AT408922B

AT408922B - Einrichtung zur vorzugsweise mikroskopischen untersuchung von objekten, insbesondere zellen

Info

Publication number: AT408922B
Application number: AT165499A
Authority: AT
Original assignee: Dietl Paul Dr; Frick Manfred Mag; Haller Thomas Dr; Mair Norbert Mag
Priority date: 1999-09-27
Filing date: 1999-09-27
Publication date: 2002-04-25
Also published as: DE20016626U1; ATA165499A

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Untersuchung von Objekten, insbesondere Zellen, welche auf einem Träger angeordnet sind.

Ein interessantes Forschungsgebiet ist die Untersuchung von Lungenalveolarzellen, die während der Einatmung gedehnt werden und auf diesen Stimulus hin einen sogenannten Surfactant, ein lipidhältiges Material zur Reduktion der Oberflächenspannung, in den Alveolarraum abgeben.

Dieser Vorgang ist lebenswichtig, da man sonst nicht einatmen kann ("Steife Lunge" bei Frühgeborenen). Es sind bisher keine experimentellen Methoden bekannt, mit denen man einzelne isolierte lebende Lungenzellen zugleich dehnen und mit dem Mikroskop untersuchen kann. Rasche Vorgänge, wie etwa die Ausscheidung von Surfactant, muss man aber synchron mit der Dehnung untersuchen können, will man nicht auf wertvolle Information verzichten. Zudem ist die Fluoreszenzmikroskopie ein extrem rasch wachsendes Gebiet und immer mehr Lebensvorgänge können durch geeignete Fluoreszenzmarker in "Real Time" (Echtzeit) untersucht werden. Beispielsweise wurde eine Fluoreszenzmikroskopie-Methode entwickelt, mit der man die Ausschüttung von Surfactant mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung untersuchen kann.

Aufgrund der wachsenden Fluoreszenz- (wie auch anderer) Mikroskopie ist das Bestreben, Simultandehnung von Zellen und deren mikroskopische Untersuchung auf Einzelniveau durchzuführen, nicht nur auf das Gebiet der Lunge beschränkt, sondern betrifft grundsätzlich alle Organe, die Dehnungen ausgesetzt sind, also Gefässe, Magen-Darm-Trakt, Respirationstrakt und natürlich auch Nervengewebe (Dehnungsrezeptoren). Grundsätzlich könnte auch nicht biologisches Material während der Dehnung untersucht werden.

Die Problematik bei der Untersuchung kleiner Objekte, insbesondere von lebenden Zellen (vorzugsweise mit mikroskopischen Methoden) während mechanischer Belastung besteht in Fokussier- (z-Achse) und Positionierungs- (x, y-Achse) Problemen, das heisst, dass bei der Dehnung die zu beobachtenden Objekte aus dem Fokus bzw. dem Messareal (Beobachtungsbereich) verschoben werden. Zudem besteht das Problem, dass man für den Fall, dass konzentrische Dehnungen gewünscht sind, nur im Mittelpunkt des zu dehnenden Areals arbeiten kann.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Einrichtung der eingangs genannten Gattung zu schaffen, mit der die Objekte, beispielsweise einzelne Zellen, vorzugsweise homogen (also konzentrisch) gedehnt werden können, ohne dabei aus dem Bild zu verschwinden. Dies soll bevorzugt auch bei einer mikroskopischen Beobachtung mit hoher Vergrösserung (beispielsweise bis zu 1000-fach) möglich sein.

Erfindungsgemäss wird dies dadurch erreicht, dass der Träger elastisch und dehnbar ausgebildet ist und dass eine einen Beobachtungsbereich umgebende, vorzugsweise plane Auflage für den Träger sowie eine Dehneinrichtung vorgesehen sind, über die der elastisch und dehnbar ausgebildete Träger entlang der Auflage vom Beobachtungsbereich nach aussen dehnbar ist.

Es wird also das zu untersuchende Objekt, beispielsweise eine lebende Zelle, auf einem flexiblen dehnbaren Träger, beispielsweise einer elastischen transparenten Membran, angeordnet, wobei die den Beobachtungsbereich umgebende Auflage dafür sorgt, die Membran (in der x-yEbene) plan zu halten, wenn die Dehneinrichtung das Objekt, insbesondere die Zelle, während der Beobachtung dehnt, indem sie den Träger, auf dem das Objekt liegt, vorzugsweise unter Dehnung radial nach aussen zieht Durch diese Auflage kann während der Dehnung die Fokussierung, also die Lage in der Beobachtungsrichtung (z-Achse) erhalten bleiben.

Um während der Dehnung auch die Lage des Objektes in der auf die Beobachtungsrichtung senkrechten x-y-Richtung beizubehalten, ist es besonders günstig, das zu beobachtende Objekt, insbesondere eine lebende Zelle, genau im Zentrum des Beobachtungsbereiches anzuordnen und die Dehneinrichtung so auszubilden, dass sie den elastischen Träger von diesem Zentrum aus allseitig radial nach aussen zieht. Damit erreicht man einerseits eine homogene (also konzentrische) Dehnung des zu untersuchenden Objektes, und es wird ausserdem ohne Nachstellmechanismen erreicht, dass dieses Objekt während der mikroskopischen Beobachtung und Dehnung nicht seitlich aus dem Bild verschwindet.

Zur Ausrichtung des Objektes an der gewünschten Stelle des Beobachtungsbereiches, insbesondere in dessen Zentrum, kann bevorzugt eine Einrichtung zum Erzeugen einer optischen Markierung, insbesondere eines fokussierten Lichtpunktes, vorgesehen sein.

Die Dehnung der flexiblen elastischen Membran kann grundsätzlich auf verschiedene Art und Weise geschehen. Besonders günstig ist eine Dehnung mittels Unterdruck, bei der die Membran in

eine den Beobachtungsbereich umgebende Vertiefung gesaugt wird und sich damit im dazwischen liegenden Beobachtungsbereich dehnt. Bei einer ringförmigen Vertiefung kann man eine homogene, radiale Dehnung vom Zentrum des Beobachtungsbereiches aus erzielen.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung sind anhand der nachfolgenden Figurenbeschreibung naher erläutert.

Die Fig. 1 zeigt in einem schematischen Längsschnitt die zentrale Komponente eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemässen Einrichtung, die Fig. 1a zeigt eine schematische Schnittansicht von oben, die Fig. 1 b zeigt eine schematische Schnittansicht von unten, die Fig. 2 zeigt zusätzlich das Objektiv eines inversen Mikroskops sowie die im Objektträger dieses Mikroskops eingespannte Membran (als flexiblen und dehnbaren Träger für eine daraufliegende Zelle), die Fig. 2a zeigt den unteren Bereich der in Fig. 1 und 2 dargestellten rohrförmigen zentralen Komponente, wobei der flexible dehnbare Träger durch Applikation von Unterdruck gedehnt ist, die Fig. 3 zeigt schematisch das Verschieben einer Zelle bei Dehnung, wenn diese sich nicht im Zentrum des Beobachtungsbereiches befindet, die Fig. 4 zeigt ein Ausführungsbeispiel, welches mit Fluoreszenzlicht arbeitet, die Fig.

5 zeigt eine Variante für die Ausbildung der Form der mit Unterdruck beaufschlagbaren Vertiefungen, die Fig. 6 zeigt eine weitere solche Variante, ebenfalls in einer Unteransicht auf die zentrale Komponente der erfindungsgemässen Einrichtung, wobei bei diesem Ausführungsbeispiel eine lineare Dehnung des Trägers bzw. der Membran unabhängig voneinander in zwei aufeinander senkrechte Richtungen erfolgen kann.

Die Fig. 1, 1 a und 1 b zeigen die zentrale Komponente eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemässen Einrichtung in einem zentralen Längsschnitt bzw. in einer Schnittansicht von oben und unten. Diese zentrale Komponente umfasst einen hohlen, rohrförmigen Körper 1, beispielsweise aus Metall oder Kunststoff
Im hohlen Inneren 2 dieses rohrförmigen Körpers 1 ist eine optische Markiereinrichtung (allgemein mit 3 bezeichnet) angeordnet, die einen Lichtleiter 4 und eine Sammellinse 5 umfasst. Das von einer schematisch angedeuteten Lichtquelle 6 ausgehende Licht wird durch die Sammellinse auf das Zentrum 7 des Beobachtungsbereiches 8 fokussiert und bildet dort beispielsweise einen Lichtpunkt ab.

Weiters umfasst der rohrförmige Körper 1 eine den freien Beobachtungsbereich 8 umgebende Auflage 9 in Form eines ringförmigen Steges. An diesen ringförmigen Steg schliessen sich zwei konzentrische Vertiefungen 11 und 12 an, die jeweils gesondert über Kanäle 13 und 14 und nicht näher dargestellte Leitungen 15 und 16 mit Unterdruckquellen (beispielsweise Saug- oder Vakuumpumpen) verbindbar sind.

Ausserdem weist der Körper 1 einen Zufuhrkanal für ein Fluid, beispielsweise als Träger für ein Hormon, auf, das dem zu untersuchenden Objekt, beispielsweise einer Zelle, während der Dehnung zuführbar ist. Dieser Zufuhrkanal ist mit 17 bezeichnet, ein entsprechender Abfuhrkanal ist mit 18 bezeichnet.

Die Fig. 2 zeigt den rohrförmigen Körper der Fig. 1 in einer Anwendung mit einem inversen Mikroskop, bei dem das Objektiv 21 unterhalb des elastischen, transparenten Trägers 19 angeordnet ist, auf dem die zu beobachtende Zelle festhaftet. Diese elastische, flexible Membran 19 ist im Objektträger 22 des Mikroskops gehalten und kann damit in x-y-Richtung gegenüber dem Objektiv verstellt werden. Damit ist es möglich, eine ausgewählte Zelle 20 in den Beobachtungsbereich des Objektivs zu bringen und das Objektiv darauf zu fokussieren.

Daraufhin wird der Körper 1, der über einen nicht dargestellten Manipulator in alle drei Raumrichtungen x, y, z bewegbar ist, derart auf die flexible Membran bzw. Träger 19 abgesenkt, dass der fokussierte Lichtpunkt der Beleuchtungseinrichtung im Inneren mit der Lage der bezüglich des Objektivs 21 bereits zentrierten Zelle zusammenfällt. Damit liegt das Zentrum des Beobachtungsbereich 8 im Zentrum des Objektivs, und auch der Körper 1 ist diesbezüglich zentriert.

Nachdem diese Komponenten relativ zu einander ausgerichtet bzw. zentriert worden sind, wird nun die Membran 19 durch Anlegen eines Unterdrucks in der äusseren ringförmigen Vertiefung 12 über die Saugleitung 14 etwas eingesaugt ohne einen Zug auf die Zelle auszuüben, und somit die

zu beobachtende Zelle 20 im Zentrum gehalten.

Die Dehnung des Trägers 19 bzw. der Membran erfolgt dann durch Anlegen eines Unterdrucks in die innere Kammer 11 über die Leitung 13. Dadurch wird die Membran, welche aussen gehalten ist, in die Vertiefung 11 gesaugt und an der Anlage 9 vorbei radial nach aussen gezogen, wie dies die Pfeile 23 andeuten. Die zu beobachtende Zelle im Zentrum des Beobachtungsbereiches bleibt dabei sowohl in der Höhenlage (z-Richtung, Fokussierung) als auch in der seitlichen Lage (x-yPositionierung) erhalten. Sie wird lediglich samt der gedehnten Unterlage gedehnt und kann dabei gleichzeitig über das Mikroskop mit dem Objektiv 21 beobachtet werden. Der Vergrösserungsbereich liegt typischerweise zwischen 200-fach bis 1100-fach, vorzugsweise zwischen 400-fach bis 1000-fach.

Die Fig. 3 zeigt drei verschiedene Zellagen vor (ausgezogene Linien) und nach (strichlierte Linien) der Dehnung.

Liegt die Zelle wie in der Position A im Zentrum, kommt es bei der Dehnung zu einer konzentrischen Dehnung der Zelle, ohne dass eine störende x-y-Verschiebung auftritt. Bei den exzentnschen Lagen B und C wird die Zelle nicht nur gedehnt, wenn der Träger gedehnt wird, sie wandert auch zur Seite, was bei einer Beobachtung mit dem Mikroskop vor allem bei hoher Vergrösserung zu einem Verschwinden aus dem Bild führt.

Die erfindungsgemässe Idee kann nicht nur bei einer mikroskopischen Untersuchung mittels eines Lichtmikroskops (wobei auch andere Mikroskope als inverse Mikroskope möglich sind), sondern beispielsweise auch bei einer fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung angewandt werden. Dabei wird der rohrförmige Körper 1 bzw. Aufsatz ebenfalls an eine elastische Membran 19 als Träger für eine in Fig. 4 nicht näher dargestellte zu beobachtende Zelle herangeführt. Über eine Anregungslichtquelle 24 gelangt Licht über den Lichtleiter auf die zu untersuchende, mit geeigneten Fluoreszenzmarkern versehene Zelle. Das Fluoreszenzlicht gelangt dann zurück ebenfalls über den Lichtleiter 4 an ein Spektrometer 25 zur Auswertung.

Wiederum stellt die gesamte Einrichtung sicher, dass bei Dehnung der Membran 19 (Träger für die zu beobachtende Zelle) eine gleichzeitige Beobachtung des sich verändernden Fluoreszenzlichts möglich ist.

Die Fig. 5 zeigt eine Schnittansicht auf einen rohrförmigen Körper 1', der ähnlich aufgebaut ist wie der Körper 1 der vorhergehenden Figuren. Es handelt sich dabei allerdings nicht um einen im Querschnitt kreisförmigen, sondern im Querschnitt quadratischen Körper. Auch hier umgibt eine Auflage 9' den Beobachtungsbereich 8'. Eine über die Leitung 13 mit Unterdruck beaufschlagbare Vertiefung 11' zieht eine nicht dargestellte Membran hinein und kann damit zu einer Dehnung derselben im Beobachtungsbereich 8' führen. Eine äussere Vertiefung 12', die über eine Leitung 14 mit Unterdruck beaufschlagbar ist, kann bei der Vorjustierung und dem Festhalten dieser nicht dargestellten Membran helfen, ganz ähnlich wie dies im Zusammenhang mit der Fig. 2a bereits beschrieben worden ist.

Mit der Erfindung sind nicht nur homogene, also konzentrische Dehnungen von einem zentra- len Punkt aus möglich, vielmehr sind auch beispielsweise lineare Dehnungen in bevorzugte Rich- tungen möglich. Dazu ist das Ausführungsbeispiel gemäss Fig. 6 geeignet. Die äussere Vertiefung
12" mit der Absaugleitung 14" erfüllt dabei dieselbe Zellfunktion wie bei den vorhergehenden
Ausführungsbeispielen, nämlich ein vorläufiges Halten einer elastischen Membran bzw. eines
Trägers für das zu beobachtende Objekt. Die eigentliche Dehnung des Trägers bzw. der Membran im mittleren Beobachtungsbereich 8" erfolgt dann durch Beaufschlagung der Bereiche 26a und 26b bzw 27a und 27b mit Unterdruck. Diese Vertiefungen 26a, 26b, 27a und 27b sind jeweils selektiv über Unterdruckleitungen beaufschlagbar.

Wenn man beispielsweise nur die Vertiefungen 26a und
26b mit Unterdruck beaufschlagt, kommt es zu einer linearen Dehnung der Membran im Beobach- tungsbereich in x-Richtung, bei einer Beaufschlagung der Vertiefungen 27a und 27b in analoger
Weise in y-Richtung. Mit derartigen oder ähnlichen Konstruktionen lassen sich also auch gezielte richtungsgebundene Dehnungen und damit verbundene Untersuchungen durchführen.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Einrichtung zur vorzugsweise mikroskopischen Untersuchung von Objekten, insbesondere Zellen, welche auf einem Träger angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass der <Desc/Clms Page number 4> Träger (19) elastisch und dehnbar ausgebildet ist, dass eine einen Beobachtungsbereich (8) umgebende, vorzugsweise plane Auflage (9) für den Träger (19) sowie eine Dehnein- richtung (11, 13) vorgesehen sind, über die der elastisch und dehnbar ausgebildete Träger (19) entlang der Auflage vom Beobachtungsbereich (8) nach aussen dehnbar ist.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehneinrichtung (11,13) derart ausgebildet ist, dass sie den elastischen Träger (19) vom Zentrum des Beobach- tungsbereichs (8) aus allseitig radial nach aussen zieht.
3. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehneinrichtung (11,13) derart ausgebildet ist, dass sie den elastischen Träger (19) in eine oder mehrere bevorzug- te Richtungen im wesentlichen jeweils linear dehnt.
4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehnung in die einzelnen Richtungen gesondert einstellbar ist.
5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehnein- richtung (11, 13) den Träger (19) mit Unterdruck beaufschlagt.
6. Einrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehneinrichtung (11,13) zumindest eine ausserhalb der den Beobachtungsbereich (8) umgebenden Auflage (9) angeordnete Vertiefung (11) aufweist, in die der randseitig gehaltene Träger (19) mittels Unterdruck einsaugbar ist.
7. Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung (11) die eben- falls vorzugsweise ringförmige Auflage (9) ringförmig umgibt.
8. Einrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei geson- dert mit Unterdruck beaufschlagbare Vertiefungen (11, 12) vorgesehen sind.
9. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die gesonderten Vertiefungen zumindest eine näher beim Beobachtungsbereich (8) liegende innere Vertiefung (11) und eine diese vorzugsweise ringförmig umgebende äussere Vertiefung (12) umfassen.
10. Einrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den geson- derten Vertiefungen (11,12) eine Zwischenauflage angeordnet ist, die mit der den Beo- bachtungsbereich (8) umgebenden Auflage (9) in einer Ebene liegt.
11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (19) im Beobachtungsbereich (8) auflagenfrei angeordnet ist.
12. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Zuführkanal (17) zum Zuführen von fluiden Stoffen auf das im Beobachtungsbereich (8) angeordnete Objekt (20) vorgesehen ist.
13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (3) zum Erzeugen einer optischen Markierung, insbesondere eines fokussierten Lichtpunk- tes, in einem Teil, vorzugsweise im Zentrum des Beobachtungsbereiches (8).
14. Einrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Markiereinrich- tung (3) einen Lichtleiter (4) und eine vorgeschaltete Fokussieroptik, vorzugsweise eine Sammellinse (5) umfasst.
15. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen hohlen rohrförmigen Körper (1) umfasst, der zumindest eines, vorzugsweise alle der fol- genden Merkmale aufweist : - eine im Inneren (2) des hohlen rohrförmigen Körpers (1) angeordnete optische Markier- einrichtung (3), vorzugsweise mit einem axialen Lichtleiter (4) und einer Sammellinse (5), - die vorzugsweise ringförmige an einer Stirnseite des rohrförmigen Körpers (1) angeord- nete Auflage (9), die einen freien Beobachtungsbereich (8) am stirnseitigen Ende des hohlen Inneren (2) des Körpers (1) umgibt, - zumindest eine über einen Saugkanal (13,14) mit Unterdruck beaufschlagbare Vertie- fung (11, 12) an der Stirnseite des rohrförmigen Körpers (1), - zumindest einen Zufuhrkanal (17) zum Zuführen eines Fluids zum Beobachtungsbereich (8), sowie - zumindest einen Abfuhrkanal (18)

zum Abführen eines Fluid vom Beobachtungsbereich (8).
16. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie Be- standteil eines Mikroskops ist, mit dem das im Beobachtungsbereich (8) angeordnete <Desc/Clms Page number 5> Objekt (20), insbesondere Zelle, während der Dehnung des Trägers (19) beobachtbar ist.
17. Einrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein Durch- lichtmikroskop ist, dessen Objektiv (21) vorzugsweise unter dem transparenten Träger (11) angeordnet ist, wobei das Licht vorzugsweise aus der optischen Markierungseinrichtung (3) stammt, die im Beobachtungsbereich (8) einen fokussierten Lichtpunkt erzeugt.
18. Einrichtung nach einem der Ansprüche 16 oder 17 dadurch gekennzeichnet, dass der Ver- grösserungsfaktor des Mikroskops zwischen 200 und 1100, vorzugsweise zwischen 400 und 1000, liegt.
19. Einrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die den Beobachtungsbereich (8) umgebende Auflage (9), vorzugsweise samt zumindest einem Teil der Dehneinrichtung, verstellbar gelagert ist.
20. Einrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger vorzugsweise am Objektträger des Mikroskops verstellbar gelagert ist.
21. Einrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Anregungslichtquelle (24) und eine Detektoreinrichtung (25) zum Erfassen von Fluores- zenzlicht aus dem Beobachtungsbereich (8) aufweist.
22. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (19) eine elastische, transparente Membran ist, die vorzugsweise randseitig gehalten ist