AT398435B - Modifiziertes polyfruktan-hydrolysierendes enzym - Google Patents
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Description
AT 398 435 B
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein modifiziertes bakterielles Polyfruktanhydrolysierendes Enzym, daß sich vom natürlichen Enzym durch das Vorhandensein eines größeren Anteils an Kohlenhydrat unterscheidet.
Polyfruktane wie Inulin sind pflanzliche Speicherstoffe, die von einigen Pflanzen mit großen Hektar-Erträgen produziert werden können (Fuchs, A., Starch/Stärke 39:335-343, 1987). Eine wichtige Voraussetzung für die technische Nutzung von Polyfruktanen ist die Verfügbarkeit von Enzymen, die die Polymere zu den monomeren Grundeinheiten hydrolysieren können. Das Enzym Levanase aus dem Bakterium Bacillus subtilis kann Polyfruktane sowohl des Inulin-Typs (/3-1,2 verknüpft) als auch des Levan-Typs (/3-2-6 verknüpft) sowie auch Saccharaose hydrolysieren (Kunst, F. et al., Biochimie 59:287-292, 1977). Das entsprechende Gen wurde isoliert (Friehs, K. et al., J.Biotechnol. 3:333-341, 1986) und charakterisiert (Schörgendorfer, K. et al., Nucleic Acids Res. 22:9606, 1987; Schörgendorfer, K. et al., J.Biotechnol. 7:247-258, 1988; Martin, I. et al., Mol.Gen.Genet. 208:177-184, 1987). Es konnte gezeigt werden, daß das Enzym Levanase durch heterologe Expression des Monierten Gens in Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden kann (Wanker, E. et al., J.Biotechnol. 18:243-254, 1991). Für die effiziente enzymatische Hydrolyse von Inulin sind die Eigenschaften des Enzyms von besonderer Wichtigkeit. Darunter fallen unter anderem Eigenschaften wie Aktivität, Substratspezifät, Stabilität bei z.B. höheren Temperaturen oder anderen externen Milieubedingungen (z.B. Salzkonzentration, pH-Wert). Für das Enzym Levanase, das von Bakterien hergestellt wurde, entweder durch Bacillus subtilis selbst oder durch Expression des Gens in heterologen Bakterienstämmen wie z.B. E.coli (Beispiel 1), konnte beispielsweise ein Maximum der Aktivität bei einer Temperatur von ca. 55 *C festgestellt werden (Beispiel 3). Weiters wurde festgestellt, daß ein solches Enzym bei niedrigen Salzkonzentrationen in Bruchstücke aufgespalten wird, was einen Verlust an Enzym bei längerer Verwendung bedeutet. Für Levanase aus B.subtilis oder aus rekombinanten E.coli Stämmen wurde ein pH-Optimum im Bereich von pH 5 bis etwa pH 6,5 festgestellt (Kunst, F. et al., Biochimie 59:287-292,1977; Beispiel 4).
Eine Verbesserung einiger dieser Eigenschaften wäre für eine technische Anwendung des Enzyms Levanase zur Hydrolyse von Polyfruktanen vorteilhaft. Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einige dieser Eigenschaften zu verbessern. Es wurde nach einem Weg gesucht, den Proteinkörper des Enzyms in einfacher und kostengünstiger Weise zu modifizieren, und somit Einfluß auf die Eigenschaften des Enzyms zu nehmen. Diese Aufgabe konnte insoferne gelöst werden, indem eine glykosylierte Form des Proteins hergestellt wurde. Bakterien sind nicht in der Lage, Glykosylierungen an Proteinen durchzuführen, wie dies bei eukayontischen Organismen der Fall ist. Die Idee war nun, durch Expression des bakteriellen Gens im Pilz Saccharomyces cerevisiae ein glykosyliertes Produkt zu erhalten, was auch tatsächlich gelungen ist (Beispiel 2). Das auf diese Weise gewonnene glykosylierte Enzym unterscheidet sich vom nicht-glykosylierten Enzym in einigen Eigenschaften wenig. So ist beispielsweise das Temperaturoptimum des glykosylierten Enzyms ebenfalls zwischen 50 bis 55 · C gelegen (Beispiel.3).
Wichtige Veränderungen zeigt das glykosylierte Enzym bei der Stabilität bei besonderen externen chemischen Bedingungen. Das nicht-glykosylierte Levanase-Enzym ist in Lösungen niedriger lonenstärke labil und zerfällt in beträchtlichem Ausmaß in kleinere Bruchstücke . Das glykosylierte Enzym, das unter denselben Bedingungen wie das nichtglykosylierte Enzym der niedrigen Salzkonzentration ausgesetzt ist, zeigt jedoch keine detektierbaren Degradierungsprodukte (keine kleineren Bruchstücke; Beispiel 5). Das glykosylierte Enzym weist somit in diesem Bereich einen deutlichen Vorteil auf.
Ein weiterer Vorteil des glykosylierten Enzyms ist bei Arbeiten bei niedrigen pH-Werten gelegen. Das nicht-glykosylierte Enzym weist bei pH-Werten unter 5,0 bereits sehr deutlich reduzierte Aktivitäten auf und bei pH 4 liegt etwa nur mehr etwa ein Zehntel der Aktivität, wie sie bei optimalen pH-Bedingungen von pH 5 bis 6,5 gefunden wird, vor. Das glykosylierte Enzym zeigt bei diesen niedrigen pH-Werten noch wesentlich höhere Aktivitäten. So können bei pH 4 noch etwa 30 bis 60% der bei optimalen pH-Bedingungen (pH 5 bis 6,5) gemessenen Aktivität gefunden werden Beispiel 4).
Beispiel 1:
Herstellen einer nicht-glykosylierten Levanase Präparation
Der Stamm Escherichia coli HB101 mit dem Plasmid pESI7HE (Wanker, E. et al., J.Biotechnol. 18:243-254, 1991) wird in M9 Mineralmedium (Miller, J.H., Experiments in Molecalar Genetics, CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, 1972) mit 10 g/l Glukose, 100 mg/l Ampicillin und 1 mM l$opropy-/3-D-Thiogalaktosid (IPTG) in Schüttelkolben bei 37 * C für 16 Stunden angezüchtet. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation werden diese in 25 mM Tris.HCI (pH 8,0) suspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (6 mal 15 sec bei 125 Watt). Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation bei 30.000 Upm (1 h) entfernt. Der Überstand 2
AT 398 435 B (Rohlysat) wird abgezogen und bei -20 * C gelagert.
Zur Reinigung der Levanase wird zuerst eine fraktionierte Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat durchgeführt. Die bei 60% bis 80% Sättigung ausgefallenen Proteine werden durch Zentrifugation gewonnen, in 25 mM Tris.HCI (pH 8,0) gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert. Eine weitere Reinigung erfolgt über standardmäßige lonentauscherchromatographie unter Verwendung der Materialien DEAE-Sepharose und S-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) und Elution mit steigenden Salzgradienten. Die Fraktionen mit Levanase werden jeweils durch Aktivitätsbestimmung (Wanker, E. et al., J.Biotechnol. 18:243-254, 1991) ermittelt. Die Reinheit der Präparationen wird durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermittelt. In Fig. 1 ist das Ergebnis einer Aufreinigung dargestellt.
Erklärung zu Fig.1: Es ist die Analyse von Fraktionen bei der chromatographischen Aufreinigung von Levanase durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dargestellt. Auf dem Gel sind aufgetragen:
Bahn 1, Molekulargewichtsstandard: Bahnen 2 und 3, Fraktionen mit Levanaseaktivität nach Chromatographie auf DEAE-Sepharose; Bahn 4, Fraktionen mit Levanaseaktivität nach Chromatographie auf S-Sepharose. Die Molekulargewichte der Proteine des Standards sind links angeführt (in Kilodalton, kDa). Der Pfeil rechts zeigt auf die Levanase-Banden.
Beispiel 2:
Herstellen einer glykosylierten Levanase Präparation
Das Plasmid pMAEW66 (Wanker, E. et a!., J.Biotechnol. 18:243-254, 1991), das das intakte Levanase-Gen (inklusive der bakteriellen Signalsequenz) unter der Kontrolle des Promoters des Saccharomyces cerevisiae PGK Gens (Mellor, J. et al., Gene 24:1-14,1983) enthält, wird in den S.cerevisiae Stamm DBY747a transformiert (Wanker, E. et al., J.Biotechnol. 18:243-254, 1991). Der resultierende rekombinante Hefestamm wird in SD-Medium (Sherman F. und Hicks J.B., Methods in Yeast Genetics, CSH Laboratory, Gold Spring Harbor, 1986) mit Glukose (5 g/l) als C-Quelle bei 30 °C im Schüttelkolben für 16 bis 20 Stunden angezüchtet. Die Zellen werden abzentrifugiert und der Kulturüberstand stellt das Rohpräparat dar.
Die Analyse der Proteine des Kulturüberstands mittels SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese und Detektion von Levanaseprotein mittels der Western Blot Technik unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums erbrachte folgendes Ergebnis: Im Kulturüberstand wird Levanaseprotein aufgefunden, daß mm größten Teil giykosyliert ist, und zwar in Form von Hyperglykosylierung. Durch die Glykosylierung verschiebt sich das Molekulargewicht von ca. 73 - 75 kDa (nicht-glykosylierte Form) auf etwa 160-190 kDa. Da die Größenbestimmung der Proteine in diesem Bereich mit dieser Methode relativ ungenau ist, kann hier eine größere Bandbreite angenommen werden.
Eine weitere Aufreinigung der Levanase aus dem Kulturüberstand erfolgt analog zu Beispiel 1 mit fraktionierter Ammoniumsulfatfällung und mit lonentauscherchromatographie.
Beispiel 3:
Temperaturabhängigkeit der Aktivität des Levanase-Enzyms
Levanasepräparationen werden mit Reaktionspuffer (0,2 Μ ΝθςΗΡΟ*, 0,2 M Na-Azetat, pH 5) entsprechend verdünnt und 1:1 mit Inulinlösung (100 mg/ml, suspendiert in Reaktionspuffer) versetzt. Die Ansätze werden 30 min bei der entsprechenden Temperatur inkubiert. Die Menge an freigesetzter Fruktose pro Zeiteinheit wird enzymatisch bestimmt und daraus die jeweilige Aktivität berechnet (Wanker, E. et al., J.Biotechnol. 18:243-254, 1991). Aus dem Vergleich der ermittelten Aktivitäten ergibt sich, daß sowohl für das nichtglykosylierte Enzym, als auch für das glykosylierte Enzym ein Maximum an Aktivität im Bereich von 50 bis 55 ° C vorliegt. Der typische Verlauf der Abhängigkeit der Aktivität von der Temperatur für das nicht-glykosylierte Enzym ist in Fig. 2 gezeigt, mit dem glykosylierten Enzym sind die Verhältnisse nahezu ident.
Beispiel 4:
Abhängigkeit der Aktivität des Levanase-Enzyms vom pH-Wert.
Levanasepräparationen werden mit Reaktionspuffer (wie Beispiel 3), der vorher auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt wurde, verdünnt und 1:1 mit Inulinlösung (wie Beispiel 3, jedoch mit Reaktionspuffer der auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt wurde hergestellt) versetzt. Die Ansätz wurden für 30 min bei 3
Claims (9)
- AT 398 435 B 37 · C inkubiert und die Enzymaktivitäten, wie bei Beispiel 3 dargestellt, ermittelt. Bei Verwendung von nicht-glykosylierter Levanase wird typischerweise das in Fig.3 dargestellte Verhalten vorgefunden. Bei Verwendung von glykosylierter Levanase kann bei pH 4 noch 40% bis 60% der maximalen Aktivität vorgefunden werden. Erklärung zu Fig. 3: Es ist der Einfluß des pH-Werts auf die Aktivität von Levanase (nichtglykosyliertes Protein) gezeigt. Die beiden Kurven stellen zwei voneinander unabhängig durchgeführte Experimente dar. Beispiel 5: Einfluß der lonenkonzentration auf die Stabilität des Levanase-Proteins Gereinigte nicht-glykosyiierte Levanase wird mit Reaktionspuffer {siehe Beispiel 3) oder 25 mM Tris.HCl (pH 8) verdünnt und für 20 h bei 37 · C inkubiert. Parallel dazu wird gereinigte, nicht-glykosyiierte Levanase über Nacht bei 4 ’C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Aliquots dieser Ansätze werden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Dabei wird gefunden, daß bei Inkubation in Reaktionspuffer oder 25 mM Tris.HCl (pH 8) nur eine Proteinbande bei etwa 75 kDa zu sehen ist. Beim Ansatz, wo die Levanase gegen Wasser dialysiert wurde, finden sich daneben mehrere distinkte Banden bei niedrigeren Molekulargewichten (zwischen ca. 15 und 60 kDa), wobei der Anteil an solchen Bruchstücken bis zu 50% betragen kann. Wird glykosylierte Levanase unter denselben Bedingungen behandelt, so kann in keinem Fall ein sichtbarer Anteil an Bruchstücken niedrigeren Molekulargewichts gefunden werden. Auch nach Abspaltung der Zuckerketten vom glykosylierten Protein mit Endoglycosidase H (Boehringer Mannheim, BRD), was zu einem nicht-glykosylierten Protein führt, und anschließender Analyse in SDS-Polyacrylamidgelen konnten keine Bruchstücke niedrigeren Molekulargewichts detektiert werden. Patentansprüche 1. Modifiziertes Polyfruktan-hydrolysierendes Enzym, das durch Expression des Levanasegens aus Bacillus subtilis in Stämmen von Saccharomyces cerevisiae unter Bedingungen, die eine Sekretion des Proteins in die Kulturflüssigkeit ermöglichen, erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß es glykosy-liert ist und Aktivität zur Hydrolyse von Polyfruktanen wie Inulin oder Levan aufweist.
- 2. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennneichnet, daß die Sekretion und damit die Glykosylierung durch die Levanase-eigene Signaisequenz vermittelt wird.
- 3. Enzym nach den Ansprüchen 1 und 2, bei dem das durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermittelte^ Molekulargewicht durch die Glykosylierung signifikant höher als das Molekulargewicht der nicht-glykosylierten Form (ca. 75 kDa) ist und im Bereich von 100 bis 250 kDa, vorzugsweise im Bereich von 160 bis 190 kDa, liegt.
- 4. Enzym nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es im Vergleich zum nicht-glykosylierten Levanase-Enzym eine erhöhte Stabilität bei niedrigen lonenkonzentrationen aufweist.
- 5. Enzym nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es im Vergleich zum nicht-glykosylierten Levanase-Enzym bei niedrigen pH-Werten von pH 3 bis pH 5, vorzugsweise um pH 4, höhere Aktivität aufweist.
- 6. Proteinpräparation, die ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
- 7. Proteinpräparation nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Kulturflüssigkeit einer Kultur von rekombinanten Saccharomyces cerevisiae Stämmen, die das Bacillus subtilis Levanase-Gen enthalten, darstellt.
- 8. Proteinpräparation nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ich bei dem Stamm um DBY747a mit dem Plasmid pMAEW66 handelt.
- 9. Proteinpräparation nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein aus einer Kulturflüssigkeit nach den Ansprüchen 7 und 8 nach den gängigen Verfahren der Proteinaufarbeitungstechniken, z.B. 4 AT 398 435 B durch Konzentrieren, Fällen, Aufreinigen (z.B. durch Chromatographieren), Trocknen, Absorbieren, oder ähnlichen Methoden hergestelltes flüssiges oder festes Präparat darstellt. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 5
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| WO2000017331A1 (en) * | 1998-09-18 | 2000-03-30 | Novozymes A/S | A 2,6-β-D-FRUCTAN HYDROLASE ENZYME AND PROCESSES FOR USING THE ENZYME |
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1992
- 1992-08-20 AT AT167692A patent/AT398435B/de not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. OF BIOTECHNOLOGY, VOL. 17, 1991; S. 243-254 * |
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| GB2480419B (en) * | 2009-02-26 | 2014-09-17 | Uws Ventures Ltd | Method for the manufacture of ethanol |
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