AT410945B - Verfahren zur diagnose von multipler sklerose (ms) - Google Patents
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Description
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnoseerstellung bel einer Person mit Multipler Sklerose (MS) oder bei welcher ein Risiko besteht, dass sie an MS erkrankt. Weiters betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnoseerstellung bel einer Person, die Krebs hat, oder bei welcher das Risiko besteht, Krebs zu bekommen
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine allgemeine entmyelinisierende Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), von der etwa 0, 1% der nordeuropaischen kaukasischen Bevolkerung betroffen sind, und man nimmt an, dass sie ein Autolmmun-Syndrom ISt, das gegen nicht-identifizierte Zentralnerven-Gewebe-Antigene genchtet ist Die Bestimmung der Empfänglichkeit für die Entwicklung einer MS ist komplex, und es sind sowohl Umwelt- als auch genetische Faktoren involviert (Ebers et al., 1995 ;
Sawcer und Goodfellow, 1998 ; Sadovnick et al., 2000), wobei etwa 20% der Patienten einen oder mehrere betroffene Verwandte haben (Chataway et al., 1998). Obwohl man denkt, dass es eine polygenetische Erkrankung ist, griff man zu Vorgangsweisen unter Verwendung von An- wärter-Genen, um Gene, die mit MS verbunden sind, zu isolieren (Weinshenker und Kantarcl, 2000) Eine Assoziierung mit dem kaukasischen Haplotyp DRB*1501-DQA1*0102-DQB1*0602 (Haines et al, 1998) und eine Punkt-Mutation im Protein-Tyrosin-Phosphatase-Rezeptor-Typ C (Jacobsen et al., 2000) wurden mit einigen Fällen in Verbindung gebracht.
Kürzlich erkannte man die Bedeutung der Apoptose sowohl bei der Eliminierung von T-Zellen als auch bei der Beschädigung von Neuronen und Oligodendrocyten bei MS (Überblick : Z) pp, 2000).
Bisher wurde jedoch noch von keinem eindeutigen Marker berichtet, obwohl mindestens ein Teil der MS-Falle deutlich familiär vererbt ist Eine einfache Erkennung der MS, oder selbst die Vorhersage eines möglichen Risikos ware fur den frühen Einsatz einer Therapie oder praventiver Massnahmen günstig
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Diagnose-System für MS vorzusehen, das eine deutliche Anzeige und eine deutliche Korrelation für diese Krankheit liefert
Der Gegenstand dieser Erfindung ist daher ein Verfahren zur Diagnoseerstellung bei einer Person mit Multipler Sklerose (MS), oder bel welcher ein Risiko einer Erkrankung an MS besteht, gekennzeichnet durch die folgenden Schutte ;
'Bereitstellen einer Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes dieser Person, wobei diese Probe mindestens eines von Wildtyp-SCF-Apoptose-Response-Gen (wt-SARG)-
Protein und fur wt-SARG codierenden Nukleinsäuren enthält, wenn sie von einer Person entnommen wird, die nicht MS hat oder bei welcher kein Risiko einer Erkrankung an MS be- steht, 'd die Detektion des Vorhandenseins des wt-SARG-Proteins oder von für wt-SARG codieren- den Nukleinsäuren in dieser Probe, und 'die Diagnostizierung von MS oder eines Risikos einer Erkrankung an MS, wenn wt-SARG-
Protein oder für wt-SARG codierende Nukleinsäuren nicht in der Probe vorhanden sind.
Uberraschenderweise erwies sich das SARG-Protein als sehr spezifischer Marker für MS. Personen, die entweder ein mutiertes SARG-Protein aufweisen oder infolge von Mutationen in SARG kein SARG-Protein exprimieren, haben ein deutlich erhöhtes MS-Risiko. Untersuchungen der immun-histochemischen Lokalisierung des SARG-Proteins zeigten an, dass dieses Protein in der grauen und weissen Substanz des ZNS lokalisiert ist.
Die Rolle des SARG bei apoptotischer Induktion führte zur Vorgangsweise unter Verwendung eines Anwärter-Gens zur Analyse des MutationsStatus von SARG bei Fallen von MS in der Familie Tatsachlich wurde die DNA von 20 nichtverwandten MS-Patienten mit MS-FÅallen in der Familie durch PCR-Amplifizlerung und DNASequenzierung der SARG-Stelle untersucht und mit SARG-Sequenzen gesunder Kontrollen verglichen. Es zeigte sich, dass alle Kontroll-Proben Wildtyp-SARG-Genom-Sequenzen aufwiesen, wogegen bei der DNA von MS-Patienten nur 6 von 20 DNA-Proben überhaupt mittels PCR ampilfi- ziert werden konnten, d h, 14 von 20 zeigten keinerlei detektierbare SARG-Signale. Bei 4 der 6 anderen Patienten fand man genetische Veranderungen.
Eine Te C-Punkt-Mutation am Nukleotid 67, die zu einer Substitution von Phenylalanin durch Leucin an Aminosäure 23 führte (Nummenerung der Aminosäuren und Nukleotide gemäss Fig 4-8) eine C-T-Punkt-Mutation am Nukleotid 359, die zur Substitution von Serin an Aminosaure 120 durch Phenylalanin führte (Fig 16), eine A- G-Punkt-Mutation am Nukleotid 89, die zur Substitution von Glutaminsaure an Aminosäure 30 durch Glycin führte (Fig 17), die Deletion eines Codons zwischen Aminosäure 116 und 121, die zum Verlust eines Senn-Rests führte (Fig. 18) Die Sequenzierung von lediglich 20 Kontroll-DNA-
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Proben zeigte nur die Wildtyp-Sequenz.
Überraschenderweise wurde auch beobachtet, dass Veränderungen im Wildtyp-SARG- oder im SARG-Protein bei mehreren Krebszellen gefunden wurden. Bel der Sequenz-Analyse von über 30 Krebszellen war immer ein G-Rest an Position 280 vorhanden, was zu einem Leucin-Rest an Position 94 anstelle eines Valins (A-Nukleotid) oder Methionins (T-Nukleotid) führte.
Bei einer Human-Melanom-Zelilinie findet man zwei Mutationen in SARG : A- > G-Punkt-Mutation am Nukleotid 74, die zur Substitution von Glyzin durch Asparaginsäure, und eine C- T-PunktMutation am Nukleotid 289, die zur Substitution von Thyrosin an Aminosäure 97 durch Histidin führte
Es gibt eine Anzahl von Restriktionsstellen, die bei diesen Mutationen eine Rolle spielen : Te C am Nukleotid 67 schafft eine Anzahl von Restriktionsstellen : Ec0881, Xhol, PaeR71, Sfr2741, Ama7811, Bcol, BsoBI, Aval ; C T am Nukleotid 359 schafft eine zusätzliche BseRIRestriktionsstelle.
Daher betrifft ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Diagnoseerstellung bei einer Person mit Krebs oder bei welcher ein Risiko einer Erkrankung an Krebs besteht, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte' 'Vorsehen einer Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes dieser Person, wobei diese Probe mindestens eines von wt-SARG-Protein und für wt-SARG codierenden Nuk- leinsäuren enthält, wenn sie von einer Person entnommen wird, die keinen Krebs hat oder bei welcher kein Risiko einer Krebs-Erkrankung besteht, 'die Detektion des Vorhandenseins des wt-SARG-Proteins oder von für wt-SARG codieren- den Nukleinsäuren in dieser Probe, und 'die Diagnostizierung von Krebs oder eines Risikos einer Erkrankung an Krebs, wenn wt-
SARG-Protein oder für wt-SARG codierende Nukleinsäuren nicht in der Probe vorhanden sind.
Die Quelle der Probe hängt immer von der Art des Krebses oder der zu diagnostizierenden Erkrankung ab. Besonders bevorzugte Proben gemäss der vorliegenden Erfindung stammen von menschlichem Blut, Plasma, Serum, Lymphe, Nervenzellen-enthaltendem Gewebe, Zerebrospinalflüssigkeit, jeglichem Biopsie-Material, einschliesslich Tumorgewebe, Knochenmark, Nervengewebe, Haut, Haaren, Tränen, fötalem Material einschliesslich Amniocentese-Material, Uterusgewebe, Speichel, Kot, Sperma usw.
Im Prinzip kann jedes Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins von wt-SARG-Protein oder von für wt-SARG codierender Nukleinsäure in der Probe gemäss der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Vorzugsweise werden Verfahren verwendet, die auch eine Charakterisierung spezifischer SARG-Mutanten, soferne vorhanden, ermoglichen, entweder durch Liefern der Information, dass eine Mutation vorhanden ist, oder durch detaillierte Analyse der Art der Mutation.
Insbesondere kann die Detektion des Vorhandenseins von Punkt-Mutationen bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt sein, d. h., nicht-wt-Formen von SARG, die sich von wt-SARG oder wtSARG-Protein in einem Nukleinsaurerest bzw einem Aminosaurerest unterscheiden. Das erfindungsgemässe Verfahren kann dazu bestimmt sein, diese Punkt-Mutationen zu identifizieren, insbesondere Punkt-Mutationen, die zu den verschiedenen Aminosäure-Sequenzen führen, z B. zum Austausch eines Aminosäurerests aus dem Wildtyp-SARG-Protein.
Geeignete Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins von wt-SARG-Protein oder von codie-
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(SSCP)-Analyse, Restrikti-onsanalyse, Mikroanordnungstechnologie, Proteomik, usw. Diese Verfahren erwiesen sich als schnell, hoch zuverlässig und bei hohem Durchsatz leicht durchführbar. Diese Tests konnten an Standard-Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben, wie Blut, Haar oder Speichel, durchgefuhrt werden.
Anderseits umfassen bevorzugte Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins von wt-SARGProtein die Anwendung eines wt-SARG-Protein-Antikörpers, insbesondere eines monoklonalen Antikörpers, z. B. in ELISA-Format. Solche Antikörper sind in grosstechnischem Massstab leicht herstellbar und haben ein hochgradiges Standardisierungs-Potential
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ist besonders zur Anwendung innerhalb
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eines Screening-Test-Formats geeignet
Die SARG-intron/Exon-Struktur ist in Fig. 19 angegeben Der Transkriptions-Start-Stellen- Initiator-Consensus YYCARR Ist unterstrichen. Donor (GU)- und Akzeptor (AG) -Spleissstellen sind kursiv und unterstrichen. Die Codier-Exon-Sequenzen sind kursiv.
SARG Ist auf dem HumanChromosom 20q12-13. 12 lokalisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen weiteren Aspekt, nämlich ein Nukleinsauremolekul, welches eine Sequenz gemäss Seq ID. Nr. 1 (Fig 4) aufweist, welche für Human-Wildtyp-SARG codiert. Solche Nukleinsauren konnen für die Diagnose, jedoch auch für therapeutische Aspekte verwendet werden, indem therapeutische Moleküle oder Gen-Sequenzen für Gen-TherapieAnsatze, z. B. antisense-Strategien vorgesehen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäure-Moleküle, welche eine Sequenz gemäss Seq. ID. Nr. 1 aufweisen, worin ein Nukleinsäurerest durch einen anderen Nukleinsäurerest ausgetauscht ist (z. B. ist T durch C, G oder A ersetzt) oder die Nukleinsäure eine Deletion In der Kodierregion von Seq. 1 D. Nr. 1 aufweist, wobei dieser Austausch eder die Deletion zu einer anderen SARG-Protein-Aminosaure-Sequenz führt, die ein Marker für Kules oder MS ist.
Besonders bevorzugte Austausche sind ausgewählt aus einem Tausch von T zu C an Position 67 der Seq. ID Nr. 1, einem Tausch von A zu G an Position 74 der Seg. ID. Nr 1, einem Tausch von A zu G an Position 89 der Seq. ID. Nr. 1, einem Tausch von C zu T an Position 289 der Seq. ID. Nr. 1, und einem Tausch von C zu T an Position 359 der Seq. ID. Nr.
Claims (31)
1. Diese Austausche betreffen Austausche, die man bei MS-Patlenten oder Krebszellen bereits beobachtet hat. Weitere Austausche, die zu einem funktionsfikiger Phänotyp führen, sind ebenfalls bevorzugt.
Andere bevorzugte Mutationen im Nukleinsaure-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen eine Deletion in der Codier-Region, vorzugsweise eine Deletion eines oder mehrerer Codons (z. B. 3 Nukleinsauren, oder 6,9, 12 usw. ). Eine dieser Mutationen führt zur Deletion eines Codons zwischen den Aminosäuren 116 und 121, was zum Verlust eines Serin-Rests führt (Fig. 18). Mutationen, die zu nicht-funktionellem SARG am SARG-Protein fuhren, können auch in den Kontroll-Regionen (5'oder 3') und/oder in den Sequenzen, insbesondere an kritischen Positionen für richtiges Spleissen, lokalisiert sein.
Wenn das Nukleinsäure-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung für einen Diagnosezweck verwendet wird, ist es nicht notwendig, die gesamte Sequenz zu verwenden. Zur Verwendung als Sonde oder zur Durchführung eines Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung ist ein Frag-
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Tests, insbesondere diagnostischer Tests, mit diesen Sonden geeignet, z. B. als Sonde zur Identifizierung oder Isolierung von Nukleinsaure-Proben oder selbst Chromosomen-Proben oder als PCRPnmer, usw.
Die Nukleinsaure-Molekule gemäss der vorliegenden Erfindung sind nicht auf die CodierSequenz gemäss Seq. ID Nr 1 eingeschrankt, sondern betreffen auch die Genom-Gegenstucke, einschliesslich der Gesamt-Exon/lntron-Struktur dieses Gens, insbesondere sind auch Imitationen in der nicht-codierenden Region, die zu nicht-Wildtyp-Formen des Proteins (oder nichttranslatierten Formen des Proteins führen, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein von diesem Nukleinsaure-Molekül codiertes Polypeptid, welches z. B. eine Aminosäure-Sequenz gemäss Seq. ID. Nr.
2 aufweist. Es gibt eine einzige potentielle N-Glykosyllerungsstelle mit einem Consensus Asn-X-Ser/Thr (Aminosäurereste 131- 133) MDPNPRAALERQQLRLRERQKFFEDILQPETEFVFPLSHLHLESQRPPIGSISSMEVNVDT- LEQVELIDLGDPDMDVFLPCEDPPPTPQSSGVDNHLEELSLPVPTSDRTTSRTSSSSSSDSSTN LHSPNPSDDGADTPLAQSDEEEERGDGGAEPGACS
Alle Threonin- und Serin-Reste können O-glykosyliert sein. Computer-Voraussagen zeigen eine grosse Wahrscheinlichkeit der Glykosyllerung der Serin-Reste 91,108, 113,117, 118,119, 120, 121, 123, 124 und 133, und der Threonin-Reste 88, 107,111, 112,115 und 125 an.
Auf ähnliche Weise können alle Threonin- und Serin-Reste phosphoryliert sein. ComputerVoraussagen zeigen eine grosse Wahrscheinlichkeit der Phosphorylierung der Serin-Reste 54,92, 108,113, 116,117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 129, 133 und 144, und der Threonin-Reste 61, 88,107, 112 und 139 an.
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Es wurden keine Signal-Sequenzen, charakteristische Domanen oder anderen 3- dimensionalen Strukturen entdeckt als die potentiellen Protein-Kinase-Erkennungsstellen. Natürlich sind auch Aminosäure-Sequenzen, die auch einen Aminosäurerest-Austausch oder eine Deletion aufweisen, von der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Aminosaurerest-Austausche des Polypeptids gemäss der vorliegenden Erfindung sind vorzugs- weise ausgewählt aus den Aminosäureresten Phe23, Asp25, Glu30, His97 und Ser120, insbeson- dere Phe23 zu Leu23-, Asp25 zu Gly25-, Glu30 zu Gly30-, His97 zu Tyr97-und Ser120 zu
Phe120-Austausche.
Bevorzugte Polypeptide gemäss der vorliegenden Erfindung werden rekombinant erzeugt und weisen Strukturunterschiede im Vergleich zum wt-SARG-Protein auf, z. B. Differential-
Glykosylierung, insbesondere nicht-homogene Glykosylierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Antikörper-
Praparation, umfassend die Verabrelchung eines Polypeptids gemäss der vorliegenden Erfindung an ein Tier, wobei man das Tier Antikörper gegen das Polypeptid entwickeln lässt, dem Tier Anti- korper enthaltende Korperflüssigkeiten oder Gewebe entnimmt, und eine Antikörper-Präparation gegen das Polypeptid aus diesen Körperflüssigkeiten oder dem Gewebe herstellt. Dieses Verfah- ren ist besonders zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendbar.
Zur Herstellung monoklonaler Antikorper wird ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Anti- körper-Praparation bevorzugt, umfassend das Verabreichen eines Polypeptids gemäss der vorlie- genden Erfindung an ein Tier, das Erzeugenlassen von Antikörpern gegen das Polypeptid durch das Tier, das Entfernen der Milz des Tieres, das Herstellen von Fusionszellen von den Milzzellen mit geeigneten Hybridom-erzeugenden Zellen, das Erzeugen von Hybridom-Zellen, die monoklona- le Antikörper gegen das Polypeptid erzeugen, das Kloneren und Kultivieren der Hybridom-Zellen, wobei monoklonale Antikörper exprimiert werden, und die Präparation der monoklonalen Antikör- per.
Der Fachmann greift dabei zu Verfahren, die für solche Zwecke leicht verfügbar und beispielsweise in "Antibodies : A laboratory manual" von Ed Harlow, Gold Spring Harbor Laboratory ;
David Lane, Imperial Cancer Research Fund Laboratories, 1988, beschrieben sind. Natürlich können auch Phagen-Display-Peptide leicht erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Set zur Durchführung des in-vitro-
Diagnoseverfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung, welches mindestens Mittel zur Detektion der Anwesenheit von wt-SARG-Protein oder von für wt-SARG codierenden Nukleinsäuren aufweist. Der Fachmann kann sich auf Grund der Offenbarung in der vorliegenden Patentschrift eine grosse Zahl geeigneter Alternativen vorstellen, z. B. anti-wt-SARG-Protein-Antikörper, NukleinsäureSonden, die selektiv an wt-SARG binden, Nukleinsäure-Primer, die eine Region definieren, welche für ein wt-SARG selektiv ist, einen Chip, welcher diese Nukleinsäure-Sonden oder diese Nukleinsäure-Primer aufweist.
Andere bevorzugte Mittel oder Tests sind Tests, bei welchen Proteine an SARG binden, wie Antikörper oder Peptide, die Mutations-spezifische Antikörper inkludieren, ELISAS, Western Blot-Tests, Strömungszytometrie-Tests und Tests unter Verwendung Immunhistochemischer Techniken, inklusive konfokale Mikroskopie.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein transgenes nicht-humanes Tiermodell der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein Tier, bei welchem das SARG-Gen mutiert oder einem Knock-out unterzogen wurde. Eine SARG-knock-out-Maus ist besonders bevorzugt Verfahren zum Vorsehen solcher Modelle, insbesondere der Mausmodelle, sind für den Fachmann leicht verfugbar. Ein solches Tiermodell ist zur Untersuchung genetischer Variationen und Mutationen von SARG extrem nützlich, insbesondere im Hinblick auf dessen MS-bezogene Erkrankungen.
Der Ausdruck"transgen"wird hierin zur Beschreibung von Genmaterial verwendet, welches künstlich in das Genom einer Säugerzelle, insbesondere in eine Saugerzelle eines lebenden Tieres, inseriert worden ist oder gerade insertiert werden soll. Das Transgen wird zur Transformation einer Zelle verwendet, was bedeutet, dass eine permanente oder vorübergehende genetische Veränderung, vorzugsweise eine permanente genetische Veränderung, in einer Zelle nach dem Einbau exogener DNA induziert wird. Eine permanente genetische Veränderung wird Im Allgemeinen durch Einführen der DNA in das Genom der Zelle erreicht. Zu den Vektoren für stabile Integration zahlen Plasmide, Retroviren und andere Tier-Viren, YACs u. dgl.. Von Interesse sind transgene Säuger, z. B. Kühe, Schweine, Ziegen, Pferde usw., und insbesondere Nager, z. B.
Ratten, Mäuse usw..
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Transgene Tiere weisen eine exogene Nukleinsaure-Sequenz auf, die als extrachromosomales
Element vorhanden oder stabil In alle oder einen Teil ihrer Zellen, Insbesondere In Pathogenzellen, integriert sind. Sofern nicht anders angegeben, nimmt man an, dass ein transgenes Tier stabile
Veranderungen an der Pathogen-Linien-Sequenz aufweist Während der ursprünglichen Konstruk- tion des Tieres werden"Chimäre"oder"chimare Tiere"erzeugt, bei welchen nur ein Teil der Zellen das veranderte Genom aufweist. Chimäre werden hauptsachlich zu Zuchtzwecken verwendet, um das gewunschte transgene Tier hervorzubringen. Tiere mit einer heterozygoten Veranderung werden durch Züchtung von Chimaren erzeugt. Mannliche und weibliche Heterozygoten werden typischer Weise gezüchtet, um homozygote Tiere hervorzubringen.
Transgene Tiere teilt man In zwei Gruppen, die umgangssprachlich"Knockouts"und"Kno- ckins" genannt werden Bei der vorliegenden Erfindung weisen Knockouts einen teilweisen oder vollstandigen Funktionsverlust In einem oder beiden Allelen des endogenen SARG auf. Knockins haben ein eingeführtes Transgen mit einer veränderten Gensequenz und-funktion aus dem endo- genen Gen. Die beiden können kombiniert werden, so dass das von Natur aus vorkommende Gen ausgeschaltet wird und eine geänderte Form eingeführt wird.
Bei einem Knockout ist vorzugsweise die Ziel-Gen-Expression nicht nachweisbar oder unbe- deutend. Ein Knockout eines SARG bedeutet, dass die Funktion des SARG-Proteins wesentlich verringert worden ist, so dass die Expression nicht nachweisbar oder nur in unbedeutenden Men- gen vorhanden oder gemäss den Lehren der vorliegenden Erfindung mutiert ist, um als ein geeigne- tes Modell für die Situation bei Menschen, wie hierin beschrieben, zu funktionieren. Dies kann durch eine Vielfalt von Mechanismen erreicht werden, einschliesslich der Einführung einer Mutation oder der Unterbrechung der Codierseguenz, z. B. der Insertion eines oder mehrerer Stop-Codons,
Insertion eines DNA-Fragments, usw., Deletion von Codier-Sequenzen, Substitution von StopCodons für Codier-Sequenzen, usw.
In einigen Fällen werden die exogenen transgenen Sequenzen letztlich aus dem Genom deletiert, wodurch die native Sequenz mit einer Netto-Änderung zurückbleibt. Verschiedene Vorgangsweisen konnen zum Erreichen des "Knockout" verwendet werden Eine Chromosomen-Deletion des gesamten oder eines Teils des nativen Gens kann induziert werden, einschliesslich Deletionen der nicht-codierenden Regionen, insbesondere der Promotor-Region, 3'-regulierenden Sequenzen, Verstärker oder Deletionen von Genen, welche die Expression von SARG aktivieren. Ein funktionelles Knockout kann auch durch die Einführung eines anti-sense-Konstrukts, das die Expression der nativen Gene blockiert, erreicht werden (siehe z.
B Li und Cohen (1996), Gell 85 : 319-329) Knockouts umfassen auch bedingte Knockouts, wo beispielsweise eine Änderung des Target-Gens auftritt, nachdem das Tier einer Substanz ausgesetzt war, die die Target-Gen-Änderung fördert, die Einführung eines Enzyms, das die Rekombination an der Target-Gen-Stelle fördert (z. B Cre im Cre-lox-System), oder ein anderes Verfahren zur Lenkung der postnatalen Target-Gen-Anderung.
Ein "Knock-in" eines Target-Gens bedeutet eine Änderung In einem Wirtszellen-Genom, die zu einer veranderten Expression oder Funktion des nativen SARG führt. Eine gesteigerte (einschliesslich ektopische) oder verminderte Expression kann durch Einfuhren einer zusätzlichen Kopie des Target-Gens oder durch operative Insertion einer regulierenden Sequenz, die eine verbesserte Expression einer endogenen Kopie des Target-Gens vorsieht, erreicht werden. Diese Änderungen konnen konstitutiv oder konditionell sein, d h. je nach dem Vorhandensein eines Aktivators oder Repressors
Das exogene Gen stammt üblicherweise entweder von einer anderen Spezies als der tierische Wirt, oder es ist auf andere Weise in seiner codierenden oder nicht-codierenden Sequenz verandert.
Das eingeführte Gen kann ein Wildtyp-Gen sein, eine natürlicherweise vorkommende Polymorphie oder Mutation oder eine genetisch manipulierte Sequenz sein, die beispielsweise Deletionen, Substitutionen oder Insertionen in den codierenden oder nicht-codierenden Regionen hat. Die eingeführte Sequenz kann für Wildtyp-Human- oder Tier-SARG-Protein oder für eine Mutation davon codieren, oder sie kann den SARG-Promotor funktionsmässig mit einem Reporter-Gen verbunden verwenden. In jenen Fällen, in welchen das eingeführte Gen eine Codiersequenz ist, ist sie üblicherweise funktionsmässig mit einem Promotor verbunden, der konstitutiv oder induzierbar
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passenden Moleküle, d h. Transkriptions-Aktivator-Proteine, an die regulierende (n) Sequenz (en) gebunden werden.
Spezifische Konstrukte, an welchen ein Interesse besteht, sind einschliesslich - jedoch nicht ausschliesslich-antsense-SARG, we ! ches eine native SARG-Expression blockiert, die Expression von dominant negativen SARG-Mutationen und die Über-Expression eines SARG. Ein detektierbarer Marker, wie lac Z, kann in den Locus eingeführt werden, wo eine Hinaufregulierung der Expression zu einer leicht nachzuweisenden Änderung im Phänotyp führt. Konstrukte unter Verwendung der SARG-Promotor-Region, in Verbindung mit einem Reporter-Gen oder mit der Codierregion, sind ebenso von Interesse.
Eine Reihe geringfügiger Deletionen und/oder Substitutionen kann im SARG durchgeführt werden, um die Rolle verschiedener Exons bei der DNA-Bindung, Transkriptionsregulierung usw. zu bestimmen. Durch Vorsehen einer Expression von SARG-Protein in Zellen, in welchen es ansonsten normalerweise nicht erzeugt wird, kann man Veränderungen des Zellverhaltens hervorrufen.
DNA-Konstrukte für die homologe Rekombination umfassen mindestens einen Teil des SARG mit der gewünschten genetischen Modifikation und werden Regionen mit Homologie zum TargetLocus inkludieren. DNA-Konstrukte für eine randomisierte Integration müssen keine HomologieBereiche aufweisen, um eine Rekombination zu vermitteln. Praktischerweise sind Marker für positive und negative Selektion inkludiert. Verfahren zur Erzeugung von Zellen mit gezielten GenModifikationen durch homologe Rekombination gehören zum Stand der Technik. Betreffend verschiedene Techniken zur Transfektion von SÅaugerzellen, vgl. Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185 : 527-537.
Für embryonale Stamm (ES) -Zellen kann eine ES-Zelllime verwendet werden, oder es können Embryonalzeilen frisch von einem Wirt, z. B. Maus, Ratte, Meerschweinchen etc., erhalten werden Solche Zellen werden auf einer geeigneten Fibroblasten-Feeder-Schicht oder in Anwesenheit geeigneter Wachstumsfaktoren, wie Leukämie-inhibierendem Faktor (LIF), gezüchtet. Wenn ESZellen transformiert wurden, können sie zur Herstellung transgener Tiere verwendet werden Nach der Transformation werden die Zellen auf eine Feeder-Schicht in einem geeigneten Medium ausplattiert.
Zellen, die das Konstrukt enthalten, können durch Verwendung eines selektiven Mediums nachgewiesen werden Nach einer für das Wachstum der Kolonien ausreichenden Zeit werden diese geerntet und auf das Vorkommen homologer Rekombinationen oder die Integration des Konstrukts analysiert. Jene Kolonien, die positiv sind, können dann zur Embryo-Manipulation und Blastozysten-Injektion verwendet werden. Blastozysten werden von 4 bis 6 Wochen alten superovulierten weiblichen Tieren genommen Die ES-Zellen werden trypsinisiert, und die modifizierten Zellen werden in das Blastocoel des Blastozysten injiziert. Nach der Injektion werden die Blasto- zysten in jedes Uterus-Horn scheinträchtiger weiblicher Tiere retourniert.
Man lässt die weiblichen Tiere austragen, und jeder resultierende Wurf wird auf mutierte Zellen, die das Konstrukt aufweisen, gescreent. Durch Vorsehen eines anderen Phanotyps der Blastozysten und der ES-Zellen ist eine chimäre Nachkommenschaft leicht detektierbar
Die chimären Tiere werden auf das Vorhandensein des modifizierten Gens gescreent, und männliche und weibliche Tiere, die die Modifikation aufweisen, werden gepaart, um eine homozygote Nachkommenschaft zu erzeugen. Wenn die Genanderungen an irgendeinem Punkt der Entwicklung zur Letalität führen, können Gewebe und Organe als allogene oder kongene Transplantate oder in-vitro-Kultur beibehalten werden.
Das Verfahren wird durch die Beispiele und Zeichnungsfiguren naher beschneben, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt einen reverse-Northern Blot, welcher die Induktion des Ratten-SARG-Gens während der Apoptose demonstriert. Plasmid-DNA wurde auf Nylon-Membranen gespottet und mit radioaktiv markierter cDNA, die aus apoptotischen Stammzellen isoliert worden war, hybridisiert Plasmide, die die 5'-Region von SARG (mit Pfeil versehen) enthalten, hybridisieren mit cDNA, die nur in apoptotischen Zellen vorhanden ist. Kontroll-DNA aus sich selbst erneuernden Zellen zeigen keine Hintergrund-Mengen (Daten nicht gezeigt).
Fig. 2 zeigt einen Mehrfach-Gewebe-Northern Blot von Ratten. Das 342bp-SARG-Fragment wurde radioaktiv markiert und mit RNA, die aus verschiedenen Rattengeweben isoliert worden war, hybridisiert. Eine Spezies von etwa 1, 3 kb. wird ubiquitär in verschiedenen Geweben und die höchsten Expression in Gehirn und Herz beobachtet.
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Flg. 3 zeigt einen Maus-Embryonalgewebe-Northern Blot. Das 342bp SARG-Fragment wurde radioaktiv markiert und mit RNA, die aus verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung Isoliert worden war, hybridisiert. Man sieht eine klare Regulierung einer 1, 4 kb-Spezies mit den höchsten Mengen nach 7 Tagen und einer Re-Expression des Gen-Produkts am Tag 17.
Fig. 4 zeigt Gesamtlangen-Ratten-, -Maus- und -Human-SARG-cDNA-Sequenzen.
Fig. 5 zeigt Vergleiche zwischen Gesamtlängen-Ratten-, -Maus- und -Human-SARG-cDNA- Sequenzen
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mitFlg. 7 zeigt einen Vergleich zwischen den Ratten-, Maus- und Human-SARG-DNA- Codlersequenzen.
Fig. 8 zeigt einen Vergleich zwischen den Ratten-, Maus-und Human-SARG-Aminosäure- Codiersequenzen.
Fig. 9 zeigt eine immunhistochemische Analyse von Maus-Gewebe mit anti-SARG-Pepttd- Antikorpern. Ein braunes Reaktionsprodukt weist auf eine SARG-Expression hin. A : Zerebral-
Cortex der Maus (40-fache Vergrösserung), B : Cerebellum (40-fach), C : Rückenmark (40-fach), D peripherer Nerv (60-fach), E : Herz (40-fach) und F : Lungengewebe (40-fach).
Fig. 10 zeigt SARG-Protein, detektiert durch Western Blot von Zellextrakten aus MelJUSO-
Melanom-Zellen, transfektiert mit pMH-SARG-HA. Monoklonaler antl-HA-Antikörper 3F10 detektier- te eine einzige Spezies, die bei 28kD wandert.
Fig 11 zeigt eine Immunhistochemische Analyse von Human-SARG-Protein in MelJUSOZellen, transfektert mit pMH-SARG-HA, detektiert mit monoklonalem antl-HA-Antikörper 3F10, welche die zytopiasmatische Lokalisation des Proteins veranschaulicht.
Fig. 12 zeigt die Lebensfahigkeit von PC12-Kulturen, transfektlert mit leerem Vektor oder pIRES2-EGFP-SARG, behandelt mit 100 nM Staurosporin
Fig. 13 zeigt strömungszytometrische Analysen von PC12-Zellen, transfektiert mit leerem Vektor oder pIRES2-EGFP-SARG, 24 h lang behandelt mit 100 nM Staurosponn Eine Sub-GJG1-
Peak-Charakteristik für die Induktion der Apoptose ist nur in SARG-überexpnmierenden Zellen zu sehen
Flg. 14 zeigt, dass PC12-Zellen, die SARG-Protein überexprimieren (t), im Vergleich zu mit leerem Vektor transferierten Zellen (+) eine beschleunigte NGF-vermittelte TerminusDifferenzierung durchmachen.
Fig 15 zeigt eine genetische Veränderung bei familiare Multipler Sklerose. Eine ToC-PunktMutation am Nukleotid 67 führt zur Substitution von Phenylalanin durch Leucin-Aminosäure 23
Fig. 16 zeigt eine genetische Veranderung bei familiärer Multipler Sklerose. Eine C-T-Punkt- Mutation am Nukleotid 359 führt zur Substitution von Serin durch Phenylalanin an Aminosäure 120.
Fig. 17 zeigt eine genetische Veranderung bei familiärer Multipler Sklerose. Eine A-G-Punkt- Mutation am Nukleotid 89 führt zur Substitution von Glutaminsaure durch Glycin an Aminosäure 30.
Fig 18 zeigt eine genetische Veranderung bel familiärer Multipler Sklerose. Die Deletion eines Codons zwischen den Aminosauren 116 und 121 führt zum Verlust eines Serin-Restes.
Flg. 19 zeigt die SARG-Intron/Exon-Struktur.
BEISPIELE :
Identifizierung eines neuen SCF-Apoptose-Response-Gens (SARG), das während der Stammzellen-Apoptose induziert wird
Das Wegnehmen von Wachstumsfaktor aus SCF-abhängigen myelomonozytaren Vorläufern führt zur raschen Induktion einer vom Zellzyklus unabhängigen Apoptose. Obwohl über 95% der Kulturen ohne SCF vitale Farbstoffe 12 h nach dem Entzug des Wachstumsfaktors ausschliessen, findet man keine proliferative Reaktion bei Restimulation mit SCF nach diesem Zeitpunkt.
Ein Differential-Display-Screen wurde durchgefuhrt, um sofortige frühe (vier Stunden) mRNAExpressions-Unterschiede wahrend der Prozesse myelomonozytärer StammzellenSelbsterneuerung und einer durch Wachstumsfaktor-Entzug induzierten Apoptose zu untersuchen Eine Amplifikation von etwa 1/3 aller zellularen mRNA-Spezies durch Dlfferential-Display-PCR
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; Lang(Display-Systemen) identifizierte ein während der Apoptose induzierte Fragment, das bel selbsterneuernden Vorläufern nicht vorhanden ist.
Nach einer Gel-Exzision dieses Bandes und TA- Kionierung in den pCRt-Vektor (Invitrogen) von Reamplifikanten wurde die spezifische Express- ons-induktion) n einem reverse-Northern-Verfahren mit repräsentativen dot-geblotteten PlasmidPraparationen, hybridisiert mit radioaktiv markierten cDNA-lsolaten, hergestellt aus unabhängigen Kulturen, bestätigt (Fig. 1). Alle positiv Identifizierten, differentiell regulierten Klone wurden sequenziert, und man stellte fest, dass sie ein identisches 342bp-lnsert enthielten (ausschliesslich der stromabwarts befindlichen und der stromaufwärts befindlichen Differential-Display-Primer-Paare).
Molekulargewicht von SARG-cDNA und Gewebe-Expression. Regulierung während embryonaler Entwicklung
Radioaktive Markierung des oben entdeckten 342bp-Fragments und Sondierung mehrfacher Gewebe-Northern Blots (Clontech) zeigte eine Lange von etwa 1300bp für die reife mRNA bei Ratten-, Maus- und Human-Geweben. Eine ubiquitäre geringe Expression fand man mit den hochsten Expressionsmengen in Gehirn und Herz (Fig. 2). Northern Blots Immobilisierter mRNA, die aus verschiedenen murinen embryonalen Entwicklungsstadien isoliert worden war und mit dem radioaktiv markierten 342bp-Fragment als Sonde untersucht wurde, zeigten eine Regulierung der SARG-mRNA während der Entwicklung, die nach 7 Tagen am stärksten war, und eine Re-Expression des Gen-Produkts am Tag 17 (Fig 3).
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ängen-Ratten-,-Mäuse-und-Human-SARGkloniert und sequenziert.
Das Gesamtlängen-SARG-1062bp-Gen-Transkript wurde sequenziert und hat einen offenen Leserahmen von 479bp, der für ein Protein von 158 Aminosäuren codiert
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loge Klone wurden isoliert und ein Xhol-Fragment sequenziert. Reife Mause-SARG-RNA wurde danach mittels PCR aus Mäusehirn-cDNA identifiziert. Humanes SARG wurde aus einer PhagenBank von Hirn-cDNA durch Homologie mit der Gesamtlängen-Rattensequenz isoliert und sequenziert. Der ganze Human-SARG-Locus wurde amplifiziert mittels PCR mit Primern, die die SARGcDNA aus chromosomaler DNA, die aus den peripheren mononuklearen Blutzellen gesunder Freiwilliger stammte, überspannte. Die Gesamtlängen-Sequenzen von Ratten-, Maus- und HumanSARG sind in den Fig. 4,5 und 6 gezeigt.
Homologien zwischen Ratten-, Mäuse- und Human-Sequenzen
Ratten- und Mäuse-SARG sind zu 93% homolog auf Nukleinsäure-Ebene bzw. zu 96% auf Ebene des vorausgesagten Proteins Human-SARG weist 83% und 84% Homologien mit Mäuseund Ratten-SARG auf Nukleinsäure-Ebene bzw. 84% und 86% Homologen auf Ebene des vorausgesagten Proteins auf (Flg. 7 und 8).
Analyse der SARG-Verteilung mit anti-SARG-Antikörpern
SARG-Antikörper wurden durch Immunisierung von Hühnern mit einem Peptid (MDPNPRAALERQQLR), welches den ersten 15 Aminosauren von Mause-, Ratten- und Human-SARG entsprach, gekoppelt mit dem Schlusselloch-Napfschnecken (keyhole hmpet)-Hämocyanin, hergestellt IgY wurde aus Eidottern hergestellt, und der spezifische Antikörper wurde durch AffinitätsChromatographie mit an der Säule immobilisiertem Peptid hergestellt.
In immunhistochemischen Analysen von mit Aceton fixierten 5 m-Schnrtten von Mause-Gewebe wurde durch spezifische anti-SARG-IgY-Antikorper, die mit mit anti-IgY-Peroxidase konjugierten Zweitschritt-Antikörpern sichtbar gemacht wurden, eine breite Expression des SARG-Proteins im Nervengewebe detektlert.
Eine SARG-Färbung ist in der gesamten cerebralen Cortex (Fig. 9A) und in den granularen, Pur- kinje-und molekularen Zellschichten des Cerebellums (Flg 9B) zu sehen. Im Rückenmark ist SARG sowohl In den Neuropil-hältigen Nervenzellenkörpern der grauen Substanz, den Dendriten, Glia-Zellen und Blutgefässen, als auch in der weissen Substanz, die hauptsächlich aus myelinierten Nervenbahnen (Flg. 9C) besteht, exprimiert. Die SARG-Expression ist auch mit gelegentlichen peripheren Nervenprozessen colokalisiert (Fig. 9D). SARG ist auch im Herzmuskel ubiqultar
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exprimiert (Fig gE), im Lungen-Flimmerepithei (Fig. 9F) und in den Epithelzellen von Ileum und Kolon (Daten nicht gezeigt).
Eine Farbung embryonalen Mäuse-Gewebes zeigte eine starke Farbung von Nervengewebe, Gehirn, Herz, Plazenta, Uterus, dem Corti-Organ, der Dermis (Stratum granulosum) und der Auskleidung der Gedarme (Daten nicht gezeigt)
Herstellung von SARG-überexprimierenden Zellen
Die MelJUSO-Melanom-Zelllinie wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM), erganzt mit 10% fötalem Kälberserum und einer Antibiotikum-Antimykotikum-Mischung enthaltend 100 Einheiten/mi Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 0, 25 f. ! g/ml Amphotericin B (alle von GibcoBRL) in einer vollstandig angefeuchteten Luftatmosphare, enthaltend 5% CO2 bei 37 C, gehalten.
Die für humanes SARG codierende Sequenz (hSARG486) wurde in den pMHExpressionsvektor (Roche) mittels molekularbiologischer Standard-Verfahren (Sanbrook et al.,
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mit diesem Vektor (pMH-SARG-HA) oder mit einem leeren Vektor in Anwesenheit von Fugene (Roche) transfektiert, und Klone, die eine Neomycin-Resistenz aufwiesen, wurden isoliert.
Zur Untersuchung der Expression und Funktion von SARG in einem Nervenzellen-
Kultursystem wurden molekularbiologische Standard-Techniken (Sanbrook et al., 1989) verwendet, um die Ratten-SARG-Codier-Sequenz (rSARG479) in den eukaryontischen p ! RES) t-EGFP-
Expressionsvektor (Clontech) unter der Steuerung eines CMV-Promotors zu klonieren, welcher bizistronisch durch eine interne IRES-Sequenz sowohl SARG477 als auch das verstärkte grüne
Fluoreszenz-Protein transiatiert.
Die Pheochromozytom-PC12-Zeillinie der Ratte wurde in DMEM, erganzt mit 8% Pferdeserum, 8% fotalem Kälberserum und einer Antibiotikum-Antlmykotikum-
Mischung, enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 0, 25 f. ! g/ml Amphotenon B (alle von Gibco BRL) in einer vollstandig angefeuchteten Luftatmosphare, enthaltend 5% CO2, bei 37 C gehalten Semi-konfluente Kulturen in Platten mit 6 Vertiefungen wurden mit pIRES2-EGFP-SARG oder mit leerem Vektor 18 h lang in Anwesenheit der Aufnahmeverstärkenden kationischen Lipid-Mischung pfxl (Invitrogen) in einem Vehaltnis von 6 :
1 Lipid zu DNA in Serum-freiem Opti-MEM (Gibco) transfektlert Stabil transfekierende Kolonien wurden aus separaten Vertiefungen nach Selektion in 800 mg/mi Geneticin (Gibco) entnommen, und Klone mit ähnlicher EGFP-Fluoreszenz aus unabhangigen Transfektionen expandiert
Post-translatorische Modifikation reifer Ratten- und Human-Proteine
Das von den Aminosäure-Sequenzen vorausgesagte Molekulargewicht von Ratten-, Mäuseund Human-SARG-Protein ist 17186,52, 17193,52 bzw. 17492,76.
Mit ! gY-Antikörpern gegen SARG wird eine 28kD-Spezies in Western Blot nachgewiesen, das in geringen Mengen in nativen P12-Zellen exprimiert wird Nach Transfektion von pIRES2-EGFP-SARG in diese Zellen nehmen die Expressionsmengen dieser Spezies zu Das Molekulargewicht von humanem SARG-Protein wurde mittels Western-Blot von Zellextrakten aus MelJUSO-Melanom-Zellen, die mit pMH-SARGHA transferiert worden waren, bestimmt Mit monokionalem anti-HA-Antikorper 3F10 (Roche) wurde eine einzige Spezies nachgewiesen, die bei 28kD wandert (Fig. 10).
Subzelluläre Lokalisation von transfektiertem SARG-Protein
Die immunhistochemische Farbung von mit SARG transfektierten PC12-Zellen zeigte für das SARG-Gen-Produkt eine ausschliessliche Lokalisation im Zytoplasma. Eine immunhistochemische Analyse mit monoklonalem anti-HA-Antikörper 3F10 zeigte fur das SARG-Protein auch eine ausschliessliche Lokalisation im Zytoplasma (Fig. 11), vorwiegend in Co-Lokalisierung mit der Expression von Bindungsprotein (bip), das als Marker für das endoplasmatische Retikulum verwendet wird. Die Co-Lokalisation von HA-SARG mit dem Golgispezifischen Antigen-Mantel-Protein (b-cop) ist minimal.
Dagegen überlappt die SARG-Expression teilweise mit der Expression des lysosomalspezifischen Proteins LAMP-2
Die Rolle von SARG bei der Apoptose und Differenzierung von Nervenzell-Kulturen
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Entwicklung einer Morphologie-Charakteristik des programmierten Zelltodes und dem Verlust von DNA aus mit Ethanol fixierten Zellen In strömungszytometrischen Zellzyklus-Analysen (Fig. 13), die für den Apopotose-Prozess (Fraker et al, 1995) charakteristisch sind, verbunden. Beim Staurospo-
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Uberexpression von SARG verstärkt auch die terminale Differenzierung von PC12-Zellen, induziert durch Nervenwachstumsfaktor (Fig. 14).
Analyse der Mutation in MS-Proben
Die immunhistochemische Lokalisation von SARG-Protein auf die graue und weisse Substanz des ZNS, und die Rolle von SARG bei der apoptotischen Induktion führte zu einer Vorgangsweise unter Verwendung eines Anwärter-Gens zur Analyse des Mutations-Status von SARG bei Fällen familiarer MS. Die DNA von zwanzig nicht miteinander verwandten Multiple-Sklerose-Patienten mit MS-Fällen in der Familie wurde mittels PCR-Amplifikation des SARG-Locus und DNASequenzierung untersucht und mit SARG-Sequenzen gesunder Kontrollen verglichen. Alle Kontroll-Proben wiesen Wildtyp-SARG-Genom-Sequenzen auf. Von MS-Patienten konnten nur 6 von 20 DNA-Proben mittels PCR amplifiziert werden.
Die verwendeten Primer-Sets überspannten die ganze Codier-Region, Intron 2/Exon 3, und für die Exons 1,2 und 3 spezifische Primer-Paare. Kontroll-GAPDH-Primer waren für alle Proben positiv. Bei 6/20 Proben, die ein PCR-Produkt erzeugten, wurden die Amplifikanten mit TA In den pCR#II-Vektor (Invitrogen) kioniert und sequenziert Bei 4/6 Patienten waren genetische Veränderungen ersichtlich. Eine ToC-PunktMutation am Nukleotid 67, die zur Substitution von Phenylalanin für Leucin-Aminosäure 23 führte (Fig. 16). Eine C-T-Punkt-Mutation am Nukleotid 359, die zur Substitution von Phenylalanin für Serin an Aminosäure 120 führte (Fig. 17). Eine A-G-Punkt-Mutation am Nukleotid 89, die zur Substitution von Glycin für Glutaminsäure an Aminosäure 30 führte (Fig. 18).
Eine Deletion eines Codons zwischen den Aminosäuren 116 und 121, die zum Verlust eines Serin-Restes führte (Fig. 19). Die Sequenzierung von mehr als 20 Kontroll-DNA-Proben zeigte nur die WildtypSequenz.
Polymorphie und andere Mutationen
Bei der Sequenz-Analyse von mehr als 30 Krebs-Zelllinien ist an Position 280 (im SARG-Gen) immer ein g-Rest vorhanden, was zur Substitution von Methionin für Valin an Position 94 führt. Bei einer Human-Melanom-Zelilinie findet man zwei Mutationen in SARG : eine A-G-Punkt-Mutation am Nukleotid 74, die zur Substitution von Asparaginsäure für Glycin führt, und eine C#T-Punkt- Mutation am Nukleotid 289, die zur Substitution von Histidin für Tyrosin an Aminosäure 97 führt.
TABELLE
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<tb>
<tb> 67 <SEP> Toc <SEP> = <SEP> F <SEP> X <SEP> L <SEP> 23
<tb> 74 <SEP> A-- > <SEP> G <SEP> = <SEP> EG <SEP> 25
<tb> 89 <SEP> A-- > <SEP> G <SEP> = <SEP> E-. <SEP> G <SEP> 30
<tb> 289 <SEP> C-T <SEP> = <SEP> H--Y <SEP> 97
<tb> 359 <SEP> C-T <SEP> = <SEP> SoF <SEP> 120
<tb> A <SEP> S <SEP> 116-121
<tb>
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1 Verfahren zur Diagnoseerstellung bel einer Person mit Multipler Sklerose (MS) oder bel welcher ein Risiko besteht, dass sie an MS erkrankt, gekennzeichnet durch folgenden
Schritte . Bereitstellen einer Probe einer Korperflussigkelt oder eines Gewebes dieser Person, wo- bei die Probe mindestens eines von Wildtyp-SCF-Apoptose-Response-Gen (wt-SARG)-
Protein gemass Seg ID.
Nr 2 und für wt-SARG codierenden Nukleinsäuren gemass
Seg ID.Nr 1 enthält, wenn sie von einer Person entnommen wird, die nicht MS hat oder bel welcher kein Risiko einer Erkrankung an MS besteht, 'die Detektion des Vorhandenseins des wt-SARG-Proteins oder von für wt-SARG codie- renden Nukleinsäuren In der Probe, und 'd die Diagnostizierung von MS oder eines Risikos einer Erkrankung an MS, wenn wt-
SARG-Protein oder fur wt-SARG codierende Nukleinsäuren nicht In der Probe vorhan- den sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe von menschlichem Blut, Plasma, Serum,
Lymphe, Nervenzellen enthaltendem Gewebe, Zerebrospinalflüssigkeit, Jeglichem Biopsie-
Material, einschliesslich Tumorgewebe, Knochenmark, Nervengewebe, Haut, Haaren, Tra- nen, fotalem Material einschliesslich Amniocentese-Material, Uterusgewebe, Speichel, Kot oder Sperma stammt.
3 Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Detektion des Vorhandenseins von wt-SARG-
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Protein oder von für wt-SARG-codierenden Nukleinsauren In der Probe weiters die Detek- tion des Vorhandenseins einer Nicht-wt-Form von SARG oder SARG-Protein umfasst
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Nicht-wt-Form von SARG sich von wt-SARG oder wt-SARG-Protein in einem Nukleinsäure-Rest bzw. Aminosäure-Rest unterscheidet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die fur wt-SARG codierenden Nukleinsauren mit einem
Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleinsaure- Ampllfikationsverfahren, Einzelstrang-Konformations-Polymorph) e (SSCP)-Analyse,
Restriktions-Analyse, Mikroanordnungs-Technik und Proteomik, detektiert werden.
6 Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Nukleinsaure-Amplifikationsverfahren ein Polyme- rase-Kettenreaktions-Verfahren ist.
7 Verfahren nach Anspruch 1 wobei das wt-SARG-Protein unter Verwendung eines wt- SARG-Protein-Antikörpers, insbesondere eines monoklonalen Antikorpers, detektiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 10der 2, wobei die Detektion des Vorhandenseins von wt-
SARG-Protein oder von Nukleinsäuren, die für wt-SARG codieren, im Rahmen eines
Screening-Tests durchgeführt wird.
9. Verfahren zur Diagnoseerstellung bei einer Person, die Krebs hat oder bei welcher das Ri- siko besteht, Krebs zu bekommen, gezeichnet durch die folgenden Schritte : 'Bereitstellen einer Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes dieser Person, wo- bei diese Probe mindestens eines von Wildtyp-SCF-Apoptose-Response-Gen (wt- SARG) -Protein gemass Seg. ID. Nr. 2 und für wt-SARG codierenden Nukleinsäuren gemäss
Seg. ID.
Nr. 1 enthält, wenn sie von einer Person entnommen wird, die keinen Krebs oder kein Risiko einer Erkrankung an Krebs hat, 'die Detektion des Vorhandenseins des wt-SARG-Proteins oder von für wt-SARG codie- renden Nukleinsäuren in dieser Probe, und 'die Diagnostizierung von Krebs oder eines Risikos einer Erkrankung an Krebs, wenn wt-
SARG-Protein oder für wt-SARG codierende Nukleinsäuren nicht in der Probe vorhan- den sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Probe von menschlichem Blut, Plasma, Serum,
Lymphe, Nervenzellen enthaltendem Gewebe, Zerebrospinalflüssigkeit, jeglichem Biopsie- Matenal, einschliesslich Tumorgewebe, Knochenmark, Nervengewebe, Haut, Haaren, Tra- nen, fötalem Material einschliesslich Amniocentese-Material, Uterusgewebe, Speichel, Kot oder Sperma stammt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Detektion des Vorhandenseins von wt-SARG-
Protein oder von für wt-SARG-codierenden Nukleinsauren In der Probe weiters die Detek- tion des Vorhandenseins einer Nicht-wt-Form von SARG oder SARG-Protein umfasst
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Nicht-wt-Form von SARG sich von wt-SARG oder wt-SARG-Protein in einem Nukleinsäure-Rest bzw. Aminosäure-Rest unterscheidet.
13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die für wt-SARG codierenden Nukleinsäuren mit einem
Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleinsaure-
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Technik, oder Proteomik detektiert werden
14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das wt-SARG-Protein unter Verwendung eines wt-
SARG-Protein-Antikorpers, insbesondere eines monoklonalen Altikorpers, detektiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Detektion des Vorhandenseins von wt-SARG-
Protein oder von Nukleinsäuren, die für wt-SARG codieren, innerhalb eines Screening-
Tests durchgeführt wird.
16 Nukleinsaure-Molekul, welches eine Sequenz gemäss Seq. ID. Nr. 1 aufweist.
17 Nukleinsaure-Molekul, welches eine Sequenz gemäss Seq. ID. Nr. 1 aufweist, worin gegen- über Seq. ID Nr. 1 ein Nukleinsäure-Rest durch einen anderen Nukleinsäure-Rest ausge- tauscht ist oder eine Deletion in der Kodier-Region von SEQ. ID. Nr. 1, aufweist, wobei der
Austausch oder die Deletion zu einer anderen SARG-Protein-Aminosaure-Sequenz fuhr, die ein Marker für Kubs oder MS eder einellerher für das Risiko für Kubs oder MS ist.
18. Nukleinsaure-Molekul nach Anspruch 17, wobei der Austausch ausgewählt ist aus einem
Tausch von T zu C an Position 67 der
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Seq. ID. Nr. 1, einem Tausch von A zu G an Position 74 der
Seq. ID. Nr. 1, einem Tausch von A zu G an Position 89 der
Seq D. Nr 1, einem Tausch von C zu T an Position 289 der
Seq. ID. Nr 1 und einem Tausch von C zu T an Position 359 der
Seq. ID. Nr. 1.
19. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 17, wobei dei Deletion 3 Nukleinsaure-Reste lang ist
20 Nukieinsaure-Sonde zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1 oder 9, umfas- send ein Fragment einer Nukleinsaure, ausgewählt aus Seq. ID. Nr 1 und einer mutierten
Form davon, wobei das Fragment eine Lange von mindestens 12, vorzugsweise mindes- tens 15, insbesondere mindestens 20, Nukleinsäure-Resten hat
21 Polypeptid, umfassend eine Aminosaure-Sequenz gemäss Seq. ID. Nr 2
22. Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz gemäss Seq. ID. Nr. 2, wobei ein Amlno- saure-Rest ausgetauscht oder deletiert ist.
23 Polypeptid nach Anspruch 22, wobei der Austausch ausgewählt ist aus Phe23 zu Leu23,
Asp25 zu Gly25, Glu30 zu Gly30, His97 zu Tyr97 und Serl20 zu Phe120.
24. Verfahren zur Herstellung einer Antikörper-Praparation, weiches das Verabreichen eines
Polypeptids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid umfassend eine
Aminosäure-Sequenz gemäss Seq. ID. Nr. 2 oder eine mutierte Form davon an ein Tier, das
Antikörper-Erzeugen-Lassen des Tieres gegen das Polypeptid, das Extrahieren von Anti- korper-enthaltenden Korperflüssigkeiten oder Gewebe von dem Tier und das Herstellen einer Antikorper-Präparation gegen das Polypeptid aus den Körperflüssigkeiten oder dem
Gewebe umfasst
25 Verfahren zur Herstellung einer Antikörper-Praparation, weiches das Verabreichen eines
Polypeptids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid enthaltend eine
Aminosäure-Sequenz gemäss Seq. ID.
Nr. 2 oder eine mutierte Form davon an ein Tier, das
Antikörper-Erzeugen-Lassen des Tieres gegen das Polypeptid, das Entfernen der Milz des
Tieres, das Herstellen von Fusionszellen der Milz mit geeigneten Hybridorn-erzeugenden
Zellen, das Erzeugen von Hybridom-Zellen, die monoklonale Antikorper gegen das Poly- peptid produzieren, das Kloneren und Züchten der Hybridomzellen, wodurch monoklonale Antikorper expnmiert werden, und das Herstellen der monoklonalen Antikörper umfasst
26 Set zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 9, welches Mittel zur Detekti- on des Vorhandenseins von wt-SARG-Protein oder von Nukleinsäuren, die für wt-SARG codieren, aufweist.
27 Set nach Anspruch 26, wobei die Mittel ausgewählt sind aus anti-wt-SARG-Protein-
Antikörpern, Nukleinsaure-Sonden, die selektiv an wt-SARG binden, Nukleinsäure-
Primern, die eine Region definieren, welche für wt-SARG selektiv ist, einem Chip, der die
Nukleinsäure-Sonden oder die Nukleinsaure-Primer aufweist, oder Tests, bei welchen Pro- teine an SARG binden.
28. Set nach Anspruch 27, wobei die Tests, bei welchen Proteine an SARG binden, ausge- wählt sind aus Tests unter Verwendung von Antikorpern oder Peptiden, einschliesslich Mu- tations-spezifischen Antikörpern, ELISAS, Western Blot-Tests, Stromungszytometrie-Tests und Tests unter Verwendung immunhistochemischer Techniken, einschliesslich konfokaler
Mikroskopie.
29. Transgenes Tier, welches ein mutiertes oder deletlertes SARG aufweist, wobei das mutier- te oder deletierte SARG mittels rekombinanter Nukleinsäure-Techniken In das Genom des
Tieres eingeführt und dann stabil integnert worden ist.
30. Transgenes Tier nach Anspruch 29, wobei das Einführen in eine embryonale Stammzelle des Tieres durchgefuhrt worden ist
31 Transgenes Tier nach Anspruch 30, wobei das Tier eine Maus ist.
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|---|---|---|---|
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| AT0099801A AT410945B (de) | 2001-06-27 | 2001-06-27 | Verfahren zur diagnose von multipler sklerose (ms) |
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2001
- 2001-06-27 AT AT0099801A patent/AT410945B/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CAS 134:203316 * |
| CAS 134:217891 * |
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| GENBANK AK000531 * |
| GENBANK AK026642 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA9982001A (de) | 2003-01-15 |
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|---|---|---|---|
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