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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer N-alkylierter Muramylpeptide der Formel
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worin X eine Carbonylgruppe. R, Wasserstoff, Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Benzyl, R z gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl. R und R 0 Wasserstoff, R. Wasserstoff oder Alkyl. mindestens einer der Reste R 7'R. und Ru Niederalkyl und die andern Wasserstoff, R, Wasserstoff oder Niederalkyl und die Reste R. R und R unabhängig voneinander einen gegebenenfalls veresterten oder amidierten Carboxyrest und R ; ; auch Wasserstoff bedeuten.
Die Konfiguration von Verbindungen, in denen R., R 0 und/oder RIo von Wasserstoff verschieden sind. ist in Formel (I) mit (D) bzw. (L) an den betreffenden Asymmetriezentren angegeben.
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ausdrücklich differenziert, in dieser Erfindung auch Verbindungen als "Muramylpeptide" bezeichnet, in denen R 3 für Wasserstoff oder einen von Methyl verschiedenen Alkylrest steht, und die streng genommen als Normuramyl- bzw. Homomuramylpeptidderivate bezeichnet werden müssten.
Alkyl ist geradkettiges oder verzweigtes, in beliebiger Stellung gebundenes Alkyl mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen, in erster Linie jedoch Niederalkyl.
Als Substituenten der gegebenenfalls substituierten Alkylgruppe kommen in erster Linie freie oder funktionell abgewandelte Hydroxy- oder Mercaptogruppen, wie verätherte oder veresterte Hydroxy- oder Mercaptogruppen, z. B. Niederalkoxy oder Niederalkylmercaptogruppen, oder Halogenatome oder freie oder funktionell abgewandelte Carboxyl-, wie Niederalkoxycarbonyl- oder Carbamoylgruppen in Frage.
Dabei kann der substituierte Alkylrest, wie Niederalkylrest, einen, zwei oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten, insbesondere freie Hydroxygruppen oder Halogenatome tragen.
Arylreste sind insbesondere monocyclische, sowie bicyclische Arylreste, in erster Linie Phenyl. aber auch Naphthyl. Sie können gegebenenfalls z. B. durch Niederalkylgruppen, freies, veräthertes oder verestertes Hydroxy, z. B. Niederalkoxy oder Niederalkylendioxy oder Halogenatome, und/oder Trifluormethylgruppen, mono-, di- oder polysubstituiert sein.
Gegebenenfalls substituierte Benzylreste sind insbesondere solche Benzylreste, die im aromatischen Kern gegebenenfalls, z. B. durch Niederalkyl, freie, verätherte oder veresterte Hydroxyoder Mercaptogruppen. z. B. Niederalkoxy-oder Niederalkylendioxy-, sowie Niederalkylmercaptooder Trifluormethylgruppen und/oder Halogenatome, mono-, di- oder polysubstituiert sind.
Eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe ist in erster Linie die Carboxylgruppe selbst. oder eine mit einem Niederalkanol veresterte Carboxylgruppe oder auch die Carbamoylgruppe, die am Stickstoffatom unsubstituiert ist oder mit Alkyl, insbesondere Niederalkyl, Aryl, in erster Linie Phenyl, oder Aralkyl, wie Benzyl, mono- oder disubstituiert ist. Die Carbamoylgruppe kann aber auch einen Alkylen-, wie den Tetra- oder Pentamethylenrest tragen.
Eine Carbamoylgruppe R IQ kann am Stickstoff auch durch die Carbamoylmethylgruppe substituiert sein.
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Verestertes oder veräthertes Hydroxy ist insbesondere Niederalkoxy oder Niederacyloxy, wie Niederalkanoyloxy.
Verestertes oder veräthertes Mercapto ist insbesondere Niederalkylmercapto- oder Niederacyl-, wie Niederalkanoylmercapto.
Acyliertes Amino ist insbesondere Niederalkanoylamino oder Carbamoylamino.
Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen mit "Nieder" bezeichneten Reste und Verbindungen enthalten vorzugsweise bis und mit 7 und in erster Linie bis und mit 4 Kohlenstoffatome.
Vorstehend, wie nachfolgend können die Allgemeinbegriffe folgende Bedeutung haben : Niederalkyl ist z. B. n-Propyl. n-Butyl. Isobutyl, sek. Butyl oder tert. Butyl. ferner n-Pentyl, n-Hexyl. Isohexyl oder n-Heptyl und in erster Linie Methyl oder Äthyl. In Aryl-. Cycloalkyl- oder Heterocyclylniederalkyl ist der Niederalkylrest, insbesondere Methyl oder Äthyl, wobei der Aryl-, Cycloalkyl- oder Heterocyclylrest die obengenannte Bedeutung besitzt.
Niederalkoxy ist z. B. n-Propoxy, n-Butoxy, Isobutoxy, sek. Butoxy oder tert. Butoxy und in erster Linie Methoxy oder Äthoxy.
Niederalkylmercapto ist z.B. n-Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sek.Butyl- oder tert. Butylmercapto und in erster Linie Methylmercapto oder Äthylmercapto.
Niederalkylendioxy ist insbesondere Methylendioxy, Äthylen- oder Propylendioxy.
Halogen steht für Fluor oder Brom, vorzugsweise jedoch für Chlor.
Niederalkanoyl ist insbesondere Propionyl oder Butyryl. in erster Linie jedoch Acetyl.
Die neuen Verbindungen der Erfindung können in Form von Gemischen von Isomeren oder von reinen Isomeren vorliegen.
Besonders hervorzuheben sind Verbindungen der Formel (I), worin R. R und R6 Wasserstoff, X Carbonyl. R2 gegebenenfalls durch Hydroxy oder Methoxy substituiertes Niederalkyl oder gegebenenfalls durch Hydroxy, Methoxy, Methyl, Äthyl oder Halogen substituiertes Phenyl. R3 und R 9 Wasserstoff oder Methyl. R, und Ru Niederalkyl oder Wasserstoff. mit der Massgabe, dass mindestens einer der Reste R7'Rg und R für Niederalkyl steht, R, Methyl oder Äthyl. RIO'Ru und R 12 Carboxy, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl und Ru auch Wasserstoff bedeuten.
Von diesen Verbindungen seien als bevorzugt diejenigen genannt, worin R, für Niederalkyl, insbesondere Methyl. und Ru four Wasserstoff stehen.
Die in allererster Linie bevorzugten Verbindungen sind die in den Beispielen genannten und deren Homologe.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) und der Salze von solchen Verbindungen mit salzbildenden Gruppen ist dadurch gekennzeichnet, dass man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der Formel
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diteR, R bzw. R oder für eine leicht abspaltbare Hydroxyschutzgruppe stehen, mit einer Verbindung der Formel
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der Massgabe, dass in diesen Resten vorhandene Carboxy-, und, wenn erwünscht, freie Hydroxygruppen durch leicht abspaltbare Schutzgruppen geschützt sind. und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abspaltet.
Eine reaktionsfähige veresterte Hydroxygruppe ist insbesondere eine mit einer starken anorganischen oder organischen Säure veresterte Hydroxygruppe, in erster Linie eine solche, die mit einer Halogenwasserstoffsäure, wie Chlor-, Brom- oder Jodwasserstoffsäure, verestert ist.
Leicht abspaltbare Schutzgruppen sind solche, die aus der Peptid- bzw. Zuckerchemie bekannt sind. Für Carboxygruppen sollen insbesondere tert. Butyl. Benzyl oder Benzhydryl und für Hydroxygruppen insbesondere Acylreste, z. B. Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste. wie Benzoyl. und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste, wie Benzyloxycarbonyl oder Niederalkoxycarbonyl. oder Alkyl. insbesondere tert. Butyl, gegebenenfalls durch Nitro, Niederalkoxy oder Halogen substituiertes Benzyl oder Tetrahydropyranyl oder gegebenenfalls substituierte Alkylidenreste, die die Sauerstoffatome in 4-und 6-Stellung des Glukoseteils verbinden, genannt werden.
Solche Alkylidenreste sind insbesondere ein Niederalkyliden-, in erster Linie der Äthyliden-, Isopropyliden- oder Propylidenrest, oder auch ein gegebenenfalls substituierter, vorzugsweise in p-Stellung substituierter Benzylidenrest.
Diese Schutzgruppen können in an sich bekannter Weise abgespalten werden. So kann man sie hydrogenolytisch z. B. mit Wasserstoff in Gegenwart eines Edelmetall-, wie Palladium- oder Platinkatalysators oder durch saure Hydrolyse entfernen.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des obengenannten Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet, dass man
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stoff oder eine leicht abspaltbare Schutzgruppe und R2 Niederalkyl bedeuten, mit einer Verbindung der Formel (III) umsetzt, worin Ra Wasserstoff oder Methyl, R50 Methyl oder Äthyl. R9 Wasserstoff. Ri, Carbamoyl. R Wasserstoff und RO.
2 gegebenenfalls durch eine leicht abspaltbare Schutzgruppe geschütztes Carboxy bedeuten, mit der Massgabe, dass in den Verbindungen der Formeln (II) und (III) mindestens einer der Reste R7 und R13 von Wasserstoff verschieden ist, und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abspaltet, c) eine Verbindung der Formel (II), worin Ro, R46 und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine leicht abspaltbare Schutz gruppe, R. Methyl und R Wasserstoff bedeuten, mit einer Verbindung der Formel (III) umsetzt, worin R Wasserstoff oder Methyl, R, Methyl oder Äthyl, R Wasserstoff, Methyl oder Äthyl, Rg Wasserstoff. Rj, Carbamoyl, R Wasserstoff und R'.
2 gegebenen- falls durch eine leicht abspaltbare Schutzgruppe geschütztes Carboxy bedeuten, und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abspaltet oder d) eine Verbindung der Formel (II), worin R13 für Wasserstoff steht, mit einer Verbindung der Formel (III) umsetzt, worin R, Niederalkyl bedeutet, wobei man bei diesen Verfahren bevorzugterweise eine Verbindung der Formel (III) einsetzt, worin R, für Methyl steht.
Die verwendeten Ausgangsstoffe sind bekannt oder lassen sich in an sich bekannter Weise herstellen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Muramylpeptide der Formel (I) können sowohl als Zwischenprodukte wie auch als Endstoffe verwendet werden. Beispielsweise dienen sie zur Herstellung der
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79100513. 5 (Publikationsnr. 0003833)Muramylpeptid-Antigen-Konjugate.
Die Muramylpeptide der Formel (I) als solche sind pharmakologisch wirksam und können als Arzneimittelwirkstoffe zur Behandlung des menschlichen und tierischen Körpers verwendet werden. Insbesondere sind sie immunomodulatorisch wirksam, wie unter anderem mit den nachstehend beschriebenen Versuchsanordnungen gezeigt werden kann :
1.
Potenzierung der zellulären Immunität in vivo : Steigerung der Spättyp-Überempfindlichkeit gegen Ovalbumin beim Meerschweinchen
Pirbright Meerschweinchen werden am Tag 0 mit 10 mg Ovalbumin in komplettem Freud'schem Adjuvans durch Injektion von je 0, 1 ml eines Antigen-Adjuvans-Gemisches in die beiden Hinterpfoten
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immunisiert. 4 Wochen später werden Hautreaktionen durch intrakutane Injektion von 100 pg Oval- bumin in 0. 1 ml gepufferter physiologischer Salzlösung ausgelöst und auf Grund des 24 h danach an Hand der Erythemfläche und der Hautdickenzunahme berechneten Reaktionsvolumens quantifiziert.
Die nach 24 h (Spättypreaktion) beobachtete antigenspezifische Zunahme des Reaktionsvolumens gilt als ein Mass für zellvermittelte Immunität. Ovalbumin ist ein zu schwaches Immunogen, um für sich allein oder in einer Wasserölemulsion mit inkomplettem Freud 1 schen Adjuvans (10 Tei- le Ovalbuminlösung in 0, 9% NaCl gemischt mit 6, 5 Teilen Bayol F und 1,5 Teilen Arlacel A) eine
Spättypreaktion zu induzieren, sondern muss für eine effektive Immunisierung in komplettem Adju- vans, dem Mykobakterien zugesetzt werden (5 mg abgetötetes und lyophilisiertes M butyricum/10 ml Bayol F/Arlacel A) appliziert werden. Zum Nachweis der immunpotenzierenden Wirkung von Prüfsubstanzen können diese nun an Stelle der Mykobakterien in Dosen von 10 bis 100 pg dem Anti- gen-Ölgemisch beigemengt werden.
Die neuen Glukosaminpeptide sind in der Lage. den Effekt der Mykobakterien in der be- schriebenen Versuchsanordnung nachzuahmen und ihn quantitativ zu übertreffen.
Eine signifikante Potenzierung der Spättypreaktivität gegen Ovalbumin kann auch dadurch erreicht werden, dass Verbindungen der beschriebenen Art nicht ins Antigen-Ölgemisch inkorporiert, sondern in Dosen von 10 bis 100 pg/Tier während einiger Tage nach der Immunisierung (z. B. am Tag 0, 1, 2, 5. 6 und 7) in Kochsalzlösung subkutan verabreicht werden.
Damit wird gezeigt, dass Verbindungen der beschriebenen Art zelluläre Immunität erheblich zu steigern vermögen, u. zw. sowohl in Mischung mit dem Antigen selber (Adjuvanseffekt im engeren Sinne), als auch bei zeitlich und örtlich von der Antigeninjektion getrennter Zufuhr (systemische Immunpotenzierung).
2. Potenzierung der humoralen Immunität in vivo : Steigerung der Antikörperproduktion gegen bovines Serumalbumin (BSA) bei der Maus
NMRI Mäuse werden durch intraperitoneale (i. p.) Injektion von 10 pg präzipitatfreiem BSA am Tag 0 immunisiert. 9. 15 und 29 Tage später werden Serumproben entnommen und auf ihren Gehalt an anti-BSA-Antikörpern mit einer passiven Haemagglutinationstechnik untersucht. In der verwendeten Dosis ist lösliches BSA für die Empfängertiere subimmunogen. d. h. es vermag keine oder nur eine ganz geringfügige Produktion von Antikörpern auszulösen. Zusätzliche Behandlung der Mäuse mit gewissen immunpotenzierenden Stoffen vor oder nach der Antigengabe führt zu einem Anstieg der Antikörpertiter im Serum.
Der Effekt der Behandlung wird durch den erreichten Scorewert, d. h. durch die Summe der log Titerdifferenzen an den drei Blutungstagen ausgedrückt.
Verbindungen der Erfindung sind in der Lage, bei intraperitonealer oder subkutaner (s. c.) Applikation von 100 bis 300 mg/kg/Tier an fünf aufeinanderfolgenden Tagen (Tag 0 bis 4) nach Immunisierung mit BSA die Antikörperproduktion gegen BSA signifikant zu steigern.
Der immunstimulierende Effekt der genannten Verbindungen ist im Gegensatz zu dem anderer bakterieller Immunoleptica (z. B. LPS auf E. coli) antigenabhängig : Injektion der neuen Verbindungen hat nur in BSA-immunisierten, nicht aber in nichtimmunisierten Mäusen, eine Erhöhung der anti-BSA-Titer zur Folge. Bemerkenswerterweise ist die s. c. Gabe der genannten Verbindungen ebenso effektiv wie die i. p. Applikation. d. h. die beobachtete immunpotenzierende Wirkung ist systemisch und hängt nicht davon ab, dass das Stimulans über die gleiche Route wie das Antigen bzw. mit dem Antigen gemischt verabreicht werden muss, wie dies bei klassischen Adjuvanten der Fall ist.
Durch die geschilderten Versuche wird gezeigt, dass Verbindungen der beschriebenen Art auch die humorale Immunität spezifisch zu steigern vermögen, dass sie die immunologische Reizbeantwortung verbessern, und dass ihre immunpotenzierenden Effekte auf einer systemischen Aktivierung des Immunapparates beruhen.
3. Potenzierung der humoralen Immunität in vitro : T-Zell-substituierender Effekt bei der
Antikörperantwort von Mäusemilzzellen gegen Schaferythrocyten (SE)
Für die Induktion einer Antikörperantwort werden in vielen Fällen aus dem Thymus stammende Lymphocyten (T-Zellen) benötigt. Diese Zellen kooperieren mit den Vorläufern antikörperbildender Lymphocyten (B-Zellen) und helfen ihnen, auf Stimulierung mit sogenannten T-abhängigen Antigenen mit Proliferation, Differenzierung und Antikörpersynthese zu reagieren. Milz-
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zellensuspensionen kongenital athymischer nu/nu Mäuse enthalten keine funktionellen T-Zellen und vermögen z. B. in vitro in Gegenwart von SE keine anti-SE-Antikörper zu bilden.
Die Verbindungen der Erfindung sind überraschenderweise in der Lage, T-Zellen in solchen Kulturen funktionell zu ersetzen und eine Antikörperantwort gegen SE zu ermöglichen. Zusatz dieser Stoffe zu nu/nu Milzzellenkulturen in Gegenwart von SE führt innert 4 Tagen zu einem erheblichen Anstieg der Zahl antikörperbildender Zellen. Die Befunde zeigen. dass die genannten Verbindungen die humorale Antikörperbildung in vitro zu steigern und einen Defekt des T-Zell-Systems zu kompensieren vermögen.
4. Selektive Mitogenität für B-Zellen : Proliferationsfördernder Effekt in B-Lymphocyten-Kulturen
Suspensionen hoch angereicherter B-Lymphocyten (Lymphknotenzellen kongenital athymischer nu/nu Mäuse), sowie weitgehend reiner unreifer und reifer T-Lymphocyten (Thymuszellen bzw. cortisonresistente, d. h. 48 h nach einer Cortisoninjektion persistierende Thymuszellen von Balb/c-Mäusen) werden in Gegenwart der Prüfsubstanzen während drei Tagen inkubiert. Die Inkorporation von H 3 -Thymidin in die Lymphocyten während der letzten 18 h der Kulturperiode gilt als Mass für die Proliferationsaktivität.
Die neuen Verbindungen sind für B-Lymphocyten (d. h. für die Vorläufer der antikörperbildenden Zellen), nicht aber für T-Lymphocyten mitogen. Sie sind somit in der Lage, die Proliferation von Lymphocyten anzuregen, die an der humoralen Immunantwort beteiligt sind.
5. Verträglichkeit
Gegenüber den zum Stand der Technik gehörenden Muramylpeptiden der Formel (I), worin R" R 9 und Ru Wasserstoff bedeuten, zeichnen sich die neuen Verbindungen der Formel (I), insbe-
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wendbarkeit ohne ständige ärztliche Kontrolle gewährleisten zu können. Insbesondere könnte die pyrogene Nebenwirkung bei ungünstigen Umständen zu einem thermischen Schock führen, weshalb bestimmte Verabreichungsformen, wie die intravenöse Gabe, ausser Betracht bleiben müssen. Die erfindungsgemässen Muramylpeptide sind auch bei Applikation von 5mal 300 mg/kg i. p. an Mäusen nicht toxisch.
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einer hohen Dosis. wie 10 mg/kg, von N-Acetylmuramyl-L- (N-methyl)-a-aminobutyryl-D-isoglutamin kein pyrogener Effekt feststellbar.
Im Lichte des Standes der Technik ist die hohe Adjuvansaktivität der neuen Verbindungen im Vergleich zu ihrer stark herabgesetzten pyrogenen Wirkung überraschend, da nach den bisherigen Untersuchungen eine hohe Adjuvansaktivität stets auch mit einer hohen Pyrogenität gekoppelt
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Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen haben die Fähigkeit, einerseits bei Mischung mit einem Antigen dessen Immunogenität zu erhöhen, anderseits bei systemischer Applikation die immunologische Reaktivität des behandelten Organismus zu steigern. Dabei sind die genannten Stoffe in der Lage, sowohl die zelluläre wie die humorale Immunität zu fördern und die für die Antikörperbildung verantwortlichen Lymphocyten zu aktivieren.
Die neuen Verbindungen können somit als Adjuvantien in Mischung mit Impfstoffen dazu benutzt werden, den Impferfolg zu verbessern und den durch humorale Antikörper und/oder zelluläre Immunität vermittelten Infektionsschutz gegenüber bakteriellen, viralen oder parasitären Erregern zu verbessern.
Schliesslich eignen sich die beschriebenen Verbindungen in Mischung mit verschiedensten Antigenen als Adjuvantien bei der experimentellen und industriellen Herstellung von Antiseren für Therapie und Diagnostik und bei der Induktion von immunologisch aktivierten Lymphocytenpopulationen für Zelltransferverfahren.
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<tb>
B.C19H32N4O11-1,2 <SEP> H2O <SEP> ber. <SEP> C <SEP> 44, <SEP> 36 <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 78 <SEP> N <SEP> 10, <SEP> 89 <SEP>
<tb> (514, <SEP> 46) <SEP> gef. <SEP> C <SEP> 44, <SEP> 32 <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 75 <SEP> N <SEP> 10, <SEP> 79. <SEP>
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Den als Ausgangsmaterial dienenden Iodacetyl-L- (N-methyl)-alanyl-D-isoglutamin-γ-benzylester erhält man durch Verknüpfung von Iodessigsäure und N-Methylalanyl-D-isoglutamin-Y-benzylester nach dem Carbodiimid-Verfahren.
Beispiel 2 : In analoger Weise erhält man
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{ [ (D-1-carbamoyl-3-carboxy-propyl)-carbamoylmethyl] -N-methyl-carbamoyl-Rf = 0, 37 (Acetonitril/Wasser = 3/1), 2-Acetylamino-3-O- (D-1-[(D-1-carbamoyl-3-carboxy-propyl)-carbamoylmethyl]-N-methyl-carbamoyl- -äthyl) -2-desoxy-D-glucose.
Rf = 0, 31 (Acetonitril/Wasser = 3/1).
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.