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Verfahren zur mikroskopischen Bestimmung der Masse von organischen Zellen
Die abtastende Mikrophotometrie im nahen UV ist für die Biologie und Medizin von praktischer Be- deutung, da es mit ihrer Hilfe möglich ist, Mengenbestimmungen an Einzelzellen und sogar an Zell- bestandteilen auszuführen, was chemischen Methoden wohl auch in Zukunft versagt sein wird. Die eigent- liche Messgrösse ist dabei das Integral der ortsabhängigen Extinktion E (x, y) über ein Gebiet G in der Ein- stellebene des Mikroskops, das nur die interessierende Objekteinzelheit enthält.
Mittels einer der Form des betreffenden Gebietes angepassten und etwa in der Bildebene angebrachten
Blende liesse sich wohl mit einer einfachen Messung der mittlere Transmissionsgrad J des Gebietes G messen. Wegen des logarithmischen Zusammenhanges zwischen Transmissionsgrad und Extinktion kann je- doch daraus nicht exakt auf den Mittelwert der Extinktion E geschlossen und mit diesem und dem Flä- cheninhalt F von G der Integralwert berechnet werden, weil sich dabei ausser im Falle ortsunabhängigen
Transmissionsgrades zu kleine Werte ergeben würden.
Wird G in möglichst kleine Teilgebiet der Grösse - A F aufgeteilt, dann werden die Schwankungen des Transmissionsgrades innerhalb eines Messgebietes ge-
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setzt wird, wobei Ei aus dem nur messbaren Wert von bestimmt wird. Das lässt sich nun durch zeilenförmiges Abtasten des Gebietes G mit einer Blende der Grösse A F (auf die Einstellebene umgerechnet) und Summation der Werte Ei realisieren, wobei dies über Photoplatte und Mikrodensitometer oder direkt photoelektrisch mit Sekundärelektronenvervielfacher und Registrierung geschehen kann.
Eine der Hauptschwierigkeiten dieser bekannten Methoden besteht darin, dass bei der Abtastung das Gebiet G nicht überschrieben wird bzw. dass das Nichtgewünschte nach der Registrierung erkannt und bei der Auswertung ausgeklammert wird. Das ist zwar bei isoliert liegenden Zellen nicht erforderlich, da dann das Umfeld mit E = 0 keinen Beitrag liefert, es ist aber unbestritten, dass die Zelle im Gewebe der allgemeinere Fall ist, der bisher die Anwendung dieser Methode stark eingeschränkt hat.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Arbeitsmethodik zu verbessern. Sie richtet sich auf ein Verfahren zur mikroskopischen Bestimmung der Masse von organischen Zellen innerhalb eines Gewe- bes durch punktweise lichtelektrische Messung der Extinktion, dessen besondere Kennzeichen darin be- stehen, dass zunächst mit Hilfe eines vergrössernden Zeichengerätes eine stark vergrösserte Umrisszeichnung der betreffenden Zelle hergestellt wird, und dass die punktweise Messung der Zelle durch die Konturen der Umrisszeichnung in der Weise gesteuert wird, dass nur eine Abtastung des gewünschten Bereiches des Objektes erfolgt.
Zur Durchführung dieses Verfahrens lässt sich die Weiterentwicklung einer Anordnung verwenden, die bei einem Mikroplanimeter bereits benutzt wurde. Zu diesem Zweck ist im Abbildungsstrahlengang eines Mikroskops eine mit einem Pantographen in Verbindung stehende Schiebelinse angeordnet, deren senkrecht zur optischen Achse erfolgende Bewegungen auf das Schreiborgan des Pantographen in vergrössertem Massstab übertragen werden.
Dabei wird zweckmässig eine derartige Ausführung gewählt, dass die Schiebelinse ohne direkte mechanische Verbindung mit dem Mikroskop im Abbildungsstrahlengang zwischen Objektiv und Okular angeordnet ist. Die Lage der Schiebelinse in Richtung der optischen Achse kann zur Anpassung an die jeweils verwendete Mikroskopoptik oder zum Ausgleich von Vergrösserungsdifferenzen bei Benutzung verschiedener Wellenlängen verstellbar sein.
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Wird bei dieser Anordnung die Schiebelinse über den Pantographen bewegt, so kann man bei Benutzung eines Okulars mit Fadenkreuz einen gewünschten Teil des Objektes in seinen Umrissen abzeichnen, da das ins Okular blickende Auge beim Verschieben der Linse eine scheinbare Objektbewegung gegenüber dem Fadenkreuz bemerkt.
Nach Ausführung der Zeichnung ist es umgekehrt möglich, gewünschte Einzelheiten des Objektes einzustellen oder auch das ganze Präparat abzutasten, wenn man es auf einen Sekundärelektronenvervielfacher mit einer A F entsprechenden Blende abbildet, die sich an der zur Fadenkreuzmitte konjugierten Stelle befindet. Die Grössenordnung des Durchmessers von G ist einige , der Durchmesser der rückprojizierten Messblende beträgt Bruchteile eines jl, das mit dem Pantographen gezeichnete Bild ist jedoch einige Zentimeter gross.
Es ist zweckmässig, zur autmatischen Bewegung des Pantographenstiftes bei der Messung ein Steuergerät zu benutzen, das auf die verschiedene physikalische Beschaffenheit der Konturen der innerhalb und ausserhalb der Umrisszeichnung liegenden Teile einer Steuerplatte anspricht und dabei jeweils eine Umschaltung zur nächsten Abtastzeile vornimmt. Das Steuergerät kann, da die Abtastzeit zur Erzielung eines günstigen Signal-Rauschverhälmisses für die Nachweisgeräte nicht zu kurz bemessen werden darf, mit den Mitteln der Relaistechnik aufgebaut werden.
Zur Durchführung verschiedener zusätzlicher Programme bei der Ausmessung ist es möglich, einen oder mehrere zusätzliche Abtaststifte und Steuerplatten vorzusehen. Die Abtaststifte sind in diesem Falle mechanisch parallelgeschaltet. Auf diese Weise ist es möglich, uninteressante Einschlüsse aus dem abzutastenden Gebiet automatisch aus der Messung herauszunehmen, indem der zusätzliche Abtaststift an den betreffenden Stellen ein elektrisches Signal auslöst, das die Integration unterbricht.
Zur näheren Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens und seiner Durchführungsmöglichkeiten
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vonlichen, während in Fig. 2 der Aufbau eines Gerätes, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren arbeitet, schematisch dargestellt ist.
In Fig. l ist der Strahlengang eines Mikroskops zwischen seiner Objektebene l, einem Objektiv 2, der Zwischenbildebene 3, einem Okular 4 und der Bildebene 5 veranschaulicht. In den Strahlengang ist unterhalb der Zwischenbildebene 3 eine senkrecht zur optischen Achse verschiebbare Linse 6 verhältnismässig langer Brennweite eingefügt, die in den Fig. la und 1b in zwei verschiedenen Stellungen gezeigt ist. Die Linse besitzt eine brechende Wirkung, die an ihrem Rande am stärksten ist und nach ihrer Mitte zu gegen Null abnimmt.
Infolgedessen wird bei einer Verschiebung der Linse 6 senkrecht zur optischen Achse ein durch sie fallender Strahl um einen Winkel abgelenkt, dessen Grösse von seinem Abstand vom Linsenmit-
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dargestellten Lage, in'der ihr Mittelpunkt mit der optischen Achse zusammenfällt, in die Lage gemäss Fig. 1b der Abbildungsstrahlengang in der Weise abgelenkt wird, dass eine scheinbare Verschiebung des Bildes in der Bildebene wie dargestellt, eintritt.
Fig. 2 zeigt als Beispiel schematisch den Aufbau eines Gerätes zur Durchführung des erfindungsgemä- ssen Verfahrens.
Im Abbildungsstrahlengang eines durch ein Objekt 7, ein Objektiv 8 und ein Okular 9 angedeuteten Mikroskops befindet sich eine Schiebelinse 10, die mechanisch mit einem Pantographen 11 in Verbindung steht. Für den Messvorgang ist der Pantograph mit einem Taststift 12 ausgerüstet, der durch ein Steuergerät 13 über eine metallische Steuerplatte 14 geführt wird. Das abzutastende Gebiet des Objektes ist, wie bereits vorher erläutert, mittels des Pantographen auf die Steuerplatte 14 aufgezeichnet worden und mit einem Isolierstoff umrandet. Innerhalb des abzutastenden Gebietes der Platte besteht also metallischer Kontakt zwischen der Steuerplatte 14 und dem Abtaststift 12. Durch das Steuergerät wird der Abtaststift in einzelnen Zeilen über die Steuerplatte geführt.
Bei Unterbrechung des metallischen Kontaktes zwischen Abtaststift und Steuerplatte durch die Isolierstoffumrandung schaltet das Gerät auf eine neue Zeile um und führt den Stift in entgegengesetzter Richtung zurück, bis wiederum nach Erreichen der Isolierstoffumrandung eine Umschaltung erfolgt. Dieser Vorgang wiederholt sich, bis das gesamte umrandete Gebiet der Steuerplatte abgetastet ist, worauf das Steuergerät automatisch abgeschaltet wird.
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