jours après l'injection sous-cutanée d'adjuvants de vaccin. Données cumulées provenant de 3 expériences indépendantes, b, expression représentative de CD44, ICOS et KI-67 par des lymphocytes Treg provenant de dLN 4 jours après l'injection sous-cutanée d'ASOl. c, activité suppressive in vitro de lymphocytes Treg purifiés à partir de dLN 3 jours après l'injection sous-cutanée d'adjuvants de vaccin. d, expression représentative de Foxp3 par des lymphocytes Treg provenant de dLN 3 jours après l'injection sous-cutanée d'ASOl. e, activité suppressive in vitro de lymphocytes Treg purifiés à partir de dLN 7 jours après l'injection sous-cutanée d'ASOl. Lymphocyte « Treg » signifie lymphocyte T régulateur.

Figure 3. a, score clinique d'une EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) chez des souris immunisées pour induire une EAE au jour 0 et traitées avec des adjuvants aux jours -3 et 0. Données cumulées provenant de 3 expériences indépendantes, b, prolifération représentative (provenant de 2 expériences indépendantes) de lymphocytes T spécifiques de 2D2 MOG35-55 3 jours après transfert dans les souris immunisées pour induire une EAE (jour 0) et traitées avec des adjuvants (jour -3). c, production d'INF-γ et d'IL-17 par des lymphocytes T sensibles à MOG provenant de dLN de souris immunisées 10 jours plus tôt pour induire une EAE (jour 0) et traitées par AS01 ou AS03 (jour -3). d, score clinique de l'EAE chez des souris immunisées pour induire une EAE au jour 0 et transférées le jour d'avant avec des lymphocytes Treg purifiés provenant de souris traitées avec du PBS, AS01 ou AS03. e,f, pourcentage de lymphocytes Treg (e) et d'intégrines aL+ et oM+ parmi les lymphocytes Treg et Tconv (f) dans des dLN au jour 10 chez des souris immunisées pour induire une EAE au jour 0 et traitées par AS03 au jour -3. Lymphocyte « Treg » signifie lymphocyte T régulateur et lymphocyte « Tconv » signifie lymphocyte T conventionnel.

Figure 4 : a, b, score clinique d'une EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) chez des souris immunisées pour induire une EAE au jour 0 et traitées avec AS01 ou AS03 au jour -3 (a) et au jour 0 (b) . Données cumulées provenant de 3 expériences indépendantes, c, d, proportions de cellules CCR6+ et de cellules CXCR3+ (c) et de cellules à intégrine a4+ et de cellules à intégrine aL+ (d) parmi les lymphocytes Treg et les lymphocytes Tconv dans des dLN au jour 10 chez des souris immunisées pour induire une EAE au jour 0 et traitées par AS03 aux jours 0 et -3. Lymphocyte « Treg » signifie lymphocyte T régulateur et lymphocyte « Tconv » signifie lymphocyte T conventionnel.

Description détaillée

Comme décrit ci-dessus, dans un premier aspect, l'invention concerne un adjuvant destiné à être utilisé dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie auto-immune, dans lequel l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.

Typiquement, l'objectif de l'utilisation de l'invention, ou du procédé de l'invention, est de prévenir une maladie auto-immune, y compris l'apparition retardée de la maladie, et/ou de traiter une telle maladie, c'est-à-dire de réduire la gravité d'une telle maladie, par exemple en réduisant la cause de la maladie auto-immune et/ou en réduisant ses symptômes. Dans un mode de réalisation, une réduction des symptômes de plus de 50 %, comme plus de 75 %, déterminée selon les exemples présentés dans le présent document, est obtenue. Adjuvants pour une utilisation dans 1'invention

Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant comprend une saponine immunologiquement active, par exemple QS21. Des adjuvants comprenant des saponines ont été décrits dans l'art. Des saponines sont décrites, par exemple, dans Lacaille-Dubois and Wagner (1996) (A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine Vol. 2 : 363). Les saponines sont connues comme adjuvants dans les vaccins. Par exemple, le Quil A (dérivé de l'écorce de l'arbre Quillaja Saponaria Molina d'Amérique du Sud) a été décrit par Dalsgaard et ai. (1974) dans « Saponin adjuvants » (Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, 243) pour avoir une activité adjuvante. Il a été isolé par CLHP des fractions purifiées du Quil A qui conservent l'activité adjuvante sans la toxicité associée au Quil A (Kensil et al. (1991) J. Immuno 1. 146 : 431) . Des fractions du Quil A sont également décrites dans le document US 5 057 540 et dans « Saponins as vaccine adjuvants » (Kensil, C.R., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2) : 1-55).

Deux de ces fractions, appropriées pour une utilisation dans la présente invention, sont QS7 et QS21 (également connues sous le nom de QA-7 et QA-21) . Le QS21 est une fraction de saponine immunologiquement active préférée pour une utilisation dans la présente invention. Le QS21 a été passé en revue dans « Vaccine Adjuvants : préparation methods and research protocols » (Humana Press, Totowa, New Jersey, édité par Derek T. 0'Hagan, chapitre 15 : « QS21 Adjuvant »). Des systèmes adjuvants particulaires comprenant des fractions du Quil A, comme le QS21 et le QS7, sont décrits, par exemple, dans le document WO 96/33 739, WO 96/11 711 et WO 07/068 907.

En plus du composant saponine, l'adjuvant comprend de préférence un stérol. La présence d'un stérol peut réduire davantage la réactogénicité des compositions comprenant des saponines, voir par exemple le document EP 0 822 831. Des stérols appropriés comprennent le bêta-sitostérol, le stigmastérol, l'ergostérol, l'ergocalciférol et le cholestérol. Le cholestérol est particulièrement approprié. De manière appropriée, la fraction de saponine immunologiquement active est QS21 et le rapport QS21/stérol est de de 1/100 à 1/1 en poids/poids, comme 1/10 et 1/1 en poids/poids, par exemple de 1/5 à 1/1 en poids/poids.

Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant utilisé dans l'invention comprend un agoniste de TLR (récepteur de type Toll), comme un agoniste de TLR4, par exemple le 3D-MPL. L'utilisation d'agonistes de TLR dans les adjuvants est bien connue dans l'art et a été décrite en détail, par exemple, par Lahiri et al. (2008, Vaccine 2 6 : 6777) . Les TLR qui peuvent être stimulés pour obtenir un effet adjuvant comprennent TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 et TLR9. Les agonistes de TLR2, TLR4, TLR7 et TLR8, en particulier les agonistes de TLR4, sont préférés.

Des agonistes appropriés de TLR4 comprennent les lipopolysaccharides, comme le lipide A monophosphorylé (MPL) et le lipide A monophosphorylé 3-0-désacylé (3D-MPL) . Le document US 4 436 727 divulgue le MPL et sa préparation. Le document US 4 912 094 et le certificat de réexamen B1 4 912 094 divulguent le 3D-MPL et un procédé pour le préparer. Un autre agoniste de TLR4 est l'adjuvant lipide glucopyranosylé (GLA), une molécule synthétique de type lipide A (voir, par exemple, Fox et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol. 19 : 1633). Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'agoniste de TLR4 peut être un agoniste synthétique de TLR4, comme une molécule disaccharidique synthétique, similaire au MPL et au 3D-MPL en termes de structure, ou peut être une molécule monosaccharidique synthétique, comme les composés d'aminoalkyl glucosaminide phosphate (AGP) divulgués, par exemple, dans les documents WO 98/50 399, WO 01/34 617, WO 02/12 258, WO 03/065 806, WO 04/062 599, WO 06/016 997, WO 06/12 425, WO 03/066 065 et WO 01/90 129. De telles molécules ont également été décrites dans la littérature scientifique et de brevets comme des mimétiques de lipide A. Les mimétiques de lipide A partage de manière appropriée certaines activités fonctionnelles et/ou structurelles avec le lipide A, et dans un aspect sont reconnus par les récepteurs TLR4. Les AGP, tels que décrits dans le présent document, sont parfois appelés mimétiques de lipide A dans l'art. Dans un mode de réalisation préféré, l'agoniste de TLR4 est le 3D-MPL. Des agonistes de TLR4, comme le lipide A monophosphorylé 3-O-désacylé (3D-MPL), et leur utilisation comme adjuvant dans des vaccins ont été décrits, par exemple, dans les documents WO 96/33 739 et WO 07/068 907 et passés en revue dans Alving et al. (2012, Curr. Opin. in Immunol. 24 : 310).

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'adjuvant comprend à la fois une saponine immunologiquement active et un agoniste de TLR4, par exemple le QS21 et le 3D-MPL.

Dans un autre mode de réalisation préféré, l'adjuvant comprend une saponine immunologiquement active est un agoniste de TLR4, par exemple le QS21 et le 3D-MPL, dans une formulation liposomique.

Le terme « liposome », quand il est utilisé dans le présent document, fait référence à des structures lipidiques uni- ou multi-lamellaires renfermant une partie interne aqueuse. Les liposomes et les formulations de liposome sont bien connus dans l'art. Des présentations liposomiques sont décrites, par exemple, dans les documents WO 96/33 739 et WO 07/068 907. Les lipides qui sont capables de former des liposomes comprennent toutes les substances ayant des propriétés grasses ou de type graisse.

La taille des liposomes peut varier de 30 nm à plusieurs pm, en fonction de la composition en phospholipides et du procédé utilisé pour leur préparation. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la taille des liposomes sera située dans la plage allant de 50 nm à 500 nm, et dans d'autres modes de réalisation, dans la plage allant de 50 nm à 200 nm. La diffusion dynamique d'une lumière laser est un procédé utilisé pour mesurer la taille des liposomes bien connu de l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation particulièrement approprié, les liposomes utilisés dans l'invention comprennent de la DOPC et un stérol, en particulier du cholestérol. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, les adjuvants de l'invention comprennent du QS21 en une quantité quelconque décrite dans le présent document sous la forme d'un liposome, ledit liposome comprenant de la DOPC et un stérol, en particulier du cholestérol.

Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend entre 5 et 100, comme entre 10 et 75, par exemple 25 ou 50 pg de QS21 par dose et entre 5 et 100, comme entre 10 et 75, par exemple 25 ou 50 pg de 3D-MPL par dose.

Il est bien connu que pour une administration parentérale, les solutions doivent être physiologiquement isotoniques (c'est-à-dire avoir une osmolalité pharmaceutiquement acceptable) pour éviter la déformation ou la lyse des cellules. Un « agent isotonique » est un composé qui est physiologiquement toléré et qui confère une tonicité appropriée à une formulation (par exemple, les compositions immunogènes de l'invention) afin d'empêcher le flux net d'eau à travers les membranes cellulaires qui sont en contact avec la formulation. Des compositions adjuvantes aqueuses sont connues, lesquelles contiennent du chlorure de sodium à 100 mM ou plus, par exemple le système adjuvant A (AS) des documents WO 05/112 991 et WO 08/142 133 ou les adjuvants liposomiques divulgués dans le document WO 07/068 907.

Dans certains modes de réalisation, l'agent isotonique utilisé pour la composition est un sel. Dans d'autres modes de réalisation, cependant, la composition comprend un agent isotonique non ionique et la concentration en chlorure de sodium ou la force ionique dans la composition est inférieure à 100 mM, comme inférieure à 80 mM, par exemple inférieure à 30 mM, comme inférieure à 10 mM ou inférieure à 5 mM. Dans un mode de réalisation préféré, l'agent isotonique non ionique est un polyol, comme le sorbitol. La concentration en sorbitol peut être située, par exemple, entre environ 3 % et environ 15 % (en poids/volume) , comme entre environ 4 % et environ 10 % (en poids/volume) . Des adjuvants comprenant une fraction de saponine immunologiquement active et un agoniste de TLR4, dans laquelle l'agent isotonique est un sel ou un polyol, ont été décrits dans le document WO 10/142 685, voir par exemple les exemples 1 et 2 du document WO 10/142 685.

Dans un mode de réalisation, l'adjuvant utilisé dans l'invention comprend une émulsion huile-dans-eau. De manière appropriée, ladite émulsion comprend une huile métabolisable en une quantité de 0,5 % à 20 % par rapport au volume total. La signification du terme huile métabolisable est bien connue dans l'art. Métabolisable peut être défini par « étant capable d'être transformé par le métabolisme » (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25ème édition, (1974)). L'huile peut être n'importe quelle huile végétale, huile de poisson, huile animale ou huile synthétique, qui n'est pas toxique pour le receveur et qui est capable d'être transformée par le métabolisme. Les noix, les graines et les grains sont des sources classiques d'huiles végétales. Les huiles synthétiques font également partie de la présente invention et peuvent comprendre les huiles disponibles dans le commerce, telles que NEOBEE® et d'autres. Une huile métabolisable particulièrement appropriée est le squalène. Le squalène (2,6,10,15,19,23-hexaméthyl-2, 6, 10, 14, 18,22-tétracosahexaène) est une huile insaturée que l'on trouve en qrandes quantités dans l'huile de foie de requin, et en plus faibles quantités dans l'huile d'olive, l'huile de germes de blé, l'huile de son de riz, et la levure, et c'est une huile particulièrement appropriée pour une utilisation dans la présente invention. Le squalène est une huile métabolisable car c'est un intermédiaire dans la biosynthèse du cholestérol (Merck index, lOème Edition, entrée no. 8619).

Les émulsions huile-dans-eau en soi sont bien connues dans l'art, et il a été suggéré qu'elles pouvaient être utiles comme compositions adjuvantes (documents EP 399 843 ; WO 95/17 210) . De manière appropriée, l'huile métabolisable est présente en une quantité de 0,5 % à 20 % (concentration finale) par rapport au volume total de la composition immunogène, de manière appropriée une quantité de 1,0 % à 10 % par rapport au volume total, de manière appropriée en une quantité de 0,2 % à 6,0 % par rapport au volume total.

Dans un mode de réalisation spécifique, l'huile métabolisable est présente en une quantité finale d'environ 0,5 %, 1 %, 3,5 % ou 5 % par rapport au volume total de la composition immunogène. Dans un autre mode de réalisation spécifique, l'huile métabolisable est présente en une quantité finale de 0,5 %, 1 %, 3,57 % ou 5 % par rapport au volume total de la composition immunogène. Une quantité appropriée de squalène est d'environ 10,7 mg par dose, de manière appropriée de 10,4 à 11,0 mg par dose.

De manière appropriée, les systèmes d'émulsion huile-dans-eau utilisés dans la présente invention présentent une petite taille de gouttelette d'huile de l'ordre du sous-micron. De manière appropriée, les tailles des gouttelettes seront dans la plage allant de 120 à 750 nm, de manière appropriée des diamètres allant de 120 à 600 nm. Traditionnellement, l'émulsion huile-dans-eau contient des gouttelettes d'huile parmi lesquelles au moins 70 % en termes d'intensité ont un diamètre inférieur à 500 nm, en particulier au moins 80 % en termes d'intensité ont un diamètre inférieur à 300 nm, de manière appropriée au moins 90 % en termes d'intensité ont un diamètre situé dans la plage allant de 120 à 200 nm. L'émulsion huile-dans-eau selon l'invention peut comprendre un stérol ou un tocophérol, comme l'alpha-tocophérol. Les stérols sont bien connus dans l'art, par exemple le cholestérol est bien connu et est, par exemple, décrit dans le Merck Index, llème Edition, page 341, en tant que stérol d'origine naturelle que l'on trouve dans les graisses animales. D'autres stérols appropriés comprennent le β-sitostérol, le stigmastérol, l'ergostérol et 1'ergocalciférol. De manière appropriée, 1'alpha-tocophérol ou un dérivé de celui-ci, comme le succinate d'alpha-tocophérol, est présent. De manière appropriée, 1'alpha-tocophérol est présent en une quantité située entre 0,2 % et 5,0 % (en volume/volume) par rapport au volume total de la composition immunogène, de manière appropriée en une quantité de 2,5 % (en volume/volume) dans un volume de dose de 0,5 ml, ou de 0,5 % (en volume/volume) dans un volume de dose de 0,5 ml ou de 1,7 à 1,9 % (en volume/volume), de manière appropriée de 1,8 % dans un volume de dose de 0,7 ml. À des fins de clarification, les concentrations données en volume/volume peuvent être converties en concentration en poids/volume par l'application du facteur de conversion suivant : une concentration d'alpha- tocophérol de 5 % (en volume/ volume) est équivalente à une concentration d'alpha-tocophérol de 4,8 % (en poids/volume). Une quantité appropriée d'alpha- tocophérol est d'environ 11,9 mg par dose, de manière appropriée de 11,6 à 12,2 mg par dose. L'émulsion huile-dans-eau peut comprendre un agent émulsifiant. L'agent émulsifiant peut être présent en une quantité de 0,01 à 5,0 % en poids de la composition immunogène (en poids/poids), de manière appropriée présent en une quantité de 0,1 à 2,0 % en poids (en poids/poids). Une concentration appropriée est de 0,5 à 1,5 % en poids (en poids/poids) par rapport à la composition totale. L'agent émulsifiant peut être de manière appropriée un monooléate de sorbitane polyoxyéthyléné (polysorbate 80 ou Tween 80) . Dans un mode de réalisation spécifique, un volume de dose de 0,5 ml contient 1 % (en poids/poids) de Tween 80, et un volume de dose de 0,7 ml contient 0,7 % (en poids/poids) de Tween 80. Dans un autre mode de réalisation spécifique, la concentration en Tween 80 est de 0,2 % (en poids/poids). Une quantité appropriée de polysorbate 80 est d'environ 4,9 mg par dose, de manière appropriée de 4,6 à 5,2 mg par dose.

Le Span 85 (trioléate de sorbitane polyoxyéthyléné) peut également être présent, par exemple à un taux de 1 %. Un exemple d'adjuvant de type émulsion huile-dans-eau comprenant du Span 85 pour une utilisation dans l'invention est donné et détaillé dans le document EP 0 399 843 B, également connu sous le nom de MF59.

Dans un mode de réalisation préféré, l'adjuvant est une émulsion huile-dans-eau comprenant du squalène, de 1'alpha-tocophérol et un tensioactif, c'est-à-dire que l'émulsion comprend du squalène, de 1'alpha-tocophérol et un tensioactif, par exemple le polysorbate 80, dans une phase aqueuse. La préparation de tels adjuvants est décrite, par exemple, dans les documents WO 95/17 210 et WO 06/100 109. Dans un mode de réalisation, l'émulsion comprend 2 à 10 % (en volume/volume) de squalène, de 2 à 10 % (en volume/ volume) d'alpha-tocophérol et de 0,3 à 3 % (en volume/volume) de Tween 80. De préférence, l'émulsion comprend 2,5 % de squalène (en volume/volume), 2,5 % d'alpha-tocophérol (en volume/volume), 0,9 % de monoléate de sorbitane polyoxyéthyléné (en volume/volume) (Tween 80).

Maladies auto-immunes à prévenir et/ou à traiter

Comme expliqué ci-dessus, l'invention concerne l'utilisation d'adjuvants pour la prévention et/ou le traitement des maladies auto-immunes. Les maladies suivantes ont été classées en maladies auto-immunes : 1'encéphalomyélite disséminée aiguë, la maladie d'Addison, l'agammaglobulinémie, l'alopécie en plaques, 1'amyloïdose, la spondylarthrite ankylosante, la néphrite anti-GBM/anti-TBM, le syndrome antiphospho-lipide (APS), l'hépatite auto-immune, la maladie autoimmune de l'oreille interne (AIED), la neuropathie axonale & neuronale (AMAN), la maladie de Behcet, la pemphigoide bulleuse, la maladie de Castleman (CD), la maladie Cœliaque, la maladie de Chagas, la polyneuropathie démyélinisante inflammatoire chronique (CIDP), l'ostéomyélite multifocal récurrente chronique (CRMO), le syndrome de Churg-Strauss, la pemphigoide cicatricielle/la pemphigoide bénigne des muqueuses, le syndrome de Cogan, la maladie des agglutinines froides, le bloc cardiaque congénital, la myocardite à Coxsackie, le syndrome de CREST, la maladie de Crohn, la dermatite herpétiforme, la dermatomyosite, la maladie de Dévie (la neuromyélite optique aiguë), le lupus discoïde, le syndrome de Dressier, l'endométriose, l'œsophagite à éosinophiles (EoE), la fasciite à éosinophiles, l'érythème noueux, la cryoglobulinémie mixte essentielle, le syndrome d'Evans, la fibromyalgie, l'alvéolite fibrosante, l'artérite à cellules géantes (l'artérite temporale), la myocardite à cellules géantes, la glomérulonéphrite, le syndrome de Goodpasture, la granulomatose avec polyangéite, la maladie de Graves, le syndrome de Guillain-Barré, la thyroïdite d'Hashimoto, l'anémie hémolytique, le purpura d'Henoch-Schonlein (HSP), l'herpès gestationis ou la pemphigoide gestationis (PG), 1'hypogamma-globulinémie, la néphropathie à IgA, la maladie sclérosante associée à IgG4, la myosite à inclusions (IBM), la cystite interstitielle (IC), la polyarthrite juvénile, la myosite juvénile (JM) , la maladie de Kawasaki, le syndrome de Lambert-Eaton, l'angéite leucocytoclasique, le lichen plan, le lichen scléreux, la conjonctivite ligneuse, la maladie à IgA linéaire (LAD), le lupus, la maladie chronique de Lyme, la maladie de Ménière, la polyangéite microscopique (MPA), la connectivité mixte (MCTD), l'ulcère de Mooren, la maladie de Mucha-Habermann, la sclérose en plaques (MS), la myasthénie gravis, la myosite, la narcolepsie, la neuromyélite optique aiguë, la neutropénie, la pemphigoide cicatricielle oculaire, la névrite optique, le rhumatisme palindromique (PR), le PANDAS (troubles neuropsychiatriques auto-immuns pédiatriques associés aux streptocoques), la dégénérescence cérébelleuse paranéoplasique (PCD), l'hémoglobinurie nocturne paroxystique (PNH), le syndrome de Parry Romberg, le pars planitis (uvéite périphérique), le syndrome de Parsonnage-Turner, le pemphigus, la neuropathie périphérique, 1'encéphalomyélite périveineuse, l'anémie pernicieuse (PA), le syndrome POEMS (polyneuropathie, organomégalie, endocrinopathie, gammopathie monoclonal, modifications cutanées), la périartérite noueuse, la polymyalgie rhumatismale, la polymyosite, le syndrome post-infarctus du myocarde, le syndrome postcommissurotomie, la cirrhose biliaire primitive, la cholangite sclérosante primitive, la dermatite à progestérone, le psoriasis, l'arthrite psoriasique, l'érythroblastopénie (PRCA), la pyodermite phagédénique, le phénomène de Raynaud, l'arthrite réactive, 1'algodystrophie sympathique réflexe, le syndrome de Reiter, la polychondrite atrophiante, le syndrome des jambes sans repos (RLS), la fibrose rétropéritonéale, le rhumatisme articulaire aigu, la polyarthrite rhumatoïde (RA) , la sarcoïdose, le syndrome de Schmidt, la sclérite, la sclérodermie, le syndrome de Sjögren, l'auto-immunité du sperme et testiculaire, le syndrome de l'homme raide (SPS), l'endocardite bactérienne subaiguë (SBE), le syndrome de Susac, l'ophtalmie sympathique (SO), l'artérite de Takayasu, l'artérite temporale/1'artérite à cellules géantes, le purpura thrombopénique (TTP), le syndrome de Tolosa-Hunt (THS), la myélite transverse, le diabète de type 1, la rectocolite hémorragique (UC), la maladie du tissu conjonctif indifférencié (UCTD), l'uvéite, la vascularisée, le vitiligo et la granulomatose de Wegener (désormais appelée granulomatose avec polyangéite (GPA).

Les maladies préférées à prévenir et/ou à traiter selon l'invention comprennent : • La polyarthrite rhumatoïde

Chez les personnes souffrant de polyarthrite rhumatoïde, le système immunitaire cible principalement le revêtement (membrane synoviale) qui recouvre diverses articulations. L'inflammation de la membrane synoviale est habituellement symétrique (en apparaissant de la même manière sur les deux côtés du corps) et provoque des douleurs, des gonflements et une rigidité des articulations. Ces caractéristiques distinguent la polyarthrite rhumatoïde de l'arthrose, qui est plus courante et une arthrite dégénérative « d'usure ». Actuellement, le traitement disponible se concentre sur la réduction de l'inflammation des articulations avec des médicaments anti-inflammatoires et immunosuppresseurs. Parfois, le système immunitaire peut également cibler les poumons, les vaisseaux sanguins ou les yeux ; occasionnellement, les patients peuvent également développer des symptômes d'autres maladies auto-immunes, comme l'inflammation de Sjögren, des prurits et une desquamation. • La sclérose en plaques

La sclérose en plaques est une maladie dans laquelle le système immunitaire cible les tissus nerveux du système nerveux central. Très fréquemment, l'endommagement du système nerveux central se produit par intermittence, ce qui permet à une personne de mener une vie relativement normale. À l'autre extrême, les symptômes peuvent devenir constants, ce qui aboutit à une maladie progressive avec éventuellement une cécité, une paralysie et une mort prématurée. Certains médicaments, comme l'interféron bêta, sont utiles pour les personnes souffrant de la forme intermittente de la sclérose en plaques. Chez les jeunes adultes, la sclérose en plaques est la maladie invalidante la plus fréquente du système nerveux. • Diabète sucré de type 1 ou à médiation immunitaire

Le diabète sucré de type 1 résulte d'une destruction auto-immune des cellules produisant de l'insuline du pancréas. L'insuline est requise par le corps pour maintenir le taux de sucre (glucose) dans le sang sous contrôle. Des taux élevés de glucose sont responsables des symptômes et des complications de la maladie. Cependant, la plupart des cellules produisant de l'insuline sont détruites avant que le patient ne développe les symptômes du diabète. Les symptômes comprennent une fatigue, une miction fréquente, une augmentation de la soif et une éventuelle confusion soudaine. Le diabète sucré de type 1 est habituellement diagnostiqué avant l'âge de 30 ans et peut être diagnostiqué dès le premier mois de vie. Conjointement avec le diabète de type 2 (qui n'est pas considéré comme une maladie auto-immune), le diabète sucré est la cause majeure de l'endommagement des reins, de la perte de la vue et de l'amputation des jambes. Une régulation stricte des taux de sucre diminue la fréquence à laquelle ces événements se produisent. • Les maladies intestinales inflammatoires

Ce terme médical est utilisé à la fois pour la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, deux maladies dans lesquelles le système immunitaire attaque l'intestin. Les patients peuvent avoir des diarrhées, des nausées, des vomissements, des crampes abdominales et des douleurs qui peuvent être difficiles à soulager. La maladie chez les personnes touchées peut résulter d'une inflammation intestinale et des effets secondaires des médicaments utilisés pour la maladie. Par exemple, l'utilisation quotidienne d'une dose élevée de corticostéroïde (prednisone), qui est nécessaire pour lutter contre les symptômes graves de la maladie de Crohn, peut prédisposer les patients aux infections, à l'amincissement des os (ostéoporose) et aux fractures. • Lupus érythémateux disséminé

Les patients souffrant de lupus érythémateux disséminé subissent très fréquemment une fatigue profonde, des éruptions cutanées et des douleurs articulaires. Dans les cas graves, le système immunitaire peut attaquer et endommager plusieurs organes, comme les reins, le cerveau ou les poumons. Pour de nombreux individus, les symptômes et les dommages causés par la maladie peuvent être contrôlés avec les médicaments anti-inflammatoires disponibles. • Psoriasis

Le psoriasis est un trouble du système immunitaire qui affecte la peau, et occasionnellement les yeux, les ongles et les articulations. Le psoriasis peut affecter de très petite zone de peau ou recouvrir la totalité du corps avec une accumulation de croûtes rouges appelées plaques. Les plaques sont de différentes tailles, formes et gravités et peuvent être douloureuses ainsi qu'inesthétiques. Les infections bactériennes et une pression ou un traumatisme sur la peau peuvent aggraver le psoriasis. La plupart des traitements se concentrent sur le soin topique de la peau afin de soulager l'inflammation, les prurits et les croûtes. • Sclérodermie

La maladie auto-immune entraîne l'épaississement de la peau et des vaisseaux sanguins. Pratiquement chaque patient atteint de sclérodermie souffre du syndrome de Raynaud, qui est un spasme des vaisseaux sanguins des doigts et des orteils. Les symptômes du syndrome de Raynaud comprennent une sensibilité accrue des doigts et des orteils au froid, un changement de couleur de la peau, des douleurs et occasionnellement des ulcères au bout des doigts ou des orteils. Chez les personnes souffrant de sclérodermie, l'épaississement de la peau et des vaisseaux sanguins peut entraîner une perte de mouvement et un essoufflement ou, plus rarement, une insuffisance rénale, cardiaque ou pulmonaire. • Maladies thyroïdiennes auto-immunes

La thyroïdite d'Hashimoto et la maladie de Graves résultent de la destruction ou de la stimulation du tissu thyroïdien par le système immunitaire. Les symptômes de fonction basse (hypo-) ou hyperactive (hyper-) de la thyroïde sont non spécifiques et peuvent se développer lentement ou soudainement ; ceux-ci comprennent une fatigue, une nervosité, une intolérance au froid ou à la chaleur, des faiblesses, des changements de texture ou de quantité des cheveux, et un gain ou une perte de poids. Le diagnostic de la maladie thyroïdienne est facile à poser avec des tests appropriés de laboratoire. Les symptômes de l'hypothyroïdie sont contrôlés avec des pilules d'hormone thyroïdienne de substitution ; cependant, des complications issues d'un sur- ou sous-remplacement de l'hormone peuvent se produire. Le traitement de l'hyperthyroïdie nécessite une thérapie de longue durée avec un médicament antithyroïdien ou la destruction de la glande thyroïde avec de l'iode radioactif ou par chirurgie. Ces deux approches de traitement présentent certains risques et des effets secondaires à long terme.

Dans un mode de réalisation préféré, la maladie auto-immune à prévenir et/ou à traiter est une maladie affectant le système nerveux, comme le système nerveux central. Dans un mode de réalisation davantage préféré, la maladie auto-immune est la sclérose en plaques. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la maladie auto-immune est le diabète de type 1. Dans un mode de réalisation davantage préféré, la maladie auto-immune est 1'encéphalomyélite disséminée aiguë.

En particulier, les adjuvants comprenant une émulsion huile-dans-eau, par exemple comprenant du squalène, de 1'alpha-tocophérol et du polysorbate 80 dans une phase aqueuse, sont préférés pour la prévention et/ou le traitement des maladies affectant le système nerveux, comme le système nerveux central, par exemple la sclérose en plaques.

Options de traitement

Dans des modes de réalisation préférés, le procédé de l'invention, ou l'utilisation de l'invention, comprend de multiples administrations de l'adjuvant, par exemple au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5 ou au moins 10 administrations de l'adjuvant. Dans un mode de réalisation, l'intervalle de temps entre chacune des administrations est situé entre 1 jour et 6 mois, par exemple l'intervalle peut être de 1 semaine à 1 mois entre chaque administration.

Dans un mode de réalisation préféré, le sujet est un sujet humain. Le sujet humain à traiter en utilisant le procédé de l'invention peut avoir n'importe quel âge. Cependant, dans un mode de réalisation, le sujet humain a plus de 18 ans quand le traitement est initié. Dans des modes de réalisation supplémentaire, le sujet a plus de 40 ans, comme plus de 50 ans, par exemple plus de 60 ans. Le sujet peut être un homme ou une femme.

Dans un mode de réalisation, l'adjuvant est destiné à être utilisé dans la prévention d'une maladie autoimmune chez un sujet humain qui est prédisposé au développement d'une maladie auto-immune, par exemple un sujet qui est prédisposé au développement d'une sclérose en plaques ou un sujet qui est prédisposé au développement d'un diabète de type 1. Un sujet humain qui est prédisposé au développement d'une maladie autoimmune peut être, par exemple, un sujet qui présente des siqnes cliniques précoces de maladie auto-immune, un sujet qui présente un risque qénétique de développer une maladie auto-immune ou un sujet qui présente des autoanticorps spécifiques.

Une personne prédisposée au développement d'une sclérose en plaques est, par exemple, une personne souffrant de CIS (syndrome cliniquement isolé) - un premier et unique épisode neuroloqique d'inflammation ou de démyélinisation dans le système nerveux central durant au moins 24 heures, en particulier quand des lésions compatibles avec une sclérose en plaques sont observées par IRM.

Une personne prédisposée au développement d'un diabète de type 1 est, par exemple, une personne présentant des auto-anticorps, comme des auto-anticorps GADA, IA-2A et/ou mIAA (Sosenko et al. (2013) Diabetes Care 36 : 2615). L'adjuvant peut être administré par diverses voies appropriées, notamment par voie parentérale, comme par administration intramusculaire, intradermique ou sous-cutanée. De manière appropriée, les compositions adjuvantes utilisées dans la présente invention ont un volume de dose pour humain situé entre 0,05 ml et 1 ml, comme entre 0,1 et 0,5 ml, en particulier un volume de dose d'environ 0,5 ml, ou de 0,7 ml. L'adjuvant peut être donné en tant que monothérapie ou en combinaison avec d'autres substances, par exemple d'autres substances connues pour avoir un effet thérapeutique ou prophylactique sur les maladies autoimmunes .

Les enseiqnements de toutes les références citées dans la présente demande, y compris les demandes de brevets et les brevets délivrés, sont incorporés à la présente dans leur globalité à titre de référence. Les termes « comprenant », « comprendre » et « comprit » peuvent, dans le présent document, être facultativement remplacés par les termes « consistant en », « consister en » et « consiste en », respectivement. L'invention va être décrite plus en détail en se référant aux exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLES

Exemple 1 - Procédé

Souris

Des souris WT ont été achetées chez Janvier Labs (France). Des souris transgéniques à récepteur de lymphocytes T 2D2, spécifiques de la glycoprotéine d'oligodendrocyte de la myéline, ont été achetées chez Jackson Laboratory. Des souris à Foxp3-IRES-GFP activé (Foxp3GFP) ont été gentiment fournies par le Pr. Bernard Malissen. Les souris 2D2 et Foxp3GFP ont été soumis un rétrocroisement avec des animaux congéniques CD90.1. Toutes les souris étaient sur un arrière-plan C57B1/6.

Les souris ont été logées dans des conditions spécifiques sans organismes pathogènes et ont été étudiées à l'âge de 7 à 14 semaines. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique local et sont en conformité avec les directives de l'Union européenne. Réactifs L'ASOl est composé de MPL (1 mg/ml), de QS-21 (1 mg/ml) et de liposomes. L'AS03 est composé d'alpha-tocophérol (23,72 mg/ml), d'une huile de squalène (21,38 mg/ml) et de polysorbate 80 (9,72 mg/ml). L'AS04 est composé de MPL (0,1 mg/ml) et d'alun (1 mg/ml). Les adjuvants de Freund ont été achetés chez Sigma-Aldrich. La forme incomplète (IFA) contient 85 % d'huile de paraffine et 15 % de monooléate de mannide. La forme complète (CFA) contient en plus Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) tué par la chaleur et séché à une concentration de 1 mg/ml.

Administration des adjuvants

Les souris ont reçu 30 μΐ d'adjuvant de vaccin ou de PBS par voie sous-cutanée dans la patte arrière gauche. Pour analyser leur effet, les ganglions lymphatiques poplités de drainage (dLN) et les ganglions lymphatiques brachiaux droits non drainant ont été prélevés à différents moments temporels. Les souris immunisées pour induire une EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) ont reçu 100 μΐ d'adjuvant de vaccin ou de PBS par voie sous-cutanée à la base de la queue et dans la partie supérieure du dos 3 jours avant et le jour de l'induction de l'EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) .

Analyses par cytométrie en flux

Les cellules provenant des ganglions lymphatiques ont été dissociées mécaniquement et remise en suspension dans du PBS 3 % de SVF. Elles ont tout d'abord été traitées avec l'anticorps 2.4G2 pour bloquer le récepteur Fc et colorées avec les anticorps suivants : anti-CD45 (30-F11), anti-CD3 (145-2C11), anti-CD4 (RM4-5), anti-CD8 (53-6.7), anti-CD25 (PC61), anti-Foxp3 (MF23), anti-CTLA-4 (UC10-4F10-11), anti-GITR (DTA-1), anti-ICOS (17G9), anti-Ki-67 (B56). Tous les anticorps ont été obtenus chez BD Biosciences. Une coloration intracellulaire a été réalisée en utilisant le jeu de tampons de perméabilisation et de fixation intracellulaire disponible chez eBioscience. Les cellules ont été acquises sur un cytomètre BD LSRII et analysées à l'aide du logiciel FlowJo.

Evaluation de l'induction périphérique des Treg

Les ganglions lymphatiques (brachiaux, axillaires, cervicaux et inguinaux) et les cellules spléniques des souris Foxp3GFP CD90.1 ont été isolés, traités comme décrit ci-dessus et colorés avec un anticorps anti-CD4. Les cellules CD4+GFP" (Tconv) ont été purifiées en utilisant un BD FACSAria II, puis injectées par voie intraveineuse à des souris WT (106 cellules/souris) . Le jour suivant, les souris ont reçu 30 μΐ d'adjuvant de vaccin ou de PBS par voie sous-cutanée dans la patte arrière gauche. Trois jours plus tard, les dLN ont été prélevés et les cellules ont été colorées avec les anticorps anti-CD4, anti-CD90.1 (OX-7), anti-CD90.2 (30— H12) et anti-Foxp3. L'induction de Foxp3 chez les souris transférées CD90.1 a été évaluée par cytométrie en flux.

Essai de suppression des Treg in vitro

Des souris Foxp3GFP ont reçu 100 μΐ d'adjuvant de vaccin ou de PBS par voie sous-cutanée à la base de la queue et dans la partie supérieure du dos. Les ganglions lymphatiques brachiaux et inguinaux ont été prélevés à 3 et 7 jours. Les cellules ont été isolées et colorées comme décrit ci-dessus. Les cellules CD4+GFP" (Tconv) et CD4+GFP+ (Treg) ont ensuite été triées en utilisant BD FACSAria II. Les cellules Tconv ont été marquées avec le kit CellTrace Violet Proliferation Kit (Life technologies) et mises dans une plaque de 96 puits à 2,5 x 104 cellules/puits avec des splénocytes provenant de souris CD3-/- à 7,5 x 104 cellules/puits. Le milieu de culture a été complété avec un anti-CD3 (KT3) disponible chez BioXCell à 0,05 pg/ml. Les cellules Treg ont ensuite été ajoutées à différents rapports allant de 1/1 à 1/16. Au jour 3, la dilution CellTrace a été évaluée par cytométrie en flux.

Induction de l'EAE

Les souris ont été immunisées par injection sous-cutanée de 100 pg de peptide MOG35-55 (PolyPeptide) émulsifiés dans 100 μΐ de CFA (Sigma-Aldrich) complétés avec 50 pg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra tué par la chaleur (BD Biosciences) . Les animaux ont reçu en outre par injection intraveineuse 200 ng de toxine de Bordetella pertussis (Enzo) au moment de l'immunisation et deux jours après l'immunisation. L'évaluation clinique a été réalisée sur une base quotidienne avec une échelle à 5 points comprenant 0, aucun signe clinique ; 1, queue molle ; 2, queue molle, réflexe de redressement altéré, et parésie d'un membre ; 3, paralysie des membres postérieurs ; 4, paralysie des membres postérieurs et des membres antérieurs ; 5, moribond.

Mesure des cytokines

Dix jours après l'induction de l'EAE, les dLN brachiaux et inguinaux ont été prélevés. Les cellules ont été cultivées avec 1 pg/ml de peptide MOG35-55 dans une plaque de 96 puits à 2 x 105 cellules/puits. Au jour 3, les surnageants ont été collectés pour mesurer les sécrétions d'INF-γ et d'IL-17 par ELISA (eBioscience).

Evaluation de l'amorçage des lymphocytes T

Les ganglions lymphatiques et les cellules spléniques issus des souris 2D2 CD90.1 ont été colorés avec les anticorps marqués à la biotine suivants : anti-CD19 (6D5), anti-CDllb (Ml/70), anti-CDllc (N418), anti- CD8 (53-6.7) et anti-CD25 (7D4), puis revêtus avec des microbilles anti-biotine (Miltenyi Biotec). Après agitation magnétique, les cellules de la fraction négative enrichie en CD4+ ont été marquées avec le kit CellTrace Violet Proliferation Kit et ont été injectées par voie intraveineuse à des souris naïves ( 106 cellules/souris) . Le jour suivant, les cellules ont été immunisées avec le peptide MOG35-55 pour ce qui concerne l'induction de l'EAE. La dilution CellTrace des cellules CD4+CD90.1+Vßll+ (transgène à récepteur de lymphocytes T) a été évaluée par cytométrie en flux à partir des ganglions lymphatiques brachiaux et inguinaux au jour 3. Les souris recevant les adjuvants ont reçu par injection 100 μΐ d'adjuvant de vaccin ou de PBS par voie sous-cutanée à la base de la queue et dans la partie supérieure du dos.

Transfert adoptif des lymphocytes Treg

Les souris Foxp3GFP CD90.1 ont reçu 100 μΐ d'adjuvant de vaccin ou de PBS par voie sous-cutanée à la base de la queue et dans la partie supérieure du dos. Au jour 3, les ganglions lymphatiques brachiaux et inguinaux ont été prélevés et les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-CD4. Les cellules CD4+GFP+ (Treg) ont ensuite été purifiées en utilisant BD FACSAria II et injectées par voie intraveineuse à des souris WT (1 x 106 cellules/souris) . Le jour suivant, les souris ont été immunisées avec le peptide MOG35-55 comme décrit précédemment dans l'induction de l'EAE.

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel GraphPad Prism. La signification statistique a été déterminée en utilisant le test U bilatéral non paramétrique de Mann—Whitney. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Les moyennes ± ETM ont été utilisées sur toutes les figures.

Exemple 2 - Les adjuvants de vaccin induisent une expansion préférentielle transitoire des lymphocytes Treg

Le CFA, les adjuvants incomplets de Freund (IFA), l'ASOl, l'AS03 et l'AS04 ont été administrés par voie sous-cutanée à des souris. Après 4 jours, une inflammation et un gonflement très importants des ganglions lymphatiques de drainage (dLN) ont été observés (figure la) . La cellularité de ces dLN avait augmenté de 11 à 20 fois (figure 2a) . Au contraire, l'injection d'alun n'a eu aucun effet sur la taille et le nombre des cellules des dLN.

Les lymphocytes Treg ont ensuite été analysés par cytométrie en flux (figure lb) . Sauf dans le cas de l'alun, nous avons observé une augmentation rapide (jour 4) de la proportion des lymphocytes Treg parmi les cellules CD4+ après l'injection des différents adjuvants, jusqu'à 1,9 fois par rapport aux souris ayant reçu du PBS (figure le) . Cette expansion des lymphocytes Treg était associée à un phénotype activé, comme le montre l'augmentation de l'expression de CD44, ICOS et Ki-67 (figure 2b) . Cette expansion et cette activation des lymphocytes Treg étaient transitoires car elles n'étaient plus du tout présentes au jour 7, sauf pour IFA (figure le). L'expansion des lymphocytes Treg induite par les injections d'adjuvant était due à l'accumulation de Treg thymiques (tTreg) et non à l'augmentation de l'induction des Treg périphériques. En effet, l'expression de Foxp3 n'a pas été induite par les adjuvants chez les cellules CD4+Foxp3- transférées de manière adoptive (figure ld) . Ces données ont révélé l'activation in vivo des lymphocytes tTreg par des adjuvants de nouvelle génération.

Ensuite, nous avons évalué l'effet de l'administration d'adjuvants de vaccin sur l'activité des lymphocytes Treg par un essai classique de suppression in vitro. L'alun, l'adjuvant de Freund, l'AS03 et l'AS04 n'ont eu aucun effet sur la fonction de lymphocytes Treg (figure 2c), tandis qu'ASOl a réduit partiellement leur activité suppressive et l'expression de Foxp3 (figures le et lf et 2d) . Cet effet a été observé au jour 4, mais plus du tout au jour 7 (figure 2e). Par conséquent, l'administration d'adjuvants de nouvelle génération ne compromet pas, ou seulement de manière marginale, la fonction suppressive des lymphocytes Treg.

Exemple 3 - Prévention de l'EAE par administration des adjuvants AS01 et AS03

Afin d'évaluer les effets des adjuvants de vaccin sur l'induction de la tolérance dans un contexte physiopathologique, nous avons testé des traitements par adjuvant avec le modèle d'EAE auto-immune. Etonnamment, 2 injections d'ASOl ou d'AS03, 3 jours avant l'immunisation et en même temps que l'immunisation, ont induit une prévention quasi-complète contre le développement de la maladie. Les scores cliniques moyens étaient inférieurs à 0,14-0,17, par rapport à 1,17 chez les témoins. Au contraire, l'AS04 et l'alun n'ont eu aucun effet sur l'EAE (figure 3a). Après seulement une injection d'ASOl ou d'AS03 réalisée 3 jours avant l'immunisation ou au moment de l'immunisation, l'EAE a été significativement retardée ou réduite, respectivement (figures 4a et 4b). Par conséquent, AS01 et AS03 ont un puissant effet de prévention contre l'EAE.

Ensuite, nous avons étudié l'amorçage et la polarisation des cytokines de lymphocytes Tconv autoréactifs. La prolifération des lymphocytes T a été évaluée après transfert adoptif de souris transgéniques 2D2 exprimant un récepteur transgénique de lymphocyte T à restriction I-Ab spécifique du peptide MOG35-55 (Bettelli et al. (2003) J. Exp. Med. 197 : 1073) avant l'induction de l'EAE. L'administration d'ASOl a légèrement réduit la prolifération des lymphocytes T spécifiques de MOG35-55 au jour 3 dans les dLN, tandis qu'AS03 n'a eu aucun effet (figure 3b). La polarisation des lymphocytes T a été évaluée en mesurant la libération d'IFNy et d'IL-17, 2 cytokines pathogènes majeures dans l'EAE, au jour 10 dans les dLN après induction de l'EAE par des lymphocytes Tconv auto-réactifs spécifiques du peptide d'immunisation MOG35-55. L'administration d'ASOl a été associée à une diminution de la production d'IFNy, tandis que l'IFNy et 1'IL-17 n'ont pas été affectés par l'administration d'AS03 (figure 3c). Par conséquent, bien qu'à la fois l'administration d'ASOl et d'AS03 a permis de prévenir le développement d'une EAE, seul AS01 à perturber l'amorçage et la polarisation des lymphocytes T réactifs à MOG35-55·

Ensuite, nous avons réalisé des expériences de transfert adoptif pour analyser davantage le rôle des lymphocytes Treg dans la prévention de l'EAE dirigée par les adjuvants. Des lymphocytes Treg purifiés issus de dLN de souris traitées par adjuvant ont été injectés à des souris naïves avant l'induction de l'EAE. Etonnamment, les souris qui ont reçu les lymphocytes Treg issus des souris traitées par AS03 ont été totalement protégées contre la maladie. Au contraire, les lymphocytes Treg issus des souris traitées par AS01 n'ont eu aucun effet car les souris réceptrices transférées avec ces cellules ont développé la même EAE que les souris témoins transférées avec du PBS ou des Treg provenant de souris naïves (figure 3d). Ces données montrent que l'administration d'AS03 renforce fortement la capacité de lymphocytes Treg à lutter contre l'EAE.

Afin de mieux comprendre le mécanisme de prévention contre l'EAE par AS03, nous avons en outre étudié les lymphocytes Treg et les molécules impliquées dans la migration des lymphocytes T. Des cellules issues de dLN de souris immunisées pour induire l'EAE et traitées avec AS03 ont été analysées au jour 10. La proportion de lymphocytes Treg avait significativement augmenté chez les souris traitées avec AS03 par rapport au témoin (figure 3e). L'expression des récepteurs de chimiokines CCR6 et CXCR3 par les lymphocytes Tconv, qui jouent un rôle critique dans l'entrée de lymphocytes T pathogènes dans le système nerveux central (SNC) pendant l'EAE (Reboldi et al. (2009) Nat. Immunol., 10 : 514 ; Sporici and Issekutz (2010) Eur. J. Immunol., 40 : 2751), n'a pas été affectée par le traitement avec AS03 (figure 4c). Il est intéressant de noter que les niveaux d'expression des intégrines impliquées dans le repérage du SNC (Yednock et al. (1992) Nature 356 : 63 ; Rothhammer et al. (2011) J. Exp. Med. 208 : 2465) ont été modifiés de manière significative par l'adjuvant. Les lymphocytes Treg ont exprimé un niveau plus élevé d'intégrine aL, tandis que les lymphocytes Tconv présentaient une diminution du taux d'intégrine aM (figure 3f). De plus, les niveaux d'expression des intégrines «4 et aL par les lymphocytes Tconv n'ont pas été affectés (figure 4d) . Ces résultats suggèrent que l'administration d'AS03 a une incidence sur la migration des lymphocytes Treg et Tconv dans le SNC, ce qui peut expliquer sa capacité à supprimer l'EAE.

Conclusion

Ces travaux démontrent que certains des adjuvants de vaccin de nouvelle génération possèdent de puissantes propriétés d'immunorégulation et ont une incidence sur l'activation et la fonction des lymphocytes Treg, ce qui montre donc leur potentiel dans le traitement des troubles auto-immuns. L'administration d'ASOl et l'administration d'AS03 ont induit toutes les deux une protection contre l'EAE. Il est intéressant de noter que leur mécanisme de suppression semble différent. AS01 a altéré l'amorçage et la polarisation des cytokines des lymphocytes Tconv encéphalitogènes, tandis qu'AS03 a fortement augmenté la capacité protectrice des lymphocytes Treg dans l'EAE et peut modifier la migration des lymphocytes Tconv et Treg.

Claims

REVENDICATIONS

1. Adjuvant pour utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie auto-immune, dans lequel l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.
2. Adjuvant selon la revendication 1, dans lequel l'adjuvant comprend une saponine immunologiquement active.
3. Adjuvant selon la revendication 2, dans lequel l'adjuvant comprend du QS21.
4. Adjuvant selon la revendication 2 ou 3, dans lequel l'adjuvant comprend un stérol.
5. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant comprend un agoniste de TLR, comme un agoniste de TLR4.
6. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant comprend du 3D-MPL.
7. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant comprend du QS21 et du 3D-MPL dans une formulation liposomique.
8. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant comprend une émulsion huile-dans-eau.
9. Adjuvant selon la revendication 8, dans lequel l'émulsion comprend du squalène.
10. Adjuvant selon la revendication 9, dans lequel l'émulsion comprend en outre de 1 'alpha-tocophérol et du polysorbate 80 dans une phase aqueuse.
11. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la maladie autoimmune est une maladie choisie dans le groupe constitué par : la sclérose en plaques, le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoïde, les affections abdominales inflammatoires, le lupus érythémateux disséminé, le psoriasis, la sclérodermie et les maladies thyroïdiennes auto-immunes.
12. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la maladie autoimmune est une maladie affectant le système nerveux, comme le système nerveux central.
13. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la maladie autoimmune est la sclérose en plaques.
14. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la maladie autoimmune est une encéphalomyélite disséminée aiguë.
15. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la maladie auto-immune est le diabète de type 1.
16. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant est destiné à être utilisé chez un patient humain.
17. Adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant est pour utilisation dans la prévention d'une maladie autoimmune chez un patient humain qui est prédisposé au développement d'une maladie auto-immune.
18. Procédé de prévention et/ou de traitement d'une maladie auto-immune comprenant l'administration d'un adjuvant à un sujet, dans lequel l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.
19. Procédé selon la revendication 18, comprenant une ou plusieurs des caractéristiques supplémentaires telles que récitées dans les revendications 2 à 17.
20. Utilisation d'un adjuvant dans la préparation d'un médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie auto-immune, où l'adjuvant ne comprend pas d'aluminium et est approprié pour une utilisation chez un sujet humain.
21. Utilisation selon la revendication 20, comprenant une ou plusieurs des caractéristiques supplémentaires telles que précitées dans les revendications 2 à 17.