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Molekularsieb für die Gelchromatographie
Es sind bereits verschiedene Substanzen bekanntgeworden, die als Molekularsiebe in der Gelchro- matographie verwendet werden können. Hieher gehören insbesondere mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol, mit Äthylenglykoldimethacrylat vernetztes Polymethylmethacrylat, mit Methylen-bis-acrylamid vernetztes Acrylamid sowie vernetzte Dextrane, Cellulosen, Polysaccharide und Polyvinylalkohole.
Es wurde nun gefunden, dass man ein besonders vorteilhaftes, zur Gel-Permeations-Chromatographie geeignetes Molekularsieb dann erhält, wenn man einen oder mehrere, bis zu 20 C-Atome enthaltende Vinylester und/oder Vinylencarbonat mit einer oder mehreren Vinyl- bzw. Allylverbindungen, mit Divinyläthern eines Oligoäthylenglykols, mitK. w-Divinylalkylenenmit bis zu 20 C-Atomen, mit Verbindungen, in denen mindestens zwei Vinylgruppen durch Heteroatome oder-gruppen verknüpft sind oder mit Divinyl- oder Diallylestern von Dicarbonsäuren copolymerisiert und das dabei erhaltene Vinylharz in einer Teilchengrösse von 0, 001 bis 5 mm einsetzt. Die dabei erhaltenen Produkte können anschlie- ssend partiell oder vollständig verseift werden.
Diese neuen Molekularsiebe zur Gelchromatographie besitzen den besonderen Vorteil, dass die an sich organophilen Copolymerisate durch Hydrolyse beliebig partiell verseift werden und damit in Gele mit definierten hydrophilen Eigenschaften überführt werden können. Darüber hinaus besitzen die vollständig verseiften hydrophilen Gele zur Verwendung nach der Erfindung, insbesondere gegenüber den vernetzten Dextrangelen, die Vorteile einer erhöhten Hydrolysebeständigkeit und einer erheblich grö- sseren Resistenz gegen Bakterien- oder Pilzbefall.
Durch die Copolymerisation der Vinylester bzw. des Vinylencarbonats mit der vernetzenden Komponente erhält man im Gegensatz zu Produkten, die durch nachträgliche Vernetzung löslicher Polymerer hergestellt worden sind, Gele mit besonders vorteilhaften Eigenschaften.
Die zur Verwendung nach der Erfindung vorgesehenen Vinylharze weisen in ihrer molekularen Struktur eine wesentlich grössere Inhomogenität auf, wodurch erheblich günstigere mechanische Eigenschaften der Gele erreicht werden. Deshalb weisen insbesondere auch die vollständig verseiften Gele für die Verwendung als Molekularsieb nach der Erfindung gegenüber nachträglich vernetzten Polyvinylalkoholen bei gleichen Vernetzergehalten eine erheblich höhere Festigkeit der Gelpartikel auf, so dass z. B. höhere Filtriergeschwindigkeiten, gegebenenfalls Anwendung von Druck, und längere Säulen bei der Chromatographie und damit höhere Trennleistungen möglich sind.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines, aus einem oder mehreren bis zu 20 C-Atome enthaltenden Vinylestern und ! oder Vinylencarbonat mit einer oder mehreren Vinyl- bzw. Allylverbindungen, beispielsweise mit Divinyläthern eines Alkandiols, wie 1, 4-Butandioldivinyläther, mit Divinyläthern eines Oligoäthylenglykols, wie Diäthylenglykoldivinyläther, mit a.
w-Divinylalkylenen mit bis zu 20 C-Atomen, wie 1, 5-Hexadien, mit Verbindungen, in denen mindestens zwei Vinylgruppen durch Heteroatome oder-gruppen verknüpft sind, wie Diallyldimethylsilan, Tetraallylsilan, Divinylsulfon oder Diallylsulfon, oder mit Divinyl- oder Diallylestern von Dicarbonsäuren, wie Adipinsäuredi-
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vinylester, durch Copolymerisation erhaltenen Vinylharzes, das eine Teilchengrösse von 0, 001 bis 5 mm besitzt, als Molekularsieb für die Gelchromatographie. Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung solcher Produkte als Molekularsieb für die Gelchromatographie, die durch partielle oder vollständige Verseifung eines solchen vernetzten Copolymerisats erhalten werden.
Als vernetzungsfähige Vinylverbindung wird vorzugsweise ein Divinyläther eines Alkandiols, z. B.
1, 4-Butandioldivinyläther, ein Divinyläther eines Oligoäthylenglykols, z. B. Diäthylenglykoldivinyl- äther, oder Tetraallylsilan verwendet.
Besondere Vorteile bietet die Herstellung der erfindungsgemäss verwendbaren Molekularsiebe durch Perlpolymerisation. Diese lässt sich besonders gut dann durchführen, wenn ein Alkohol und/oder ein Äther, vorzugsweise ein Gemisch aus Hexanol und Di-n-butyläther, zugegen ist. Besonders gute Produkte erhält man auch, wenn die Perlpolymerisation in Gegenwart eines Gemisches aus n-Heptanol, nOctan und Polyvinylpyrrolidon durchgeführt wird.
Als Vinylester können alle Ester von Carbonsäuren mit 1 bis 18 C-Atomen verwendet werden, wobei die Vinylester der niederen Fettsäuren mit bis zu 4 C-Atomen, also die Formiate, Acetate, Propionate und Butyrate, von besonderem Vorteil sind. Bevorzugt werden Vinylacetat oder Vinylpropionat verwendet, weil diese Verbindungen grosstechnisch leicht zugänglich sind. Es lassen sich aber, insbe-
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B.aliphatischer Monocarbonsäuren kommen jedoch zur Herstellung der neuen Gele auch die Vinylester aliphatischer Dicarbonsäuren sowie die Vinylester aromatischer oder cycloaliphatischer Säuren in Frage. Beispielsweise seien hier Benzoesäure, Toluylsäure, Cyclohexancarbonsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Glutarsäure und Malonsäure genannt.
Für besondere Anwendungsgebiete ist es auch vorteilhaft, Gemische dieser Vinylester untereinander oder mit Vinylencarbonat einzusetzen. Besonders wichtig sind z. B. Gemische von Vinylestern niederer aliphatischer Carbonsäuren mit bis zu 2Wo an Estern der höheren Fettsäuren.
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findet die eigentliche Vernetzung statt ; dabei kann entweder eine unmittelbare Reaktion der Epoxyde nach einem ionischen Mechanismus erfolgen, der beispielsweise durch Alkalialkoholate katalysiert wird, oder man kann die Epoxydgruppen mit andern bifunktionellen Verbindungen reagieren lassen, wobei eine Vernetzung der Polymerketten über die dadurch gebildeten Brücken erfolgt.
Solche bifunktionellen Verbindungen sind insbesondere mehrwertige, vorzugsweise zwei-bis sechswertige, Alkohole, wie Glykol, Glycerin oder Sorbit, Butandiol, Hexandiol, Dekandiol, Propylenglykol, Pentaerythrit, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol oder Verbindungen, wie Glyceringlycid. Derartige Umsetzungen zwischen Epoxyden und Alkoholen sind an sich bekannt und in der Literatur vielfältig beschrieben. Verwendet man eine Verbindung mit einer Aldehydgruppe als vernetzungsfähige Vinylverbindung, so kommt insbesondere Acrolein in Betracht, wobei zu beachten ist, dass die Vernetzung erst durch die während der Polymerisation ablaufende, geringfügige Verseifung eintritt, die durch die gegebenenfalls anschliessende partielle oder totale Verseifung vervollständigt werden kann.
Die Herstellung der vernetzten Copolymerisate des Vinylencarbonats und/oder der Vinylester mit bis zu 20 C-Atomen kann nach allen üblichen Methoden erfolgen. So kann die Polymerisation z. B. in Substanz, in Lösung, in Emulsion, als Fällungs- oder Perlpolymerisation durchgeführt werden. Bevorzugt wird zur Herstellung der Gele nach der Erfindung die Perlpolymerisation angewandt, da hiebei die Teilchengrösse der Gele von vornherein gesteuert werden kann und damit Verluste, die sonst beim Zerkleinern und Sieben entstehen, vermieden werden können. Die Teilchengrösse der Gele liegt je nach dem geplanten Verwendungszweck zwischen 0, 001 und 5 mm, vorzugsweise zwischen 0, 01undO, 5mm.
Die Herstellung der Gele zur Verwendung nach der Erfindung durch Perlpolymerisation bietet darüber hinaus den Vorteil, dass man diese Perlpolymerisation als Öl-in-Wasser-Polymerisation durchführen kann, die bekanntlich technisch erheblich leichter zu beherrschen ist als die Polymerisation in der umgekehrten Phasenverteilung, die z. B. bei der nachträglichen Vernetzung von Polyvinylalkohol allein möglich ist.
Die Perlpolymerisation selbst erfolgt nach allen üblichen, in der Literatur hinlänglich beschriebenen Verfahren. Häufig wird eine radikalische Initiierung bevorzugt, die z. B. durch Oxydationsmittel, wie Peroxyde, insbesondere Dibenzoylperoxyd, Dilauroylperoxyd, Di-o-tolylperoxyd, Wasserstoffperoxyd oder auch Salze der Peroxydischwefelsäure oder durch Azoisobutyrodinitril, hervorgerufen werden kann. Auch eine Redox-Initiierung ist möglich, z. B. durch Verwendung des Systems Natriumdi- thionit/Alkaliperoxydisulfat. Die Initiatoren werden in an sich üblicher Weise in Konzentrationen von 0, 01 bis lOgo, vorzugsweise 0, 1 bis 2%, eingesetzt. Die Perlpolymerisation selbst wird im allgemeinen
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durchgeführt, vorzugsweise bei etwa 50 bis 800C.
Die Polymerisation kann als Substanz-, Lösungs- oder Fällungspolymerisation auch mit ionischer Initiierung durchgeführt werden, wobei man allgemein bei niedrigeren Temperaturen und in Gegenwart von Lewis-Säuren als Katalysatoren arbeitet. Auch hier gelten die üblichen Reaktionsbedingungen.
Sowohl die Perl-als auch die Emulsionspolymerisation wird in Gegenwart von Wasser durchgeführt.
Um ein vorzeitiges Abbrechen der Polymerisation zu verhindern, sollte die Reaktion zweckmässig bei p-Werten zwischen 5 und 8, vorzugsweise bei 7, 5, erfolgen. Deshalb gibt man normalerweise PufferSubstanzen in wässeriger Lösung hinzu, z. B. Alkaliphosphate, Citrate odertert. Amine.
Bei der Emulsions- und Perlpolymerisation werden die üblicherweise angewandten oberflächenaktiven Stoffe zugesetzt ; d. s. bei der Emulsionspolymerisation vorzugsweise ionogene Stoffe, wie beispielsweise Seifen oder Paraffinsulfonate in den gebräuchlichen Konzentrationen von 0, 01 bis 10%, vor- zugsweise 0, 1 bis eo. Bei der Perlpolymerisation werden im allgemeinen wasserlösliche Kolloide bevorzugt, insbesondere Polyvinylalkohol oder teilweise verseiftes Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidon, Stärke, Pektine u. ähnl., für diesen Verwendungszweck bekannte Stoffe. Hier werden Konzentrationen von etwa 0, 01 bis 10%, vorzugsweise 0, 1 bis 2 ! %, bevorzugt.
Das Verhältnis von organischer zu wässeriger Phase liegt bei der Perlpolymerisation im allgemeinen zwischen 1 : 1 und 1 : 20, vorzugsweise zwischen 1 : 3 und 1 : 5.
Durch Variation der Polymerisationsbedingungen ist es möglich, die Porengrösse der erfindungsgemässen Verbindungen zu beeinflussen. Eine wesentliche Möglichkeit besteht im Variieren der Konzentration des zugesetzten Vernetzers. Mit zunehmendem Vernetzeranteil werden die Gele weniger quellbar und ihre Formstabilität wird erhöht.
Eine weitere Möglichkeit, die Ausbildung der Poren zu beeinflussen, besteht insbesondere bei der Perlpolymerisation oder bei der Polymerisation in Substanz in der Zugabe bestimmter Stoffe, die vor oder während der Polymerisationzugegebenwerden. Hiefür kommen in erster Linie solche Verdünnungs-
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mittel in Betracht, die für das eingesetzte Monomere Lösungsmittel und für das entstehende Polymere
Quellungsmittel sind (z. B. Äthylacetat) ; ferner solche Substanzen, die für das Monomere Lösungsmit- tel, für das Polymere aber Fällungsmittel sind. Hieher gehören z. B. aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Octan, Dodecan, Petroläther oder auch Alkohole, insbesondere Hexylalkohol, Decylalkohol, Hep- tylalkohol oder Amylalkohol und Äther, vorzugsweise Dibutyläther.
Es können auch mehrere solcher
Lösungsmittel gleichzeitig eingesetzt werden. Es können aber auch solche Inertstoffe ohne chemische
Bindung in das Polymere eingebaut werden, die später wieder aus dem Gel entfernt werden. Hiefür kommen vor allem Polymere, wie Polyvinylacetat oder Polystyrol sowie Erdalkalicarbonate, insbeson- dere Calciumcarbonat, Zucker oder Salze, wie NaCl, in Betracht. Die Zusatzstoffe müssen natürlich abgestimmt sein auf die übrigen Polymerisationsbedingungen, insbesondere auf die dabei verwendeten Lösungs-und/oder Fällungs-und/oder Suspendierungsmittel. Je nach der gewünschten Porengrösse des
Gels können natürlich auch verschiedene solcher Zusatzstoffe gleichzeitig angewandt werden.
Durch diese Zusätze können die verschiedensten Ausschlussgrenzen erreicht werden. Die Ausschluss- grenze ist ein Mass für den Porendurchmesser eines Gels, wobei üblicherweise das Molekulargewicht der kleinsten Moleküle angegeben wird, die gerade nicht mehr in die Poren des Gels eindringen können. So erzielt man durch die Beifügung der Fällungs-/LösungsmittelAusschlussgrenzen bis zu Molekulargewichten im Bereich von etwa 107, vorzugsweise 103 bis 106. Die Zugabe von löslichen Polymersubstanzen ermöglicht die Herstellung von Gelen mit Ausschlussgrenzen., die in der Grössenordnung der Molekulargewichte der zunächst eingebauten Polymeren liegen. Durch Zusätze von Feststoffen, die nach der Herstellung des Gels wieder entfernt werden, lassen sich aber auch noch Gele mit wesentlich höheren Ausschlussgrenzen herstellen.
Die durch Vernetzung von Vinylestern und/oder Vinylencarbonat erhaltenen Gele können durch partielle oder vollständige Verseifung in ihren Eigenschaften weitgehend verändert und insbesondere hydrophil gemacht werden. Es ist ein besonderer Vorteil der neuen Gele, dass die Verseifung auf jeder beliebigen Stufe abgebrochen werden kann, so dass man je nach dem geplanten Verwendungszweck Gele mit verschiedenen organophilen bzw. hydrophilen Eigenschaften herstellen kann.
Unter der anschliessend an die Polymerisation gegebenenfalls durchzuführenden Verseifung sollen hier alle Verfahren verstanden sein, durch die die Hydroxylgruppen des vernetzten Polyvinylidencarbonats oder der Polyvinylester in Freiheit gesetzt werden.
Normalerweise wird die Verseifung entweder im sauren oder im alkalischen Medium durchgeführt.
Sofern zur Herstellung der Gele Vinylformiat verwendet worden ist, kann die Verseifung auch durch einfaches Erwärmen mit Wasser durchgeführt werden.
Die alkalische Verseifung wird vorzugsweise in solchen Fällen angewandt, wo eine totale Verseifung erwünscht ist. Normalerweise erfolgt die Reaktion mit alkoholischem Alkali, vorzugsweise durch methanolische oder äthanolische Lösungen von Alkali- oder Erdalkalihydroxyden. Neben Methanol und Äthanol lassen sich natürlich auch andere Alkohole, insbesondere Isopropanol, sowie Alkohol/WasserGemische, verwenden. Man lässt die Gele mit dem Alkali entweder mehrere Stunden bis Tage bei Raumtemperatur stehen oder man kocht einige Minuten oder Stunden unter Rückfluss. Die Verseifung kann auch in rein wässerigen Lösungen durchgeführt werden, doch sind dann die benötigten Verseifungszeiten wesentlich länger.
Die saure Verseifung ist dann bevorzugt, wenn eine partielle Verseifung angestrebt wird. Sie wird beispielsweise in wässeriger Lösung unter Zusatz von starken Säuren, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder p-Toluolsulfonsäure, durchgeführt. Erfolgt die Reaktion bei höheren Temperaturen (etwa 1000C), so können die Säuren in geringerer Konzentration eingesetzt werden, während bei Verwendung höherer Konzentrationen (15 bis 2ufo) die Verseifung auch bei niederen Temperaturen (20 bis 600C) erfolgt. Wird die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt, so muss gegebenenfalls mehrere Stunden gerührt werden.
Die Verseifung kann auch so gelenkt werden, dass ein beispielsweise aus Vinylacetat erhaltenes vernetztes Polymeres in Gegenwart von methanolischem Chlor- wasserstoff mit Methanol behandelt wird. Durch Umesterung entsteht dabei Methylacetat, das abdestilliert werden kann, während der verseifte, vernetzte Polyvinylalkohol zurückbleibt. Es ist auch moglich, die Hydroxylgruppen des Vinylesters oder des Vinylidencarbonats in dem vernetzten Polymeren durch aminolytische Verfahren in Freiheit zu setzen. So kann man beispielsweise das aus Vinylacetat hergestellte Gel mit niederen sekundären Aminen, beispielsweise Diäthylamin, Dimethylamin, Piperidin oder Morpholin, umsetzen, wobei man das Polyvinylalkoholgel neben leicht auswaschbaren, substituierten Acetamiden erhält.
Auch dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft bei der Herstellung partiell verseifter Gele, da der Verseifungsgrad besonders gut durch Zusatz einer ganz bestimmten A minmenge gere-
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gelt werden kann.
Die zur Verwendung nach der Erfindung vorgesehenen Gele sind normalerweise in den üblichen Lo- sungsmitteln unlöslich. Die unverseiften (organophilen) Gele sind in den meisten organischen Lösungs- mitteln gut quellbar. Eine Ausnahme bilden die gesättigten Kohlenwasserstoffe, die beispielsweise bei vernetzten Polyvinylacetatgelen nur eine geringe (wie z. B. n-Hexan) oder gar keine (wie z. B. n-Octan)
Quellung hervorrufen. Naturgemäss hängt das Quellverhalten der Gele sehr stark von der Esterkompo- nente der Polyvinylester ab. So haben selbstverständlich Gele, die beispielsweise ganz oder teilweise aus Vinylstearat hergestellt wurden, erheblich organophilere Eigenschaften und zeigen stärkere Quell- barkeit gegenüber Kohlenwasserstoffen als solche Gele, die aus Vinylacetat oder gar dem sehr hydrophi- len Vinylformiat hergestellt wurden.
Die verseiften Gele sind vor allem mit Wasser und auch den niederen Alkoholen quellbar. Je nach
Vernetzergehalt können die verseiften Gele ein Mehrfaches ihres Volumens an Wasser durch Quellung aufnehmen.
Die Gele zur Verwendung nach der Erfindung lassen sich praktisch zu allen Trennungen verwenden, für die eine Gel-Permeations-Chromatographie in Frage kommt. Bekanntlich erfolgt dabei eine mole- kulargewichtsabhängige Trennung. Moleküle oberhalb einer bestimmten Teilchengrösse (Ausschlussgren- ze) können überhaupt nicht in die Poren des Gels eindringen und werden zuerst eluiert. Substanzen mit einem Molekulargewicht im Bereich oder unter der Ausschlussgrenze des jeweiligen Gels werden im all- gemeinen umso langsamer eluiert, je kleiner ihr Molekulargewicht ist.
Die neuen Gele können z. B. zur Trennung von Substanzen mit sehr weit streuenden Molekulargewichten angewandt werden. Das Gel wird im Hinblick auf den geplanten Verwendungszweck, d. h. die zu trennenden Substanzen, die gewünschte Trennungskapazität und die Filtergeschwindigkeit ausgewählt. Sowohl niedermolekulare als auch hochmolekulare Substanzen können mit den neuen Molekularsieben für die Gelchromatographie nach der Erfindung getrennt werden.
Besonders gut geeignet sind die neuen Gele zur Abtrennung von Substanzen mit Molekulargewichten über 500, z. B. auch über 1000, weil solche Substanzen sehr oft durch andere Methoden nur schwierig zu trennen sind.
Spezielle Anwendungen der neuen Gele sind z. B. die Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung von Polymeren. Im oligomeren Bereich lassen sich Substanzen molekulareinheitlich isolieren. Es ist auch möglich, Substanzen gleichen Molekulargewichtes voneinander zu trennen, wenn die Polarität hinreichende Unterschiede aufweist.
So lassen sich z. B. Oligophenylene, Oligourethane, Oligoäthylenglykole und Oligostyrole in molekulareinheitliche Fraktionen zerlegen.
Bei Polymeren, beispielsweise Polystyrol, Polyvinylacetat oder Polyvinylchlorid, lässt sich die Molekulargewichtsverteilung bis zu Molekulargewichten von etwa 106 bestimmen.
Die neuen Gele können mit Vorteil auch verwendet werden zur Trennung kolloidaler Substanzen von Substanzen in echter Lösung, insbesondere auch zur Trennung empfindlicher Kolloide, z. B. Enzyme oder Viren. Vorteile ergeben sich auch bei der Behandlung von Mischungen, die Proteine oder Polypeptide, z. B. Plasmaprotein, Enzyme, wie Pepsin oder Pankreasenzyme oder Hormone, z. B. Insulin, enthalten. Auch die Trennung von Polysacchariden, wie Amylodextrinen, Heparin oder Amylosen, ist möglich.
Die neuen Gele können auch Anwendung finden zur Auftrennung komplizierter Gemische, die mehrere ganz verschiedene Verbindungen enthalten, z. B. biologische Flüssigkeiten, wie Pflanzenextrakte oder Extrakte aus Mikroorganismen oder tierischen Organen. Dabei kann sowohl eine Auftrennung als auch eine Reinigung erfolgen. In Frage kommt z. B. die fraktionierte Auftrennung von Blutplasma, Seren, Enzymen u. a. Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuren, Vitaminen, Coenzymen, Hormonen, Antibiotika, Alkaloiden und Kohlenhydraten.
Speziell die hydrophilen Gele eignen sich beispielsweise zu Trennungen von hochmolekularen und ionischen Substanzen, z. B. zu Entsalzungen von Eiweissstoffen, die sich quantitativ und verlustlos durchführen lassen, wobei in den ersten Fraktionen der Gelchromatographie der hochmolekulare Anteil eluiert wird.
In ähnlicher Weise kann man z. B. hochmolekulare Naturstoffe, wie Eiweissstoffe, Kohlenhydrate und Nucleinsäuren, von einem Ionenmilieu in ein anderes lonenmilieu überführen. Dabei kann sowohl die Natur der Ionen, ihre Konzentration und/oder der PH-Wert der Lösung geändert werden.
Die Anwendungstechnik der neuen Molekularsiebe für die Gelchromatographie unterscheidet sich nicht von der der bekannten stationären Phasen in der Gelchromatographie. Üblicherweise füllt man die Gele in Säulen, die ab-oder aufsteigend von den Elutionsmitteln durchströmt werden. Häufig ist es
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zweckmässig, während des Füllens der Säule das Lösungsmittel strömen zulassen, um damit eine gleichmässige Packung des Gels zu erzielen. Das Gel muss bis zur Erreichung des Gleichgewichtszustandes vorgequollen sein. Normalerweise wird zu diesem Vorquellen das gleiche Lösungsmittel verwendet, das für die spätere Elution vorgesehen ist.
In vielen Fällen ist es bei der Herstellung der hydrophilen Gele auch vorteilhaft, die Verseifung gleichzeitig mit der Vorquellung durchzuführen, so dass die Gele in gequollenem Zustand anfallen und nach dem Auswaschen unmittelbar verwendet werden können. Zweckmä- ssigerweise werden hiebei die Gele vor der Verseifung gesiebt.
Zuweilen ist es aus Zeitersparnis auch günstig, die Chromatographie unter Druck durchzuführen.
Die Anwendung erhöhter Temperaturen (z. B. 30 bis 1500C) bei der Gelchromatographie begünstigt die Einstellung des Gleichgewichtes und erhöht damit häufig die Trennschärfe.
Selbstverständlich können für die Chromatographie auch die verschiedensten Mischungen der neuen Gele verwendet werden. Solche Mischungen sind z. B. besonders dann erwünscht, wenn eine breitere Porengrössenverteilung erreicht werden soll, mit der ein grösserer Molekulargewichtsbereich erfasst werden kann. Das kann z. B. bei der Trennung von Polymeren mit hohen und niedermolekularen Anteilen der Fall sein.
A : Herstellung der Gele
Beispiel 1 :
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kantiert und das Polymerisat mehrfach mit Wasser gewaschen und anschliessend getrocknet. Ausbeute 90 bis 95%. Spezifisches Gelbettvolumen (Tetrahydrofuran) : 8, 7 ml/g. b) 50 g des nach Beispiel 1 a) hergestellten Gels werden in einer Lösung von 20 g NaOH in 500 ml Methanol 10 h unter Stickstoff gerührt, das Gel wird abfiltriert und sorgfältig mit Methanol und Wasser gewaschen. Das Quellmittel wird im Rotationsverdampfer entfernt.
Beispiel 2 : a) Analog Beispiel l a) wird eine in 1000 ml einer 0, 51vingen wässerigen Polyvinylalkohollösung suspendierte Mischung von 184 g Vinylacetat, 16 g Butandiol-(1,4)-divinyläther und 0, 5 g Azoisobu- tyrodinitrilpolymerisiert und aufgearbeitet. Ausbeute etwa 95%. Gelbettvolumen (Tetrahydrofuran) : 3, 9 ml/g. b) 50 g des nach Beispiel 2 a) hergestellten Gels werden mit 500 mu 18% figer Salzsäure unter Stickstoff 10 h gerührt und analog Beispiel 1 b) aufgearbeitet.
Sofern das Produkt vor der Verseifung auf die gewünschte Perlengrösse gesiebt worden ist, kann die gut mit Wasser gewaschene Suspension unmittelbar verwendet werden.
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JeErlenmeyer-Kolben eingewogen und unter unterschiedlichen Bedingungen bei Zimmertemperatur partiell verseift. Das Gel wird anschliessend mit Wasser auf eine Nutsche gespült, neutral gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
Man erhält folgende Produkte :
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<tb>
<tb> Probe <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP>
<tb> konzentrierte
<tb> HCl <SEP> (ml) <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> HL <SEP> O <SEP> (ml) <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 15 <SEP> 5
<tb> CH3COOH <SEP> (ml) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10
<tb> Zeit <SEP> (h) <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 24 <SEP> 24 <SEP> 24
<tb> Trockengewicht
<tb> d. <SEP> verseiften
<tb> Probe <SEP> (g) <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Acetylgruppengehalt <SEP> (unverseiftes <SEP> Produkt <SEP> zirka <SEP> zirka
<tb> =100) <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 49 <SEP> 25 <SEP> 100 <SEP> 62
<tb>
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dinitril polymerisiert und aufgearbeitet.
Gelbettvolumen (Tetrahydrofuran) : 7, 5 ml/g.
Die Quellung dieses Gels wird in verschiedenen Lösungsmitteln bestimmt. Je 1 g des trockenen Gels
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Dioxan 7, 7 ; Äthylacetat 6, 8 ; n-Butylacetat 5, 5 ; Aceton 6, 9 ; Methyläthylketon 6, 6 ; Dimethylformamid 7, 4 ; Dimethylsulfoxyd 4, 8. b) 50 g eines nach Beispiel 10 a) hergestellten und gesiebten Gels werden unter N mit einer Lösung von 25 g NaOH, 415 ml Methanol und 415 ml Wasser etwa 10 h bei Zimmertemperatur gerührt und dann 2 h auf 600C erwärmt. Das verseifte Gel wird abgesaugt und mit Wasser neutral gewaschen. Das Gel wird im gequollenen Zustand unter Wasser aufbewahrt. Es besitzt ein Gelbettvolumen von 170 ml.
Beispiel 11 :
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dinitril polymerisiert und aufgearbeitet. Gelbettvolumen (Tetrahydrofuran) : 5, 4 ml/g. b) Analog Beispiel 10 b) werden 35 g eines nach Beispiel 11 a) hergestellten Gels verseift. Das Gel besitzt in Wasser ein Gelbettvolumen von 100 ml.
Beispiel 12 : Analog Beispiel 1 a) wird eine in 1200 ml einer 0, 5%igen wässerigen Polyvinylalkohollösung suspendierte Mischung von 184 g Vinylacetat, 16 g Butandiol-(1,4)-divinyläther, 0,6 g Azoisobutyrodinitril, 86 g Hexylalkohol und 86 g Di-n-butyläther polymerisiert und aufgearbeitet. Gelbettvolumen (Tetrahydrofuran) : 7, 3 ml/g.
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Nach 4 h wird das Reaktionsgemisch bis auf 1200C erwärmt und nach weiteren 3 h abgekühlt. Als Reaktionsprodukt wird ein farbloses, zähelabtisches Harz erhalten, das in Tetrahydrofuran quellbar ist.
Das in Tetrahydrofuran gequollene Gel wird durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0, 1 mm gepresst und in die zehnfache Menge Wasser eingetragen. Durch drei-bis viermaliges Dekantieren und Waschen mit der gleichen Menge Wasser wird das Gel vollständig entquollen. Das granulierte Produkt
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dinitril wird unter Stickstoff in einem mit Rückflusskühler versehenen Kolben auf 60 C erwärmt und 12 h bei dieser Temperatur gehalten. Danach lässt man erkalten und erhält ein weisses, undurchsichtiges, zähes Harz, das in Tetrahydrofuran quellbar ist.
Beispiel 15 : Analog Beispiel 1 a) wird eine in 1000 ml 0, 5%iger wässerigen Polyvinylpyrrolidonlösung suspendierte Mischung von 140 g Vinylacetat, 16 g Butandiol-(1,4)-divinyläther, 44 g Adipinsäuredivinylester, 200 ml n-Heptylalkohol, 100 ml n-Octan und 4 g Azoisobutyrodinitril polymerisiert und aufgearbeitet. Gelbettvolumen (Tetrahydrofuran) : 6, 0 ml/g.
Beispiel 16 : Analog Beispiel 1 a) wird eine in 1000 ml einer O, 3%igen wässerigen Polyvinyl-
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rohr (1, 15 X 100 cm), das im oberen Teil graduiert ist, gefüllt. Während des Sedimentierens des Gels lässt man das Elutionsmittel schwach strömen, um eine gleichmässige Packung zu erzielen. Das Gelbettvolumen kann am graduierten Teil unmittelbar abgelesen werden. Je 1 mg der folgenden vier Substanzen wird in 0, 5 ml Tetrahydrofuran gelöst.
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<tb>
<tb>
1. <SEP> Octamethyloctiphenyl <SEP> (M <SEP> = <SEP> 723)
<tb> 2. <SEP> Tetramethylquaterphenyl <SEP> (M <SEP> = <SEP> 362)
<tb> 3. <SEP> p-Terphenyl <SEP> (M <SEP> = <SEP> 230)
<tb> 4. <SEP> Toluol <SEP> (M <SEP> = <SEP> 92).
<tb>
Die Lösung wird auf das Gelbett gegeben und die Säule mit Tetrahydrofuran eluiert. Die UV-Durch-
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lässigkeit des Eluats wird kontinuierlich registriert. Die vier Substanzen erscheinen auf dem Diagrammstreifen in Form von vier getrennten Peaks. Bei einem Gelbettvolumen von 99,7 ml erhält man folgen-
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:Beispiel II : Analog Beispiel I wird eine Säule mit einem Polyvinylacetatgel, das mit lo Butandioldivinyläther vernetzt ist (hergestellt nach Beispiel 10 a), gefüllt und 10 mg eines Oligourethangemisches werden getrennt. Für das aus acht Substanzen bestehende Gemisch erhält man acht verschiedene Peaks.
Bei einem Gelbettvolumen von 97,0 ml werden folgende Werte erhalten :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Molekulargewicht <SEP> Elutionsvolumen <SEP> (ml)
<tb> Tetradeca-urethan <SEP> 2001 <SEP> 42, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dodeca-urethan <SEP> 1727 <SEP> 45, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Deca-urethan <SEP> 1442 <SEP> 48,8
<tb> Octo <SEP> -urethan <SEP> 1167 <SEP> 53,6
<tb> Hexa-urethan <SEP> 893 <SEP> 58,3
<tb> Tetra-urethan <SEP> 618 <SEP> 65,8
<tb> D-urethan <SEP> 344 <SEP> 74,5
<tb> Diphenylharnstoff <SEP> 212 <SEP> 81,4
<tb>
Beispiel III : Ein analogBeispiel 11 b) verseiftesundausVinylacetat und22%) Butandiol- (l, 4)-di- vinyläther hergestelltes Copolymerisat (Perlgrösse des unverseiften Produktes 0, 05 bis 0, 1 mm) wird in gequollenem Zustand in eine Säule von 1, 6 X 33 cm gefüllt und mit Wasser vom PH-Wert 8 äquilibriert.
Auf diese Säule wird ein Gemisch von 20 mg Azoalbumin und 20 mg Natriumchlorid, gelöst in 1 ml Wasser vom p 8, gegeben. Es wird mit Wasser vom PH -Wert 8 eluiert und das Eluat in Fraktionen von 3, 5 ml aufgefangen. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 42 ml/h. Die Elution des Eiweissstoffes wird durch Messung bei 280 nm, diejenige des Salzes durch Leitfähigkeitsmessung verfolgt. Das gesamte Azoalbumin wird in den Fraktionen 5 und 6 wiedergefunden. Die Fraktionen 11 und 12 enthalten das gesamte Natriumchlorid. Das Azoalbumin wird quantitativ eluiert, ohne dass auf der Säule ein Rest zurückgehalten wird.
Beispiel IV : Ein analog Beispiel 10 b) erhaltenes, verseiftes Copolymerisat aus Vinylacetat und 10/0 Butandiol- (1, 4) -divinyläther wird in gequollenem Zustand in eine Säule von 1, 6 X 35 cm gefüllt und mit Wasser vom pH-Wert 8 äquilibriert. Eine Probe von 20 mg Azoalbumin und 20 mg Natriumchlorid, gelöst in 1 ml Wasser, wird unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 3 getrennt. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 25 ml/h. Das Azoalbumin wird mit den Fraktionen 6 bis 8 quantitativ eluiert, während das Natriumchlorid erst in den Franktionen 11 bis 14 erscheint.
Beispiel V : Über eine analog Beispiel III gefüllte Säule wird unter den dort geschilderten Bedingungen eine Lösung von 60 mg Dextran-Blau 2000 (Handelsprodukt der Fa. Pharmacia, Schweden) und 60 mg Kaliumchromat in 2 ml Wasser vom p-Wert 8 gegeben. Die Elution erfolgt analog Beispiel III. Das Dextran-Blau wird in den Fraktionen 5ois 7 quantitativ eluiert, das Kaliumchromat wird in den Fraktionen 12 bis 13 gefunden.
Be ispiel VI : Ein nach Beispiel 11 b) hergestelltes Gel wird in eine Säule von 1, 5 X 26 cm ge-
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/Citrat-Pufferlösung 0,1/0,05 m PHdieser Pufferlösungeluiert. Das Fraktionsvolumen beträgt 1, 5 ml, die Durchflussgeschwindigkeit 60 Frak tionen/h. Die Elution wird durch Umsetzen der Fraktionen mit Folin-Reagenz und Messung bei 750 nm verfolgt. Das Insulin wird in den Fraktionen 14 bis 22, das Oxytocin in den Fraktionen 29 bis 36 aufgefangen.
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