AT231065B

AT231065B - In geformte Gebilde aus festem Kunststoff eingebettete Enzyme oder enzymhaltige Mikroorganismen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: AT231065B
Application number: AT501161A
Authority: AT
Inventors: Fred Dr Leuschner
Original assignee: Fred Dr Leuschner
Priority date: 1960-07-12
Filing date: 1961-06-28
Publication date: 1964-01-10

Description

In geformte Gebilde aus festem Kunststoff eingebettete Enzyme oder enzymhaltige Mikroorganismen und Verfahren, zu ihrer Herstellung
Es ist bekannt, dass verschiedene höhermolekulare Stoffe (im folgenden als höhermolekulare, biologische Wirkstoffe bezeichnet), beispielsweise Enzyme, zur Durchführung bestimmter Reaktionen, wie der Katalyse von chemischen Umsetzungen oder der zeitweisen Bindung von chemischen Substanzen, verwendet werden können. Die biologischen Wirkstoffe gehen aus diesen Prozessen unverändert hervor.

Man hat bereits Enzyme als kolloidale Lösungen dem str'strathaltigen Reaktionsansatz beigemischt ; jedoch ist die Trennung von Wirkstoff und Substrat nach vollendeter Reaktion schwierig und unwirtschaftlich. Es ist auch bekannt, biologische Wirkstoffe an Trägerstoffen zu adsorbieren oder in die wässerige stationäre Phase einer Zweiphasenkolonne aufzunehmen, wobei kontinuierliche Verfahrensweisen möglich sein sollen. Die Anwendung ist jedoch auf Einzelfälle beschränkt. Ein erheblicher Nachteil dieser Verfah-
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Reaktionsansatz eingeschleppt werden können. Schliesslich können dielocker am Träger haftenden Enzyme leicht von der mobilen Substratphase mitgerissen werden, so dass der Vorteil dieser Verfahren - die ein- wandfreie Trennung der Wirkstoffe vom Substrat - nicht erreicht wird.

Es wurde nun gefunden, dass ein kontinuierlicher Einsatz und eine einfache Wiedergewinnung der biologischen Wirkstoffe für die Durchführung enzymatischer Umsetzungen in. einem flüssigen Medium sowie die aufeinanderfolgende Anwendung verschiedener biologischer Wirkstoffe am gleichen Substrat möglich sind, wenn man geformte Gebilde verwendet, die in einem festen Kunststoff eingebettete Enzyme oder enzymhaltige Organismen enthalten, wobei der Kunststoff Poren einer Weite besitzt, welche den Durchtritt des flüssigen Mediums und seiner Bestandteile, nicht aber des Enzyms ermöglichen. Die nicht permeierbare Form des eingebetteten Stoffes wird im allgemeinen dadurch erreicht, dass die Porenweite des Einbettungsmaterials geringer ist als der Durchmesser der eingebetteten Stoffe.

Diese Anordnung ermöglicht den Kontakt von Substrat und Wirkstoff, da das nicht eingebettete Substrat das semipermeable Einbettungsmaterial durchdringen k.'nn. Gleichzeitig ist aber jederzeit durch Trennung von Reaktionsflüssigkeit und geformtem Gebilde auch eine einfache Trennung von Substrat und Wirkstoff möglich.

Die in semipermeables Material eingebetteten und damit gesicherten Wirkstoffe werden den übli- - chen Reaktionsansätzen hinzugefügt. Ausser wässerigen Lösungen ist auch die Anwendung organischer, mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittel möglich. In diesem Fall muss das semipermeable Material vorher ausgiebig gewässert werden. Ausserdem muss das Lösungsmittel wassergesättigt sein.

Als semipermeables Material kann man irgendeine inerte Substanz verwenden, die den Wirkstoff oder Mikroorganismus einzubetten vermag, im Reaktionsmedium unlöslich ist, jedoch dem Substrat freien Durchtritt gestattet. Bewährt haben sich z. B. abgewandelte Naturstoff, wie Cellulosenitrat, -acetat, Äthylcellulose und Kautschukhydrochlorid, oder Kunststoffe, wie Polyamid und Polyvinylacetat. Auch Lipoide eignen sich. Um funktionell einwandfreie Einbettungssubstanzen zu erhalten, ist häufig die Mischung semipermeabler Stoffe notwendig, wie z. B. Lipoid mit Cellulosenitrat. Diese Mischungen ermöglichen eine feinere Anpassung an die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Substrat und Wirkstoff.

Die Wirkstoffe oder Mikroorganismen werden trocken, emulgiert oder gelöst in das im allgemeinen gelöste Einbettungsmaterial eingearbeitet. Dabei erhält man eine Suspension, Emulsion oder Lösung des einzubettenden Materials in der Lösung des Einbettungsmaterials. Der Ansatz wird darauf unter Beachtung der für das einzubettende Gut erforderlichen Vorsicht getrocknet und gegebenenfalls gehärtet, Während des Verfestigungsvorganges erhält das Gemisch die gewünschte Form, beispielsweise durch Ausreichen,
Aufbürsten, Aufspritzen auf andersartiges Material, durch Eintauchen von Arbeitsgeräten zur Herstellung von Überzügen, durch Ausgiessen oder Auswalzen zur Herstellung von Membranen,

durch Zerstäubungtrocknung zur Herstellung von Hohlkugeln oder durch Zerschneiden zur Herstellung von Lamellen oder Füllkörpern für Säulen.

Bei der Einbettung der Wirkstoffe in das semipermeable Einbettungsmaterial muss die Labilität der Wirkstoffe oder Mikroorganismen berücksichtigt werden. Wirkstoffe oder Mikroorganismen, die während der Einbettung in einem offenen System und/oder bei Zimmertemperatur inaktiviert werden, können bei tiefen Temperaturen, im Vakuum oder in einer inerten Gasphase verarbeitet werden.

Besonders bewährt hat sich die Suspendierung eines trockenen Mikropulvers im semipermeablen Material, das in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen ist. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bleibt die wirkstofftragende Membran zurück. Auch in Wasser gelöste Wirkstoffe können je nach den
Eigenschaften des semipermeablen Einbettungsmaterials und dessen Lösungsmittel eingeschlossen werden.

In diesem Falle werden die gelösten Wirkstoffe im gelösten semipermeablen Einbettungsmaterial fein emulgiert. Die Trocknung. bei Kunststoffen auch die Härtung, muss so gelenkt werden, dass die wässerige Phase - meist in Form winziger Tröpfchen-zurückbleibt. Bei lebenden Organismen empfiehlt sich in der Regel eine vorausgehende Gefriertrocknung aus einer Gelatinelösung.

Die äussere Form der geformten Gebilde kann den praktischen Erfordernissen angepasst werden. Besonders geeignet sind Lamellen, Kugeln und Überzüge für Arbeitsgeräte, wie Walzen, Glasgefässe oder Konservendosen. In Reaktionssäulen bewähren sich Kugeln und poröses Material. Zum kontinuierlichen Betrieb in Säulen werden häufig Hohlkugeln (Mikroballons) herangezogen, deren Wände aus wirkstoffhaltigem, semipermeablem Material bestehen, sogenannte Enzymgranula.

Es ist nicht erforderlich, dass die Wirkstoffe in reiner Form eingebettet werden. Auch unreine Präparate können benutzt werden. Die Wirkstoffe von unreinen Präparaten werden häufig im wässerigen Milieu durch unerwünschte Begleitenzyme (z. B. Proteasen) in kurzer Zeit inaktiviert. In eingebetteter Form werden verunreinigte Wirkstoffe jedoch vielfach erheblich langsamer zerstört. Die Einbettung führt ausserdem zu einem fast vollkommenen Schutz vor inaktivierenden Parasiten im Reaktionsansatz. Die geformten Gebilde können durch Zusätze, wie Ionenaustauscher, Redoxsubstanzen, Kunststoffhärter oder Stoffe, die die Permeabilität beeinflussen, verbessert werden.

Die erfindungsgemässen geformten Gebilde besitzen gute Lagerfähigkeit. Sie ermöglichen eine kontinuierlich oder im Schichtverfahren durchgeführte Umsetzung von Substraten auf biologischem Wege bei langer Verwendbarkeit und rascher Abtrennbarkeit des biologischen Wirkstoffes. Man kann daher ein Substrat durch aufeinanderfolgende Kontaktierung mit verschiedenen, eingebetteten, biologischen Wirkstoffen auch stufenweise umsetzen.

Die neuen geformten Gebilde lassen sich beispielsweise für synthetische und analytische Arbeiten oder zur Abwässerreinigung benutzen. Fermentgranula (Mikroballons) in geeigneter Grösse sind für Injektionszwecke brauchbar, wie im Tierversuch gefunden werden konnte.

Die Erfindung ist in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen ohne Beschränkung hierauf näher erläutert.

Beispiel l : Gewinnung von 1-Alanin durch Transaminierung im System 1-Glutaminsäure-Brenztraubensäure mit Enzymlamellen.

Diese Umsetzung verläuft nach dem Schema :
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f Amylalkohol und 3, 70/0 Äthylenglykoläthyläther (alle Angaben in Gew. -0/0). Die Mischung wird auf einer horizontalen, 4 m2 grossen Glasfläche ausgegossen und in einer feuchtigkeitsarmen Atmosphäre bei 22 C im Verlaufe von 75 min getrocknet. Daraufhin wird die Membran 12 h gewässert und in Lamellen von 1 cm2 zerschnitten. Die Membrandicke beträgt 0, 2-0, 3 mm, die Porenweite 5 min.

Die Enzymlamellen werden zu 20 l eines Reaktionsansatzes gegeben, der 0, 05 molar an Natriumpyruvat und 0,05 molar an Natriumglutamat (I-Form) und auf einen PH-Wert von 7, 4 eingestellt und ge-

puffert ist. Dieser Ansatz wird 5-6 h bei 250C inkubiert und daraufhin bei Verwendung der alten Lamellen erneuert. Der gleiche Wechsel wird 28 Tage vorgenommen. Aus der wässerigen kolloidfreien Reaktions- flüssigkeit wird 1-Alanin durch gleichförmige multiplikative Verteilung nach Jantzen abgetrennt. Ausbeu- te 1550 g 1-Alanin.

Zum Vergleich werden die Ergebnisse angeführt, die bei der bisher üblichen Anwendung der Glut- aminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase in kolloidaler Lösung erzielt werden, Das Enzym ist in die- sem Falle nur einmal verwendbar. Aus einem 20-Liter-Ansatz können im Mittel 30 g 1-Alanin gewonnen werden. Bei der 28-tägigen Anwendung der Enzymlamellen ist somit die Ausbeute etwa 50mal grösser.

Beispiel 2 : Kontinuierliche Trennung von d, 1-Methionin durch Spaltung von Acetyl-l-Methionin an einer Enzymsäule mit Aminosäureacylase I.

Acetyl-d, l-methionin wird im kontinuierlichen Verfahren einer asymmetrischen Hydrolyse durch ein
Enzym aus Schweineniere, das in Cellulosenitrat eingebettet ist, unterworfen. Daraufhin trennt man
1-Methionin und Acetyl-d-methionin und hydrolysiert die d-Verbindung.

1 g Aminosäureacylase I (Acetontrockenpulver aus Schweineniere) wird wie in Beispiel 1 behandelt, in einer Cellulosenitratlösung aufgenommen und zu einer 1 mm dicken Membran ausgegossen. Daraus werden mit einer Schneidemaschine unregelmässig gestaltete Teilchen von etwa 1 bis 2 mm Durchmesser hergestellt, die man in eine Glassäule füllt (Durchmesser 2, 5 cm, Länge 25 cm), wie sie für die Ver- teilungschromatographie gebraucht wird. Die Säule wird 6 h mit eiskaltem Wasser gewaschen (Durchlauf etwa 50 ml/h) und anschliessend mit einer 0, 07 m Lösung von Acetyl-d, l-methionin beschickt, deren pH-Wert 7, 4 beträgt.

Der Durchlauf beträgt 50 ml/h. 1-Methionin und ungespaltenesAcetyl-d-methionin werden durch gleichförmige multiplikative Verteilung nach Jantzen im Lösungsmittelgemisch n/10 HC1- Essigsäureäthylester aufgetrennt. 1-Methionin bleibt dabei in der wässerigen Phase. Diese Lösung wird im
Vakuum eingeengt und 1-Methionin mit absolutem Äthylalkohol gefällt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Wasser/Äthylalkohol.

Diese Enzymsäule wird 28 Tage zur kontinuierlichen Razemattrennung benutzt. Es werden 140 g 1-Methionin gewonnen. Wird die gleiche Enzymmenge in der bekannten Weise zur Trennung benutzt, dann beträgt die Ausbeute im einmaligen 24stündigen Ansatz 15 g 1-Methionin.

Beispiel 3 : Enzymatischer Abbau von 8-d-Glucose in frischem Eiweiss aus Hühnerei.

Um die für gewerbliche Zwecke in Betracht kommenden Eigenschaften von Hühnereiweiss zu verbessern, wird die störende ss-d-Glucose durch ein Enzymsystem, das in Cellulosenitrat eingebettet ist, in ö-d-Gluconsäurelacton umgewandelt. Nach der Umsetzung werden die Enzyme vollständig wiedergewonnen und können mehrfach erneut verwendet werden. Das HUhnereiweiss wird annähernd glucosefrei und kann weiterverarbeitet werden.

10 g rohe Glucoseoxydase und 1 g partiell gereinigte Meerrettich-Peroxydase werden wie in Beispiel 1 in eine Cellulosenitratlösung aufgenommen und zu einer etwa 0, 3 mm dicken Membran ausgegossen. Die mittlere Porenweite beträgt 7 mijn. Diese Membran wird in etwa 1 cm2 grosse Lamellen zerschnitten, die für 5 h bei 250C mit 2 kg Hühnereiweiss unter leichtem Rühren inkubiert werden. Nach Beendigung der Umsetzung ist die Glucosekonzentration unter 2 mgllo. Die Enzymlamellen lassen sich leicht vom Eiweiss abtrennen und in wenigstens 6-8 weiteren Ansätzen wiederverwenden.

Ohne diese Fixierung in Lamellen kann das Enzymsystem üblicherweise nicht zurückgewonnen werden.

Bei s piel 4 : Enzymatischer Schutz der Mayonnaise vor oxydativen Prozessen.

Das sauerstoff- und glucoseverbrauchende Enzymsystem Glucoseoxydase/Katalase verhindert in Mayonnaise, solange sie in luftdichten Konservendosen aufbewahrt wird, Geruchs- und Geschmacksverluste und die Bildung von Peroxyden. Die Konservendosen werden mit einer Polyurethanfolie ausgekleidet, in die das Enzymsystem eingebettet ist.

5 g eines penicillinfreien, lyophilisierten Mycels von Penicillium notatum (nach H. Raistrick) vermischt mit 0, 5 g partiell gereinigter Meerrettich-Katalase werden in 200 ml einer Lösung zur Herstellung von Polyurethanfolien (100 Teile Desmophen + 30 Teile Desmodur L) aufgenommen. Mit diesem Gemisch wird eine 1000 mI-Konservendose ausgekleidet. Die Härtung des Films benötigt etwa 24 h bei Zimmertemperatur. 1000 ml schwach saure Mayonnaise können in dieser Dose 5 Monate ohne die sonst bekannten Zersetzungserscheinungen aufbewahrt werden.

Beispiel 5 : Man arbeitet nach Beispiel l, wobei aber die Cellulosenitratlösung durch einen Zusatz von 1,5go Rizinusöl ergänzt wird. Dieser Lipoidzusatz zur Membran verbessert offenbar die semipermeablen Eigenschaften. Die Alaninausbeute wird dabei um im Mittel 7% gesteigert. Ein Nachteil dieser Lipoid/Cellulosenitrat-Membran ist die etwas grössere Anfälligkeit gegen bakterielle Zersetzung beim langdauernden Gebrauch.

Beispiel 6 : Kontinuierliche Spaltung von Saccharose durch Invertase, die in Polyvinylalkohol eingebettet ist.

Saccharose wird im kontinuierlichen Verfahren der Hydrolyse in Glucose und Fructose durch das Enzym Invertase, das in Polyvinylalkohol eingebettet ist ; unterworfen.

2 g partiell gereinigte Invertase werden in 200 ml einer zweigen wässerigen Lösung von Polyvinylalkohol (Mowiol N 70-88) aufgenommen und zu einer etwa 1 mm dicken Membran nach bekannten Verfahren verarbeitet. Daraus werden mit einer Schneidemaschine unregelmässig gestaltete Teilchen von 1 bis 2 mm Grösse hergestellt und in eine Säule gefüllt, wie sie im Beispiel 2 beschrieben worden ist. Diese Säule wird bei Zimmertemperatur mit einer 0, 2'7oigen Lösung von Saccharose in wässerigem n-Butanol beschickt. Der Durchfluss beträgt 40 ml/h.

Diese Enzymsäule wurde 16 Tage ohne Unterbrechung mit Saccharoselösung beschickt. Im Durchlauf konnten nur Spuren Saccharose wiedergefunden werden. Die Ausbeute an Glucose betrug 67% der Theorie.

PATENTANSPRÜCHE : 1. In geformte Gebilde aus festem Kunststoff eingebettete Enzyme oder enzymhaltige Mikroorganismen für die Durchführung enzymatischer Umsetzungen in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoff Poren einer Weite besitzt, welche den Durchtritt des flüssigen Mediums und seiner Bestandteile, nicht aber des Enzyms, ermöglichen.

Claims

2. Geformte Gebilde nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass als Einbettungsmaterial Polyamid oder Polyvinylacetat, abgewandelte Naturstoff, wie Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Äthylcellulose oder Kautschukhydrochlorid, oder Lipoide oder Gemische aus diesen Stoffen vorhanden sind.

3. Geformte Gebilde nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem Ergänzungsstoffe, wie Ionenaustauscher, Redoxsubstanzen, Kunststoffhärter oder-modifizierungsmittel, oder Stoffe, die die Permeabilität beeinflussen, enthalten.

4. Geformte Gebilde nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Hohlkugeln (Mikroballons), Überzüge für Arbeitsgeräte, wie Walzen, Glasgefässe oder Konservendosen, oder als Lamellen ausgebildet sind.

5. Verfahren zur Herstellung der geformten Gebilde nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man aus mindestens einem höhermolekularen Wirkstoff oder wirkstoffhaltigen Organismus oder einem durch biologische Wirkstoffe oder Mikroorganismen veränderbaren Substrat in trockener, emulgierter oder gelöster Form und einem semipermeablen Einbettungsmaterial eine Lösung, Emulsion oder Suspension herstellt und diese unter Trocknung und gegebenenfalls Härtung in die gewünschte Form überführt.

6. Verfahren zur Herstellung der geformten Gebilde nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das einzubettende Material als Mikropulver in einer Lösung des Einbettungsmaterials, vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel, suspendiert und das Lösungsmittel abgedampft oder die Suspension einer Zerstäubungstrocknung unterworfen wird.