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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines über virushemmende Aktivität verfügenden Präparats. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung von Präparaten, welche-werden sie Menschen oder Tieren verabreicht-in der lebenden Zelle und dem Organismus Virusresistenz hervorrufen und/oder die Bildung natürlicher virushemmender Abwehrstoffe induzieren.
Es ist bekannt, dass die Widerstandsfähigkeit lebender Zellen und Gewebe gegen Viren nicht nur durch Viren, sondern auch durch natürliche oder synthetische verbindungen induziert werden kann. Um eine Widerstandsfähigkeit gegen Viren anzuregen, können natürliche Ribonucleinsäuren, z. B. Virusnucleinsäuren (G. E. W. Wolstonhome and Mc O'Connor : Interferon, London 1967, Little and Brown), von Pilzen stammende Ribonucleinsäuren (M. R. Hilleman : J. Infect. Diseases 121, [1970] S. 196) sowie gewisse Stoffe pflanzlichen Ursprungs, z. B. Phythohaemagglutinin und Polysaccharide (N. B. Finter : Interferons, Philadelphia, [1966], W. B. Saunders Co.) verwendet werden.
Als die aktivsten Induktoren haben sich die Polyribonucleinsäuren, u. zw. sowohl die natürlichen als auch die synthetischen, erwiesen (M. Harris : Science 170, [1970], S. 1068). Die einfachen (ohne Komplexbildung entstandenen) Gemische, Komplexe, Hybridverbindungen (bei denen z. B. die eine Kette des Komplexes eine Desoxyribonucleinsäure und die andere eine Ribonucleinsäure sein kann), ferner die modifizierten Derivate (z. B. schwefelhaltige Nucleotide enthaltende Nucleinsäuren) und die (durch Einführen modifizierter Nucleotide in das Molekül vor der Polymerisation hergestellten) Analogen der einzelnen Induktoren verfügen ebenfalls über eine die Bildung der Virusabwehrstoffe induzierende Wirkung.
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B.DBR-Patentschrift Nr. 1935667), Mengovirus (R. Falcoff u. E. Falcoff : Biochim.
Biophys. Acta 182, [1969], S. 501), Vaccinia-Virus (C. Colby und P. Duesberg : Nature 222, [1969], S. 940), T 4 phag (W. J. Klein- schmidt u. a. : Nature 228, [1970], S. 27).
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einfache Gemische oder Komplexe von Homopolyribonucleotiden wie Poly-rI, Poly-rC, Poly-rA, Poly-rU usw.
(M. R. Hilleman : J. Infect Diseases 121, [1970], S. 96) oder beispielsweise Poly-rI+ Poly-rA, Poly-rC + PolyrG usw., femer die mit Copolyribonucleotiden gebildeten Komplexe und Mischungen von Homoribonucleoti-
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tide.
Die synthetischen polynuc1eotide können ferner Homopolydesoxyribonucleotide wie z. B. Poly-dT und Poly-dC, Copolydesoxyribonucleotide wie Poly-dAT sowie die Komplexe, Hybridverbindungen oder Mischungen sein, die diese Verbindungen miteinander oder mit Polyribonucleotiden bilden, wie z. B. Poly-dI : PolydC, Poly-rI : Poly-dC usw. (J. Vilcek u. a. : J. Virology 2, [1968] S. 648 ; belgische Patentschrift Nr. 744. 528), ebenso die mit nucleotidbasenhaltigen synthetischen Polymeren gebildeten Hybride der Polynucleotide, wie z. B. Poly-rI : Polyvinylcytosin a. Pitha und M. Pitha : Science 172, [1971], S. 1146).
Die modifizierten Derivate und Analoge können Ribo- oder Desoxyribonucleotide natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein, die durch Alkylierung, Allylierung, Acylierung, Desaminierung, Oxydation, Halogenierung usw. im Zuckerteil (belgische Patentschrift Nr. 757.653) oder durch beispielsweise Schwefeleinbau im Phosphatteil substituiert sind (De Clercq u. a. : Virology 42, [1970], S. 421).
Weiterhin ist bekannt, dass die Wirkung der Induktoren vom Nucleinsäuretyp durch die Gegenwart gewisser Polykationen wesentlich gesteigert wird. So üben z. B. Polylysin (f. B. Iodineu. a. : j. Virology 7, [1971], S. 595 ; J. M. Rice u. a. : Appl. Micorbiol. 22, [1971], S. 380), po1yomithin und Polyarginin eine aktivierende Wirkung auf die Induktoren aus. Das am eingehendsten untersuchte und am häufigsten angewendete Poly-
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a. :Proc. N.. A. S. US 58, [1967], S. 1004).
In der veröffentlichten franz. Patentschrift Nr. 2. 092. 875 ist die Herstellung einer Komplexverbindung beschrieben, die eine höhere Interferoninduktion hervorruft als die einzelnen, nucleinsäureartigen Komponenten. Gemäss der Beschreibung wird der Komplex hergestellt, indem man eine aus einer, zwei oder drei Spiralen bestehende, im Molekül über negative oder anionische Punkte verfügende Nucleinsäure oder eines ihrer Analogen in verdünnter wässeriger Lösung mit einem über positive oder kationische Molekülstellen verfügenden Polykation zur Reaktion bringt.
Von den Polykationen sind in der Patentschrift folgende vier Stoffgruppen erwähnt :
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B.quaternären Salze dieser Polykationen, wobei die quatemierenden Substituenten heterocyclische Ringe, Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 5 C-Atomen oder aus diesen gebildete Derivate sein können, die einen hydrophilen Substituenten (Carboxygruppe, Sulfonsäuregruppe usw.) sowie eine Carbonsäureestergruppe enthalten (brit.
Patentschrift Nr. 834,227). c) Herstellung von polykationischen Polypeptiden durch Reaktion von Anhydropolyasparginsäure mit Äthylendiamin, Putrescin oder einem in Nf-Stellung mono-oder dialkylierten Diamin sowie mit Gemischen dieser Verbindungen (ungarische Patentschriften Nr. 147363 und Nr. 147566) und Herstellungderquatemären Derivate der genannten Verbindungen, wobei die quatemierenden Gruppen substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Aralkylgruppen, vorzugsweise Methyl-, Äthyl-, Hydroxyäthyl-, J3enzyl- oder p-Chlorbenzylgruppen sind (ungarische Patentschrift Nr. 150576). d) 3-Aminopropylamide von ct-Poly- (L oder D)-asparginsäure, ss-Poly-(L oder D)-asparginsäure oder α-,ss-(L oder D)-asparginsäure (Nagy-Kovacs, Kovacs, Pisano, Shidlovsky ; J. Med.
Chem. 10, [1967], S. 904). e) Herstellung von polykationischen Polypeptiden durch Reaktion von a-po1y-L-glutaminsäure-y -estern, Polyglutaminanhydrid oder y-Poly-D-glutaminsäure-Derivaten mit Äthylendiamin, Putrescin, in NI-Stellung mono- oder dialkylierten Diaminen oder deren Gemischen, sowie die Herstellung der Salze (ungarischen
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(ungarische Patentschrift Nr. 150 756). f) Herstellung von Polykationen durch Reaktion von o-Poly-L-glutaminsäure-y-estem oder Glutaminsäure- - y-ester und andere Aminosäuren (z. B. Gly, Leu) enthaltenden Copolymeren mit primär-tertiären Diaminen sowie die Herstellung der verschiedenen quaternären Derivate dieser Polykationen (brit.
Patentschrift Nr. 834, 227).
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Einheiten noch Glutanyl- und Glutaminsäure-γ-estergruppen im Molekül enthalten ; ferner durch 2-Amino- äthylamin modifizierte polykationische Polyglutaminsäurederivate, die ausser den oben erwähnten Einheiten im Molekül noch durch zweifach acylierteÄthylendiamineinheiten gebildete"Kreuzbindungen"enthalten (A. ôtai : Acta Chim.
Hung : 54, [1967], S. 65). h) Derivate von mittels 2-Dimethylaminoäthylamin modifizierter a-Poly-L-glutaminsäure, die im Molekül ausser den durch das Amin modifizierten Einheiten und ausser Glutamyl- und/oder Glutamylestergruppen noch mittels Äthanolamin und/oder Cysteamin und/oder Histamin zuCarboxamidgruppen umgesetzte Einheiten
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i) Derivate von in der Carboxylgruppe mit Äthylendiamin und/oder Putrescin und/oder einem in NI-stel- lung mono- oder dialkyliertem Diamin modifizierter a-Amino-DL-adipinsäure und die verschiedenen quaternären Verbindungen dieser Derivate (ungarische Patentschrift Nr. 150576). j) N-substituierte und quatemierte Derivate des Polylysins (brit. Patentschrift Nr. 834,227). k) Lysin und andere Aminosäuren (z.
B. Alanin) enthaltende Copolypeptide und ihre quaternären Derivate (brit. Patentschrift Nr. 834, 227).
Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von Komplexen mit gesteigerter virushemmender Wirkung. Das Verfahren besteht darin, dass man an sich bekannte, zur Induktion der Produktion von natürlichen virushemmenden Stoffen in der lebenden Zelle befähigte und/oder selbst über virushemmende Aktivität verfügende Substanzen in einem wässerigen Medium mit ganz oder teilweise aus ct-Aminosäureein- heiten der allgemeinen Formel
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wobei
A eine Gruppe der Formel
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B eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, Ri und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, oder zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen 5 bis 6 gliedrigen, gegebenenfallsnoch ein weite- res Heteroatom enthaltenden heterocyclischen Ring bedeuten,
R 3 für eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, R 4. für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen steht und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 bedeutet. bzw. falls A eine Gruppe der Formel
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bedeutet, auch 0 sein kannaufgebauten synthetischen polykationischen Polypeptiden oder mit den Säureadditionssalzen oder quaternären Ammoniumsalzen dieser Polypeptide versetzt.
Die virushemmende und/oder die Bildung virushemmender Stoffe hervorrufende Substanz, der Induktor, wird in einem wässerigen Medium mit dem synthetischen polykationischen Polypeptid (im folgenden : Aktivator) versetzt, wobei die Lösungen vorzugsweise mit physiologischer Kochsalzlösung bereitet werden.
Das Produkt des Verfahrens wird also in Form einer wässerigen Lösung erhalten, die den gebildeten Komplex und eventuell noch weitere Stoffe, so z. B. einen Überschuss der einen oder der ändern Komponente des Komplexes und/oder Kochsalz oder gegebenenfalls noch andere, an sich bekannte pharmazeutische Hilfsstoffe enthält.
Die erhaltenen Lösungen können unmittelbar für therapeutische Zwecke verwendet werden ; sie können mittels Sterilfiltration sterilisiert werden. Gewünschtenfalls kann das Präparat durch Gefriertrocknung der Lösung in fester Form erhalten werden.
Die Herstellung der Komplexe und die Anwendung der Präparate, die diese Komplexe enthalten, wird im folgenden ausfuhrlich beschrieben.
Wie bereits ausgeführt, enthalten die erfindungsgemässen Komplexe zwei Komponenten : einen Induktor oder das Gemisch mehrerer Induktoren und einen Aktivator oder das Gemisch mehrerer Aktivatoren. Die die erfindungsgemäss hergestellten Komplexe enthaltenden (festen oder flüssigen) Präparate können ausserdem noch
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Beschreibung der einzelnen Aktivatoren, die zu ein und demselben Typ gehören. Der erste Zahlenwert ist die reduzierte Viskosität in Deciliter/g, gemessen in Dichloressigsäure bei Konzentrationen von 0, 3. Der zweite Wert gibt den Substitutionsgrad der charakteristischen kationischen Gruppen in Prozent an (Beispiel-A./0. 89 ; 93%).
Für die verschiedenen Aktivatortypen werden folgende Zeichen verwendet :
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<tb>
<tb> A <SEP> = <SEP> Polyglutaminsäure <SEP> derivate, <SEP> deren <SEP> freie <SEP> Carboxylgruppen <SEP> mit <SEP> 2-Dimethylaminoäthylamin <SEP> in <SEP> verschiedenem <SEP> Grade <SEP> zu <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzt <SEP> sind. <SEP> Der <SEP> Grad <SEP> der <SEP> Umsetzung <SEP> ist <SEP> in <SEP> Klammem <SEP> angegeben.
<tb>
AZ <SEP> Polyglutaminsäure-Derivate, <SEP> deren <SEP> freie <SEP> Carboxylgruppen <SEP> mit2-Diäthylaminoäthylaminin <SEP> dem
<tb> in <SEP> Klammern <SEP> angegebenen <SEP> Masse <SEP> zu <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzt <SEP> sind.
<tb>
As <SEP> = <SEP> jodide <SEP> von <SEP> Polyglutaminsäure-Derivaten, <SEP> bei <SEP> denen <SEP> die <SEP> zu <SEP> substituierten <SEP> Carboxamidgruppen
<tb> umgesetzten <SEP> Carboxylgruppen <SEP> 2-Trimethylammoniumäthylgruppen <SEP> in <SEP> dem <SEP> angegebenen <SEP> Verhältnis <SEP> enthalten.
<tb>
A <SEP> = <SEP> Chloride <SEP> von <SEP> Derivaten <SEP> der <SEP> Polyglutaminsäure, <SEP> bei <SEP> denen <SEP> die <SEP> zu <SEP> substituierten <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzten <SEP> Carboxylgruppen <SEP> im <SEP> angegebenen <SEP> Verhältnis <SEP> durch <SEP> 2- <SEP> (Butyldimethyl- <SEP>
<tb> ammonium)-äthylgruppen <SEP> substituiert <SEP> sind.
<tb>
As <SEP> = <SEP> Polyglutaminsäure-Derivate, <SEP> bei <SEP> denen <SEP> die <SEP> zu <SEP> substituierten <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzten
<tb> Carboxylgruppen <SEP> zu <SEP> 73% <SEP> mit <SEP> Dimethylaminoäthyl-, <SEP> zu <SEP> 15% <SEP> mit <SEP> 2-Hydroxyäthyl-und <SEP> zu <SEP> Blo
<tb> mit <SEP> 2-Imidazoläthylgruppen <SEP> substituiert <SEP> sind.
<tb>
A <SEP> = <SEP> Die <SEP> Metholsulfate <SEP> von <SEP> Polylsin-Derivaten, <SEP> bei <SEP> denen <SEP> die <SEP> freien <SEP> Aminogruppen <SEP> methyliert <SEP> sind.
<tb>
A7 <SEP> = <SEP> MethostÜfate <SEP> von <SEP> Polyomithin-Derivaten, <SEP> bei <SEP> denen <SEP> die <SEP> freien <SEP> Aminogruppen <SEP> methyliert <SEP> sind.
<tb>
A <SEP> = <SEP> Po1yasparginsäure-Derivate. <SEP> bei <SEP> denen <SEP> die <SEP> freien <SEP> Carboxylgruppen <SEP> in <SEP> dem <SEP> angegebenen <SEP> Verhältnis <SEP> mit <SEP> 2-Diäthylaminoäthylamin <SEP> zu <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzt <SEP> sind.
<tb>
A9 <SEP> = <SEP> Poly-α-aminoadipinsäure-Derivate, <SEP> deren <SEP> freie <SEP> Carboxylgruppen <SEP> in <SEP> dem <SEP> angegebenen <SEP> Verhältnis <SEP> mit <SEP> 2-Dimethylaminoäthylamin <SEP> zu <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzt <SEP> sind.
<tb>
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<tb>
<tb> A <SEP> 10 <SEP> = <SEP> Jodide <SEP> von <SEP> Polyglutaminsäure-Derivaten, <SEP> deren <SEP> zu <SEP> substituierten <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umge- <SEP>
<tb> setzten <SEP> Carboxylgruppen <SEP> in <SEP> dem <SEP> angegebenen <SEP> Verhältnis <SEP> durch <SEP> 2-(Methyldiäthylammonio)-
<tb> - <SEP> äthylgruppen <SEP> substituiert <SEP> sind.
<tb>
A11 <SEP> = <SEP> Polyglutaminsäure <SEP> -Derivate, <SEP> deren <SEP> zu <SEP> Carboxamidgruppen <SEP> umgesetzten <SEP> freien <SEP> Carboxylgruppen
<tb> zu <SEP> 48% <SEP> mit <SEP> 2-Dimethylaminoäthyl- <SEP> und <SEP> zu <SEP> 481o <SEP> mit <SEP> 2-Aminoäthylgruppen <SEP> substituiert <SEP> sind.
<tb>
Die Induktoren sind durch die allgemein anerkannten Abkürzungen gekennzeichnet, die in Klammem angegebenen Werte bedeuten die Sw-Werte der einzelnen Polynucleotidketten in Swedberg-Einheiten.
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synthetische doppeltfaserige Nucleinsäure, die durch Komplexierung von Polyriboinasin (SW-Wert = 12,2) und Polyriboditosin (SW-Wert = 6, 3) hergestellt wurde. Der SW-Wert ist eine international anerkannte Kennzeichnung der Grösse des Makromolekills, welche auf Grund von Ultrazentrifugierungswerten berechnet wird.
Die Bezeichnung "Poly A:U" bedeutet einen doppeltfaserigen Nucleinsäurekomplex aus Polyriboadenin und Polyribouracil : "Poly (AU)" ist ein einfaseriges Copolymeres aus Riboadenin und Ribouracil.
Die Präparate können als Lösung, Suspension, Lyophilisat oder als durch Lufttrocknung oder Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Alkohol, gewonnene Feststoffe vorliegen.
Die absolute und relative Menge der einzelnen Komponenten in dem Präparat können innerhalb weiter Grenzen variiert werden und hängen sowohl von den Eigenheiten des behandelten Organismus wie auch von der Art der Verabreichung ab.
Im folgenden wird die Herstellung der erfindungsgemässen Präparate durch Beispiele näher veranschaulicht, ohne dass die Erfindung indessen auf die Beispiele beschränkt bliebe.
Präparate I/a bis I/i
40 mg eines Aktivators werden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird neutralisiert, und mittels Sterilfiltration sterilisiert und anschliessend mit 100 ml steriler physiologischer Kochsalz- lösung vermischt, die pro ml 1 y Induktor enthält.
Das erhaltene Präparat wird unter sterilen Bedingungen in Ampullen gefüllt und kann im gefrorenen Zustand gelagert werden.
Es können z. B. folgende Aktivator-Induktor-Paare verwendet werden :
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<tb>
<tb> I/a <SEP> A, <SEP> (0, <SEP> 81 <SEP> ; <SEP> 88%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> I/b <SEP> A1 <SEP> (0,92: <SEP> 94%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (4, <SEP> 7 <SEP> ; <SEP> 3, <SEP> 1) <SEP>
<tb> 1/c <SEP> A1(1,13; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (4, <SEP> 7 <SEP> ; <SEP> 3, <SEP> 1) <SEP>
<tb> 1/d <SEP> Al <SEP> (0, <SEP> 60 <SEP> 96%)-Statolon
<tb> I/e <SEP> A3 <SEP> (- <SEP> ; <SEP> 91%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> I/f <SEP> A2 <SEP> (0,90; <SEP> 93%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> I/g <SEP> A4, <SEP> (- <SEP> ;
<SEP> 92%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (12,2;6,3)
<tb> I/h <SEP> A, <SEP> (0, <SEP> 92 <SEP> ; <SEP> 94%)-Poly <SEP> 1 <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb> I/i <SEP> A, <SEP> (1, <SEP> 13 <SEP> ; <SEP> 96%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb>
Präparate II/a bis II/i
Es wird auf die bei den Präparaten I/a bis I/i beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass die Lösungen 10% Dextran enthalten.
Präparate III/a bis III/1
Es wird auf die bei den Präparaten I/a bis I/i beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass die Lösungen 5% Polyvinylpyrrolidon enthalten.
Präparate IV/a bis IV/i
Es wird auf die bei den Präparaten Va bis I/i angegebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass die Lösungen an Stelle von Kochsalz 0, 1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7, 2 enthalten.
Präparate V/a bis V/i
Es wird auf die bei den Präparaten I/a bis I/i beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass an Stelle von Kochsalz in den Lösungen 0, 02 M eines Citrätpuffers vom pH-Wert 7, 4 enthalten ist.
Präparate VI/a bis VI/i
Es wird auf die bei den Präparaten I/a bis I/i beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass die Lösung in Ampullen eingefüllt (pro Ampulle 10 ml sterile Lösung) und danach unter sterilen Bedingungen lyophilisiert wird.
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Präparate VII/a bis VII/e
Es wird auf die bei den Präparaten I/a bis I/i beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass der Aktivator in Form seines neutralen Hydrochlorides in Lösung gebracht wird und die Neutralisation der Lösung unterbleibt.
Präparate VIII/a bis VIII/h
100 mg eines Aktivators werden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird neutralisiert und durch Filtrieren sterilisiert und danach unter sterilen Bedingungen mit 100 ml physiologischer Koch-
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pullen abgefüllt werden (10 ml Lösung in eine Ampulle). Das Präparat kann danach in gefrorenem Zustand gelagert oder durch Gefriertrocknung getrocknet werden.
Es können z. B. folgende Aktivator-Induktor-Paare verwendet werden :
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<tb>
<tb> VIII/a <SEP> A1 <SEP> (0,39; <SEP> 92%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> VIII/b <SEP> A <SEP> (0, <SEP> 45 <SEP> ; <SEP> 97%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> VIII/c <SEP> A1 <SEP> (0,49; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> VIII/d <SEP> A1 <SEP> (0,37; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Statolon
<tb> VIII/e <SEP> Al <SEP> (0, <SEP> 45 <SEP> ; <SEP> 97%)-Statolon <SEP>
<tb> VIII/f <SEP> A <SEP> (0,54; <SEP> 33%) <SEP> - <SEP> Statolon
<tb> VIII/g <SEP> A <SEP> (0,52;
<SEP> 93%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> (AU) <SEP> Sw <SEP> = <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> A/U <SEP> = <SEP> 1
<tb> VIII/h <SEP> Ag <SEP> (---PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb>
Präparate IX/a bis IX/j
40 mg eines Aktivators werden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird neutrali- siert, durch Filtration sterilisiert und danach unter sterilen Bedingungen mit 100 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung vermischt, die pro ml 0, 05 γ Induktor enthält. Im weiteren wird wie unter VIII beschrieben gearbeitet.
Es können folgende Aktivator-Induktor-Paare verwendet werden :
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<tb>
<tb> IX/a <SEP> A <SEP> (1, <SEP> 13 <SEP> ; <SEP> 96%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> IX/b <SEP> A <SEP> (1, <SEP> 17 <SEP> ; <SEP> 99%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb> IX/c <SEP> A <SEP> (1, <SEP> 52 <SEP> ; <SEP> 94%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> IX/d <SEP> A1 <SEP> (2,0; <SEP> 98%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> IX/e <SEP> A <SEP> (2,92; <SEP> 82%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> IX/f <SEP> A1 <SEP> (0,81; <SEP> 98%) <SEP> - <SEP> Statolon
<tb> IX/g <SEP> A1 <SEP> (0,92;
<SEP> 94%) <SEP> - <SEP> Statolon
<tb> IX/h <SEP> A1 <SEP> (0,92; <SEP> 94%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> (AU) <SEP> Sw <SEP> = <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> A/U <SEP> = <SEP> 1
<tb> IX/i <SEP> Ag <SEP> (- <SEP> -) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12,2;6,3)
<tb> IX/j <SEP> A <SEP> (--)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb>
Präparate X/a bis X/d
100 mg Aktivator werden in 100 m1 physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird neutralisiert, durch Filtrieren sterilisiert und dann unter sterilen Bedingungen mit 100 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung vermischt, die pro ml 0,05 γ Induktor enthält. Im folgenden kann gearbeitet werden wie bei den Präparaten VIII beschrieben. Es können folgende Aktivator-Induktor-Paare verwendet werden.
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<tb>
<tb>
X/a <SEP> A1 <SEP> (0,49; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Statolon
<tb> X/b <SEP> A1 <SEP> (0,52; <SEP> 93%) <SEP> - <SEP> Statolon
<tb> X/c <SEP> A <SEP> (1,09; <SEP> 36%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I: <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb> X/d <SEP> A9 <SEP> (0, <SEP> 98 <SEP> ; <SEP> 91%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb>
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Präparate XI/a bis XI/g
Es wird im wesentlichen so gearbeitet wie bei den Präparaten X/a bis X/d beschrieben, jedoch mit dem Unterschied, dass die erste Lösung nicht 100 mg, sondern 40 mg Aktivator enthält und die zweite Lösung pro ml nicht 0, 05 y, sondern 10 y Induktor enthält.
Es können z. B. folgende Aktivator-Induktor-Paare verwendet werden :
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<tb>
<tb> XI/a <SEP> A1 <SEP> (0,60; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (12,2;6,3)
<tb> XI/b <SEP> A1 <SEP> (0,81; <SEP> 80%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (12,2;6,3)
<tb> XI/c <SEP> A1 <SEP> (1,13; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (4,7;3,1)
<tb> XI/d <SEP> A1 <SEP> (1,13; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> A:U <SEP> (8,1;7,6)
<tb> XI/e <SEP> A <SEP> (- <SEP> 93%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> XI/f <SEP> A3(- <SEP> ; <SEP> 91%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (12,2;6,3)
<tb> XI/g <SEP> A2 <SEP> (0,90;
<SEP> 93%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (12,2;6,3)
<tb>
Präparate XII/a bis XII/d
Es wird auf die gleiche Weise gearbeitet wie bei den Präparaten X/a bis X/d beschrieben, die zweite Lösung enthält jedoch pro ml nicht 0, 05 y, sondern 10 y Induktor.
Folgende Aktivator-Induktor-Paare können verwendet werden :
EMI7.2
<tb>
<tb> XII/a <SEP> Al <SEP> (0, <SEP> 49 <SEP> ; <SEP> 96%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (4, <SEP> 7 <SEP> ; <SEP> 3,1)
<tb> XII/b <SEP> A1 <SEP> (0,37; <SEP> 92%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I:C <SEP> (4,7; <SEP> 3,1)
<tb> XII/c <SEP> A <SEP> (0,49; <SEP> 96%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> A:U <SEP> (8,1; <SEP> 7,6)
<tb> XII/d <SEP> A <SEP> 11 <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb>
Präparate XIII/a bis XIII/i
4, 0 g Aktivator werden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird mit Salzsäure neutralisiert und danach mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung vermischt, die pro ml 100 y Induktor enthält. Die Lösung wird lyophilisiert.
Das Lyophilisat wird zum Zwecke der Tablettenherstellung mit 1, 0 kg
EMI7.3
0Induktor-Paare können die gleichen Paare Verwendung finden wie bei den Präparaten I/a bis I/i.
Präparate XIV/a bis XIV/e
2, 5 mg des Salzes eines Aktivators werden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mittels Filtration sterilisiert und dann unter sterilen Bedingungen mit 50 ml sterilem destilliertem Wasser vermischt, das 125 mg Induktor enthält. Dabei kann eine leichte Opaleszenz auftreten. Das Präparat wird unter sterilen Bedingungen in Ampullen gefüllt (1 ml pro Ampulle) und lyophilisiert.
Es können z. B. folgende Aktivator-Induktor-Paare Verwendung finden :
EMI7.4
<tb>
<tb> XIV/a <SEP> Al <SEP> (1, <SEP> 32 <SEP> ; <SEP> 90%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> XIV/b <SEP> Al <SEP> (0, <SEP> 95 <SEP> ; <SEP> 91%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> XIV/c <SEP> A2 <SEP> (0, <SEP> 90 <SEP> ; <SEP> 93%)-Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb> XIV/d <SEP> A <SEP> (1, <SEP> 12 <SEP> ; <SEP> 96%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> XIV/e <SEP> A1 <SEP> (0,84; <SEP> 90%) <SEP> - <SEP> Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ;
<SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb>
Präparate XV/a bis XV/b
Es wird auf die bei den Präparaten XIV/a bis XIV/e beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass 5 mg Aktivator in 50 ml destilliertem Wasser gelöst werden.
Zum Beispiel können folgende Aktivator-Induktor-Paare verwendet werden :
EMI7.5
<tb>
<tb> XV/a <SEP> A <SEP> (0, <SEP> 90 <SEP> ; <SEP> 93%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 1 <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 3) <SEP>
<tb> XV/b <SEP> A <SEP> (0, <SEP> 90 <SEP> ; <SEP> 92%)-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (7, <SEP> 3 <SEP> ; <SEP> 3, <SEP> 4) <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
Präparate XVI/a bis XVI/b
Es wird auf die bei den Präparaten XIV la bis XIV/e beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass in 50 ml sterilem destilliertem Wasser nicht 125 mg. sondern 1, 0 mg Induktor gelöst wird.
Als Aktivator-Induktor-Paare können z. B. folgende Paare verwendet werden :
EMI8.1
<tb>
<tb> XVI/a <SEP> (1, <SEP> 12 <SEP> ; <SEP> 96 <SEP> )-PolyI <SEP> : <SEP> C <SEP> (12, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 6,3)
<tb> XVI/b <SEP> Al <SEP> (1, <SEP> 12 <SEP> : <SEP> 960/0) <SEP> - <SEP> Statolon <SEP>
<tb>
Präparat XVII
Es wird auf die bei den Präparaten XIV/a bis XIV/e beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass an Stelle der dort angegebenen Mengen 5, 0 mg Aktivator und 200 mg Induktor in je 50 ml Wasser gelöst werden.
Zum Beispiel wird folgendes Aktivator-Induktor-Paar verwendet :
EMI8.2
Präparat XVIII
Es wird auf die bei den Präparaten XIV/a bis XIV/e beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass an Stelle der dort angegebenen Mengen 5,0 mg Aktivator und 50 mg Induktor in je 50 ml Wasser gelöst werden.
Zum Beispiel kann folgendes Aktivator-Induktor-Paar verwendet werden :
Al (1, 32 ; 90%)-Poly I : C (7, 3 ; 3, 4)
Präparat XIX
Es wird auf die bei den Präparaten XIV/a bis XIV/e beschriebene Weise gearbeitet mit dem Unterschied, dass an Stelle der dort angegebenen Mengen 100 mg Aktivator und 2,0 mg Induktor in je 50 ml Wasser gelöst werden. Als Aktivator-Induktor-Paar kann das gleiche verwendet werden wie bei dem Präparat XVIII.
Beschreibung der in den Beispielen angewendeten Methoden
1. Der Nährboden für die Gewebekulturen wird aus Parkers Medium 199 durch Zusatz von 5 bis 1f11/o Kälberplasma bzw. Plasmaersatz und Einstellen des pH-Wertes mit l%oigem Natriumhydrogencarbonat-Kohlen- säure-Puffer auf 7, 2 bis 7, 4 hergestellt.
2. Die Gewebekulturen aus menschlichen Fötuszellen werden hergestellt, indem aus frischem menschchem Fötusmaterial durch Trypsin-Verdauung gewonnene, mehrmals gewaschene Zellen zu einer stationären Gewebekultur mit einer Zellenzahl von 106 Zellen/ml angelegt und diese auf dem obigen Nährboden 4 bis 5 Tage lang bei 370C inkubiert wird. Die so gewonnene Gewebekultur ist verwendungsfertig.
3. Challenge-Virus und Auswertung : Der Indiana-Stamm des Vesicular stomatitis Virus (VSV) wird auf Mäusefibroblastzellen L-929 vermehrt. Die Auswertung wird durch Auszählen der auf den Fibroblastmonolayers
EMI8.3
Bei(= Plaque-, fleckenbildende Einheiten), in den Zellkulturen aus menschlichen Fötuszellen 105 p. f. u. pro ml verwendet.
4. Unter der biologischen Aktivität in Gewebekulturen wird hier diejenige Menge Poly I: C in y ver - standen, die bei Anwendung einer fast toxischen Aktivatorkonzentration nötig ist, um die Zellen der Gewebekultur völlig gegen den VSV-Virus zu schützen. Dabei wird unter toxischer Konzentration des Aktivators die Konzentration verstanden, bei deren Anwesenheit die Zellen mit dem Mikroskop wahrnehmbare morphologische Veränderungen erleiden. Die biologische Aktivität der Polykationen wird also durch die unter den erwähnten Bedingungen gemessene minimale Poly I : C-Dosis in y/ml ausgedrückt.
5. Bestimmung der minimalen Dosis an Induktor :
Das fragliche Kation wird in einer beinahe toxischen Konzentration dem Nährmedium der Gewebekultur zugesetzt und mit der erhaltenen Flüssigkeit die Stammlösung des Induktors (z. B. Poly I : C) verdünnt. Von den Verdünnungen wird je 1ml auf die Zellen der Gewebekultur gegeben, 12 h lang bei 370C inkubiert, gewaschen und danach in 1 ml neuer Nährflüssigkeit der Challenge-Virus eingebracht. Nach 48 bis 72 stündiger Inkubation bei 37 C wird der Challenge-Virus ausgewertet. In Zweifelsfällen wird Plaquetitration mit Hühnerembryofibroblast-Monolayers durchgeführt.
6. In vivo Untersuchungen an CFLP Albinomäusen (Gewicht eines Tieres 20 bis 22 g) (s. Carworth Europe Handbook 1969) :
Die Induktor-Aktivator-Lösung wird durch Filtrieren sterilisiert, mit steriler Pufferlösung versetzt, und bei jeder Injektion werden zur Vermeidung bakterieller Infektionen pro Maus 200 IE Penicillin G zugegeben. Im Hinblick darauf, dass zur Bestimmung natürlicher virushemmender Substanzen nur das in der Literatur beschrie-
<Desc/Clms Page number 9>
bene Verfahren zur Bestimmung des Interferon-Titers zur Verfügung stand, wird in den Beispielen die Menge des gebildeten natürlichen virushemmenden Stoffes als Interferontiter ausgedrückt.
Zur Bestimmung des Interferontiters wird 4 h nach der Injektion eine Blutprobe genommen, aus dieser werden die Zellenelemente entfernt und anschliessend der Interferongehalt des Plasmas an 48 halten Fibroblast L-929-Reagenzglaskulturen untersucht. Die Verdünnungen werden 16 bis 18 h lang in Gegenwart von 25 E/ml Nystatin und 50 E/ml Erythromycin bei 370C gehalten. Danach wird mit VSV-Virus in einer Dosis von 5 x 103 p. f. u. challengiert und nach weiteren 48 h Inkubation bei 370C der Interferontiter bestimmt. (Ch. Buckleru. a. : Proc. Soc. Exp. Biol.
Med. 136, [1971J, S. 394 bis 399).
7. Bestimmung der überlebensrate : Den Mäusen wird intraperitoneal virulenter Mäuse - Semlicki-Forest- - Virus (Stamm SFV-L10) (C. J. Boradish u. s. : J. Gen. Virol. 12, [1971], S. 141 bis 160) in einer Verdünnung appliziert, die nach einigen Tagen hundertprozentige Mortalität hervorruft. Die Zahl der dazu nötigen Virusteilchen muss in Vorversuchen ermittelt werden. Den Versuchstieren wird das zu untersuchende Präparat in der gewünschten Weise appliziert und die überlebensrate durch Beobachten der Tiere über 21 Tage festgestellt.
B e i s p i e l 1: Mäusefibroblastzellen L-929 werden in dem oben definierten Nährmedium inkubiert und dann das ursprüngliche Nährmedium gegen frisches Nährmedium ausgewechselt, welches pro ml 20 y Polyglutaminsäure-Deribat enthält, bei dem die freien Carboxylgruppen mit 2-Dimethylaminoäthylamin in verschiedenem Grade zu Carboxamidgruppen umgesetzt sind. In einem Vergleichsversuch wird die gleiche Menge DEAE-Dextran verwendet.
Als Induktor ist in den Lösungen Poly I : C enthalten, das durch Komplexierung gleicher Gewichtsmengen Poly C (Sw = 6,3) und Poly-I (Sw = 12,2) gebildet wurde. Es werden Zellkulturen untersucht, die pro ml zwischen 10 und 10-5 γPoly I: C enthalten. Die Zellkulturen werden bei 370C 12 h lang inkubiert, dann gewaschen, anschliessend challengiert und darauf erneut bei 370C für 92 h inkubiert. Danach wird bestimmt, wie hoch die minimale wirksame Dosis Poly 1 : C in Gegenwart der verschiedenen Aktivatoren ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
EMI9.1
<tb>
<tb> A <SEP> ktivator <SEP> minimale <SEP> wirksame <SEP> Dosis
<tb> y/ml
<tb> Al <SEP> (0,92; <SEP> 94%) <SEP> 5.10-4
<tb> A <SEP> (1,13; <SEP> 96%) <SEP> 1.10-4
<tb> A <SEP> (1,17; <SEP> 99%) <SEP> 5.10-5
<tb> A <SEP> (1,52; <SEP> 94%) <SEP> 1.10-4
<tb> A <SEP> (2, <SEP> 82 <SEP> ; <SEP> 82%) <SEP> 5. <SEP> 10- <SEP> 5 <SEP>
<tb> Al <SEP> (2,00; <SEP> 98%) <SEP> 1.10-5
<tb> DEAE-Dextran <SEP> 1. <SEP> 10'3
<tb> ohne <SEP> Aktivator <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 100 <SEP>
<tb>
Beispiel 2 :
Mäusefibroblastzellen L-929 werden in dem beschriebenen Nährmedium inkubiert, danach wird das ursprüngliche Medium gegen frisches Nährmedium ausgewechselt, welches die folgenden Präparate in einer Konzentration von 10% enthält :
EMI9.2
<tb>
<tb> I/a <SEP> - <SEP> I/i
<tb> II/a <SEP> - <SEP> II/g <SEP>
<tb> III/a <SEP> - <SEP> III/g
<tb> IV/a <SEP> - <SEP> IV/g
<tb> V/a-V/g
<tb> VII/a-VII/e
<tb> VIII/a <SEP> - <SEP> VIII/h
<tb> IX/a-IX/j
<tb> X/a <SEP> - <SEP> X/d
<tb> XI/a-XI/b
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> XI/d-XI/e
<tb> XII/a-XII/d
<tb>
oder pro 100 ml Nährmedium den Inhalt einer Ampulle der Präparate VI/a bis VI/i oder pro 100 ml Nährmedium eine Tablette der Präparate XIII/a bis XIII/i enthält.
Die Zellkulturen werden bei 37 C 12 h lang inkubiert, mit VSV challengiert und danach erneut für 92 h bei 370C inkubiert.
In keiner der behandelten Kulturen kann bei mikroskopischer Auswertung und/oder Plaque-Titration eine Vermehrung des Virus festgestellt werden.
Beispiel 3 : Gewebekulturen aus menschlichen Primärfötuszellen werden in dem beschriebenen Nährmedium inkubiert. Dann wird das Medium gegen frisches Nährmedium ausgewechselt, welches in einer Konzentration von l o die folgenden Präparate
EMI10.2
<tb>
<tb> I/h <SEP> - <SEP> I/i
<tb> 11/hui
<tb> III/h <SEP> - <SEP> III/i
<tb> IV/h-IV/i
<tb> V/h <SEP> - <SEP> V/i
<tb> VII/h <SEP> - <SEP> VII/i
<tb> XI/f, <SEP> XI/c, <SEP> XI/g
<tb>
EMI10.3
rate XIlI/h bis XIII/i enthält.
Die Zellkulturen werden bei 370C 12 h lang inkubiert, gewaschen, dann mit VSV challengiert und erneut bei 370C für 72 h inkubiert. In keiner der behandelten Kulturen kann bei Auswertung mit dem Mikroskop und/oder Plaquetitration eine Vermehrung des Virus festgestellt werden.
Beispiel 4: Der Inhalt je einer Ampulle der Präparate XIV/a bis XIV/c wird in 1 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 0, 1 ml der erhaltenen Lösung männlichen CFLP Albinomäusen (Gewichteines Tieres 20 bis 22 g) intraperitoneal appliziert. Nach 4 h wird der Titer der virushemmenden Stoffe im Blut der Tiere auf die beschriebene Weise bestimmt.
Die Titerwerte der natürlichen virushemmenden Stoffe sind in der Tabelle 2 enthalten.
Tabelle 2
EMI10.4
<tb>
<tb> Präparat <SEP> Titer
<tb> XIV/a <SEP> 8000
<tb> XIV/b <SEP> 6400
<tb> XIV/c <SEP> 6900
<tb> 125 <SEP> y <SEP> Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> ohne <SEP> Aktivator <SEP> 960 <SEP>
<tb>
Beispiel 5 : Männliche CFLP Albinomäuse (Gewicht eines Tieres 20 bis 22 g) werden mit SemlickiForest-Virus (SFV) infiziert. Nach der Infektion wird den Tieren intraperitoneal 0, 1 ml einer Lösung appliziert, die durch Verdünnen des Inhaltes je einer Ampulle der Präparate XIV/a, XIV/d, XIV/e, XV/a, XVI/a und XVI/b mit je 1 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde. Diese Behandlung wird am Tage der Infektion und an den zwei darauffolgenden Tagen durchgeführt.
Die Überlebensrate der Tiere ist in den Tabellen 3 bis 8 angegeben.
<Desc/Clms Page number 11>
Tabelle 3
EMI11.1
<tb>
<tb> Tage <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterblichkeit, <SEP> %
<tb> Behandlung <SEP> unbehandelt <SEP> behandelt <SEP> mit <SEP> behandelt <SEP> mit
<tb> Poly <SEP> I <SEP> : <SEP> C <SEP> XIV/a <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 65 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 90 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 9-10 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> - <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> 11-20 <SEP> 0
<tb> 12-20 <SEP> 0
<tb> 13-20 <SEP> 0
<tb> 14-20 <SEP> 0
<tb> 21 <SEP> 100 <SEP> 20 <SEP> 0
<tb>
Tabelle 4
EMI11.2
<tb>
<tb> Tage <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterblichkeit, <SEP> %
<tb> Behandlung <SEP> unbehandelt <SEP> behandelt <SEP> mit <SEP> behandelt <SEP> mit
<tb> PolyI <SEP> :
<SEP> C <SEP> XIV/d <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 90 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 95 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> 12 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 0
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 0
<tb> 14 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 0
<tb> 21 <SEP> 100 <SEP> 20 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle 5
EMI12.1
<tb>
<tb> Tage <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterblichkeit, <SEP> ! <SEP> h <SEP>
<tb> Behandlung <SEP> unbehandelt <SEP> behandelt <SEP> mit <SEP> behandelt <SEP> mit
<tb> PolyI <SEP> :
<SEP> C <SEP> XIV/e <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 85 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 95 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 10
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 10
<tb> 12 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 10
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 10
<tb> 14-30 <SEP> 10
<tb> 21 <SEP> 100 <SEP> 30 <SEP> 10
<tb>
Tabelle 6
EMI12.2
<tb>
<tb> Tage <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterblichkeit,
<SEP> %
<tb> Behandlung <SEP> unbehandelt <SEP> behandelt <SEP> mit <SEP> behandelt <SEP> mit
<tb> Poly <SEP> I <SEP> C <SEP> XV/a
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 90 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 95 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 0
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 12 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 14 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 21 <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Tabelle 7
EMI13.1
<tb>
<tb> Tage <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterblichkeit, <SEP> %
<tb> Behandlung <SEP> unbehandelt <SEP> behandelt <SEP> mit <SEP> behandelt <SEP> mit
<tb> PolyI <SEP> :
<SEP> C <SEP> XVI/a <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 90 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 95 <SEP> 30 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 0
<tb> 10-50 <SEP> 10
<tb> 11-50 <SEP> 10
<tb> 12-50 <SEP> 10
<tb> 13-50 <SEP> 10
<tb> 14-50 <SEP> 10
<tb> 21 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb>
Tabelle 8
EMI13.2
<tb>
<tb> Tage <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterblichkeit, <SEP> %
<tb> Behandlung <SEP> unbehandelt <SEP> behandelt <SEP> mit <SEP> behandelt <SEP> mit
<tb> Poly <SEP> I <SEP> :
<SEP> C <SEP> XVI/b
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 90 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 12 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 14 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> 21 <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
Beispiel 6 : Albinomäuse mit einem Gewicht von je 18 bis 20 g werden mit dem vollständig an Mäuse adaptierten Influenzavirusstamm Hongkong 68/1 infiziert.
Unmittelbar nach der Infektion wird den Tieren intravenös je 0, 1 ml einer Lösung appliziert, die durch Lösen des Inhaltes einer Ampulle des Präparates XV/b in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde. Diese Behandlung wird am darauffolgenden Tag und am dritten Tag wiederholt. Der Durchschnitt der reziproken Überlebenszeit ist bei der Kontrollgruppe 0,145, bei der behandelten Gruppe 0, 080.
Beispiel 7 : Der Versuch gemäss Beispiel 6 wird wiederholt mit dem Unterschied, dass das Präparat subkutan verabreicht wird. Die reziproke Überlebenszeit beträgt im Durchschnitt bei der Kontrollgruppe 0,140, bei den behandelten Gruppen 0, 096.
Beispiel 8 : Man geht auf die im Beispiele beschriebene Weise vor mit dem Unterschied, dass das Präparat den Tieren mit Hilfe einer Sonde peroral appliziert wird. Die durchschnittliche reziproke Überlebens- zeit beträgt bei der Kontrollgruppe 0,150, in den behandelten Gruppen 0,110.
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dem Vacciniavirusstamm IHD vorgenommen wird und die Präparate intraperitoneal verabreicht werden. Die Durchschnittswerte der reziproken Überlebenszeit : In der Kontrollgruppe 0, 205, bei den behandelten Gruppen 0, 090.
Beispiel 10 : 11 Tage lang bebrütete Eier werden mit dem neurovirulenten Stamm IHD des Vaccinia- Virus infiziert, indem die Scheinluftsäcke an der chorionischen Seite der chorioallantoiden Membran auf die von T. Najade u. a. (Journal of Laborarity and Clinical Medicine vol. 46, [1955], S. 648) beschriebene Weise behandelt werden. 1 h nach der Infektion werden an der gleichen Stelle 0, 2 ml einer Lösung appliziert, die durch Auflösen des Inhaltes einer Ampulle des Präparates XVIII in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt wurde.
Die Eier werden 48 h lang inkubiert, danach werden die Flecken (Plaques), die sich auf der Choriomembran gebildet haben, ausgezählt und in Prozent der bei der unbehandelten Kontrolle gefundenen Flecken die Inhibition ausgedrückt. Unter den angegebenen Bedingungen wird eine 89% igue Inhibition erreicht. Bei Behandlung mit 50 y Poly I : C allein, ohne Aktivator, ist die Hemmung nur zig
Beispiel 11 : Die auf die Vermehrung des Influenzavirus ausgeübte hemmende Wirkung wird durch Inokulieren in die Allantoid-Säcke von 11 Tage alten Hühnerembryos und Messung des Hemagglutinintiters der Allantoidflüssigkeit bestimmt.
Zuerst werden die embryonierten Eier intraperitoneal mit 0,25 ml einer Lösung inokuliert, die durch Auflösen des Inhaltes einer Ampulle des Präparates XIX in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt wurde.
Die behandelten Eier werden 1 h lang bei 360C in einem Thermostaten inkubiert. Danach werden die Eier mit Dosen zwischen 10-3 und 10-5 LD50 des Influenzavirus Hongkong 1/58 A-2 infiziert. Nach 48 stündiger Inkubation im Thermostaten werden die Eier eine Nacht lang bei 40C gelagert und dann ihr Hemagglutinintiter nach der Mikromethode von Tak5tsy (Acta microbiologica Academiae Scientiarum hungaricae, vol. 3, [1955], S. 191) bestimmt. Die statistische Analyse wird nach I. Hollows (Acta microbiologica Academicae Scientiarum hungaricae, vol.. 13, [1966], S. 133) vorgenommen.
Die auf die Vermehrung des Virus ausge- übte hemmende Wirkung beträgt 70 bis 96go.
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