AT346285B - Verfahren zur aktivitaetsbestimmung eines enzyms und vorrichtung zum durchfuehren dieses verfahrens - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Aktivität von Enzymen wird üblicherweise durch Messen des Verbrauchs eines Substrats oder der erzeugen Menge eines Reaktionsproduktes bestimmt   (vgl. I1UllmalIDs Enzyldopädie   der Technischen Chemie, 3.   Aufl., Bd.   7, Seiten 419 bis 436), wobei nach Ablauf einer bestimmten Umsetzungsdauer die verbrauchte Menge an Substrat und/oder die erzeugte Menge an Reaktionsprodukt bestimmt werden kann. Da unter dem Einfluss von Enzymen ablaufende Reaktionen vielfach erst nach Ablauf einer bestimmten Zeit, der sogenannten Anlaufphase mit einer Geschwindigkeit ablaufen, die der für das Enzym geltenden Reaktionsordnung entsprechen, werden die Messungen der Konzentration des Reaktionsgemisches an Substrat bzw. an Reaktionsprodukt erst nach Ablauf der Anlaufphase vorgenommen.

   Hiebei wird meist so vorgegangen, dass die enzymhaltige Probe mit einem geeigneten Substrat und den erforderlichen Hilfsstoffen, darunter in der Regel einem Puffer, versetzt wird und im erhaltenen Reaktionsgemisch die Konzentration des Substrats oder des Reaktionsproduktes wiederholt nach Ablauf genau bestimmter Reaktionszeiten gemessen und aus den Messwerten die Aktivität des Enzyms berechnet wird. 



   Die bisher   gebräuchlichenMethoden   zum Bestimmen der Aktivität eines Enzyms sind nun insoferne nicht völlig zufriedenstellend, als sie nur chargenweise durchgeführt werden können und in aus dem Reaktionsgemisch gezogenen Proben das Enzym inaktiviert und aus der gezogenen Probe bei der Messung störende, meist hochmolekulare Stoffe, abgetrennt werden müssen, um tatsächlich dem Zeitpunkt der Probenahme entsprechende Messwerte erhalten zu können. 



   Mit dem erfindungsgemässen Verfahren wird nun bezweckt, die oben erwähnten Mängel bekannter Verfahren zum Bestimmen der Aktivität eines Enzyms zu vermeiden. Dementsprechend ist das erfindungsgemässe Verfahren zum Bestimmen der Aktivität eines Enzyms durch Messen der Konzentration eines bei der enzymatischenReaktion entstehenden oder umsetzbaren Bestandteiles in einem dieses Enzym enthaltenden flüssigen Reaktionsgemisch an zumindest zwei aufeinanderfolgenden und nach der Anlaufphase liegenden Zeitpunkten und anschliessendes rechnerisches Auswerten der Messergebnisse unter Zugrundelegung der unter den herrschenden Reaktionsbedingungen für dieses Enzym geltenden   Reaktionsgeschwindigkeitsgleichung,   gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet,

   dass zu den Zeitpunkten der Messung ein Teil der Reaktionslösung über ein Ultrafilter abgetrennt und die Konzentration des bei der enzymatischen Reaktion entstehenden bzw. umsetzbaren Stoffes im Ultrafiltrat bestimmt wird. Da für verschiedenste Trennaufgaben geeignete Membranen für Ultrafilter ohne weiteres erhältlich sind, kann im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens ein Ultrafilter eingesetzt werden, dessen Filtermembran in verlässlicher Weise ermöglicht, aus dem Ultrafilter ein kein Enzym und keine sonstigen störenden hochmolekularen Stoffe enthaltendes Filtrat abzuziehen, in welchem die Konzentration des Substrats oder eines bei der   enzymatischen R eaktion entstandenen Reaktionsproduktes wäh-   rend der für die Messung erforderlichen Zeit praktisch keiner Änderung unterworfen ist.

   Sofern die für eine Messung aus dem Reaktionsgemisch über das Ultrafilter abgezogene Menge an Reaktionsgemisch relativ zur Menge des Reaktionsgemisches klein ist, erfährt die Konzentration an Enzym bzw. an Substrat bzw. an Reaktionsprodukt des Reaktionsgemisches keine praktisch erfassbare Änderung, so dass der bei der folgenden Probenahme über ein Ultrafilter erhaltene Messwert unverändert mit dem zuvor erhaltenen Messwert zur rechnerischen Bestimmung der Enzymaktivität verwendet werden kann.

   Falls die Menge des Ultrafiltrats relativ zur ursprünglich vorliegenden Menge   anReaktionsgemisch   gross ist und die Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration des Enzyms im Reaktionsgemisch abhängt, ist es   zweckmässig,   das spätere Auswerten der erhaltenen Messergebnisse dadurch zu vereinfachen, dass gemäss der Erfindung nach jedmaligem Abtrennen von Ultrafiltrat aus dem Reaktionsgemisch der verbleibende Teil des Reaktionsgemisches durch Zusetzen einer 
 EMI1.1 
 dert wird, da naturgemäss hiebei vom Reaktionsgemisch ein grosser Teil in Form eines Ultrafiltrats abgezweigt wird und die in später   folgenden Ultrafiltern   ankommende Menge an Reaktionsgemisch zu gering werden würde. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann im Prinzip chargenweise   inReaktionsgefässen durchgeführt   werden, in deren Wandung ein Ultrafilter eingebaut ist, wobei aus dem Reaktionsgefäss dadurch Probelösung in Form eines Ultrafiltrats entnommen werden kann, dass das im Reaktionsgefäss befindliche Reaktionsgemisch periodisch unter Druck gesetzt wird. Das erfindungsgemässe Verfahren wird jedoch vorzugsweise als Durchlaufverfahren durchgeführt. Eine hiezu besonders geeignete Ausführungsform einer Vorrichtung zum Durchführen des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass zwei Durchflussultrafilter in Reihe geschaltet sind und eine Pumpe zum Fördern des Reaktionsgemisches durch diese Serienschaltung sowie nach dem letzten   Durchflussultrafilter   ein Druckhalteventil vorgesehen sind.

   Durch das Druckhalteventil nach dem letzten Ultrafilter kann der Druck vor dem Druckhalteventil auf einen solchen Wert eingestellt werden, dass Ultrafiltrat aus den Ultrafiltern mit der   gewünschten Geschwindigkeit abfliesst. Zweckmässig   wird hiebei durch das Druckhalteventil der Druck auf einen solchen Wert eingestellt, dass aus dem die Ultrafilter durchströmenden Reaktionsgemisch etwa ein Zehntel seines Volumens an Ultrafiltrat abgezweigt wird. 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 



     Zweckmässig   ist in einer   erfindungsgemässen   Vorrichtung die Anordnung so getroffen, dass für die Lösung des Enzyms, für die Lösung des Substrats und für die Lösung der Hilfsstoffe je eine Förderpumpe, insbesondere eine Peristaltikpumpe, vorgesehen ist und die Länge der von der Mischstelle für die einzelnen Lösungen zum ersten Durchflussultrafilter führenden Leitungen so bemessen ist, dass das Reaktionsgemisch erstnach Ablauf der Anlaufphase zum ersten Durchflussultrafilter gelangt.

   In diesem Falle kann das erfindungsgemässe Verfahren praktisch kontinuierlich durchgeführt werden, wobei auch die Möglichkeit besteht, im Leitungssystem für das Reaktionsgemisch durch ein amAustrittsende   der Vorrichtungvorgesehenes Drosselventil   den Druck im Leitungssystem in dem Zeitabstand zwischen zwei Messzeitpunkten entsprechenden Zeitabständen periodisch zu erhöhen, um aus den Ultrafilter Ultrafiltrat abzuziehen. 



   Beim praktischenArbeiten nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Probelösung mit geeigneten Substraten und Hilfsstoffen versetzt durch eine Leitung aus inertem Material gepumpt. Nach einer Strecke, zu deren Zurücklegung sicher mehr als die maximaleAnlaufphase erforderlich ist, gelangt die Flüssigkeit in eine der bekannten   Durchfluss-Ultrafiltrationszellen.   Hierin wird ein Teil des Reaktionsgemisches mit den 
 EMI2.1 
 erforderlich ist. Danach gelangt die Lösung in eine zweite Ultrafiltrationszelle, in der abermals ein Teil des Reaktionsgemisches abgetrennt wird. Zur Kontrolle kann dieser Vorgang bei Bedarf wiederholt werden.

   In den Ultrafiltraten wird die Konzentration des Substrats oder eines Reaktionsproduktes gemessen, die Messung kann dabei an den verschiedenen Filtraten parallel in mehreren Messanordnungen oder nacheinander in einer einzigen Messanordnung durchgeführt werden. Bedingt durch die Art der Abtrennung befinden sich in diesen Teilproben weder Enzyme, noch sonstige hochmolekulare Stoffe, welche die gegebenenfalls abermals enzymatisch durchzuführende Bestimmung der Substratkonzentration bzw. der Konzentration des Reaktionsproduktes beeinflussen könnten. 



   Nachfolgend wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispieles für die GPT-Aktivitätsbestimmung näher erläutert :
Lösungen : 
A : 0, 1M Phosphatpuffer   (pg   : 7, 4)
1 M L-Alanin   B : 0, 2M a-Ketoglutarat   
C : Probe   (= Serum)   
Fördermengen : 
Puffer : 3 ml/min
Serum : 0,3 ml/min   o-Ketoglutarat : 0,   3 ml/min
60 s Ansaugdauer für jede Probe
3 Schlauchpumpen : 3 bzw. 2 x 0,3 ml/min 
Durchführung : 
Nach dem Mischen und Segmentieren durch Luftblasen wird das Gemisch durch ein auf   250C   thermostatisiertes Reaktionsrohr geführt (3 min   Durchflussdauer).   



   Reaktion : 
 EMI2.2 
 
 EMI2.3 
 sigkeitsstrom anschliessend durch ein weiteres, ebenfalls auf   25 CthermostatisiertesDurchflussreaktionsrohr   mit abermals 3 min Verweildauer geführt. Danach werden daraus wieder 0,3 ml/min Ultrafiltrat gewonnen. 



  Die Ultrafiltrate werden abwechselnd für jeweils 30 s dem   eigentlichen Messkreis zugeführt   bzw. verworfen. 



   Reaktion im   Enzymmesskreis :   
 EMI2.4 
 
T) TTLösungen : D   : 0, IM Phosphatpuffer (pH : 7, 4)   E : 2,5mM NADH2 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
 EMI3.1