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Composition pharmaceutique
La présente invention concerne de nouveaux composés, leurs mélanges et des procédés pour les préparer.
Le nedocromil sodique, qui est le sel de sodium de l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-4, 6-dioxo-1O-propyl-4H- pyranno[3, 2-gJquinoléine-2, 8-dicarboxylìque, a été recommandé pour le traitement d'états allergiqueset autres, en particulier des affections obstructives réversibles des voies aériennes.
Les bronchodilatateurs et les stéroides ont été recommandés aussi pour le traitement des affections obstructives réversibles des voies aériennes. Toutefois, le traitement au moyen d'une combinaison de constituants actifs, en particulier des combinaisons ä dose fixée, peut susciter des inconvénients et il existe une forte prévention contre l'administration de ces combinaisons.
Chez de nombreux patients, le traitement au moyen d'un bronchodilatateur sur une base régulière pendant une longue durée, par exemple six semaines, conduit ä une baisse de la réponse à l'agent thérapeutique qui laisse le patient sans protection. Dans certains cas, l'administration prolongée d'un bronchodilatateur peut même provoquer une bronchoconstriction de rebond. Dans d'autres cas, l'un des constituants du mélange peut par lui-même suffire à maîtriser l'affection, rendant ainsi les autres constituants superflus.
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La Demanderesse a découvert ä présent que les melanges de nédocromil sodique avec des agents propres à l'inhalation choisis parmi les bronchodilatateurs et les stéroïdes, les sels de l'acide 9-ethyl- 6, 9-dihydro-4, 6-dioxo-IO-propyl-4H-pyranno[3, 2-gJquino- léine-2, 8-dicarboxylique avec ces agents, et les mélanges de ces sels avec le nedocromil sodique ou l'agent dans le rapport thérapeutique approprié offrent l'avantage qu'ils sont tant palliatifs que prophylactiques, sont plus efficaces, exposent moins ä une perte de réponse, induisent moins d'effets secondaires, réduisent l'hyperactivité bronchique, peuvent être administrés en doses plus faibles, peuvent être administrés directement au site de l'affection,
par exemple par inhalation, peuvent être administrés moins fréquement, par exemple 1 ou 2 fois par jour, peuvent être administrés en thérapie à long terme, ont un effet plus durable, réduisent la candidiase induite par les stéroïdes, sont plus stables, sont synergiques, menent le patient à une meilleure observance, ont un goût moins désagréable ou ont d'autres propriétés souhaitables par comparaison avec les stéroides ou bronchodilatateurs administrés tels quels, le nédocromil sodique administré tel quel ou certains autres mélanges lors d'épreuves sur des modèles pharmacologiques compétents.
L'invention a pour objet un mélange pharmaceutique comprenant a) un ou plusieurs d'entre l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro- 4, 6-dioxo-10-propyl-4H-pyranno[3, 2-g]quinoléine-2, 8-di- carboxylique et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, comme "constituant actif A", en combinaison avec b) un ou plusieurs agents propres ä l'inhalation choisis parmi les bronchodilatateurs, les stéroides et leurs derives pharmaceutiquement acceptables, comme"consti-
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tuant actif B".
La Demanderesse préfère utiliser le sel disodique de l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-10-propyl-4H-pyranno[3,2-g]quinoléine-2,8-dicarboxylique, connu sous le nom de nédocromil sodique. Elle préfère aussi utiliser un seul constituant actif A en mélange avec soit un bronchodilatateur, soit un steroide comme constituant actif B.
Les bronchodilatateurs que le constituant B peut représenter comprennent l'isoprénaline. La Demanderesse préfère toutefois que le bronchodilatateur soit bêta-2-sélectif.
Un bronchodilatateur bêta-2-sélectif est un agoniste des récepteurs bêta-adrénergiques qui a davantage d'affinité pour les récepteurs bêta-2-adrénergiques, dont la stimulation se traduit par le relächement des muscles bronchiques (et aussi artériels et utérins) que pour les récepteurs bêta-1-adrénergiques, dont les agonistes induisent la stimulation cardiaque (et la lipolyse).
Pour la détermination de la bêta-2-sélectivité, une comparaison est établie entre l'activiste du composé (a) comme agent de relâchement des préparations de trachée isolée de cobaye sous tonus spontané (Chez = concentration molaire donnant 50% de la réponse de relâchement maximale à l'isoprénaline) et (b) l'augmentation de la fréquence de battement auriculaire de l'oreillette isolée en battement spontané du coeur de cobaye (CErr) = concentration molaire induisant 50% de l'augmentation maximale de rythme induite par l'isoprenaline).
Un composé bêta-2-sélectif doit avoir une CE- plus faible sur la trachée que sur l'oreillette. 11 est possible de déterminer un rapport de sélectivité qui est l'antilogarithme de la difference entre le logarithme négatif de CE50 (trachée) et le logarithme négatif de CE-- (oreillette). Plus ce rapport de sélectivité est
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élevé et plus le compose est sélectif pour les récepteurs bêta-2-adrénergiques.
La Demanderesse préfère que le bronchodilatateur bêta-2-sélectif soit ä action durable. Par l'expression "à action durable", on entend que le composé a comme agent de relâchement du muscle bronchique lisse dans les épreuves pharmacologiques une durée d'action plus longue que celle de l'isoprénaline ou de l'orci- prénaline. Pour les études de la durée d'action, une comparaison est établie entre l'effet de doses i. v. également actives pour l'inhibition du bronchospasme induit par l'acétylcholine ou l'histamine chez le cobaye anesthésié. La durée d'action de l'isoprénaline dans une telle épreuve est relativement brève (retour de la réponse témoin à la valeur normale en 10 à 25 minutes).
Dans le cas d'un composé ayant une plus longue durée d'action la réponse témoin ne devrait retourner à la valeur normale qu'en une durée plusieurs fois plus longue.
Des bronchodilatateurs spécifiques qui peuvent être cités sont la terbutaline, le fénotérol, le réprotirol, le pirbutérol, le rimitérol, l'orciprénaline et en particulier le salbutamol.
Des stéroïdes convenantcomme constituant actif B sont notamment l'hydrocortisone, outre des composés plus actifs tels que le valérate de bêtaméthasone, le butyrate de clobétasone, l'acétonide de fluocinolone, l'hexanoate de fluocortolone, le dipropionate de béclométhasone, le butyrate d'hydrocortisone, le valérate de difluocortolone, l'acétonide de triamcinolone, le flucinonide, le désonide, la f1urandrénalone, le piva-
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late de fluméthasone, la méthylprednisolone, le propionate de clobétasol, l'halcinonide, le tixocortol, la prednisolone et le 21-acétate de fluprednylidène. La Deman- deresse préfère que le constituant actif B soit le dipropionate de béclométhasone.
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L'invention a aussi pour objet un sei de l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-4, 6-dioxo-10-propyl-4H-pyranno[3, 2-g]quinoléine-2, 8-dicarboxylique avec un agent basique propre ä l'inhalation choisi parmi les broncho- dilatateurs bêta-2-sélectifs et les stéroïdes.
Le sei peut être préparé par un procédé de double décomposition, par exemple par réaction d'un sei approprié, tel que le sei disodique, de l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-4/6-dioxo-1O-propyl-4H-pyranno- [3, 2-g]quinoléine-2, 8-dicarboxylique avec un sei convenable, par exemple le chlorhydrate ou le sulfate, de la base de l'agent propre à l'inhalation. Toutefois, le sei est de préférence produit par réaction de l'acide
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libre, à savoir l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-4, 6-dioxo- 10-propyl-4H-pyranno [3, 2-g]quinoléine-2, 8-dicarboxylique, avec la base libre de l'agent propre ä l'inhalation, parce qu'un tel procédé ne donne pas de sei inorganique comme sous-produit. La reaction peut être exécutée dans un solvant qui est inerte dans les conditions de réaction.
Le solvant est de préférence un solvant dans lequel le sei souhaité est soluble, par exemple l'eau. Le sel souhaité peut être isolé et purifié, par exemple, par cristallisation ou lyophilisation.
L'invention a donc pour objet le sei lorsqu'il n'est pas en solution, par exemple le sei lorsqu'il se trouve sous une forme sensiblement sèche, ou lorsqu'il se trouve en mélange avec insuffisamment de liquide, par exemple d'eau, pour le dissoudre complètement.
Le sei peut, si la chose est souhaitée, etre
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utilisé conjointement avec un ou plusieurs autres sels de l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-4, 6-dioxo-lO-propyl-4Hpyranno[3, 2-g]quinoléine-2, 8-dicarboxylique, notamment son sei disodique.
Le rapport des constituants actifs A et B dans la composition variera avec la nature des constituants
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actifs particuliers et les fins spécifiques auxquelles la composition est destinée. Lorsque le constituant actif A est lui-même un sel de l'acide 9-éthyl-6, 9-
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dihydro-lO-propyl-4H-pyranno[3, 2-g]quinoléine-2, 8-dicarboxylique avec un agent basique propre ä l'inhala- tion, par exemple un bronchodilatateur bêta2-sélectif, il peut être nécessaire d'utiliser une proportion nulle ou tout au plus tres faible de l'agent basique "libre" ou d'un autre sel de celui-ci comme constituant actif B.
Une dose appropriée du constituant actif A pour 1'inhalation se situe dans l'intervalle de 1 à 100 mg et de préférence de 1 à 20 mg (à mesurer en nédocromil sodique).
Une dose appropriée du. constituant actif B pour l'inhalation et un nombre approprié de parties en poids de constituant actif A (à mesurer en nédocro- mil sodique) pour une partie en poids de constituant actif B sont spécifiés ci-après:
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<tb>
<tb> Compose <SEP> Dose <SEP> en <SEP> Rapport <SEP> A <SEP> : <SEP> B <SEP> (composimicrogrammes <SEP> tion <SEP> en <SEP> aérosol <SEP> sous
<tb> pression)
<tb> Salbutamol <SEP> 50 <SEP> ä <SEP> 300 <SEP> 4 <SEP> ä <SEP> 20 <SEP> : <SEP> l
<tb> (sous <SEP> forme <SEP> de <SEP> de <SEP> préférence
<tb> sulfate) <SEP> 50 <SEP> ä <SEP> 200
<tb> Terbutaline <SEP> 100 <SEP> à <SEP> 600 <SEP> 2 <SEP> ä <SEP> 10 <SEP> :
<SEP> 1
<tb> (sous <SEP> forme <SEP> de <SEP> de <SEP> préférence
<tb> sulfate) <SEP> 100 <SEP> ä <SEP> 500
<tb> Fénotérol <SEP> 100 <SEP> ä <SEP> 500 <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 1
<tb> (sous <SEP> forme <SEP> de
<tb> bromhydrate)
<tb> Pirbutérol <SEP> 100 <SEP> à <SEP> 500 <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 15 <SEP> : <SEP> 1
<tb> (sous <SEP> forme <SEP> de
<tb> chlorhydrate)
<tb> Réprotérol <SEP> 150 <SEP> à <SEP> 750 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> : <SEP> 1
<tb> (sous <SEP> forme <SEP> de
<tb> chlorhydrate)
<tb> Dipropionate <SEP> de <SEP> 10 <SEP> à <SEP> 500 <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 40 <SEP> : <SEP> 1
<tb> béc1ométhasone <SEP> de <SEP> préférence
<tb> 25 <SEP> à <SEP> 200
<tb>
11 est hautement préféré que la dose de constituant B soit de nature à exercer un effet persistant plutôt que transitoire.
Le mélange peut être administré en doses subdivisées 1 à 6 et de préférence 2 à 4 fois par jour.
Chaque dose peut comprendre une ou plusieurs doses unitaires.
Les rapports spécifiques des constituants actifs A et B particuliers dans toute composition conforme à l'invention peuvent varier dans un large intervalle.
La Demanderesse préfère toutefois une composition contenant 0, 4 ä 400 parties en poids et plus avantageusement 2 à 200 parties en poids de constituant actif A (à mesurer en nédocromil sodique) par partie en poids de con-
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stituant actif B.
Les mélanges conformes ä l'invention peuvent être préparés en mélangeant ensemble les différents constituants actifs suivant des techniques habituelles connues.
Les sels, melanges et compositions de l'invention sont utiles parce qu'ils ont une activité pharmacologique chez les animaux ; en particulier, ils sont utiles parce qu'ils inhibent le dégagement et/ou l'action des médiateurs pharmacologiques qui résultent de la combinaison in vivo de certains types d'anticorps et d'antigènes spécifiques, par exemple la combinaison d'un anticorps réaginique avec un antigène spécifique (voir exemple 27 du brevet anglais nO 1. 292. 60l). Les sels et compositions se sont aussi révélés inhiber la dégranulation des mastocytes et intervenir dans les trajets réflexes chez les animaux d'expérience et l'homme, en particulier dans les réflexes associés à la fonction pulmonaire.
Chez l'homme, les altérations tant subjectives qu'objectives qui résultent de l'inhalation d'un antigène spécifique par un sujet sensibilisé sont inhibées par une administration préalable des nouveaux sels et nouvelles compositions. Les nouveaux sels et nouvelles compositions sont donc utiles pour le traitement d'une obstruction réversíble des voies aériennes et/ou pour la prévention de la sécrétion d'un excès de mucus.
Ils sont donc utiles pour le traitement de l'asthme allergique, de l'asthme dit"intrinsèque" (pour lequel aucune sensibilité à un antigène extrinsèque ne peut être démontrée), de l'asthme induit par l'exercice etc., de la rhinite, du poumon du fermier, de la maladie des oiseleurs, de la bronchite, des toux (y compris la coqueluche) et des obstructions du nez et des bronches associées au rhume ordinaire. Les nouveaux sels, mélanges et compositions sont precieus aussi pour le
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traitement d'autres états dans lesquels des réactions antigènes-anticorps ou une sécrétion excessive de mucus sont la cause ou une cause accessoire de la maladie.
Les nouveaux sels, mélanges et compositions de l'invention peuvent être administrés par des voies tres diverses et peuvent agir par voie systémique ou locale. Par conséquent, les composés peuvent être' administrés par inhalation orale ou nasale dans les poumons, directement dans le nez ou les yeux, dans la
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'it6 buc' cavité buccale, dans l'oesophage ou sur d'autres surfac ces accessibles du corps. Les nouveaux sels et mélanges peuvent être administrés directement sur l'organe ou la partie du-corps manifestant les symptômes ou sur une partie éloignée que celle manifestant les symptomes.
L-j'in-vention a aussi pour objet un procédé de traitement des affections obstructives et réversibles des voies aériennes, qui comprend l'administration d'une quantite-therapeutiquement efficace de
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a) un ou plusieurs d'entre l'acide 9-éthyl-6, 9-dihydro-4, 6-dioxo-10-prqpyl-4H-pyranno [3, 2-g] quinoléine- 2,8-dicarboxylique et les sels pharmaceutiquement ac- ceptables de celui-ci comme "constituant actif A", en combinaison avec b) une quantité thérapeutiquement efficace d'un ou plusieurs agents propres à l'inhalation choisis parmi les bronchodilatateurs bêta2-sélectifs, les stéroïdes et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables comme "constituant actif B", simultanément ou séparément dans le temps à un patient souffrant d'une telle affection.
Le procédé de traitement est exécuté de préférence sur base quotidienne régulière, par exemple 1 à 4 fois par jour. Le procédé est exécuté de pré- férence pendant une longue durée, par exemple au moins
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4 semaines et de préférence au moins 8 semaines. Le procédé comprend de preference l'administration simultanée de doses fixées du constituant actif A avec des doses fixées du constituant actif B.
Les nouveaux sels, mélanges et compositions de l'invention peuvent être administrés suivant une grande variété de posologies, soit tels quels, soit conjointement avec un ou plusieurs autres composés actifs.
Les nouveaux sels de l'invention et les constituants actifs des mélanges et compositions peuvent etre préparés à des granulométries d'une grande variété. Par exemple, pour l'inhalation et d'autres applications, les composés peuvent avoir un diamètre médian en masse
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de 0, a 10. tt. rn, de préférence de 2 a 6. fn et plus avantageusement de 2 à 4 m.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant (de préférence ä raison de moins de 80% et plus avantageusement à raison de moins de 50% en poids) un sel ou mélange conforme ä l'invention, en association avec un adjuvant, diluant ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
Des exemples d'adjuvants, diluants ou exci-
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pients appropriés sont : pour les comprimés, capsules et dragées : 1a cellulose microcristalline, le phosphate de calcium, la terre de diatomées, un. sucre tel que le lactose, le dextrose ou le mannitol, le talc, l'acide stéarique, l'amidon, le bicarbonate de sodium et/ou la gelatine ; pour les suppositores : les cires et huiles naturelles ou durcies, et pour les compositions à inhaler : le lactose grossier.
Pour l'administration par inhalation, les nouveaux sels ou mélanges peuvent etre mis en composition avec un gaz comprimé, par exemple l'azote, ou avec
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un agent propulseur liquéfié ä l'état de composition en aérosol sous pression, la composition contenant de préférence 1 à 20% p/v du ou des agents actifs.
Les nouveaux sels ou mélanges peuvent être administrés aussi à l'état de solution nébulisée.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLE 1 Aérosol sous pression débitant du nédocromil sodique (2 mg) et du sulfate de salbutamol (0, 1 mg)
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<tb>
<tb> Nédocromil <SEP> sodique <SEP> (micronisé, <SEP> séché) <SEP> 1, <SEP> 4420% <SEP> p/p
<tb> Salbutamol <SEP> (micronisé) <SEP> 0,0721
<tb> Trioleate <SEP> de <SEP> sorbitan <SEP> 0, <SEP> 5000
<tb> Diclorotétrafluoroéthane <SEP> 39, <SEP> 1944
<tb> Dichlorodifluorométhane <SEP> 58, <SEP> 7915
<tb>
Refroidir le dichlorodifluorométhane ä - 55 C et y disperser le trioleate de sorbitan au moyen d'un mélangeur ä cisaillement intense.
Disperser le nédocromil sodique et le sulfate de salbutamol dans le mélange et ajouter le dichlorotétrafluoroéthane préalablement refroidi à -55 C.
Introduire la suspension dans des bidons et sertir sur chaque bidon une valve doseuse d'une capacité de 100. 1.
EXEMPLE 2 Aérosol sous pression débitant du nédocromil sodique (2 mg) et de la terbutaline (0, 25 mg).
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<tb>
<tb>
Nédocromil <SEP> sodique <SEP> (séché, <SEP> micronisé) <SEP> 1, <SEP> 4286% <SEP> p/p
<tb> Terbutaline <SEP> (micronisée) <SEP> 0, <SEP> 1786
<tb> Trioléate <SEP> de <SEP> sorbitan <SEP> 0, <SEP> 5000
<tb> Trichlorofluorométhane <SEP> 24, <SEP> 4732
<tb> Dichlorotétrafluoroéthane <SEP> 24, <SEP> 4732
<tb> Dichlorodifluorométhane <SEP> 48, <SEP> 9464
<tb>
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Dissoudre le trioleate de sorbitan dans le trichlorofluorométhane et disperser le nédocromil sodi-
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que et le sulfate de terbutaline dans la solution. Refroidir la solution à -55OC et ajouter le dichlorotétrafluoroéthane et le dichlorodifluorométhane refroidis à -55Oc. Introduire la suspension dans des bidons et sertir sur chaque bidon une valve doseuse
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d'une capacité de 1001.
EXEMPLE 3 Aérosol sous pression débitant du nédocromil sodique (2 mg) et du réprotérol (0, 5 mg).
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<tb>
<tb> Nédocromil <SEP> sodique <SEP> (seche, <SEP> micronise) <SEP> 1, <SEP> 4663% <SEP> p/p
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> réprotérol <SEP> (micronisé) <SEP> 0,3666
<tb> Trioléate <SEP> de <SEP> sorbitan <SEP> 1, <SEP> 0000
<tb> Trichlorofluorométhane <SEP> 10, <SEP> 0000
<tb> Dichlorotétrafluoroéthane <SEP> 13, <SEP> 0751
<tb> Dichlorodifluorométhane <SEP> 74,0920
<tb>
Préparer comme dans l'exemple 2.
EXEMPLE 4 Aerosol sous pression débitant du nédocromil sodique
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<tb>
<tb> (2 <SEP> mg) <SEP> et <SEP> du <SEP> dipropionate <SEP> de <SEP> béclométhasone <SEP> (0, <SEP> 05 <SEP> mg)
<tb> Nédocromil <SEP> sodique <SEP> (séché, <SEP> micronisé) <SEP> 1,4420% <SEP> p/p
<tb> Dipropionate <SEP> de <SEP> béclométhasone <SEP> (micronisé) <SEP> 0,0361%
<tb> Trioleate <SEP> de <SEP> sorbitan <SEP> 0, <SEP> 5000
<tb> Dichlorotetrafluoroethane <SEP> 39, <SEP> 2088
<tb> Dichlorodifluorométhane <SEP> 58, <SEP> 8131
<tb>
EMI12.4
Préparer comme dans l'exemple 1.
On a examiné les effets des mélanges, sels et compositions conformes à l'invention dans les systèmes suivants : EXEMPLE A Epreuve d'anaphylaxie pulmonaire passive chez le rat
On a sensibilise passivement des femelles de rat (Charles River) d'un poids de 250 g par injec-
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tion intraveineuse de 0, 5 ml d'antisérum à l'IgE de rat potentialisée dirigée contre l'ovalbumine.
On a anesthesie les rats à la pentobarbitone
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sodique (70 mg/kg) par voie intraveineuse. On a canulé la trachée et on a ventilé le rat à l'aide d'une pompe respiratoire Palmer Miniature Ideal en système clos.
On a enregistré la pression dans la trachée au moyen d'une dérivation de la canule connectée à un transducteur de différence de pression de l'air (UPI, Pye Ether Ltd. ). On a réglé le rythme respiratoire ä 99 coups par minute avec une pression dans la trachée de 6 cm d'eau.
On a agressé les rats, 48 heures après la sensibilisation, avec de l'ovalbumine (25 mg/kg par voie intraveineuse) et on a mesuré, en pinçant la trachée l'augmentation résultante de la pression dans la trachée exprimée en pourcentage du degré maximum possible de bronchoconstriction (A PCB max).
On a administré le constituant actif A et/ou le constituant actif B, soit isolément, soit en combinaison, par voie intraveineuse dans de la solution physiologique salée au cours de la période de 1 ä 5 minutes avant l'agression par l'antigène.
On a analysé les résultats de l'administration des deux composés en combinaison en exécutant une analyse de variance pour un agencement factoriel avec des mesures répétées dans chaque cellule. On a effectué une transformationpar racine carree avant l'analyse.
On a examiné plus en détail un effet antagoniste ou synergique éventuel des deux composés en appliquant le procédé décrit par Berenbaum, Clin. Exp.
Immunol., 28, 1 (1977). Celui-ci consiste ä calculer la grandeur :
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dose de A dose de B Ae Be
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où (A, B) est la combinaison exerçant un effet X.
Ae est la dose de A seul donnant un effet X.
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Be est la dose de B seul donnant un effet X.
Si Z < 1, A et B sont synergiques.
Z = 1, A et B sont additifs.
Z > 1, A et B sont antagonistes.
EXEMPLE B Inhibition du dégagement du médiateur par les cellules
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broncho-alvéo1aire Matériels et procédés Matériels
On a acquis de la [3H]-S-adénosyl-L-méthionine
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(SOOrnCi/mmole) et du [P]-orthophosphate (sans entrai- neur) chez Amersham International (Amersham, Buckinghamshire, Royaume-Uni), de l'antiserum de mouton contre 1'IgE de rat, de l'antiserum de chèvre contre de 1'IgE humaine et du sérum de chèvre normal chez Miles Laboratories (Slough, Buckinghamshire, Royaume-Uni). On a précipité le sérum de chèvre anti-IgE humaine et le témoin avec du sulfate d'ammonium saturé ä 40% (Largman et al, Methods Enzymol (1981) 74 : 22) et après dialyse, on a ajusté la fraction de globuline au volume original du sérum.
On a préparé l'antigene d'ascaris à partir du liquide pseudocoelomique d'Ascaris suum adulte par chromatographie sur Sephadex G200 (Pharmacia, Milton Keynes, Buckinghamshire, Royaume-Uni) suivant le proceded'Ambler
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et al, J. Immunol. Meth. (1972), !, 317.
Infection et lavage broncho-alvé01aire chez des macaques
On a utilisé pour ces études un groupe de 20 singes Macaca arctoides, d'un poids de 8-18 kg. On a c infecté les animaux au moyen d'A. suum et on a effectué le lavage comme décrit par Pritchard et al, Clin. Exp.
Immunol., (1983), 54 : 469. On a recueilli le liquide du lavage dans des tubes héparinisés et on l'amis sur glace.
Traitement de cellules du lavage broncho-alvéo1aire
On a filtre le liquide de lavage ä travers un
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filtre en Nylon de 175m et on a recueilli les cellules -011-
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par centrifugation (450 g pendant 5 minutes ä 4 C). On a lavé les cellules et on les a remise en suspension ä la dilution de travail requise dans du tampon (Tyrode tamponné ä l'HEPES 10 mM, pH 7, 4, contenant 1 mg/ml de gélatine et 5 unités/ml d'héparine). On a effectué les comptages différentiels de cellules sur les préparations humides dans du milieu colorant de Kimura (20).
Lorsque seul le dégagement d'histamine devait être mesure, les cellules ont été agressées, en triple expé- rience, par addition de 0, 05 ml de cellules, ä une den- sité de 105 mastocytes/ml, à du constituant A, par exemple à 0, 05 ml de tampon contenant l'agent de dégagement
EMI15.1
Q outre le constituant B, par exemple (3 x 10-8 - 10-6M), et du nédocromil sodique (3 x 10-6 - 10-4M) isolément et en combinaison à 37OC. Après 20 minutes d'incubation ä 37 C, le processus de dégagement a été bloqué par addition de 0, 25 ml de tampon glacé exempt de Ca2+ et Mg2+ contenant de l'EDTA 2 mM.
Après centrifugation (450 g pendant 5 minutes ä 4OC), on a recueilli 0, 2 ml de liquide surnageant pour le dosage de l'histamine.
Dans toutes les expériences d'inhibition, on a choisi un taux d'agression submaximal qui, d'après l'expérience de lavages antérieurs du même animal, dégage 15-25% de l'histamine totale, mais pas plus de la moitié du déga- gement maximum réalisable.
Mesures de l'histamine
On a mesuré l'histamine par le procédé isotopique double de Beaven et al, Clin. Chim. Acta, (1972), 37,97 modifié comme décrit dans Pritchard et al.
EXEMPLE C Hyperactivité bronchique non spécifique chez l'asthmatique adulte
Des adultes asthmatiques ont donné leur consentement après information et participé ä l'etude.
On a effectué l'agression par l'histamine
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suivant le procédé de Cockcroft, Clin. Allergy, (1977), 7, 235. On a fait inhaler pendant 2 minutes à intervalles de 5 minutes, des concentrations doublées de phosphate acide d'histamine (0, 03-8 mg/ml). On a mesuré le volume expiratoire forcé ä une seconde (VEF.) au moyen d'un spiromètre Vitalograph à coin sec avant, de même que 0, 5 et 1, 5 minute après chaque inhalation.
On a interrompu l'agression lorsque le VEUF. a été diminué de 20% ou davantage par rapport ä la ligne de base mesurée. On a établi les courbes Log-dose/réponse et mesuré la CP20 par interpolation des deux derniers points.
EXEMPLE D
On a rassemblé pour cette étude des volontaires souffrant d'asthme allergique spécifique. Chez ces volontaires, une crise d'asthme succède normalement à l'inhalation d'un antigène auquel ils sont spécifiquement sensibles. Le degré d'asthme provoqué par ce mode opératoire peut être mesuré par examen répété de la résistance des voies aériennes.
On utilise un spiromètre approprié conçu pour mesurer le volume expiratoire forcé à une seconde (VEF1) et dès lors les modifications de la résistance des voies aériennes.
On mesure les modifications de VEUF. induites par le médicament 5 minutes après l'administration du médicament.
Six heures après l'administration du médicament, on déclenche une attaque témoin par antigène chez le volontaire et on mesure la baisse de VEUF. 5 minutes après l'administration de l'antigène.