EP3328422A1 - Composition vaccinale contre les infections a chlamydiaceae - Google Patents

Composition vaccinale contre les infections a chlamydiaceae

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EP3328422A1
EP3328422A1 EP16753280.3A EP16753280A EP3328422A1 EP 3328422 A1 EP3328422 A1 EP 3328422A1 EP 16753280 A EP16753280 A EP 16753280A EP 3328422 A1 EP3328422 A1 EP 3328422A1
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EP
European Patent Office
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bacterium
bacteria
chlamydiaceae
family
cells
Prior art date
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Pending
Application number
EP16753280.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Verbeke
Colette Kanellopoulos
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Diderot Paris 7
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Diderot Paris 7 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3328422A1 publication Critical patent/EP3328422A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/118—Chlamydiaceae, e.g. Chlamydia trachomatis or Chlamydia psittaci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • Chlamydia is the most common sexually transmitted disease of bacterial origin with nearly 106 million new cases a year. Effective antibiotic treatments exist but this disease is often asymptomatic (75% of women and 50% of men). Most patients are not treated because they are undiagnosed and the consequences of untreated infection can be serious (infertility, ectopic pregnancies, preterm births, neonatal infections).
  • Chlamydiaceae comprises two genera, Chlamydia and Chlamydophila, each comprising several species; each species consists of different biovars and serovars. Each of these species leads to a set of disabling diseases in humans or animals, or even fatal in the case of C. psittaci infections.
  • the bacteria of the family Chlamydiaceae are Gram-negative bacteria. They are called "strict intracellular” because they can only grow and multiply in a parasitophorous vacuole within an infected eukaryotic cell. During their development, bacteria of the family Chlamydiaceae come in two forms: • The elementary body (EC), which is the infectious form and does not divide, and
  • the CE enters the host cell within a gallbladder. If several ECs infect the same cell, the vesicles usually cluster at the centrosome and merge with each other to form the inclusion. After 5 to 12 hours of infection, ECs differentiate into CRs that actively multiply. After 30 to 40 hours, the CRs become EC; the inclusion and the host cell are then lysed, releasing the bacterial offspring that will infect the neighboring cells. All of these parameters may vary from one serovar and one bacterial species to another, and depending on the experimental conditions (Fields, K. A. & T. hackstadt, Annu Rev Cell Dev Biol 18: 221-45, 2002).
  • the Chlamydia bacterium notably inhibits the apoptosis of the host cell induced by external signals, inhibits the fusion of lysosomes with bacterial inclusion, defeats the vesicular traffic towards the vacuole to allow the growth of this one, and injects into the cytoplasm multiple virulence factors, including a key protease (Chlamydia protease / proteasome-like activity factor, CPAF) that induces the degradation of many eukaryotic proteins, transcription factors of the major histocompatibility complex molecules responsible for the presentation of antigens to the cells of the immune system.
  • CPAF Chromydia protease / proteasome-like activity factor
  • Persistence accounts for a high level of interaction between the pathogen and the host and allows the bacteria to remain alive, or dormant ("persistent") in the body for months or years.
  • Chlamydia bacteria can exist for several years within a tissue such as the genital tract, conjunctival mucosa or vascular tissue, thus generating recurrent infections and chronic inflammation (Beatty et al., Microbiol Rev 58 (4): 686-99, 1994; Kern et al. ., FEMS Immunol Med Microbiol 55 (2): 131-9, 2009).
  • the high rate of asymptomatic infections and the severity of the diseases justify the active search for a safe and effective vaccine for the control of Chlamydia infections.
  • Chlamydiaceae inactivated by a peptidoglycan inhibitor in particular ⁇ -lactams or D-cycloserine, can be used very efficiently to produce drugs for prophylactic treatment of infections by bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • BL forms always have native antigens, even though these forms are abnormally dilated and are absolutely no longer infectious.
  • the injection of BL forms into mice thus makes it possible to protect these animals against subsequent infections by infectious bacteria.
  • This BL form therefore represents an inactivated form that can be used to immunize naive individuals susceptible to infection by Chlamydiaceae.
  • an immunogenic bacterial form obtained by treatment of bacteria of the family Chlamydiaceae by a peptidoglycan inhibitor, in particular by a ⁇ -lactam, is immunogenic.
  • immunogenic refers to the ability of a molecule to elicit an immune response, whether humoral or cell-mediated, or both.
  • An immune response to an immunogenic bacterial form means the development in a subject of a humoral and / or cell-mediated immune response to one or more molecules present in said bacterial form (e.g., an antigen, as a protein, a glycolipid (LPS) or a polysaccharide).
  • the term "humoral immune response” is understood to mean an immune reaction whose effectors are soluble molecules, for example antibodies. These are in particular produced by plasma cells and B lymphocytes.
  • a "cell-mediated immune response” within the meaning of the invention is an immune reaction whose effectors are cells such as cytotoxic T lymphocytes, killer T cells or helper T cells.
  • a "cell-mediated immune response” within the meaning of the invention also includes the production of cytokines, chemokines and other similar molecules produced by activated T cells and / or other hematopoietic cells, including those derived from CD4 + T cells. or CD8 + , and / or epithelial cells.
  • the BL form of the present invention is capable of eliciting an immune response of antibody-producing B lymphocytes and Chlamydia-specific T-lymphocytes (LT) in the spleen.
  • LT effector effectors effector or regulators
  • these LT effector effectors are likely to leave the spleen for the ganglia draining the genital tract where the infection occurs.
  • the subject of the invention is a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising bacteria of the family Chlamydiaceae previously treated with at least one peptidoglycan inhibitor, in particular with a ⁇ -lactam, or extracts thereof for use in prophylactic and / or therapeutic treatment of infections by bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • Chlamydiaceae family is intended to mean the taxonomic group composed of two genera, Chlamydia and Chlamydophila, as defined in Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol. 51 (Pt 1): 203-20, 2001.
  • “genus Chlamydia” means, within the meaning of the invention, the taxonomic group comprising the species Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis and Chlamydia muridarum, and by "genus Chamydophila", the taxonomic group composed of the species Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila felis and Chlamydophila pneumoniae (Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol, 51 (Pt 1): 203-20, 2001).
  • Chlamydia trachomatis and Chlamydophila pneumoniae are responsible for infections in humans, Chlamydia suis in pigs and Chlamydophila abortus in humans. ruminants.
  • the invention is not limited to a specific bacterial species, but can be applied to any of the species of the family Chlamydiaceae and, in particular, to those mentioned above.
  • adjuvants are commonly used in the manufacture of vaccine compositions to increase immunogenicity, for example by stimulating the immune system.
  • adjuvant describes any substance added to accelerate, prolong, enhance or modify the quality of the specific immune response induced by the composition according to the invention when the adjuvant and the composition according to the invention are used together.
  • Adjuvants are thus products that enhance innate and adaptive immune system responses when administered in the presence of antigens of viral, bacterial or synthetic origin. They cause the massive attraction of macrophages at the injection site, then in the lymph nodes, activate dendritic cells, increase the production of specific immunoglobulins, antibodies, and stimulate many cells involved in the mechanisms of immune defense.
  • the composition according to the invention further comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • the pharmaceutically acceptable adjuvants are well known to those skilled in the art and may be chosen according to the proper and interesting properties of these adjuvants, such as those described by Petrovsky et al. , Immunology and Cell Biology, 82: 488-496, 2004 or Vermout et al. , Ann. Med. Vet. 147: 393-401, 2003. It is well known, moreover, that adjuvants of immunity can be adapted in particular according to the route of administration chosen.
  • the adjuvant according to the invention will, for example, be chosen from bacterial constituents, bacterial toxins, oily adjuvants, mineral adjuvants, CpG oligodeoxynucleotides, saponins, vesicular or nanoparticulate adjuvants, synthetic copolymers, lipophilic amines, cytokines, imidazoquinolones, or polysaccharides.
  • Bacillus Calmette-Guerin or BCG which comprises a strain of Mycobacterium bovis attenuated
  • Muramyl dipeptide N-acetylmuramyl-1-alanyl-D-isoglutamine
  • MPD MPD
  • the endotoxin of gram-negative bacteria also called lipolysaccharide or LPS and its derivative monophosphoryl lipid A or MPL.
  • LPS lipolysaccharide
  • MPL monophosphoryl lipid A
  • CT Vibrio cholerae
  • CTB purified subunit B
  • thermolabile lymphotoxin of Escherichia coli LT
  • Oil adjuvants based on squalene such as for example TiterMax (marketed under this name by Vaxcel Norcross Georgia USA) or RIBI Adjuvant System (product marketed under this name by Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana USA).
  • inorganic adjuvants that can be used as adjuvants according to the invention, mention may be made, by way of example, of alum, a name commonly used to designate compounds such as aluminum hydroxide and aluminum phosphate, potassium phosphate or calcium phosphate.
  • synthetic copolymers that may be used as adjuvants according to the invention, mention may be made by way of example of synthetic amphipathic copolymers composed of hydrophilic chains of polyoxyethylene (POE) and hydrophobic chains of polyoxypropylene (POP) or dimethyldioctadecylammonium bromide or chloride (DDA). ).
  • POE polyoxyethylene
  • POP polyoxypropylene
  • DDA dimethyldioctadecylammonium bromide or chloride
  • lipophilic amines which can be used as adjuvants according to the invention, mention may be made by way of example of avridine.
  • Cytokines useful as adjuvants according to the invention include, for example, histamine, interferon, in particular INF ?, interleukins, in particular IL-1 and IL-2.
  • imidazolquinolones that may be used as adjuvants according to the invention, mention may be made, by way of example, of imiquimod or resiquimod.
  • the adjuvant is, for example, hevea, TASO3 (composed of squalene, DL- ⁇ -tocopherol, and polysorbate), MF59C.1 (composed of polysorbate 80, squalene, sorbitan trioleate, sodium citrate, citric acid and water).
  • the inventors have discovered that, surprisingly, the bacteria of the Chlamydiaceae family treated with peptidoglycan inhibitors, in particular with ⁇ -lactams, as well as the fragments of these bacteria, are highly immunogenic.
  • the vaccine compositions comprising these inactivated bacteria induce very good protection of mice against vaginal infections by Chlamydia muridarum.
  • the inventors have shown that the repeated administration of the vaccine compositions of the invention results in an immune response of Chlamydia muridarum-specific T lymphocytes in the spleen.
  • CD4 + and CD8 + LTs and regulatory T cells leave the spleen for the ganglia draining the genital tract.
  • T cells or "T lymphocytes” is used here to mean a type of lymphocyte that plays a central role in cell-mediated immunity.
  • T cells can be distinguished from other lymphocytes, such as B cells and natural killer cells (NK cells), by the presence of a T cell receptor (TCR) on the cell surface.
  • TCR T cell receptor
  • a "T cell receptor” or “TCR” as used herein is a receptor present on the surface of T cells that is responsible for the specific recognition of antigens presented by the major histocompatibility complex (MHC) molecules.
  • MHC major histocompatibility complex
  • CD4 + T lymphocytes that express the CD4 glycoprotein on their surface
  • CD8 + T cells characterized by the expression of the CD8 glycoprotein.
  • T effector lymphocyte within the meaning of the invention is a T lymphocyte providing a specialized function in the immune response, such as the secretion of cytokines or the assistance to B cells in humoral function (CD4 + T lymphocytes also called lymphocytes T helper) as well as a cytotoxic activity (CD8 + T lymphocytes).
  • CD4 + T lymphocytes also called lymphocytes T helper
  • CD8 + T lymphocytes Over-expressed (ICOS, CD44) or under-expressed (CD62L) surface markers mark the activation status of effector T cells.
  • Regulatory lymphocytes within the meaning of the invention are T cells which strongly express markers of the CD4 and CD25 surface. These cells also express the FOXP3 marker which is a transcription factor (Battaglia and Rancarolo 2009). These regulatory lymphocytes are therefore CD4 + CD25highFOXP3high. These cells are characterized by an ability to suppress or downregulate immune responses mediated by effector T cells, such as CD4 + or CD8 +
  • the present invention relates to a process for preparing a vaccine composition for the prophylactic and / or therapeutic treatment of infections by bacteria of the family Chlamydiaceae, said method comprising a contacting step, in vitro, bacteria, preferably intracellular bacteria of the family Chlamydiaceae with at least one peptidoglycan inhibitor, including at least one ⁇ -lactam.
  • peptidoglycan inhibitor is intended to mean any compound capable of inhibiting the synthesis of the peptidoglycan or of affecting the structure thereof.
  • the peptidoglycan inhibitors within the meaning of the invention include, among others, D-cycloserine (d-4-amino-3-isoxazolidinone), vancomycin, teicoplanin, bacitracin, daptomycin and ⁇ -lactams.
  • a "peptidoglycan inhibitor" within the meaning of the invention is preferably D-cycloserine or a ⁇ -lactamine.
  • ⁇ -lactam is meant herein any antibiotic which contains a ⁇ -lactam nucleus in its molecular structure.
  • Bis-lactams within the meaning of the invention are thus understood to include penicillin derivatives as well as cephalosporins, monobactams, carbapenems or ⁇ -lactamase inhibitors.
  • the ⁇ -lactam of the invention may be benzylpenicillin (penicillin G), phenoxymethylpenicillin (penicillin V), ampicillin (penicillin A), benzyl benzylpenicillin, methicillin, dicloxacillin, flucloxacillin, co - amoxiclav (amoxycillin + clavulanic acid), piperacillin, ticarcillin, azlocillin, carbenicillin, cephalexin, cephalothin, cephazolin, cefaclor, cefuroxime, cefamandole, cefotetan, cloxacillin, cephadroxil, cefixime , cefoxitin, ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime, cefepime, cefpirome, imipenem, imipenem in combination with cilastatin, cefixime in combination with imipenem, meropenem, mecillinam, ertapenem
  • said ⁇ -lactam is not amoxicillin.
  • said ⁇ -lactam is chosen from the group consisting of benzylpenicillin (penicillin G), phenoxymethylpenicillin (penicillin V), cloxacillin, cephadroxil, cefixime, imipenem, cefixime in combination with imipenem, mecillinam, clavulanic acid, tazobactam and sulbactam.
  • said ⁇ -lactam is penicillin G.
  • a concentration of at least 100 ⁇ l, preferably at least 200 ⁇ l, of D-cycloserine makes it possible to generate BL forms.
  • the ⁇ -lactam is used at a concentration greater than or equal to 0.1 ⁇ , preferably greater than or equal to 0.3 ⁇ .
  • cephadroxil or sulbactam is used at a concentration greater than or equal to 3 ⁇ , preferably greater than or equal to 10 ⁇ .
  • cefixime and imipenem are used in combination, each at a concentration greater than or equal to 30 ⁇ M.
  • cefixime or imipenem is used at a concentration greater than or equal to 100 ⁇ , preferably greater than or equal to 300 ⁇ .
  • the mecillinam is used at a concentration greater than or equal to 1 ⁇ , preferably greater than or equal to 3 ⁇ .
  • tazobactam is used at a concentration greater than or equal to 10 ⁇ , preferably greater than or equal to 30 ⁇ .
  • clavulanic acid is used at a concentration greater than or equal to 0.3 ⁇ , preferably greater than or equal to 1 ⁇ .
  • amoxicillin benzylpenicillin (penicillin G), phenoxymethylpenicillin (penicillin V), cloxacillin or mecillinam
  • penicillin G benzylpenicillin
  • penicillin V phenoxymethylpenicillin
  • cloxacillin or mecillinam is used at a concentration greater than or equal to 0.1 ⁇ , preferably greater than or equal to equal to 0.3 ⁇ .
  • the bacteria of the family Chlamydiaceae are brought into contact with said inhibitor for at least 1 hour, preferably at least 2 hours, more preferably at least 3 hours, even more preferably at least 4 hours. hours, still more preferably at least 5 hours, even more preferably at least 10 hours, more and more preferably at least 24 hours.
  • Bacteria of the family Chlamydiaceae exist in different forms, depending on the phase of their life cycle. The virulent form of these bacteria is the elemental body.
  • the elementary body is transformed into a reticulated body, a larger element whose DNA is decondensed and which can multiply to give elementary bodies which will then be released into the medium.
  • the inventors have shown that the bacteria are particularly sensitive to peptidoglycan inhibitors, especially to ⁇ -lactams, after having infected eukaryotic cells. Said bacteria are then in the form of crosslinked bodies which express the target enzymes of these inhibitors, which are essential for the biosynthesis of a molecule regulating bacterial division.
  • said bacteria of the invention are treated with said inhibitor, for example with a 6-lactam, after these bacteria have infected eukaryotic cells.
  • said inhibitor for example with a 6-lactam
  • the subject of the present invention is a process for the preparation of a composition for the prophylactic and / or therapeutic treatment of infections by bacteria of the family Chlamydiaceae, said method comprising the steps of: contacting eukaryotic cells in vitro with bacteria of the Chlamydiaceae family, and obtaining infected eukaryotic cells; b) incubating the infected eukaryotic cells obtained in step a) with at least one peptidoglycan inhibitor, in particular at least one 6-lactamine;
  • steps a) and b) of the process for preparing the vaccine composition are carried out under conventional cell culture conditions and which are well known to a person skilled in the art, who will be able to choose and adapt them according to the type of eukaryotic cell used.
  • steps a) and b) are carried out at a temperature of 37 ° C., an air humidity of 35% and an air CO 2 content of 5%.
  • the cells are cultured in a culture medium appropriate.
  • the incubation of step b) is maintained for at least one hour, preferably at least 2 hours, more preferably at least 3 hours, even more preferably at least 4 hours, still more preferably at less than 5 hours, even more preferably at least 10 hours, more and more preferably at least 24 hours.
  • the eukaryotic cells according to the invention are animal cells, preferably mammalian cells or avian cells.
  • the latter are for example cells of the order Galliformes, such as chicken (Gallus gallus) or that of the Anseriformes, such as mallard duck (Anas platyrhynchos) or musk duck (Cairina moschata).
  • the mammalian cells according to the invention are, for example, eukaryotic cells derived from rodents (Rodentiens), porcine eukaryotic cells (Suidae), or eukaryotic primate cells.
  • the eukaryotic rodent cells are, for example, of the family Muridae (Muridae), in which there are among others the subfamilies of hamsters (Cricetinae) or mice and rats (Murinae), which include, for example, the mouse (mus musculus) or the rat (rattus norvegicus).
  • Porcine eukaryotic cells include, among others, eukaryotic cells of domestic swine (Sus scrofa domesticus).
  • the eukaryotic cells of the order of the primates comprise, inter alia, eukaryotic cells of the family Cercopithecidae, in which mention will be made, for example, of the green monkey (Chlorocebus sabaeus), or that of Hominidae, which includes, in particular, the human (Homo sapiens).
  • eukaryotic cells within the meaning of the present invention do not include cells whose production requires or has required the destruction of human embryos.
  • the eukaryotic cells are primary cells or immortalized or tumor cell lines, such as, for example, eukaryotic cells from cell lines.
  • Primary cells are defined as a group of original cells derived from normal tissue up to and including the 10th passage, used for the production of biological products.
  • immortalized cells is intended to mean cells that divide beyond the Hayflick limit, the cells being able to be immortalized spontaneously or because of the implementation of an immortalization technique.
  • the immortalization techniques of the cells are well known to those skilled in the art who will be able to choose among them the best adapted to their goal.
  • an immortalization technique of the transformation with an oncogene, for example those encoding the SV40 T antigen, the Ras protein or the Myc protein.
  • telomerase reverse transcriptase for example hTERT
  • the eukaryotic cells used are chosen for example from epithelial cells or fibroblates.
  • the eukaryotic cells used are, by way of example, primary fibroblasts of embryonic origin, such as, for example, CEFs (Chick Embryo Fibroblast), REF (Rat Embryo Fibroblasts) or MEF (Mouse Embryo Fibroblast). It is also possible to use avian stem cell lines, as described in WO 2008/129058).
  • the eukaryotic cells according to the invention come from cell lines.
  • the eukaryotic cells according to the invention come from one of the lines chosen from the immortalized cell lines NIH3T3, Vero, COS-7, the tumor lines Caco-2, CHO, PC12, HeLa, Jurkat, HL- 60, AtT20, GH3, HEK-293, HT29, HT-29, LNCap, MCF-7, MDA-MB-231, MDCK, Saos-2, Sf9, Sf21, S2, T-47D, U20S and EB66® lines. (Valneva, France). These cells are commonly used by laboratories working in the field.
  • said extract is a membrane extract.
  • the extract is a cytoplasmic extract.
  • Protocols for isolating membrane extracts have been described in the art (see, for example, Frohlich et al., J. Microbiol Methods 91 (2): 222-230, 2012) and can be used to obtain such extracts. They include two steps, a nitrogen cavitation first and a second immunoprecipitation with antibodies against LPS bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • Nitrogen cavitation allows eukaryotic cells to be lysed in a gentle manner without abrupt increase in temperature in the sample (Gott Kunststoff & Adachi, Methods Enzymol 322: 213-221, 2000).
  • some eukaryotic cell debris is removed by low speed centrifugation (between 3000 g and 6000 g), while the bacteria remain in the supernatant.
  • the method of the invention will therefore comprise an additional step of low speed centrifugation between the nitrogen cavitation step and the immunoprecipitation step with antibodies against LPS of the bacteria of the family of Chlamydiaceae. Gentle sonication in the ice can be used as well.
  • Antibodies against LPS have been described in the prior art (Herrera et al., Mol. Med. 9: 135-142, 2003). They make it possible to selectively isolate the bacterial membrane fraction in the immunoprecipitation step after lysing the eukaryotic cells while the bacterial cytoplasmic fraction remains in the supernatant.
  • the lysates are centrifuged at a rate of between 10,000 and 20,000 g, more preferably between 12,000 g and 18,000 g, still more preferably between 14,000 g and 17,000 g, and most preferably between 15,000 g and 16,000 g.
  • the cytoplasmic extracts can be obtained by subjecting the pellet to isopycnic ultracentrifugation, according to the conditions described by Frohlich et al. (J Microbiol Methods 91 (2): 222-230, 2012).
  • the vaccine compositions of the invention are particularly useful for preventing or treating infections by bacteria of the family Chlamydiaceae, as well as pathologies caused by said infections.
  • the vaccine compositions of the invention are particularly capable of triggering a specific immune reaction against bacteria of the family Chlamydiaceae. This reaction is characterized in particular by an immune response of T-lymphocytes specific for Chlamydia muridarum in the spleen. In response to an intravaginal infection with Chlamydia muridarum, these activated CD4 + and CD8 + LTs and regulatory T cells leave the spleen for the ganglia draining the genital tract.
  • the invention therefore also relates to bacteria of the family Chlamydiaceae and / or extracts thereof characterized in that said bacteria have been previously treated with at least one peptidoglycan inhibitor, especially at least one a ⁇ -lactam for their use in the prophylactic or therapeutic treatment of infections by bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • the invention also relates to the use of a composition comprising bacteria of the family Chlamydiaceae and / or extracts thereof characterized in that said bacteria have been previously treated with a peptidoglycan inhibitor, especially at least one ⁇ -lactam, for the manufacture of a medicament for the prophylactic or therapeutic treatment of infections of bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • the invention also relates to a method of treatment, preferably prophylactic, of infections by bacteria of the family Chlamydiaceae by a composition comprising bacteria of the family Chlamydiaceae and / or extracts thereof, said bacteria having been previously treated with a peptidoglycan inhibitor, especially at least one ⁇ -lactam.
  • said method of treatment comprises a step of administering said composition to a subject likely to be infected by bacteria.
  • this administration results in an increase in the population of activated specific CD4 + and CD8 + T lymphocytes activated in the spleen and their migration to the ganglia draining the infected genital tract.
  • this administration results in a decrease in the population of regulatory T lymphocytes in the spleen and an increase in the ganglia draining the infected genital tract.
  • this administration results in an increase in the activated specific effector CD4 + and CD8 + T cell population and their migration to the genital tract draining ganglia and a decrease in the regulatory T cell population in the spleen and an increase in the ganglia draining the infected genital tract.
  • infection with a bacterium of the family Chlamydiaceae or “infection with a Chlamydiaceae” means the presence in at least one cell of the body of the patient or the animal of said bacterium family Chlamydiaceae.
  • the infection can be genital, ocular, respiratory or pulmonary; it can also affect other sites, such as vascular endothelium or joints.
  • pathology caused by infection with bacteria of the family Chlamydiaceae is meant within the meaning of the invention any disease whose triggering is directly or indirectly caused by infection with at least one bacterium of the family Chlamydiaceae.
  • Chlamydiaceae in the sense of the invention are thus more particularly included in abortions and neonatal mortalities caused by Chlamydophila abortus, as well as conjunctivitis, keratoconjunctivitis, purulent rhinitis, enteritis, bronchopneumonia.
  • Chlamydia pneumoniae infections cause a form of pneumonia and that Chlamydophila psittaci is responsible for psittacosis. It is also known that infections by bacteria of the family Chlamydiaceae disseminate in the body causing many infections and atypical pathologies such as cardiovascular and circulatory dysfunctions (atheroma).
  • the pathologies caused by infection with bacteria of the family Chlamydiaceae are ocular pathologies or genital pathologies.
  • ocular pathologies caused by infection with bacteria of the family Chlamydiaceae include trachoma.
  • genital pathologies caused by infection with bacteria of the family Chlamydiaceae include lymphogranuloma venereum or Durand-Nicolas-Favre disease.
  • genital pathologies in humans caused by infection with bacteria of the family Chlamydiaceae include pathologies such as urethritis and orchi-epididymitis. These can lead to a decrease in male fertility.
  • an infection by bacteria of the family Chlamydiaceae cause in the female genital pathologies such as cervico-vaginitis, cervicitis, endocervites, urethritis, endometritis or peri-hepatitis, which can lead to complications such as high genital infections and, in particular, salpingitis that can evolve, among other things, towards the formation of pyosalpinx and hydrosalpinx, which cause total obstruction of the fallopian tubes.
  • Salpingitis is the main risk factor for tubal infertility and ectopic pregnancy in women.
  • compositions furthermore comprising other active ingredients, or a mixture of active principles, thus allow a better protection of the general health of the subjects, and consequently a better protection against infections by the bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • the composition further comprises another active ingredient.
  • this other active ingredient is, within the meaning of the invention, another vaccine composition.
  • vaccine compositions that may reduce the risk of pneumococcal infections, tetanus, polio, influenza, diphtheria, pertussis, hepatitis B, hepatitis A, HPV (Human papilloma virus), tuberculosis (for example by Bacille Calmette Guerin). More preferably, said other vaccine composition is capable of increasing, in vaccinated individuals, the amplitude and speed of the protective immune response.
  • compositions according to the invention will also be able to choose the best routes and modes of administration of the composition according to the invention, as well as optimal dosages and galenic forms, according to the criteria generally taken into account in the manufacture of a medicament or the establishment of a pharmaceutical or veterinary treatment.
  • these compounds will be administered systemically, in particular intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally or subcutaneously, orally, or topically (by means of gel, aerosols, drops, etc. .).
  • parenterally for example subcutaneous, intradermal, or intramuscular
  • mucosal eg intranasal, sublingual, intravaginal, transcutaneous.
  • the pharmaceutical composition of the invention will be administered repeatedly, spread over time. Its mode of administration, its dosage and its optimal dosage form can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a treatment adapted to a patient such as the age or the body weight of the patient, the gravity general condition, tolerance to treatment and side effects noted.
  • the composition according to the invention is prepared in any galenical form known to those skilled in the art, for example in liquid or gel form, such as solutions, suspensions, syrups, or in the form of a spray, or in solid form, such as in the form of tablets, microspheres, or capsules.
  • the composition according to the invention is prepared in the form of a solution or an injectable suspension. According to a variant of the invention, the composition is freeze-dried in order to be supplied or prepared in solid form.
  • the solution according to the invention is administered at a therapeutically effective dose, in particular at an immunogenic dose that is to say capable of inducing an antigen-specific immune response.
  • the antigen-specific immune response can be measured by any technique known to those skilled in the art.
  • the antigen-specific immune response is evaluated by measuring the concentration of antibodies (immunoglobulins or Ig) specific for the bacterium of the family Chlamydiaceae used, in the subject, in particular IgM, IgG and IgA, at a given time after the last administration of the composition, by Elisa or Elispot test.
  • the antigen-specific immune response is evaluated from biological samples of the subject, such as, for example, blood, serum, tears or vaginal secretions.
  • the composition according to the invention is administered according to a vaccination scheme comprising several administrations.
  • the composition is administered repeatedly between 2 and 4 times over a period of 15 to 90 days, and then one or more booster administrations are carried out between 1 and 10 years from the first administration. .
  • the composition according to the invention further comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the composition according to the invention may further comprise diluents, such as sodium, calcium carbonate, or lactose, for example, lubricating agents, such as, for example, magnesium stearate, dyes, flavoring agents, texturizing agents, antibiotics, for example thimerosal or antibiotics of the ⁇ -lactam family, proteins, in particular albumin or ovalbumin, stabilizers, such as monosodium glutamate (MSG) and 2-phenoxyethanol.
  • a fourth aspect of the invention also relates to a method for in vitro diagnosis of infection with a bacterium of the family Chlamydiaceae in a subject, comprising the steps of: a) contacting a sample of said subject with a bacterium of the family Chlamydiaceae previously treated with at least one peptidoglycan inhibitor, in particular a ⁇ -lactam, and
  • said method comprises the steps of: a) bringing said sample into contact with specific antibodies of said bacterium generated against said bacterium previously treated with a peptidoglycan inhibitor, especially a ⁇ lactamine, said antibodies comprising a label producing a detectable signal, or being attached to a detectably labeled reagent;
  • the invention relates to a diagnostic kit for the detection of infection with a bacterium of the Chlamydiaceae family, comprising said bacterium previously treated with a peptidoglycan inhibitor, in particular a ⁇ -lactamine, together with substances for performing a humoral immunity determination assay against said bacterium, in a unit packing container.
  • a diagnostic kit for the detection of infection with a bacterium of the Chlamydiaceae family comprising said bacterium previously treated with a peptidoglycan inhibitor, in particular a ⁇ -lactamine, together with substances for performing a humoral immunity determination assay against said bacterium, in a unit packing container.
  • the diagnostic kits according to the invention include without limitation the kits for immunological methods such as immunohistochemistry, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), "western blotting", immunoenzymometry, immunofluorometry, immunoluminometry, immunoradiometry ( IRMA), ⁇ (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), lateral flow immunoassay, dipstick tests, immuno histo / cyto-chemistry and all other tests that are known to those skilled in the art.
  • immunological methods such as immunohistochemistry, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), "western blotting", immunoenzymometry, immunofluorometry, immunoluminometry, immunoradiometry (IRMA), ⁇ (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), lateral flow immunoassay, dipstick tests, immuno histo / cyto-chemistry and all other tests that are known to those skilled in the art.
  • immunological methods such as immunohistochemistry, ELISA (Enzy
  • the invention therefore also provides, according to a sixth aspect, the use of a bacterium of the family Chlamydiaceae previously treated with a peptidoglycan inhibitor, especially a ⁇ -lactam, as an in vitro diagnostic reagent in a binding, optionally in a diagnostic kit, for the detection of neutralizing antibodies conferring immunity against said bacterium. It also relates to the use of antibodies specific for a bacterium of the family Chlamydiaceae generated against said bacterium previously treated with a peptidoglycan inhibitor, especially a ⁇ -lactam, as an in vitro diagnostic reagent in a binding assay , possibly in a diagnostic kit, for the detection of said bacterium.
  • the present invention also includes other features and advantages which will emerge from the examples which follow, and which should be considered as illustrating the invention without limiting its scope.
  • Figure 1 Vaccine efficacy of BL forms.
  • BL forms result in a significant decrease in the number of infected mice.
  • Figure 2 Proportion of animals from different immunization groups (Mefs, b-Lac, b-Lac / 3, De) with vaginal loss of Chlamydia muridarum at different times after infection. °: p ⁇ 0.08; * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.005 compared to the Mefs group (Mann Whitney test).
  • Figure 3 A-Characterization of cell loss at the lamina intestinal of the uterine horns of mice, uterine horn normal grade 0, (A), grade 1 (B), grade 2 (C), grade 3 (D), snapshots taken at 10X magnification.
  • Figure 5 Number of total CD4 + T lymphocytes, and activated after complete immunization by the vaccine forms.
  • the total number of CD4 + T lymphocytes (A) as well as the number of CD4 + T lymphocytes exhibiting activation markers are shown by focusing on the membrane expression of CD25 (B), CD44 hl CD62L 10W (C) , ICOS + (D) and the intracellular expression of FoxP3 to highlight the regulatory T cell population (E).
  • Figure 6 Number of total CD8 + T lymphocytes, and activated after complete immunization by the vaccine forms.
  • the total number of CD8 + T cells (A), as well as the number of CD8 + T lymphocytes exhibiting activation markers are shown by focusing on the membrane expression of ICOS (B), and CD44 hl CD62L 10W ( VS).
  • Unpaired t-test the symbols *, represent the measurements of the p values resulting from the tests carried out with respect to the MEF control (* p ⁇ 0.05,).
  • ns or the absence of stars indicates the absence of statistically significant differences between the group of control animals immunized with sonicate of uninfected MEF cells and the group of control animals injected with PBS alone, or between the MEF and b-Lac groups, or MEF and De.
  • Figure 8 Number of total CD4 + and CD8 + T splenic lymphocytes, and activated after complete immunization with the vaccine forms and one week after intra-vaginal Chlamydia infection muridarum.
  • the total number of CD4 + (A) and CD8 + (D) T lymphocytes and their activation profile are here represented by looking at the number of CD25 + T cells among the CD4 + T (B) and CD8 + T T cells.
  • the total number of CD4 + (A) and CD8 + (E) T lymphocytes, as well as their activation profile, are here represented by focusing on the CD4 + CD25 + (C) and ICOS + (D) lymphocyte population, and to the number of CD4 + T lymphocytes and CD8 + CD44 hi CD62L 10W (B and F respectively).
  • Unpaired t-test the symbols *, **, represent the measurements of the p values resulting from the tests carried out with respect to the MEF control (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01,).
  • the symbol "ns" or the absence of stars indicates the absence of statistically significant differences between the group of control animals immunized with sonicate of uninfected MEF cells and the group of control animals injected with PBS alone, or between the MEF and b-Lac groups, or MEF and De.
  • Figure 10 The number of proliferating CD4 + and CD8 + T lymphocytes in the ganglia draining the genital tract and the spleen after complete immunization with the vaccine forms and one week intravaginal post-infection with Chlamydia muridarum.
  • the total number of proliferating CD4 + (A) and CD8 + (B) T lymphocytes in the ganglia draining the genital tract (I) and the spleen (II) is presented here.
  • Unpaired t-test The "ns" symbol or absence of stars indicates no statistically significant differences between the group of control animals immunized with uninfected MEF sonicate and the group of control animals injected with PBS alone, or between the MEF and b-Lac groups, or MEF and De.
  • Figure 1 Number of total and proliferating CD4 + regulatory T lymphocytes in the ganglia draining the genital tract and the spleen after complete immunization by the vaccine forms and one week post-infection.
  • the total number of total regulatory (T) and proliferative (B) regulatory CD4 + (T) lymphocytes in the ganglia draining the genital tract (I) and the spleen (II) is presented here.
  • Unpaired t-test The symbols represent the measurements of the p values from the tests performed with respect to the MEF control (* p ⁇ 0.05,).
  • the symbol "ns" or the absence of stars indicates the absence of statistically significant differences between the group of control animals immunized with sonicated uninfected MEF cells and the group of control animals injected with PBS alone, or between the MEF and b-Lac groups, or MEF and De EXAMPLES
  • C57BL / 6J mice were vaccinated with different compositions and then secondarily infected with bacteria of the family Chlamydiaceae.
  • the different bacterial forms were produced in embryonic fibroblasts from C57BL / 6J mice.
  • embryonic fibroblasts from C57BI / 6 mice with Chlamydia muridarum (Cm) were infected in vitro.
  • This strain is genetically very close to Chlamydia trachomatis. It infects the mouse and the guinea-pig but not the human species, and causes the same physiopathological sequelae in the genital tract as in humans.
  • C1 -composition comprising an infectious form of Cm or also called virulent form (72 h in vitro cell infection and removal of the cell lysate)
  • This form is a BL form and in particular a b-Lac form.
  • IP intraperitoneally
  • 4 groups were injected intraperitoneally (IP) one or more times with one of the compositions, and then the 4 groups were infected vaginally with the infectious form of Cm.
  • the amount of composition used for each injection corresponded to about 10 cm 2 of cells (MEF) cultured in vitro, 100% infected, in a volume of 150 ⁇ by IP injection.
  • mice an IP injection (at the time to) of the form 1 of the bacterium.
  • t0 + 39j vaginal infection with 1 million IFU of Cm.
  • mice 3 mice: three IP injections (to, to + 10j, to + 21 j) of the form 2 of the bacterium. At t + 39j, vaginal infection with 1 million IFU of Cm.
  • mice 4 mice: three IP injections (to, to + 10j, to + 21 j) of the form 3 of the bacterium. At t + 39j, vaginal infection with 1 million IFU of Cm.
  • mice After infection, the mice were kept isolated for 82 days, without any antibiotic treatment, in order to allow pathophysiological sequelae to develop. The mice were then sacrificed and examined: macroscopic appearance of the genital tract, search for tissue lesions (hydrosalpinx, deformities, fluid cysts,), measurement of the weight of the spleen, removal of various organs (including para-aortic lymph nodes draining uterus) for further analysis. Results obtained:
  • mice 3/4 of the mice had tissue lesions of the upper genital tract on at least one of the 2 uterine horns (spleen 106 +/- 3g, normal para-aortic lymph nodes)
  • mice 1/3 of the mice had tissue lesions of the upper genital tract on at least one of the 2 uterine horns (spleen 14 +/-
  • Group 3 2/3 of the mice had tissue lesions of the upper genital tract on at least one of the uterine horns (280 +/- 81 g spleen, normal para-aortic lymph nodes). A mouse was sacrificed 60 days after infection because it had skin wounds and significant weight loss, potentially unrelated to experience.
  • Group 4 no mice had tissue damage of the upper genital tract (111 +/- 17g spleen, normal para-aortic lymph nodes)
  • mice show sequelae (tissue damage of the genital tract)
  • mice show sequelae (tissue damage of the genital tract)
  • mice show sequelae (tissue damage of the genital tract)
  • mice show sequelae (tissue damage of the genital tract)
  • mice ⁇ 0/5 mice (0%) have sequelae (tissue damage of the upper genital tract)
  • mice have sequelae (tissue lesions of the upper genital tract
  • mice have sequelae (tissue damage of the upper genital tract)
  • mice 4 groups of 10 female mice were immunized by intraperitoneal injection on D0, J0 + 10, JO + 21 with either an extract of C57 / BL6 mouse embryonic fibroblasts (Mefs) or with the b-Lac (b-Lac) form. either with the Lac form diluted to one third of the usual dose (b-Lac / 3), or with the form De (De).
  • Mefs C57 / BL6 mouse embryonic fibroblasts
  • b-Lac b-Lac
  • Lac form diluted to one third of the usual dose
  • De De
  • the animals were cycled by subcutaneous injection of 50 ⁇ l of Deprovera (50 mg / ml, Pfizer).
  • mice in the b-Lac group have no macroscopic lesions.
  • the uterine horns were fixed with paraformaldehyde, dehydrated and paraffin embedded. Longitudinal sections were stained with HPS (Hemalum Phloxine, Saffron) to highlight the different structures of the uterine horn (myometrium and endometrium including epithelium and lamina propria).
  • HPS Hemalum Phloxine, Saffron
  • the selection strategy (gating) of CD4 + T or CD8 + T lymphocyte populations used was as follows: FSC / SSC (diffraction of light emitted at small angles and at 90 °), Singulets (elimination of cell doublets), CD19 negative (exclusion of B lymphocytes), CD3 + (selection of T cells carrying a TCR) and CD4 + (CD4 + T lymphocytes) or CD8 + (CD8 + T lymphocytes).
  • the study of the number of CD4 + regulatory T cells (Treg) was performed after permeabilization of splenocytes and intracellular labeling of the FoxP3 molecule.
  • the gating strategy of the regulatory CD4 + T cells (Treg) used was FSC / SSC, Singulets, CD19 negative (B-cell exclusion), Fixable Viability Dye + (viable cell selection), CD3 + (T-lymphocytes). ), CD4 + (CD4 + T cells) and FoxP3 + (Treg selection, a strong expression of FoxP3 is a specific marker for Tregs).
  • Statistical analyzes were performed using the GraphPad Prism software.
  • the total numbers of lymphocytes, or CD4 + or CD8 + T cells are not significantly different between the different groups ( Figures 4, 5A, 6A).
  • the number of activated CD4 + CD44 hi CD62L 10W T cells is significantly increased following immunization with the b-Lac vaccine form only ( Figure 35).
  • the ICOS expression profile on CD4 + T cells also shows a very significant increase in the number of CD4 + ICOS + T cells (ICOS being a marker reflecting the inflammatory potential of CD4 + T cells) ( Figure 5).
  • the FoxP3 intracellular labeling shows a decrease in the CD4 + regulatory lymphocyte population, significant in terms of numbers following immunization with the vaccine form De.
  • mice After complete immunization (three immunizations at one week interval each), the mice were cycled by an injection of progesterone (Deprovera, 50 ⁇ per mouse) and infected with Chlamydia muridarum intravaginally at 10 7 IFU. After one week post-infection, the mice were sacrificed and tested individually. Splenocytes and ganglia draining the genital tract (inguinal / para-aortic / mesenteric) were recovered and isolated. The activation profile and the number of CD4 + and CD8 + T lymphocytes were studied by flow cytometry as indicated in the previous paragraph (part 1) by focusing on the expression of CD25, CD62L, CD44 and ICOS.
  • Figure 7 shows the total number of lymphoid cells of the lymph nodes draining the genital tract and spleen from the 4 PBS, MEF, b-Lac or De groups. It is very clear that immunization with the b-Lac form followed intravaginal mice resulted in a marked increase in the number of draining lymphocytes (p ⁇ 0.05) and a marked decrease in the spleen (p ⁇ 0.01).

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Abstract

La présente invention a pour objet des compositions vaccinales pour traiter et/ou prévenir les infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae, lesdites compositions comprenant des bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, ou des extraits desdites bactéries traitées.

Description

COMPOSITION VACCINALE CONTRE LES INFECTIONS A CHLAMYDIACEAE
INTRODUCTION
Les infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, qui peuvent toucher les hommes ou les animaux, sont responsables d'un ensemble de pathologies particulièrement graves.
La chlamydiose est la plus fréquente des maladies sexuellement transmissibles d'origine bactérienne avec près de 106 millions de nouveaux cas par an. Des traitements efficaces par antibiotiques existent mais cette maladie est souvent asymptomatique (75% des femmes et 50% des hommes). La plupart des patients n'est donc pas traitée car non diagnostiquée et les conséquences d'une infection non traitée peuvent être graves (stérilité, grossesses extra-utérines, accouchements prématurés, infections néonatales).
Ainsi, le développement d'un vaccin est un enjeu sanitaire majeur afin d'éradiquer la maladie.
Il n'existe à ce jour aucun vaccin efficace pour prévenir les infections à Chlamydiae chez l'Homme. Différentes stratégies vaccinales ont été menées ces vingt dernières années mais des problèmes de faible immunogénicité (vaccins antigéniques, formes inactivées) ou réglementaires (formes vivantes atténuées pouvant être réactivées) n'ont pas permis à ces vaccins d'être testés en phase clinique.
La famille des Chlamydiaceae comprend deux genres, Chlamydia et Chlamydophila, eux-mêmes comprenant chacun plusieurs espèces ; chaque espèce se compose de différents biovars et sérovars. Chacune de ces espèces conduit à un ensemble de pathologies invalidantes chez l'homme ou les animaux, voire mortelles dans le cas des infections par C. psittaci.
Les bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont des bactéries gram négatives. Elles sont dites « intracellulaires strictes » car ne pouvant croître et se multiplier que dans une vacuole parasitophore au sein d'une cellule eucaryote infectée. Au cours de leur développement, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae se présentent sous deux formes : • Le corps élémentaire (CE), qui est la forme infectieuse et ne se divise pas, et
• Le corps réticulé (CR), non infectieux, strictement intracellulaire et qui se divise par fission binaire.
Le CE pénètre la cellule hôte au sein d'une vésicule. Si plusieurs CE infectent la même cellule, les vésicules généralement se regroupent au niveau du centrosome et fusionnent entre elles pour former l'inclusion. Après 5 à 12 heures d'infection, les CE se différencient en CR qui se multiplient activement. Après 30 à 40 heures, les CR se transforment en CE ; l'inclusion et la cellule hôte sont ensuite lysées, libérant la progéniture bactérienne qui va infecter les cellules voisines. Tous ces paramètres peuvent varier d'un sérovar et d'une espèce bactérienne à l'autre, et en fonction des conditions expérimentales (Fields, K. A. & T. Hackstadt, Annu Rev Cell Dev Biol 18: 221 -45, 2002).
Au cours de son cycle de développement, la bactérie met en place de nombreuses stratégies afin de survivre dans la cellule hôte. La bactérie Chlamydia inhibe notamment l'apoptose de la cellule hôte induite par les signaux externes, inhibe la fusion des lysosomes avec l'inclusion bactérienne, déroute le trafic vésiculaire vers la vacuole pour permettre la croissance de celle-ci, et injecte dans le cytoplasme de multiples facteurs de virulence, dont une protéase clef (Chlamydia protease/proteasome-like activity factor, CPAF) qui induit la dégradation de nombreuses protéines eucaryotes, des facteurs de transcription des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, responsables de la présentation des antigènes aux cellules du système immunitaire.
A ces mécanismes développés au cours d'un cycle bactérien continu s'ajoute le phénomène de persistance. En réponse à certains stress dans l'environnement cellulaire, tels que la présence de certains antibiotiques ou de l'Interféron gamma (IFN-γ) ou l'absence de fer, la bactérie arrête son cycle bactérien et son mécanisme prolifératif, devenant ainsi un corps persistant, viable mais non cultivable in vitro. La persistance rend compte d'un haut niveau d'interaction entre le pathogène et l'hôte et permettrait à la bactérie de pouvoir rester vivante, ou dormante (« persistante »), dans l'organisme pendant des mois, voire des années. En effet, bien qu'il soit très difficile de mettre en évidence la persistance in vivo, de multiples études permettent de penser qu'une bactérie Chlamydia peut exister pendant plusieurs années au sein d'un tissu tel que le tractus génital, la muqueuse conjonctive ou le tissu vasculaire, engendrant ainsi infections récurrentes et inflammation chronique (Beatty et al. , Microbiol Rev 58(4): 686-99, 1994; Kern et al. , FEMS Immunol Med Microbiol. 55(2): 131 -9, 2009). Le taux élevé d'infections asymptomatiques et la sévérité des pathologies justifient la recherche active d'un vaccin sûr et efficace pour le contrôle des infections à Chlamydia. A ce jour, une quarantaine d'essais vaccinaux ont été réalisés principalement chez la souris, en utilisant soit des bactéries inactivées ou des antigènes purifiés ou protéines antigéniques recombinantes, voire des vaccins à ADN (voir par exemple Hafner et al. , Vaccine, 32(14) : 1563-1571 , 2014, Farris et al. , Infection and Immunity, 79 : 986-996, 201 1 , Schautteet et al. , Infect. Dis. Obstet. Gynecol. , 201 1 :963513, 201 1 ; Campos et al., In vision and ophtalmology, 36(8) 1477-1491 , WO 92/00096 ; Lu Hang et al. , The Journal of Immunology, 169(1 1 ), 6324-6331 ). Aucun n'a donné de résultat convaincant. Il est convenu qu'une forme atténuée de la bactérie pourrait être la base d'un excellent vaccin. Malheureusement les Chlamydiaceae ne peuvent pas être transformées et très peu de souches atténuées expérimentalement ont pu être isolées.
Actuellement aucun vaccin n'existe sur le marché pour prévenir les infections à Chlamydiaceae chez l'homme. Le caractère asymptomatique d'un grand nombre d'infections par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae et la sévérité des pathologies développées justifient la recherche d'un vaccin préventif sûr et efficace, c'est-à-dire qui présente une grande immunogénicité tout en garantissant un faible risque d'infection par le sujet.
Les inventeurs ont trouvé que, de façon très surprenante et contrairement aux préjugés établis, les formes de Chlamydiaceae inactivées par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment des β-lactamines ou la D-cyclosérine peuvent être utilisées de façon très efficace pour fabriquer des médicaments pour le traitement prophylactique des infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.
DESCRIPTION DE L'INVENTION Les inventeurs ont précédemment montré que le traitement de cultures cellulaires infectées par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, par des inhibiteurs du peptidoglycane, notamment par les β-lactamines, conduit à la formation de formes bactériennes anormales, les formes BL, qui ont perdu toute infectiosité (WO 201 1 /086134 ; Dumoux et al. , PLoS One. 8(12):e8351 1 , 2013). Ces résultats ont été ultérieurement confirmés par d'autres laboratoires. (Ouellette et al. , Mol Microbiol. 85(1 ): 164-178, 2012 ; Pilhofer et al. , Nat Commun. 4:2856, 2013 ; Liechti et al. , Nature. 506(7489) : 507-510, 2014). Les inventeurs ont maintenant trouvé que, de façon tout à fait surprenante, les formes BL présentent toujours des antigènes natifs, alors même que ces formes sont anormalement dilatées et ne sont absolument plus infectieuses. L'injection de formes BL à des souris permet ainsi de protéger ces animaux contre des infections ultérieures par des bactéries infectieuses. Cette forme BL représente donc une forme inactivée utilisable pour immuniser des individus naïfs, susceptibles d'être infectés par les Chlamydiaceae.
Les inventeurs ont montré que la forme BL obtenue par traitement des bactéries de la famille des Chlamydiaceae par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment par une β-lactamine, est immunogène. Le terme « immunogène » tel qu'on l'entend ici se rapporte à la capacité d'une molécule de déclencher une réponse immunitaire, que celle-ci soit humorale ou à médiation cellulaire ou encore les deux. Une réponse immunitaire à une forme bactérienne immunogène, telle qu'entendue ici, signifie le développement chez un sujet d'une réponse immunitaire humorale et/ou à médiation cellulaire à une ou des molécules présentes dans ladite forme bactérienne (par exemple, un antigène, comme une protéine, un glycolipide (LPS) ou un polysaccharide). On entend par « réponse immunitaire humorale » une réaction immunitaire dont les effecteurs sont des molécules solubles, comme par exemple les anticorps. Ceux-ci sont notamment produits par les plasmocytes et les lymphocytes B. Une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » au sens de l'invention est une réaction immunitaire dont les effecteurs sont des cellules telles que les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules T tueuses ou les cellules T helper. Une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » au sens de l'invention comprend aussi la production de cytokines, chimiokines et autres molécules similaires produites par les cellules T activées et/ou d'autres cellules hématopoïétiques, y compris celles dérivées de lymphocytes T CD4+ ou CD8+, et/ou des cellules épithéliales. La capacité d'un antigène ou d'une forme bactérienne particulière de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire peut être aisément déterminée par l'homme du métier. Il existe dans l'art un grand nombre de tests à cet effet (voir par exemple, Erickson et al. , J. Immunol. 1 51 : 4189-4199, 1993; Doe et al. , fur. J. Immunol. 24 : 2369-2376, 1994).
En particulier, la forme BL de la présente invention est susceptible de déclencher une réponse immunitaire de lymphocytes B producteurs d 'anticorps et de lymphocytes-T (LT) spécifiques des Chlamydiae dans la rate. En réponse à une infection intra-vaginale par Chlamydia, ces LT effecteurs activés (effecteurs ou régulateurs) sont susceptibles de quitter la rate pour les ganglions drainant le tractus génital siège de l'infection.
Selon un premier aspect, l'invention a pour objet une composition vaccinale comprenant des bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment par une β-lactamine, ou des extraits de celles-ci pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d 'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.
Par « famille des Chlamydiaceae », on entend au sens de l'invention l'ensemble taxonomique composé de deux genres, Chlamydia et Chlamydophila, tel que défini dans Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol. 51 (Pt 1 ):203-20, 2001 . De même, par « genre Chlamydia », on entend au sens de l'invention l'ensemble taxonomique comprenant les espèces Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis et Chlamydia muridarum, et par « genre Chamydophila », l'ensemble taxonomique composé des espèces Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila felis et Chlamydophila pneumoniae (Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol. 51 (Pt 1 ):203-20, 2001 ). I l est bien connu de l'homme du métier que ces espèces ont des spectres d 'hôtes distincts : par exemple, Chlamydia trachomatis et Chlamydophila pneumoniae sont responsables d 'infections chez l'homme, Chlamydia suis chez le porc et Chlamydophila abortus chez les ruminants. L'invention n'est pas limitée à une espèce bactérienne spécifique, mais peut être appliquée à n'importe laquelle des espèces de la famille des Chlamydiaceae et, en particulier, à celles mentionnées ci-dessus.
Divers adjuvants sont couramment utilisés dans la fabrication de compositions vaccinales afin d'en augmenter l'immunogénicité, par exemple en stimulant le système immunitaire. Au sens de l'invention, le terme « adjuvant » décrit toute substance ajoutée pour accélérer, prolonger, renforcer ou modifier la qualité de la réponse immune spécifique induite par la composition selon l'invention quand l'adjuvant et la composition selon l'invention sont utilisés conjointement. Les adjuvants sont ainsi des produits qui augmentent les réactions du système immunitaire inné et adaptatif, lorsqu'ils sont administrés en présence d'antigènes d'origine virale, bactérienne ou synthétique. Ils provoquent l'attraction massive de macrophages au site d'injection, puis dans les ganglions lymphatiques, activent les cellules dendritiques, accroissent la production d'immunoglobulines spécifiques, les anticorps, et stimulent de nombreuses cellules impliquées dans les mécanismes de la défense immunitaire. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. Les adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier et pourront être choisis en fonction de propriétés propres et intéressantes de ces adjuvants, telles que celles décrites par Petrovsky et al. , Immunology and Cell Biology, 82: 488-496, 2004 ou encore Vermout et al. , Ann. Méd. Vét. 147: 393-401 , 2003. Il est bien connu par ailleurs que les adjuvants de l'immunité peuvent être adaptés en particulier en fonction de la voie d'administration choisie.
L'adjuvant selon l'invention sera par exemple choisi parmi des constituants bactériens, des toxines bactériennes, des adjuvants huileux, des adjuvants minéraux, des oligodésoxynucléotides CpG, des saponines, des adjuvants vésiculaires ou nanoparticulaires, des copolymères synthétiques, des aminés lipophiles, des cytokines, des imidazoquinolones, ou des polysaccharides.
Parmi les constituants bactériens utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera par exemple : - le bacille de Calmette-Guérin ou BCG, qui comprend une souche de Mycobacterium bovis atténuée
- Le muramyl dipeptide (N-acétylmuramyl-l-alanyl-D-isoglutamine) ou MPD, ainsi que ses dérivés synthétiques
- Le tréhalose dimycolate ou TMD
- L'endotoxine des bactéries gram négatives, aussi dite lipolysaccharide ou LPS et son dérivé le monophosphoryl lipide A ou MPL. Parmi les toxines bactériennes utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'illustration :
- La toxine cholérique de Vibrio cholerae (CT), en particulier sa sous-unité B purifiée (CTB).
- La toxine pertussique de Bordetella pertussis (PT) sous forme inactivée
- La lymphotoxine thermolabile de Escherichia coli (LT)
Parmi les adjuvants huileux utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'illustration :
- Les adjuvants huileux à base de squalène comme par exemple TiterMax (commercialisés sous ce nom par Vaxcel Norcross Georgia USA) ou RIBI adjuvant System (produit commercialisé sous ce nom par Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana USA).
Parmi les adjuvants minéraux utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'alun, nom communément utilisé pour désigner les composés hydroxyde d'aluminium et phosphate d'aluminium, le phosphate de potassium ou le phosphate de calcium.
Parmi les saponines utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple celles extraites de l'écorce de Quillaja saponaria molina (Quil A), préférentiellement les formes purifiées QS-21 et QS-7 (voir pour référence Kensil et al. Dev Biol Stand. ;92:41 -7. 1998).
Parmi les copolymères synthétiques utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple les copolymères synthétiques amphipathiques composés de chaînes hydrophiles de polyoxyéthylène (POE) et de chaînes hydrophobes de polyoxypropylène (POP) ou le dimethyldioctadecylammonium bromide ou chloride, (DDA).
Parmi les aminés lipophiles utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'avridine.
Parmi les cytokines utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'histamine, l'interféron, en particulier l'INFa, les interleukines, en particulier l'IL-1 et l'IL-2. Parmi les imidazolquinolones utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'imiquimod ou le resiquimod.
Parmi les polysaccharides utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple les dextrans, les mannanes, les glucanes, les chitosanes. Selon l'invention, l'adjuvant est aussi par exemple l'hévéa, TAS03 (composé de squalène, de DL-a-tocophérol, et de polysorbate), le MF59C.1 (composé de polysorbate 80, squalène, trioléate de sorbitan, citrate de sodium, acide citrique et eau).
Les inventeurs ont découvert que, de façon surprenante, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae traitées par les inhibiteurs du peptidoglycane, notamment par les β-lactamines, de même que les fragments de ces bactéries, sont très immunogènes. De fait, les compositions vaccinales comprenant ces bactéries inactivées induisent une très bonne protection des souris contre les infections vaginales par Chlamydia muridarum. Les inventeurs ont notamment montré que l'administration répétée des compositions vaccinales de l'invention entraîne une réponse immunitaire des lymphocytes-T spécifique de Chlamydia muridarum dans la rate. En réponse à une infection intra- vaginale par Chlamydia muridarum, ces LT CD4+ et CD8+ activés et les lymphocytes T régulateurs (CD4+ FoxP3+) quittent la rate pour les ganglions drainant le tractus génital.
On entend ici par « cellules T » ou « lymphocytes T » un type de lymphocytes jouant un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire. Les lymphocytes T peuvent être distingués des autres lymphocytes, tels que les cellules B et les cellules tueuses naturelles (cellules NK), par la présence d'un récepteur de lymphocytes T (TCR) sur la surface cellulaire. Un «récepteur des cellules T » ou "TCR" tel qu'utilisé ici est un récepteur présent sur la surface des cellules T qui est responsable de la reconnaissance spécifique des antigènes présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). On distingue des lymphocytes T CD4+ qui expriment la glycoprotéine CD4 sur leur surface, des lymphocytes T CD8+ caractérisés par l'expression de la glycoprotéine CD8. Un « lymphocyte T effecteur » au sens de l'invention est un lymphocyte T assurant une fonction spécialisée dans la réponse immunitaire, telle que la sécrétion de cytokines ou encore l'aide aux lymphocytes B dans la fonction humorale (lymphocytes T CD4+ encore appelés lymphocytes T auxiliaires) ainsi qu'une activité cytotoxique (lymphocytes T CD8+). Des marqueurs de surface surexprimés (ICOS, CD44) ou sous-exprimés (CD62L) marquent l'état d'activation de lymphocytes T effecteurs. Les « lymphocytes régulateurs » au sens de l'invention sont des cellules T qui expriment fortement les marqueurs de la surface CD4 et CD25. Ces cellules expriment également le marqueur FOXP3 qui est un facteur de transcription (Battaglia et Rancarolo 2009). Ces lymphocytes régulateurs sont donc CD4+ CD25highFOXP3high. Ces cellules sont caractérisées par une capacité à supprimer ou réguler négativement les réactions immunitaires médiées par les cellules T effectrices, telles que effectrices CD4+ ou CD8+.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition vaccinale pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact, in vitro, de bactéries, de préférence des bactéries intra-cellulaires de la famille des Chlamydiaceae avec au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une B-lactamine. On entend au sens de l'invention par inhibiteur du peptidoglycane tout composé capable d'inhiber la synthèse du peptidoglycane ou d'affecter la structure de celui- ci. Les inhibiteurs du peptidoglycane au sens de l'invention comprennent entre autres la D-cyclosérine (d-4-amino-3-isoxazolidinone), la vancomycine, la teicoplanine, la bacitracine, la daptomycine, les B-lactamines. Un « inhibiteur du peptidoglycane » au sens de l'invention est préférablement la D-cyclosérine ou une B-lactamine.
On entend ici par B-lactamine tout antibiotique qui contient un noyau B-lactamine dans sa structure moléculaire. Sont ainsi compris dans les B-lactamines au sens de l'invention aussi bien les dérivés de la pénicilline que les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes ou les inhibiteurs de la B-lactamase. En particulier, la B-lactamine selon l'invention peut être la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V) , l'ampicilline (pénicilline A), la benzatine benzylpénicilline, la méticilline, la dicloxacilline, la flucloxacilline, la co- amoxiclav (amoxycilline + acide clavulanique), la pipéracilline, la ticarcilline, l'azlocilline, la carbénicilline, la céphalexine, la céphalotine, la céphazoline, le céfaclor, le céfuroxime, le céfamandole, le cefotetan, la cloxacilline, le céphadroxil, la céfixime, le cefoxitin, la ceftriaxone, le céfotaxime, la ceftazidime, le céfépime, le cefpirome, l'imipénème, l'imipénème en association avec la cilastatine, la céfixime en association avec l'imipénème, le méropénème, le mécillinam, l'ertapénème, l'aztréonam, l'acide clavulanique, le tazobactam ou le sulbactam. Dans un aspect préféré de l'invention, ladite B-lactamine n'est pas l'amoxicilline. Selon un mode de réalisation plus préféré de l'invention, ladite B-lactamine est choisie dans le groupe constitué de la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la cloxacilline, le céphadroxil, la céfixime, l'imipénème, la céfixime en association avec l'imipénème, le mécillinam, l'acide clavulanique, le tazobactam et le sulbactam. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ladite B-lactamine est la pénicilline G. L'homme du métier pourra facilement déterminer les conditions du traitement des bactéries par les inhibiteurs du peptidoglycane, particulièrement par les B-lactamines, qui permettent d'obtenir les formes BL qui sont utilisées dans la composition vaccinale. L'effet des β- lactamines sur le phénotype des Chlamydiaceae notamment est connu depuis les années 1970. De façon générale, l'homme du métier pourra s'appuyer sur l'enseignement des publications des inventeurs, ainsi que celles des autres laboratoires ayant montré un effet des B-lactamines sur les Chlamydiaceae (WO 201 1 /086134 ; Dumoux et al. , PLoS One. 8(12):e8351 1 , 2013 ; Ouellette et al. , Mol Microbiol. 85(1 ): 164-178, 2012 ; Pilhofer et al. , Nat Commun. 4:2856, 2013 ; Liechti et al. , Nature. 506(7489) : 507-510, 2014). En particulier, la concentration d'inhibiteur du peptidoglycane, notamment de 6 lactamine, à utiliser pour obtenir les formes BL pourra être aisément évaluée en se basant sur les publications de l'art antérieur, notamment les publications des inventeurs.
Par exemple, une concentration d'au moins 100 μΜ, préférentiellement au moins 200 μΜ, de D-cyclosérine permet de générer des formes BL.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la β-lactamine est utilisée à une concentration supérieure ou égale à 0,1 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 0,3 μΜ. Selon une première variante de l'invention, le céphadroxil ou le sulbactam est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 3 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 10 μΜ. Selon une autre variante de l'invention la céfixime et l'imipénème sont utilisés en association, chacun à une concentration supérieure ou égale à 30 μΜ. Selon au aspect particulier de l'invention, la céfixime ou l'imipénème est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 100 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 300 μΜ. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le mécillinam est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 1 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 3 μΜ. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le tazobactam est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 10 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 30 μΜ. Selon un aspect particulier de l'invention, l'acide clavulanique est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 0.3 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 1 μΜ. Selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, l'amoxicilline, benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la cloxacilline ou le mécillinam, est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 0,1 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 0,3 μΜ.
De la même façon, l'homme du métier sera à même d'apprécier la durée d'incubation des bactéries avec les inhibiteurs du peptidoglycane, notamment les 6- lactamines, nécessaire à l'apparition des formes BL. Il pourra par exemple suivre l'apparition de telles formes au microscope. Comme expliqué plus haut, il pourra aussi consulter les publications de l'art antérieur.
Il est ainsi particulièrement avantageux d'incuber les bactéries avec lesdits inhibiteurs du peptidoglycane, dont notamment les β-lactamines, durant le temps de développement complet de l'inclusion bactérienne, c'est-à-dire jusqu'à ce qu'elle remplisse 80 à 90 % du volume cellulaire. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont mises en contact avec ledit inhibiteur pendant au moins 1 heure, préférentiellement au moins 2 heures, plus préférentiellement au moins 3 heures, encore plus préférentiellement au moins 4 heures, toujours plus préférentiellement au moins 5 heures, de façon encore plus préférée au moins 10 heures, de façon toujours plus préférée au moins 24 heures. Les bactéries de la famille des Chlamydiaceae existent sous différentes formes, selon la phase de leur cycle de vie. La forme virulente de ces bactéries est le corps élémentaire. Celui-ci est adapté à la survie dans le milieu extérieur, sans possibilité de multiplication mais avec l'aptitude de pénétrer, probablement par phagocytose, à l'intérieur de la cellule-hôte. Dans la vacuole, le corps élémentaire se transforme en corps réticulé, élément plus grand dont l'ADN est décondensé et qui peut se multiplier pour donner des corps élémentaires qui seront ensuite libérés dans le milieu. Les inventeurs ont montré que les bactéries sont particulièrement sensibles aux inhibiteurs du peptidoglycane, notamment aux β-lactamines, après avoir infecté des cellules eucaryotes. Lesdites bactéries sont alors sous forme de corps réticulés qui expriment les enzymes cibles de ces inhibiteurs, indispensables à la biosynthèse d'une molécule régulant la division bactérienne. Avantageusement, lesdites bactéries de l'invention sont traitées par ledit inhibiteur, par exemple par une 6-lactamine, après que ces bactéries ont infecté des cellules eucaryotes. Dans ce cas, il est avantageux dans la composition vaccinale d'utiliser un lysat cellulaire de la cellule eucaryote infectée, ledit lysat comprenant lesdites bactéries traitées par la 6- lactamine.
Dans ce mode préféré de réalisation, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mise en contact in vitro de cellules eucaryotes avec des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, et obtention de cellules eucaryotes infectées ; b) incubation des cellules eucaryotes infectées obtenues à l'étape a) avec au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une 6- lactamine ;
c) préparation d'un lysat des cellules de l'étape b).
Selon l'invention, les étapes a) et b) du procédé de préparation de la composition vaccinale sont réalisées dans des conditions de culture cellulaire classiques et bien connues de l'homme du métier, qui saura les choisir et les adapter en fonction du type de cellule eucaryote utilisé. Préférentiellement, les étapes a) et b) sont réalisées à une température de 37° C, une humidité de l'air de 35% et un taux de C02 de l'air 5%. Selon l'invention les cellules sont cultivées dans un milieu de culture approprié. Selon un aspect de l'invention, l'incubation de l'étape b) est maintenue pendant au moins une heure, préférentiellement au moins 2 heures, plus préférentiellement au moins 3 heures, encore plus préférentiellement au moins 4 heures, toujours plus préférentiellement au moins 5 heures, de façon encore plus préférée au moins 10 heures, de façon toujours plus préférée au moins 24 heures.
Les cellules eucaryotes selon l'invention sont des cellules animales, préférentiellement des cellules de mammifères ou des cellules aviaires. Ces dernières sont par exemple des cellules de l'ordre des Galliformes, comme celles de poulet (Gallus gallus) ou de celui des Anseriformes, comme celles de canard colvert (Anas platyrhynchos) ou de canard musqué (Cairina moschata). Les cellules de mammifères selon l'invention sont par exemple des cellules eucaryotes issues de rongeurs (Rodentiens), des cellules eucaryotes porcines (Suidae), ou des cellules eucaryotes de primates. Les cellules eucaryotes de rongeurs sont par exemple de la famille des muridés (Muridae), dans laquelle on trouve entre autres les sous-familles des hamsters (Cricetinae) ou des souris et rats (Murinae), dont font partie par exemple la souris (mus musculus) ou le rat (rattus norvegicus). Les cellules eucaryotes porcines comprennent, entre autres, les cellules eucaryotes du porc domestique (Sus scrofa domesticus). Les cellules eucaryotes de l'ordre des primates comprennent, entre autres, les cellules eucaryotes de la famille des Cercopithecidae, dans laquelle on mentionnera par exemple le singe vert (Chlorocebus sabaeus), ou de celle des Hominidae, laquelle comprend en particulier l'homme (Homo sapiens). Toutefois, les cellules eucaryotes au sens de la présente invention ne comprennent pas les cellules dont l'obtention nécessite ou a nécessité la destruction d 'embryons humains. Selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules eucaryotes sont des cellules primaires ou des lignées cellulaires immortalisées ou tumorales, telles que, par exemple, des cellules eucaryotes provenant de lignées cellulaires. Les « cellules primaires » sont définies comme étant un groupe de cellules originales dérivées d'un tissu normal jusqu'au 10e passage inclus, utilisées pour la production de produits biologiques. Par « cellules immortalisées », on entend au sens de l'invention, des cellules se divisant au-delà de la limite de Hayflick, les cellules pouvant être immortalisées spontanément ou du fait de la mise en œuvre d'une technique d 'immortalisation. Les techniques d 'immortalisation des cellules sont bien connues de l'homme du métier qui saura choisir parmi elles les mieux adaptées à son objectif. A titre d'exemple, et sans toutefois limiter l'invention à ces exemples, on peut citer comme technique d'immortalisation la transformation par un oncogène, comme par exemple ceux codant l'antigène T de SV40, la protéine Ras, la protéine Myc ou la protéine Abl, ou la surexpression d'une reverse transcriptase de la télomérase, par exemple hTERT, ou encore la culture des cellules eucaryotes à confluence pendant plusieurs passages. Les cellules eucaryotes utilisées sont choisies par exemple parmi des cellules épithéliales ou des fibroblates. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules eucaryotes utilisées sont à titre d'exemple des fibroblastes primaires d'origine embryonnaire, comme par exemple des CEF (Chick Embryo Fibroblast), des REF (Rat Embryo Fibroblast) ou des MEF (Mouse Embryo Fibroblast). Il est aussi possible d'utiliser des lignées de cellules souches aviaires, comme décrit dans WO 2008/ 129058). Préférentiellement, les cellules eucaryotes selon l'invention proviennent de lignées cellulaires. Selon un mode de réalisation avantageux les cellules eucaryotes selon l'invention proviennent d'une des lignées choisie parmi les lignées cellulaires immortalisées NIH3T3, Vero, COS-7, les lignées tumorales Caco-2, CHO, PC12, HeLa, Jurkat, HL-60, les lignées AtT20, GH3, HEK-293, HT29, HT-29, LNCap, MCF-7, MDA-MB-231 , MDCK, Saos-2, Sf9, Sf21 , S2, T-47D, U20S et EB66® (Valneva, France). Ces cellules sont couramment utilisées par les laboratoires travaillant dans le domaine. Elles sont disponibles auprès de collections de cultures cellulaires comme l'ATCC (American Type Culture Collection) ou la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), ou commercialement. L'homme du métier saura choisir si nécessaire les cellules eucaryotes selon l'invention en fonction de la bactérie utilisée ou bien encore en fonction du sujet auquel on destine la composition selon l'invention. Les bactéries entières peuvent être utilisées en tant qu'immunogène dans la composition vaccinale de l'invention, une fois qu'elles ont été traitées avec ledit inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine. Toutefois, l'homme du métier comprendra aisément que des extraits des bactéries ainsi traitées peuvent aussi être utilisés dans ladite composition vaccinale, pour autant que lesdits extraits présentent des antigènes natifs intacts. Selon un premier mode de réalisation, ledit extrait est un extrait membranaire. Selon un autre mode de réalisation, l'extrait est un extrait cytoplasmique. Des protocoles pour isoler des extraits membranaires ont été décrits dans l'art (voir par exemple Frohlich et al. , J Microbiol Methods. 91 (2) : 222-230, 2012) et peuvent être utilisés pour obtenir de tels extraits. Ils comprennent notamment deux étapes, une première de cavitation à l'azote et une seconde d'immunoprécipitation avec des anticorps contre le LPS des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.
La cavitation à l'azote permet de lyser les cellules eucaryotes de façon douce, sans augmentation brusque de la température dans l'échantillon (Gottlieb & Adachi, Methods Enzymol. 322 : 213-221 , 2000). Avantageusement, certains débris de cellules eucaryotes sont éliminés par centrifugation à petite vitesse (entre 3 000 g et 6000 g), tandis que les bactéries restent dans le surnageant. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention comprendra donc une étape supplémentaire de centrifugation à petite vitesse entre l'étape de cavitation à l'azote et l'étape d'immunoprécipitation avec des anticorps contre le LPS des bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Une sonication douce dans la glace peut être utilisée également.
Des anticorps contre le LPS (ou des anticorps anti-MOMP, anti-InC, anti-PMP ou anti- CPAF...) de la famille des Chlamydiaceae ont été décrits dans l'art antérieur (Herrera et al. , Mol. Med. 9 : 135-142, 2003). Ils permettent d'isoler sélectivement la fraction membranaire bactérienne dans l'étape d'immunoprécipitation après avoir lysé les cellules eucaryotes tandis que la fraction cytoplasmique bactérienne reste dans le surnageant.
Il peut être avantageux d'enrichir la fraction bactérienne en soumettant les lysats débarrassés des débris cellulaires à une centrifugation pour séparer la fraction membranaire bactérienne qui reste dans le surnageant de la fraction particulaire qui précipite. De préférence, les lysats sont centrifugés à une vitesse comprise entre 10 000 et 20 000 g, plus préférablement, entre 12 000 g et 18 000 g, encore plus préférablement, entre 14 000 g et 17 000 g, et de façon la plus préférée entre 15 000 g et 16 000 g. Les extraits cytoplasmiques peuvent être obtenus en soumettant le culot à une ultracentrifugation isopycnique, selon les conditions décrites par Frohlich et al. (J Microbiol Methods. 91 (2) : 222-230, 2012). Comme le montrent les résultats des inventeurs, les compositions vaccinales de l'invention sont en particulier utiles pour prévenir ou traiter les infections par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae, ainsi que les pathologies causées par lesdites infections. Les compositions vaccinales de l'invention sont notamment capables de déclencher une réaction immunitaire spécifique contre les bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Cette réaction est caractérisée notamment par une réponse immunitaire de lymphocytes-T spécifique de Chlamydia muridarum dans la rate. En réponse à une infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum, ces LT CD4+ et CD8+ activés et les lymphocytes T régulateurs quittent la rate pour les ganglions drainant le tractus génital. Comme le montrent les résultats rapportés dans les exemples (voir notamment les exemples 3 et A), cette réponse immunitaire est capable de protéger l'individu contre les bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Selon un troisième aspect, l'invention a donc aussi pour objet des bactéries de la famille des Chlamydiaceae et/ou des extraits de celles-ci caractérisées en ce que lesdites bactéries ont été préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une β-lactamine, pour leur utilisation dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition comprenant bactéries de la famille des Chlamydiaceae et/ou des extraits de celles-ci caractérisées en ce que lesdites bactéries ont été préalablement traitées par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une β-lactamine, pour fabriquer un médicament pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae. De la même façon, l'invention porte aussi sur une méthode de traitement, préférentiellement prophylactique, d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae par une composition comprenant bactéries de la famille des Chlamydiaceae et/ou des extraits de celles-ci, lesdites bactéries ayant été préalablement traitées par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins au moins une β-lactamine. Selon un mode de réalisation particulier, ladite méthode de traitement comprend une étape d'administration de ladite composition à un sujet risquant d'être infecté par des bactéries. Préférentiellement, cette administration entraîne une augmentation de la population de lymphocytes T CD4+ et CD8+ effecteurs spécifiques activés dans la rate puis leur migration vers les ganglions drainant le tractus génital infecté. Alternativement, selon un autre mode de réalisation préféré, cette administration entraîne une diminution de la population des lymphocytes T régulateurs dans la rate et une augmentation dans les ganglions drainant le tractus génital infecté. De façon plus préférée, cette administration entraîne une augmentation de la population des lymphocytes T CD4+ et CD8 + effecteurs spécifiques activés puis leur migration vers les ganglions drainant le tractus génital et une diminution de la population des lymphocytes T régulateurs dans la rate et une augmentation dans les ganglions drainant le tractus génital infecté.
Par « infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae » ou « infection par une Chlamydiaceae », on entend la présence dans au moins une cellule du corps du patient ou de l'animal de ladite bactérie de la famille des Chlamydiaceae. L'infection peut être génitale, oculaire, respiratoire ou pulmonaire; elle peut aussi toucher d'autres sites, comme l'endothélium vasculaire ou les articulations.
Bien qu'un grand nombre des infections causées par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae soit asymptomatique, lesdites infections peuvent néanmoins causer des pathologies sérieuses chez les patients ou les animaux. Par « pathologie causée par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae », on entend au sens de l'invention toute pathologie dont le déclenchement est directement ou indirectement causé par une infection par au moins une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.
Sont ainsi comprises dans les pathologies causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae au sens de l'invention les pathologies causées par Chlamydia suis, Chlamydia muridarum, abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum et Chlamydophila felis. Sont ainsi plus particulièrement incluses dans lesdites pathologies causées par une infection par Chlamydiaceae au sens de l'invention les avortements et les mortalités néo-natales causés par Chlamydophila abortus, ainsi que les conjonctivites, les kératoconjonctivites, les rhinites purulentes, les entérites, les bronchopneumonies et les pneumonies, causées en particulier chez le porc par Chlamydia suis. Chez l'homme, ces pathologies peuvent en particulier être des pathologies génitales ou des pathologies oculaires ou trachome induisant des cécités (Chlamydia trachomatis), mais elles peuvent aussi être des pathologies respiratoires (pneumopathies néo-natales). Ainsi il est connu que les infections par Chlamydophila pneumoniae provoquent une forme de pneumonie et que Chlamydophila psittaci est responsable de la psittacose. Il est également connu que les infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae disséminent dans l'organisme provoquant de nombreuses infections et pathologies atypiques comme des dysfonctionnements cardio-vasculaires et circulatoires (athérome). Parmi les dysfonctionnements cardio- vasculaires et circulatoires causés par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae, on peut citer respectivement les sténoses valvulaires et l'athérome. D'autre part, lesdites bactéries de la famille des Chlamydiaceae peuvent aussi entraîner des maladies inflammatoires et des pathologies articulaires. Il est connu en particulier que ces bactéries peuvent causer des arthrites sévères.
Toutefois, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les pathologies causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont des pathologies oculaires ou des pathologies génitales. Selon un aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les pathologies oculaires causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae comprennent le trachome. Selon un autre aspect plus particulièrement préféré, les pathologies génitales causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae comprennent le lymphogranulome vénérien ou maladie de Durand- Nicolas-Favre. Selon encore un autre aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les pathologies génitales chez l'homme causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae comprennent des pathologies telles que des urétrites et des orchi-épididymites. Celles-ci peuvent conduire à une diminution de la fertilité masculine. Selon encore un autre aspect plus particulièrement préféré de l'invention, une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae causent chez la femme des pathologies génitales telles que des cervico-vaginites, des cervicites, des endocervites, des urétrites, des endométrites ou des péri-hépatites, qui peuvent donner des complications comme des infections génitales hautes et, en particulier, des salpingites pouvant évoluer entre autres vers la formation de pyosalpinx et hydrosalpinx responsables de l'obstruction totale des trompes de Fallope. Les salpingites représentent ainsi le principal facteur de risque de stérilité d'origine tubaire et de grossesse extra-utérine chez la femme.
Il est bien connu de l'homme du métier que l'incidence des infections est de façon générale inversement corrélée à l'état de santé du patient, et que le risque d'infection est donc plus grand chez des individus par ailleurs déjà infectés par d'autres micro-organismes. Les compositions comprenant par ailleurs d'autres principes actifs, ou mélange de principes actifs permettent ainsi une meilleure protection de la santé générale des sujets, et par conséquent une meilleure protection contre les infections par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae.
Ainsi, selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, la composition comprend en outre un autre principe actif. A titre d'exemple, cet autre principe actif est, au sens de l'invention, une autre composition vaccinale.
Parmi les autres compositions vaccinales selon l'invention, on peut citer notamment les compositions vaccinales susceptibles de diminuer le risque des infections à pneumocoques, du tétanos, de la poliomyélite, de la grippe, de la diphtérie, de la coqueluche, de l'hépatite B, de l'hépatite A, d'HPV (Human papilloma virus), de la tuberculose (par exemple par le Bacille de Calmette Guérin). Plus préférablement, ladite autre composition vaccinale est capable d'augmenter, chez les individus vaccinés, l'amplitude et la rapidité de la réponse immune protectrice.
L'homme du métier saura par ailleurs choisir au mieux les voies et modes d'administration de la composition selon l'invention, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d'un médicament ou l'établissement d'un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intra- péritonéale ou sous-cutanée, par voie orale, ou par voie topique (au moyen de gel, aérosols, gouttes, etc.). il sera particulièrement avantageux selon l'invention d'administrer la composition par voie entérale, orale, parentérale (par exemple sous- cutanée, intradermique, ou intramusculaire) ou mucosale (par exemple intranasale, sublinguale, intravaginale, transcutanée). De manière plus préférée, la composition pharmaceutique de l'invention sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Son mode d'administration, sa posologie et sa forme galénique optimale peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. La composition selon l'invention est préparée sous toute forme galénique connue de l'homme du métier, par exemple sous forme liquide ou gel, telle que des solutions, suspensions, sirops, ou sous forme de spray, ou sous forme solide, telle que sous forme de comprimés, de microsphères, ou de gélules. Avantageusement, la composition selon l'invention est préparée sous forme de solution ou de suspension injectable. Selon une variante de l'invention, la composition est lyophilisée afin d'être fournie ou préparée sous forme solide.
La solution selon l'invention est administrée à une dose thérapeutiquement efficace, en particulier à une dose immunogène c'est-à-dire capable d'induire une réponse immunitaire spécifique d'antigène. La réponse immunitaire spécifique d'antigène pourra être mesurée selon toute technique connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, la réponse immunitaire spécifique d'antigène est évaluée par la mesure de la concentration d'anticorps (Immunoglobulines ou Ig) spécifiques de la bactérie de la famille des Chlamydiaceae utilisée, chez le sujet, en particulier les IgM, IgG et IgA, à un temps donné après la dernière administration de la composition, par test Elisa ou Elispot. La réponse immunitaire spécifique d'antigène est évaluée à partir d'échantillons biologiques du sujet, comme par exemple le sang, le sérum, les larmes ou les sécrétions vaginales.
L'homme du métier pourra adapter la dose d'administration de la composition selon l'invention en fonction par exemple de la voie d'administration choisie, du schéma de vaccination, ainsi que des caractéristiques du sujet, telles que l'espèce, l'âge, le poids, l'état de santé général. Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention est administrée selon un schéma de vaccination comprenant plusieurs administrations. Par exemple, selon un mode de réalisation, la composition est administrée de manière répétée entre 2 et 4 fois sur une période de 15 à 90 jours, puis une ou plusieurs administrations de rappel sont effectuées entre 1 et 10 ans à compter de la première administration.
En fonction de la forme galénique et du type d'administration souhaitée, la composition selon l'invention comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. A titre d'exemple, la composition selon l'invention pourra en outre comprendre des diluants, tel que le sodium, le carbonate de calcium, ou le lactose par exemple, des agents lubrifiants, tels que par exemple le stéarate de magnésium, des colorants, des agents de sapidité, des agents de texture, des antibiotiques, tels par exemple du thimérosal ou des antibiotiques de la famille des β-lactamines, des protéines, notamment de l'albumine ou de l'ovalbumine, des stabilisants, tels que le glutamate monosodique (MSG) et le 2-phénoxyéthanol. Selon un quatrième aspect de l'invention, celle-ci a aussi pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae chez un sujet, comprenant les étapes consistant : a) à mettre en contact un échantillon dudit sujet avec une bactérie de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitée par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, et
b) à déterminer la présence d'anticorps dans ledit échantillon qui sont capables de se lier à ladite bactérie.
De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être mises en œuvre à l'aide d'un grand nombre de procédures standard, telle que la détection de radioactivité, de fluorescence, de luminescence, de chimioluminescence, d'absorbance, ou par microscopie, imagerie, etc. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend les étapes consistant : a) à mettre en contact ledit échantillon avec des anticorps spécifiques de ladite bactérie engendrés contre ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, lesdits anticorps comprenant un marqueur produisant un signal détectable, ou étant fixés à un réactif marqué de manière détectable;
b) à laisser la bactérie présente dans ledit échantillon s'y lier de manière à
former des complexes antigènes/anticorps ; et
c) à déterminer la présence de ladite bactérie dans ledit échantillon au moyen dudit marqueur détectable.
Selon un cinquième aspect, l'invention porte sur une trousse de diagnostic pour la détection d'une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae, comprenant ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, conjointement avec des substances pour effectuer une analyse de détermination d'immunité humorale contre ladite bactérie, dans un récipient d'emballage unitaire. Les trousses de diagnostic selon l'invention incluent sans limitation les trousses pour les méthodes immunologiques telles que immunohistochimie, ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay), le « western blotting », l'immunoenzymométrie, rimmunofluorométrie, l'immunoluminométrie, l'immunoradiométrie (IRMA), ΕΜΙΤ (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), l'immunodosage à flux latéral, les tests en dipstick, l'immuno histo/cyto-chimie et tous les autres tests qui sont connus de l'homme du métier. Ces méthodes immunologiques permettent de déterminer la présence ou l'absence d'un anticorps dans un échantillon. Elles permettent aussi de mesurer la quantité dudit anticorps dans l'échantillon. L'invention a donc aussi pour objet, selon un sixième aspect, l'utilisation d'une bactérie de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, comme réactif de diagnostic in vitro dans une analyse de liaison, éventuellement dans un kit de diagnostic, pour la détection d'anticorps neutralisant conférant une immunité contre ladite bactérie. Elle a aussi pour objet l'utilisation d'anticorps spécifiques d'une bactérie de la famille des Chlamydiaceae engendrés contre ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, comme réactif de diagnostic in vitro dans une analyse de liaison, éventuellement dans un kit de diagnostic, pour la détection de ladite bactérie. Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Efficacité vaccinale des formes BL. Les formes BL entraînent une diminution significative du nombre de souris infectées.
Figure 2 : Proportion d'animaux issus des différents groupes d'immunisation (Mefs, b-Lac, b-Lac/3, De) présentant une perte vaginale de Chlamydia muridarum à différents temps après infection. ° :p<0.08; * p<0.05; ** p<0.01 ; *** p< 0.005 par rapport au groupe Mefs (Test de Mann Whitney). Figure 3 : A-Caractérisation de la perte cellulaire au niveau de la lamina propria des cornes utérines des souris, corne utérine normale grade 0, (A), grade 1 (B), grade 2 (C), grade 3 (D), clichés pris au grossissement 10X. B-Evaluation de la sévérité des atteintes microscopiques des cornes utérines des animaux des différents groupes. Corne utérine normale (grade 0, A), grade 1 (B), grade 2 (C), grade 3 (D). *p=0.054 (Test de Mann Whitney). Figure 4 : Nombre total de lymphocytes spléniques des souris après immunisation complète par les formes vaccinales ou contrôles. Les cellules isolées ont été comptées sur lame de Malassez et leur nombre a été rapporté au nombre de cellules viables analysées par cytométrie en flux grâce à un marqueur de viabilité (Fixable Viability Dye, BD Biosciences). Graphique représentatif d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 5 : Nombre des lymphocytes T CD4+ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales. Le nombre total des lymphocytes T CD4+ (A) ainsi que le nombre de lymphocytes T CD4+ présentant des marqueurs d'activation sont représentés en s'intéressant à l'expression membranaire de CD25 (B), de CD44hl CD62Ll0W (C), ICOS+ (D) et à l'expression intracellulaire de FoxP3 pour mettre en évidence la population de lymphocytes T régulateurs (E). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De.
Figure 6 : Nombre des lymphocytes T CD8+ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales. Le nombre total des lymphocytes T CD8+ (A), ainsi que le nombre de lymphocytes T CD8+ présentant des marqueurs d'activation sont représentés en s'intéressant à l'expression membranaire de ICOS (B), et de CD44hl CD62Ll0W (C). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De.
Figure 7 : Nombre total de cellules dans les ganglions et la rate des souris après immunisation complète par les formes vaccinales, et une semaine post-infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Les cellules isolées ont été comptées sur lame de Malassez et leur nombre a été rapporté au nombre de cellules viables analysées par cytométrie en flux grâce à un marqueur de viabilité (Fixable Viability Dye, BD Biosciences). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs de p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 8 : Nombre des lymphocytes T spléniques CD4+ et T CD8+ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine post-infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Le nombre total des lymphocytes T CD4+ (A) et CD8+ (D) ainsi que leur profil d'activation sont ici représentés en s'intéressant au nombre de lymphocytes T CD25+ parmi les T CD4+ (B) et T CD8+ (E), et au nombre de lymphocytes T CD4+ et T CD8+ CD44hi CD62Ll0W (C et F, respectivement). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié: les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul , ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 9 : Nombre des lymphocytes T ganglionnaires CD4+ et T CD8+ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine postinfection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Le nombre total des lymphocytes T CD4+ (A) et CD8+ (E), ainsi que leur profil d'activation sont ici représentés en s'intéressant à la population lymphocytaire CD4+ CD25+ (C) et ICOS+ (D), et au nombre de lymphocytes T CD4+ et T CD8+ CD44hi CD62Ll0W (B et F respectivement). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 10 : Le nombre des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ en prolifération dans les ganglions drainant le tractus génital et la rate après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine post-infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Le nombre total des lymphocytes T CD4+ (A) et CD8+ (B) en prolifération dans les ganglions drainant le tractus génital (I) et la rate (II) est ici présenté. Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De.
Figure 1 1 : Nombre des lymphocytes T régulateurs CD4+ totaux et en prolifération dans les ganglions drainant le tractus génital et la rate après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine post-infection. Le nombre total des lymphocytes T CD4+ régulateurs (Treg) totaux (A) et en prolifération (B) dans les ganglions drainant le tractus génital (I) et la rate (II) est ici présenté. Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul , ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. EXEMPLES
Exemple 1 : Immunisation de souris C57BL/6J.
Des souris C57BL/6J ont été vaccinées par des compositions différentes, puis infectées secondairement par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.
Afin d'éviter une réaction immunitaire de l'hôte liée à la reconnaissance d'alloantigènes portés par les cellules eucaryotes, les différentes formes bactériennes (infectieuse, BL) ont été produites dans des fibroblastes embryonnaires issus de souris C57BL/6J.
Dans ce but, des fibroblastes embryonnaires (MEF) issus de souris C57BI/6 avec Chlamydia muridarum (Cm) ont été infectés in vitro. Cette souche est génétiquement très proche de Chlamydia trachomatis. Elle infecte la souris et le cobaye mais pas l'espèce humaine, et entraîne les mêmes séquelles physiopathologiques au niveau du tractus génital que chez l'Homme.
Plusieurs compositions ont été préparées
- C1 -composition comprenant une forme infectieuse de Cm ou encore appelé forme virulente (infection cellulaire in vitro de 72h et prélèvement du lysat cellulaire)
- C2- composition comprenant une forme infectieuse inactivée 30 min à 56 ° C ou encore appelée forme chauffée (idem 1 suivi d'une étape d'inactivation par la chaleur)
- C3- composition comprenant une forme inactivée par antibiotiques:
(infection cellulaire in vitro de 3h, puis incubation continue des cellules infectées avec la pénicilline G (100IU/mL), prélèvement du lysat cellulaire après 90h). Cette forme est une forme BL et en particulier, une forme b-Lac.
li a été vérifié par titration que la forme 1 était infectieuse, et que les formes 2 et 3 ne l'étaient pas. 4 groupes de souris femelles C57BL/6J âgées de 8 semaines ont été utilisés.
Trois groupes ont été injectés par voie intrapéritonéale (IP) une ou plusieurs fois avec l'une des compositions, puis les 4 groupes ont été infectés par voie vaginale par la forme infectieuse de Cm. La quantité de composition utilisée pour chaque injection correspondait à environ 10 cm2 de cellules (MEF) cultivées in vitro, infectées à 100%, dans un volume de 150μΙ par injection IP.
- groupe 1 (4 animaux): infection avec Cm (1 million d'IFU).
- groupe 2 (3 souris): une injection IP (au temps to) de la forme 1 de la bactérie. A t0+39j, infection vaginale avec 1 million d'IFU de Cm.
- groupe 3 (3 souris): trois injections IP (to, to + 10j, to + 21 j) de la forme 2 de la bactérie. A tO + 39j, infection vaginale avec 1 million d'IFU de Cm.
- groupe 4 (4 souris): trois injections IP (to, to + 10j, to+ 21 j) de la forme 3 de la bactérie. A tO + 39j, infection vaginale avec 1 million d'IFU de Cm.
Après infection, les souris ont été maintenues isolées pendant 82 jours, sans aucun traitement antibiotique, afin de permettre aux séquelles physiopathologiques de se développer. Les souris ont ensuite été sacrifiées, et examinées : aspect macroscopique du tractus génital, recherche de lésions tissulaires (hydrosalpinx, déformations, kystes liquidiens,), mesure du poids de la rate, prélèvements de différents organes (dont les ganglions para-aortiques drainant l'utérus) en vue d'analyses ultérieures. Résultats obtenus:
- Groupe 1 : 3/4 des souris présentaient des lésions tissulaires des voies génitales hautes sur au moins une des 2 cornes utérines (rate 106 +/- 3g, ganglions para-aortiques normaux)
- Groupe 2: 1 /3 des souris présentaient des lésions tissulaires des voies génitales hautes sur au moins une des 2 cornes utérines (rate 1 14 +/-
9g, ganglions para-aortiques normaux) - Groupe 3: 2/3 des souris présentaient des lésions tissulaires des voies génitales hautes sur au moins une des cornes utérines (rate 280 +/- 81 g, ganglions para-aortiques normaux). Une souris a été sacrifiée 60j après infection car elle présentait des plaies cutanées et une perte de poids importante, potentiellement sans rapport avec l'expérience.
- Groupe 4: aucune souris ne présentait de lésions tissulaires des voies génitales hautes (rate 111 +/- 17g, ganglions para-aortiques normaux)
Cette étude préliminaire montre que seul le groupe de souris préinjectées avec la forme BL de Cm a été protégé du développement de lésions tissulaires des voies génitales hautes, suite à une infection par Cm.
Exemple 2 : Efficacité vaccinale des formes BL
Afin de confirmer l'efficacité vaccinale des formes BL, une nouvelle expérience a été réalisée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1.
• Souris 1 -10 : immunisation par les MEFs à J0, J10 et J21
o Souris 1 -5 : infection par 2.106 IFU à J39
■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
o Souris 6-10 : infection par 2.105 IFU à J39
■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
• Souris 11 -20 : immunisation par la forme infectieuse préalablement inactivée 10 min à 90° C à J0, J10 et J21
o Souris 11 -15 : infection par 2.106 IFU à J39
■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
o Souris 16-20 : infection par 2.105 IFU à J39
■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
• Souris 21 -30 : immunisation par la forme BL à J0, J10 et J21
o Souris 21 -25 : infection par 2.106 IFU à J39
■ 0/5 souris (0%) présente des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
o Souris 26-30 : infection par 2.105 IFU à J39 ■ 0/5 souris (0%) présente des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
• Souris 31 -40 : immunisation par la forme infectieuse Cm à J0, J10 et J21
o Souris 31 -35 : infection par 2.106 IFU à J39
■ 2/5 souris sont mortes 1 semaine après l'infection
■ 2/3 souris survivantes présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes
o Souris 36-40 : infection par 2.105 IFU à J39
■ 2/5 souris sont mortes 1 semaine après l'infection
■ 2/3 souris survivantes présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)
Les résultats montrent une diminution significative du nombre de souris infectées dans le groupe préalablement immunisées par la forme BL (Figure 1 ). Ces résultats confirment que l'administration de la forme BL protège les souris d'une infection par C. muridarum.
Exemple 3 : Effet de l'injection intrapéritonéale de différentes doses immunisantes de formes b-Lac (formes BL, traitées par une B-lactamine) ou des formes Pc (formes BL traitées par la D-cvclosérine) de Chlamydia muridarum sur la protection vis-à-vis de l'infection vaginale par C. muridarum et le développement de la pathologie tubaire.
4 groupes de 10 souris femelles ont été immunisés en injection intrapéritonéale à J0, J0+10, JO+21 soit avec un extrait de fibroblastes embryonnaires de souris C57/BL6 (Mefs), soit avec la forme b-Lac (b-Lac), soit avec la forme Lac diluée au tiers de la dose habituelle (b-Lac/3), soit avec la forme De (De). Ces formes vaccinales ont été produites dans des Mefs.
A J32, les animaux ont été cyclés par injection sous cutanée de 50μΙ de Deprovera (50mg/mL, Pfizer).
A J39 les animaux ont été infectés par voie vaginale avec 107 IFU de Chlamydia muridarum. A J3, J6, J8, J10 et J13 post infection, des frottis vaginaux ont été effectués et la présence de Chlamydia muridarum a été évaluée par titration de la capacité infectieuse des Chlamydiae extraites de ces frottis (Figure 2).
A 8 semaines post infection le reste des animaux (n=6) a été sacrifié, les cornes utérines disséquées et les lésions macroscopiques (kystes liquidiens et zones translucides au niveau des cornes utérines ou de l'oviducte) ont été recherchées à la loupe binoculaire. Seules les souris du groupe b-Lac ne présentent aucune lésion macroscopique. Les cornes utérines ont été fixées au paraformaldéhyde, déshydratées et incluses en paraffine. Des sections longitudinales ont été colorées à l'HPS (hemalun Phloxine, Safran) pour mettre en évidence les différentes structures de la corne utérine (myomètre et endomètre comprenant l'épithélium et la lamina propria). Nous avons évalué la sévérité des atteintes microscopiques par la perte cellulaire observée au niveau de la lamina propria utérine (Figure 3).
Un plus grand nombre d'animaux présentant des lésions tubaires mineures (grade 1 ) ou pas de lésions (grade 0) est observé dans les groupes b-Lac et De, comparés aux groupes Mefs et b-Lac/3. Les atteintes les plus sévères visibles dans le groupe Mefs sont absentes des groupes b-Lac, b-Lac/3 et De.
Ces résultats confirment donc l'effet protecteur de 3 injections intra-péritonéales de formes b-Lac (avec un effet dose confirmé) et de formes De, vis à vis de l'infection vaginale par une forme virulente de Chlamydia muridarum. Cette protection se traduit par une diminution de la charge bactérienne dès le début de l'infection locale, une réponse anticorps spécifique détectable dans la rate des souris immunisées infectées, et une protection vis à vis des lésions génitales inflammatoires post infection dans ces mêmes souris. Exemple 4 : Etude de l'activation lymphocvtaire après immunisation complète suivie ou non d'une infection.
1. Profil d'activation des lymphocytes T après immunisation complète par les formes vaccinales b-Lac et De in vivo
Une semaine après immunisation complète (trois immunisations à une semaine d'intervalle chacune), les splénocytes de souris individuelles ont été récupérés comme précédemment décrit et le profil d'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ a été étudié par cytométrie en flux en s'intéressant à l'expression des marqueurs d'activation classiques CD25, CD62L, CD44 et ICOS. La stratégie de sélection (gating) des populations lymphocytaires T CD4+ ou T CD8+ employée a été la suivante : FSC/SSC (diffraction de la lumière émise aux petits angles et à 90° ), Singulets (élimination des doublets cellulaires), CD19 négatives (exclusion des lymphocytes B), CD3+ (sélection des lymphocytes T porteurs d'un TCR) puis CD4+ (lymphocytes T CD4+) ou CD8+ (lymphocytes T CD8+). L'étude du nombre de lymphocytes T régulateurs CD4+ (Treg) a été effectuée après perméabilisation des splénocytes et marquage intracellulaire de la molécule FoxP3. La stratégie de gating des lymphocytes T CD4+ régulateurs (Treg) employée a été la suivante : FSC/SSC, Singulets, CD19 négatives (exclusion des lymphocytes B), Fixable Viability Dye+ (sélection des cellules viables), CD3+ (lymphocytes T), CD4+ (lymphocytes T CD4+) puis FoxP3+ (sélection des Treg, une forte expression de FoxP3 étant un marqueur spécifique des Tregs). Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel GraphPad Prism.
Dans la rate, les nombres totaux de lymphocytes, ou de lymphocytes T CD4+ ou CD8+ ne sont pas significativement différents entre les différents groupes (Figures 4, 5A, 6A). Toutefois, le nombre de lymphocytes T activés CD4+ CD44hi CD62Ll0W est significativement augmenté suite à l'immunisation par la forme vaccinale b-Lac seulement (Figure 35). Le profil d'expression d'ICOS sur les lymphocytes T CD4+ montre lui aussi une augmentation très significative du nombre des lymphocytes T CD4+ ICOS+ (ICOS étant un marqueur reflétant le potentiel inflammatoire des lymphocytes T CD4+) (Figure 5). En parallèle, le marquage intracellulaire FoxP3 montre une diminution de la population lymphocytaire régulatrice CD4+, significative en termes de nombre suite à l'immunisation par la forme vaccinale De. La même tendance est observée dans le groupe b-Lac (Figure 5E). Les formes vaccinales n'induisent pas de différences significatives pour ce qui est des populations T CD8+ ICOS+ (Figure 6B). On constate une augmentation significative du nombre de lymphocytes T activés CD8+ CD44hl CD62Ll0W après immunisation par la forme b-Lac (Figure 6C). 2. Profil d'activation des lymphocytes T après immunisation complète par les formes vaccinales b-Lac et De suivie d'une infection intra-vaginale par 107 IFU de Chlamydia muridarum.
Après immunisation complète (trois immunisations à une semaine d'intervalle chacune), les souris ont été cyclées par une injection de progestérone (Deprovera, 50μΙ par souris) et infectées par Chlamydia muridarum par voie intra-vaginale à 107 IFU. Après une semaine post-infection, les souris ont été sacrifiées et testées individuellement. Les splénocytes et ganglions drainant le tractus génital (inguinaux/para-aortiques/mésentériques) ont été récupérés et isolés. Le profil d'activation et le nombre des lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont été étudiés par cytométrie en flux comme indiqué au paragraphe précédent (partie 1 ) en s'intéressant à l'expression de CD25, CD62L, CD44 et ICOS. L'étude de la prolifération des lymphocytes T ainsi que le nombre de Treg est réalisée après perméabilisation et marquage intracellulaire de la molécule Ki67 (prolifération) et FoxP3 (Treg). Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel GraphPad Prism.
La figure 7 présente le nombre total de cellules lymphoïdes des ganglions drainant le tractus génital et de la rate des souris des 4 groupes PBS, MEF, b-Lac ou De. Il est très clair que l'immunisation avec la forme b-Lac suivie par l'infection intra-vaginale des souris entraîne une nette augmentation du nombre des lymphocytes des ganglions drainants (p<0,05) et une diminution tout aussi marquée dans la rate (p<0,01 ).
Dans la rate de ces souris, on observe également, pour le groupe b-Lac, une diminution significative des lymphocytes T CD4+ CD25+ (Figure 8B) et une tendance comparable pour les lymphocytes T CD4+ et CD4+ CD44hi CD62Ll0W (Figure 8A et 8C respectivement) En ce concerne les lymphocytes T CD8+, dans le groupe b-Lac, ils sont significativement diminués (p<0,05, Figure 8D), ainsi que les T CD8+CD25+ (p<0,01 , Figure 8E).
Une image en miroir est observée dans les ganglions drainants, avec une augmentation significative des mêmes populations T CD4+ et CD4+ CD25+ (Fig.9A et C) dans le groupe b-Lac, et une tendance comparable pour les lymphocytes T CD4+ et CD4+ CD44hi CD62Ll0W et ICOShi CD4+ (Figure 9 B et D). La même observation s'applique aux lymphocytes T CD8+, et CD8+ CD44 CD62L eux aussi significativement augmentés seulement dans le groupe b-Lac (Figure 9 E et F).
En accord avec les résultats ci-dessus, si l'on examine les nombres des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en prolifération (porteurs du marqueur nucléaire Ki67) on constate une nette tendance à la diminution dans la rate et à l'augmentation dans les ganglions, toujours seulement dans le groupe b-Lac (Figure 10).
Les analyses du nombre de lymphocytes T régulateurs (porteurs des marqueurs CD4 et FoxP3) aboutissent aux mêmes conclusions, toujours dans le groupe b-Lac: tendance à la diminution des Treg CD4+ KÏ67+ dans la rate, et augmentations significatives (p<0,05) des T reg CD4+ et CD4+ KÏ67+ dans les ganglions drainants (Figure 1 1 ).
L'ensemble de ces résultats suggère que les injections immunisantes de formes b-Lac induisent une activation et une réponse immunitaire T spécifiques de Chlamydia muridarum dans la rate, avec production d'anticorps spécifiques. En réponse à une infection intra-vaginale, les lymphocytes T activés quittent la rate pour les ganglions drainant le tractus génital. Ainsi une base immunitaire à l'origine de la baisse de charge bactérienne locale (lymphocytes effecteurs) et à la diminution de la réaction inflammatoire locale génératrice de lésions tissulaires (lymphocytes T régulateurs) est apportée.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composition vaccinale comprenant des bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, ou des extraits desdites bactéries traitées pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention des infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.
2. Composition vaccinale pour traiter et/ou prévenir des pathologies causées par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae, ladite composition comprenant des bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane ou des extraits desdites bactéries traitées.
3. La composition vaccinale de l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits extraits de bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane sont des extraits membranaires ou des extraits cytoplasmiques.
4. La composition vaccinale de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit inhibiteur du petidoglycane est une β-lactamine ou une D-Cyclosérine.
5. La composition vaccinale de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite β-lactamine est choisie dans le groupe constitué de l'amoxicilline, la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la cloxacilline, le céphadroxil, la céfixime, l'imipénème, la céfixime en association avec l'imipénème, le mécillinam, l'acide clavulanique, le tazobactam et le sulbactam.
6. La composition vaccinale de la revendication 5, caractérisée en ce que ladite 6- lactamine est la pénicilline G.
7. La composition vaccinale de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite bactérie de la famille des Chlamydiaceae est Chlamydia trachomatis ou Chlamydia muridarum.
8. La composition vaccinale de l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que la pathologie est une pathologie oculaire, une pathologie génitale, une pathologie respiratoire, un dysfonctionnement cardio-vasculaire, un dysfonctionnement circulatoire, une pathologie articulaire ou une maladie inflammatoire.
9. La composition vaccinale de la revendication 8 caractérisée en ce que la pathologie génitale est choisie parmi le groupe composé du lymphogranulome vénérien, des urétrites, des orchi-épididymites, des cervico-vaginites, des cervicites, des endocervites, des endométrites, des péri -hépatites et des salpingites.
10. Composition vaccinale comprenant des bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane ou des extraits desdites bactéries, et un adjuvant.
1 1 . Procédé de préparation de la composition vaccinale de la revendication 10, ledit procédé comprenant une étape de traitement desdites bactéries de la famille des Chlamydiaceae par un inhibiteur du peptidoglycane.
12. Le procédé de la revendication 1 1 , comprenant une étape préalable d'infection d'une cellule hôte par lesdites bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement à l'étape de traitement par un inhibiteur du peptidoglycane.
13. Méthode pour détecter une bactérie de la famille des Chlamydiaceae dans un échantillon provenant d'un sujet supposé être infecté par ladite bactérie, comprenant les étapes consistant : a) à mettre en contact ledit échantillon avec des anticorps spécifiques de ladite bactérie engendrés contre ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, lesdits anticorps comprenant un marqueur produisant un signal détectable, ou étant fixés à un réactif marqué de manière détectable ; b) à laisser la bactérie présente dans ledit échantillon s'y lier de manière à former des complexes antigènes/anticorps ; et c) à déterminer la présence de ladite bactérie dans ledit échantillon au moyen dudit marqueur détectable.
14. Kit de diagnostic pour la détection d'une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae, comprenant ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane conjointement avec des substances pour effectuer une analyse de détermination d'immunité humorale contre ladite bactérie, dans un récipient d'emballage unitaire.
15. Utilisation d'une bactérie de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane comme réactif de diagnostic in vitro dans une analyse de liaison, éventuellement dans un kit de diagnostic, pour la détection d'anticorps neutralisant conférant une immunité contre ladite bactérie.
16. Utilisation d'anticorps spécifiques d'une bactérie de la famille des Chlamydiaceae engendrés contre ladite bactérie préalablement traitée par une 6-lactamine comme réactif de diagnostic in vitro dans une analyse de liaison, éventuellement dans un kit de diagnostic, pour la détection de ladite bactérie.
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