AT381396B

AT381396B - Verfahren zur quantitativen bestimmung von 4-methoxy-n-(2-(2-(1-methyl-2- piperidinyl) aethyl)phenyl)benzamid und von dessen o-demethyl- und 3-methoxy-o-demethylmetaboliten in einer biologischen fluessigkeit

Info

Publication number: AT381396B
Application number: AT315483A
Authority: AT
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1980-09-18
Filing date: 1983-09-02
Publication date: 1986-10-10
Also published as: ATA315483A

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



     4-Hydroxyl-3-methoxy-N-12- [2- (1-methyl-2-piperidinyl) äthyl] phenyllbenzamid,   das 4-Hydroxy- - 3-methoxy-benzanilid-analogon von Encainid der Formel 
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 ist beim Menschen ein Stoffwechselprodukt von Encainid und ein auf Grund seiner mit Bezug auf Encainid längeren Wirkungsdauer verbessertes Antiarrhythmicum. 



   Encainid-Hydrochlorid ist ein Antiarrhythmicum, welches in der Literatur auch als MJ 9067 (USAN and the USP Dictionary of Drug Names 1980, Seite 122, United States Pharmacopeial Convention, Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, Library of Congress Catalog Card No. 72-88571) bezeichnet wird. Encainid hat die folgende Strukturformel : 
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Die folgenden Veröffentlichungen beschreiben die chemische Synthese von Encainid, einer Anzahl von Analogen hievon sowie die antiarrhythmischen Eigenschaften dieser Verbindungen bei Tieren. 



   Dykstra, et al., J. Med. Chem., 16,1015-1020 (1973). 



   Dykstra und Minelli, US-PS Nr. 3, 931, 195 patentiert 6. Jänner 1976. 



   Byrne, et al., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 200,147-154 (1977). 



   Untersuchungsmethoden von Encainid und seinen Metaboliten werden in den folgenden Ver- öffentlichungen beschrieben :
Mayol und Gammans, Therap. Drug Monitoring, 1, 507-524 (1979). 



   Die Strukturformeln von Encainid und einer Anzahl seiner Analoga, welche in der obgenannten Veröffentlichung von Dykstra et al. und in der obgenannten Patentschrift beschrieben werden, sind aus der folgenden Tabelle im Vergleich zu der Struktur der Verbindung (A) zu ersehen : Die Nummern der in der Tabelle angeführten Verbindungen sind die gleichen, wie sie von Dykstra et al. für die Nummern der Beispiele verwendet werden. 

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  Strukturformeln 
 EMI2.1 
 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> Verbindung <SEP> Nr. <SEP> R'R'R"
<tb> 89 <SEP> (O-Demethylencainid <SEP> oder <SEP> ODE) <SEP> HO- <SEP> H- <SEP> CH3- <SEP> 
<tb> 107 <SEP> (Encainid <SEP> oder <SEP> E) <SEP> CHaO-H-CHa-
<tb> 108 <SEP> H-CHaO-CHs-
<tb> 109 <SEP> CHaO-CHsO-CHg-
<tb> 139 <SEP> (N-Demethylencainid <SEP> oder <SEP> NDE) <SEP> CHsO-H-H-
<tb> (A) <SEP> (3-Methoxy-0-demethylencainid
<tb> oder <SEP> 3-Methoxy-ODE) <SEP> HO- <SEP> CH3O-CH3 <SEP> 
<tb> 
 
Die Verbindung Nr. 89 und 139 wurden von Mayol und Gammans (op. cit) als Stoffwechselprodukte von Encainid (Verbindung Nr. 107) identifiziert, in welcher Veröffentlichung das erstere als ODE und das letztere als NDE bezeichnet wird.

   Das erstere (ODE) wurde als hauptsächliches Stoffwechselprodukt identifiziert, welches manchmal im Plasma in Mengen vorhanden ist, welche ein Mehrfaches der Konzentration von Encainid nach der Behandlung mit dem letzteren darstellen. Als Ergebnis einer Verbesserung der Hochdruck-Flüssigchromatographie-Versuchsmethode, die in der Veröffentlichung von Mayol und Gammans beschrieben wird, wurde gefunden, dass die Verbindung (A) auch ein hauptsächliches Stoffwechselprodukt von Encainid beim Menschen nach oraler Verabreichung des letzteren darstellt und dass sie im Blutplasma in Konzentrationen vorhanden ist, die wesentlich grösser sind als von Verbindung 89 zwei oder mehr Stunden nach der oralen Verabreichung einer 50 mg-Dosis von Encainid-Hydrochlorid.

   Es wurde nun gefunden, dass das in der Veröffentlichung von Mayol und Gammans beschriebene HPLC-Versuchsverfahren nicht imstande ist, zwischen der Verbindung 89 und der Verbindung (A) zu unterscheiden. Es wird angenommen, dass die Verbindung (A) in dem Körper aus der Verbindung 89 durch einen biologischen Umwandlungsprozess erzeugt wird. 



   Demnach betrifft die Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Encainid und von dessen O-Demethyl- und 3-Methoxy-O-demethylmetaboliten in einer biologischen Flüssigkeit, welche deren Extraktion aus dieser Flüssigkeit und deren Abtrennung durch Hochdruck-Flüssigchromatographie auf einer Siliciumdioxydsäule unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels als mobile Phase umfasst ; das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass die mobile Phase aus einer Mischung von   Äthanol : Wasser : Methansulfonsäure   von 500 : 30 : 0, 1 besteht. 



   Zum Vergleich wird die biologische Wirksamkeit der Verbindungen, deren Struktur in der obigen Tabelle angegeben wurde, in der folgenden Tabelle dargelegt, in welcher ein Vergleich der antiarrhythmischen Wirksamkeit, wie sie in dem in der Veröffentlichung von Dykstra et al. beschriebenen Laboratoriumstest bestimmt wurde, angegeben wurde. Dies wird in der Tabelle als Test I bezeichnet. Test II ist eine annäherungsweise Angabe der oralen Toxizität dieser Verbindungen bei Mäusen, und die Tests III und IV beziehen sich auf die Ergebnisse des Metabolismus beim Menschen, die nach der oralen Verabreichung einer antiarrhythmischen oralen Dosis von 75 mg Encainid-Hydrochlorid an Patienten beobachtet wurden. 

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  Biologische Wirksamkeit : I. Antiarrhythmische Wirksamkeit für bei Mäusen durch Chloroform-Inhalation erzeugte 
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 physiologischen oder neurologischen Verlustes bei der Hälfte der Tiere auftreten, aus- gedrückt als mg/kg Körpergewicht. 



  III. Zeit, die der oralen Dosis an Menschen mit 75 mg Encainid-Hydrochlorid für die Besei- tigung (Plasma-Konzentration ' 20 ng/ml) aus dem Blutplasma folgt, in Stunden. 



  IV. Ungefähre halbe Lebensdauer in menschlichem Blutplasma nach der oralen Dosierung mit Encainid-Hydrochlorid in Stunden. 
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<tb> 
<tb> 



  Verbindung <SEP> Nr. <SEP> 1 <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> 
<tb> 89 <SEP> 1, <SEP> 7-2, <SEP> 8* <SEP> 25-50/5-10 <SEP> > 16 <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 107 <SEP> 5, <SEP> 3-15* <SEP> 50-100/5- <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 2, <SEP> 5-3
<tb> (Encainid)
<tb> 108 <SEP> 10 <SEP> 100/10 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> ** <SEP> ** <SEP> 
<tb> 109 <SEP> 10 <SEP> 100/25 <SEP> ** <SEP> **
<tb> 139 <SEP> 28 <SEP> 147/15,7 <SEP> + <SEP> +
<tb> (A) <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 250/31, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 62, <SEP> 5 <SEP> > 16 <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 
 * Bereich der verschiedenen Bestimmungen. 



   ** Verbindungen, die weder an Menschen verabreicht wurden noch als Meta- bolite bei Mensch oder Tieren beobachtet wurden. 



   + Auftreten im Plasma nach oraler Verabreichung von Encainid an
Menschen war selten und es war kein Wert nachweisbar. 



   Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen ungefähr äquivalente antiarrhythmische Wirksamkeit für jede dieser Substanzen mit Ausnahme der Verbindung Nr. 89, welche etwas wirksamer ist, jedoch gegenüber Mäusen auch etwas giftiger ist. Die Verbindung (A) unterscheidet sich von den Verbindungen Nr. 89 und 107 und weist diesen gegenüber Vorteile auf in bezug auf eine verringerte Toxizität und eine längere Anwesenheit im Blut. 



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert. 



   Versuchsverfahren
A) Extraktion von biologischer Flüssigkeit
Zu 1 ml Plasma oder Urin in einem verschraubten Rohr gibt man 0, 2 ml einer   0, 5. M-Tris-HCl-     - Pufferlösung (2-Amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propandiol), pH-Wert 8, 5   und 10 ml n-Butylchlorid, das 5 Vol.-% Isopropanol enthält. Die Probe wird sodann auf einem Vibrationsmischer geschüttelt und daraufhin zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Ein 9 ml-aliquoter Teil der organischen Schicht wird entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in 100   III   Äthanol wieder gelöst. Ein aliquoter Teil von 50   til   dieser Lösung wird auf die Säule für   Hochdruck-Flüssigchromatographie   gespritzt. 



   B)   Hochdruck-Flüssigchromatographie   (HPLC)-Bedingungen :
Es wird eine Säule mit Normalphasen-Kieselsäure mit den Abmessungen 3, 9 mm x 30 cm Länge, die mit einem variablen Wellenlängen-UV-Detektorsatz ausgestattet ist, bei 254 nm verwendet. 



   Die verwendete mobile Phase besteht aus 500 ml Äthanol, 30 ml Wasser und 0, 1 ml Methansulfonsäure bei einer Fliessgeschwindigkeit von 1 ml/min. Es wird eine Reihe von Standardproben, die 0,25, 100 und 500 ng/ml von jeder zu untersuchenden Verbindung enthalten, unter Verwendung 

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 von angesammeltem menschlichem Plasma hergestellt. Diese Standardproben werden, wie oben beschrieben, behandelt. Eine Messung des Ansprechens des Detektors wird erzielt durch digitale Integration oder Messung der Höhen der Spritzen. Die Standardkurve für jede Komponente wird durch Auftragen der linearen Beziehung des Ansprechens des Detektors gegen die Konzentration aus den Plasma-Standards konstruiert. Die Konzentration der Verbindung in der Probe wird sodann aus diesen Kurven interpoliert. 



   C) Ergebnisse
Die relative Reihenfolge der Eluierung von Encainid und seiner O-Demethyl- und 3-Methoxy-   -O-demethyl-metaboliten   aus der Säule und deren Rückhaltezeiten sind wie folgt : Verbindung Nr. 89,   8, 3 min ;   Verbindung (A)   9, 7 min ;   Verbindung Nr. 107, 11, 4 min. Die letzte aus der Säule eluierte endogene Plasma-Komponente hat eine Rückhaltezeit von 3, 6 min und die Basislinie ist in dem Bereich, in welchem der Metabolit eluiert sehr stabil. Daher erfolgt aus den endogenen Plasmakomponenten keine Interferenz.

   Aus den Unterschieden in den Extraktions-Wirksamkeiten, den spezifischen molaren Absorptivitäten und den Rückhaltezeiten für die einzelnen Komponenten ergibt sich die Empfindlichkeit des Versuches für jede dieser Komponenten wie folgt : Verbindung Nr. 89, 10 ng/ml ; Verbindung (A), 20 ng/ml ; Verbindung Nr. 107, 15 ng/ml.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 4-Methoxy-N- {2- [2- (I-methyl - 2 -piperidinyl) - äthyl] phenyltbenzamid (Encainid) und von dessen O-Demethyl- und 3-Methoxy-O-demethylmetaboliten in einer biologischen Flüssigkeit, welche deren Extraktion aus dieser Flüssigkeit und deren Abtrennung durch Hochdruck-Flüssigchromatographie auf einer Siliciumdioxydsäule unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels als mobile Phase umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die mobile Phase aus einer Mischung von Äthanol : Wasser : Methansulfonsäure von 500 : 30 : 0, 1 besteht.