WO2026005351A1 - 내재 내부 대조군으로 corynebacterium spp. 또는 cutibacterium spp.를 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법 - Google Patents

내재 내부 대조군으로 corynebacterium spp. 또는 cutibacterium spp.를 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법

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WO2026005351A1
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sample
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김현중
이혜민
윤소라
이연지
이도경
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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an endogenous internal control nucleic acid, and to a composition for nucleic acid amplification used in the method.
  • Human diseases can be detected through in vitro and in vitro diagnostics.
  • In vitro diagnostics analyze the cause of disease through X-rays, CT scans, and other methods, while in vitro diagnostics analyze the cause of disease through urine, blood, tissue cells, and other methods.
  • In vitro diagnostics include immunochemical diagnostics, self-blood glucose monitoring, point-of-care diagnostics, and molecular diagnostics.
  • molecular diagnostics directly examines genes using techniques like polymerase chain reaction (PCR). This involves extracting nucleic acids containing the pathogen's genetic information from samples such as saliva, blood, or stool from infected individuals, then amplifying these nucleic acids to confirm the presence of disease.
  • PCR polymerase chain reaction
  • molecular diagnostics In molecular diagnostics, accurate and appropriate sample collection is essential for accurate test results. Insufficient sample volume or contamination during sample collection can lead to inaccurate test results, increasing retest rates and delaying test result reporting. Furthermore, as described above, molecular diagnostics involves extracting and amplifying nucleic acids from a sample. If loss occurs during the nucleic acid extraction process or if the sample solution contains substances that inhibit the amplification reaction (e.g., heparin, detergents, protein denaturants, or organic solvents), amplification efficiency will be reduced, preventing sufficient amplification of pathogen nucleic acids. In such cases, despite the presence of pathogens in the sample, the inability to amplify pathogen nucleic acids can result in false negative results. Furthermore, even when using the same sample, different results can be obtained depending on the degree of loss during the nucleic acid extraction process.
  • substances that inhibit the amplification reaction e.g., heparin, detergents, protein denaturants, or organic solvents
  • the present inventors have diligently studied and endeavored to develop a novel internal control that can improve the accuracy of detection by minimizing false negative and false positive judgments in a method for detecting target microorganisms from samples collected from the skin using nucleic acid amplification.
  • the present inventors have experimentally demonstrated that the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. can be successfully used as an internal control for the sample collection process, the nucleic acid extraction process from the sample, and/or the nucleic acid amplification process of the extracted nucleic acid in a method for detecting target microorganisms from samples collected from the skin using nucleic acid amplification, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a method for detecting a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a bacterial nucleic acid selected from the normal skin flora as an endogenous internal control nucleic acid, comprising the following steps:
  • the present inventors have conducted extensive research efforts to develop a novel internal control that can be used in a method for detecting target microorganisms from skin samples using nucleic acid amplification.
  • a novel protocol for detecting target microorganism nucleic acids from skin samples was established using bacterial nucleic acids selected from the normal skin flora as internal control nucleic acids.
  • bacterial nucleic acids selected from the normal skin flora can be used as internal control nucleic acids for the sample collection process, the nucleic acid extraction process, and/or the nucleic acid amplification process of the extracted nucleic acids.
  • normal skin flora as used herein means the entire community of bacteria formed on the skin of a human or animal.
  • the normal skin flora is the normal skin flora of human skin.
  • the normal skin flora may include, but is not limited to, Corynebacterium , Cutibacterium , Staphylococcus , Enhydrobacter , and Micrococcus . More specifically, the normal flora of the skin includes Corynebacterium spp., Cutibacterium spp., Staphylococcus spp., Enhydrobacter spp., and Micrococcus spp., and more specifically, Corynebacterium tuberculostearicum , Corynebacterium simulans , Corynebacterium afermentans , Corynebacterium fastidiosum , Corynebacterium resistens , Cutibacterium acnes , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus capitis , Staphylococcus hominis , Staphylococcus haemolyticus , Staphylococcus warneri ,
  • the present invention provides a method for detecting a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an endogenous internal control nucleic acid, comprising the following steps:
  • the method of the present invention includes the step of (a) collecting and preparing a sample from the skin.
  • sample in this specification means a sample obtained from a human or animal subject for which nucleic acid of a target microorganism is to be detected from a sample collected from the skin by a nucleic acid amplification method.
  • the sample is a sample obtained from a test subject of a human or animal suspected of being infected with a pathogenic microorganism.
  • the animals include, but are not limited to, primates, livestock (e.g., pigs, sheep, cows, horses, and donkeys), laboratory animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, hamsters, and rabbits), pet animals (e.g., dogs and cats), farmed wild animals (e.g., squirrels, foxes, kangaroos, and deer), and birds.
  • livestock e.g., pigs, sheep, cows, horses, and donkeys
  • laboratory animals e.g., rats, mice, guinea pigs, hamsters, and rabbits
  • pet animals e.g., dogs and cats
  • farmed wild animals e.g., squirrels, foxes, kangaroos, and deer
  • the preparation of the sample further comprises a step of extracting nucleic acid from the sample.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” as used herein refers to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer in single-stranded or double-stranded form, wherein the nucleotides include derivatives of natural nucleotides, non-natural nucleotides, or modified nucleotides that can function in the same manner as naturally occurring nucleotides.
  • Nucleic acids can be extracted from the above samples using various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).
  • various nucleic acid extraction kits are commercially available depending on the type of sample, and those skilled in the art can extract nucleic acids from various samples using commercially available kits.
  • the method of the present invention includes a step of performing an amplification reaction of the nucleic acid in the sample using (i) a pair of primers for amplifying the nucleic acid of the target microorganism; and (ii) a pair of primers for amplifying the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp., which is an endogenous internal control nucleic acid.
  • the amplification reaction of the nucleic acid may additionally include (i) a probe for detecting the nucleic acid of the target microorganism; and (ii) a probe for detecting the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp.
  • primer as used herein means an oligonucleotide that acts as an initiation point for synthesis under conditions that induce the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template), i.e., the presence of nucleotides and a polymerizing agent such as a nucleic acid polymerase, and conditions of suitable temperature and pH.
  • template i.e., the presence of nucleotides and a polymerizing agent such as a nucleic acid polymerase, and conditions of suitable temperature and pH.
  • probe as used herein means a single-stranded nucleic acid molecule comprising a portion or portions substantially complementary to a target nucleic acid sequence.
  • the primers or probes used in the present invention may include natural NMPs (i.e., AMP, GMP, CMP, and UMP), natural dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), modified nucleotides, or non-natural nucleotides.
  • natural NMPs i.e., AMP, GMP, CMP, and UMP
  • natural dNMPs i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP
  • modified nucleotides i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP
  • the primer must be sufficiently long to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizing agent.
  • the appropriate primer length depends on several factors, such as temperature, application, and primer source.
  • annealing or “priming” herein refers to the juxtaposition of an oligonucleotide or nucleic acid to a template nucleic acid, which juxtaposition causes a polymerase to polymerize the nucleotides to form a nucleic acid molecule complementary to the template nucleic acid or a portion thereof.
  • complementary means sufficiently complementary that a primer or probe selectively hybridizes to a target nucleic acid molecule under given annealing or hybridization conditions, and includes both substantially complementary and perfectly complementary, and specifically means perfectly complementary.
  • target nucleic acid refers to a nucleic acid molecule that is ultimately to be amplified or detected, and is annealed or hybridized with a primer under specific hybridization conditions.
  • target microorganism refers to a microorganism to be detected in a sample collected from the skin.
  • nucleic acid of target microorganism means the nucleic acid of a microorganism to be detected in a sample collected from the skin.
  • the target microorganism to be detected through the method of the present invention refers to a microorganism present in a sample collected from the skin of a human or animal, and the microorganism may include, but is not limited to, bacteria, yeast, fungi, viruses, protozoans, etc.
  • the target microorganism is a drug-resistant microorganism, a dermatophyte, or methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA).
  • MRSA methicillin-resistant staphylococcus aureus
  • the drug-resistant microorganism is a multidrug resistant organism, and more specifically includes Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , Candida auris , and Stenotrophomonas maltophilia .
  • the nucleic acid of the target microorganism may include, but is not limited to, a DNA molecule or an RNA molecule.
  • the nucleic acid of the target microorganism may include a resistance gene that confers drug resistance, and may include, for example, a mutation of a gene, a resistance gene mediated by a plasmid or a transposon.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. used as the internal control nucleic acid is different from the nucleic acid of the target microorganism to be detected according to the method of the present invention.
  • the method for detecting nucleic acids of target microorganisms can detect 1 to 30, specifically 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5 target microorganism nucleic acids simultaneously, and more specifically, can detect 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 30 target microorganism nucleic acids, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid amplification reaction may use 1 to 30 pairs, specifically 1 to 25 pairs, 1 to 20 pairs, 1 to 15 pairs, 1 to 10 pairs or 1 to 5 pairs of primer pairs for amplification of target microbial nucleic acids, and more specifically, 1 pair, 2 pairs, 3 pairs, 4 pairs, 5 pairs, 6 pairs, 7 pairs, 8 pairs, 9 pairs, 10 pairs, 15 pairs, 20 pairs, 25 pairs or 30 pairs of primer pairs for amplification of target microbial nucleic acids, but is not limited thereto.
  • hybridization refers to the formation of a double-stranded polynucleotide through non-covalent bonding between complementary nucleotide sequences of two single-stranded polynucleotides under certain hybridization conditions or stringent conditions.
  • Hybridization can occur when two nucleic acid sequences have perfect complementarity at the site of hybridization (the site where the double-stranded DNA is formed) or when there is a mismatch (e.g., a mismatch of 1 to 4 bases).
  • the degree of complementarity required for hybridization can vary depending on the conditions of the hybridization reaction, particularly temperature.
  • hybridization and “annealing” are not different and are used interchangeably in this specification.
  • Amplification of target nucleic acid molecules can be performed using various primer-assisted nucleic acid amplification methods known in the art. Specifically, target nucleic acid amplification is performed using polymerase chain reaction (PCR), a PCR method disclosed in U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159. Other examples include ligase chain reaction (LCR) (U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), strand displacement amplification (SDA) (Walker, et al. Nucleic Acids Res.
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA strand displacement amplification
  • DNA polymerases can be used for the nucleic acid amplification of the present invention, including E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase, and bacteriophage T7 DNA polymerase.
  • the DNA polymerase is a thermostable DNA polymerase obtainable from various bacterial species, including Thermus aquaticus ( Taq ), Thermus thermophilus , Thermus filiformis , Thermus flavus, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05, and Thermus species sps 17.
  • amplification of the nucleic acid can be performed by performing PCR.
  • the amplification reaction can be performed by a fast PCR method.
  • fast PCR refers to a PCR method that increases the speed of PCR compared to a general PCR method.
  • the fast PCR can be achieved by controlling various factors such as the extension rate of the DNA polymerase, the temperature change rate (ramp speed) of the thermal cycler, and the complexity of the template.
  • the extension rate of the DNA polymerase used in general PCR, which has a standard extension rate of 1 kb per minute
  • a Taq DNA polymerase with a standard extension rate of 2-4 kb per minute can be used to achieve fast PCR.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. and Cutibacterium spp. may include a nucleotide sequence encoding 16s rRNA or gyrA (DNA gyrase subunit A).
  • the nucleic acid of the Corynebacterium spp. may include a nucleotide sequence encoding 16s rRNA, or the nucleic acid of the Cutibacterium spp. may include a nucleotide sequence encoding gyrA (DNA gyrase subunit A).
  • the nucleic acid of the Corynebacterium spp. comprises the sequence 1 in the sequence listing, or a complementary sequence thereof, or the nucleic acid of the Cutibacterium spp. comprises the sequence 6 in the sequence listing, or a complementary sequence thereof.
  • the Corynebacterium spp. is Corynebacterium tuberculostearicum , Corynebacterium simulans , Corynebacterium afermentans , Corynebacterium fastidiosum , or Corynebacterium resistens , or the Cutibacterium spp. is Cutibacterium acnes , and more specifically, the Corynebacterium spp. is Corynebacterium tuberculostearicum , or the Cutibacterium spp. is Cutibacterium acnes .
  • the 16s rRNA gene sequence of Corynebacterium tuberculostearicum can be found in GenBank accession number X84247.1, and that of Cutibacterium acnes
  • the gyrA gene sequence can be found in GenBank accession number KX650495.1.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. can be used as an internal control for (i) the step of collecting a sample, (ii) the step of extracting nucleic acid from the sample, and/or (iii) the step of amplifying the extracted nucleic acid.
  • the present inventors devised a method for detecting the nucleic acid of a target microorganism in a sample collected from the skin using the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an endogenous internal control nucleic acid.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. is amplified simultaneously with the amplification of the target microbial nucleic acid from a sample collected from the skin in the same reaction vessel.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. can be used as an internal control in each of the above steps. The role of the internal control in each step is described in detail as follows.
  • the sample is not collected properly during the sampling process, for example, if the amount of sample collected is too small to detect nucleic acids, the nucleic acids of the target microorganism may not be detected even if they are present in the sample collected from the skin. This may ultimately result in a false negative result, and such false negative results can be determined by confirming the presence or absence of nucleic acids of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an internal control.
  • nucleic acid loss occurs during the nucleic acid extraction step, i.e., if the amount of nucleic acid extracted as a template for the amplification reaction is insufficient, the efficiency of the amplification reaction may be reduced, resulting in undetectable nucleic acid and false negative results.
  • the presence or absence of nucleic acid from Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an internal control can be used to determine whether a false negative result has occurred.
  • the amplification efficiency may be reduced despite the presence of the target nucleic acid, resulting in a false negative result without detecting the nucleic acid amplification.
  • the presence or absence of a false negative result can be determined by confirming the presence or absence of the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an internal control.
  • the method according to the present invention further comprises a step of amplifying nucleic acid in the collected sample using a pair of primers for amplifying nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp., which is an endogenous internal control nucleic acid, thereby determining whether the collection of the sample is valid or invalid.
  • the method according to the present invention further comprises a step of amplifying nucleic acid extracted from the sample using a pair of primers for amplifying nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp., which is an endogenous internal control nucleic acid, thereby determining whether the extraction is valid or invalid.
  • the amplification reaction of a nucleic acid is carried out in the presence of a label or labeled oligonucleotide (labeled primer or labeled probe) capable of providing a signal dependent on the presence of the nucleic acid to be detected.
  • a label or labeled oligonucleotide labeled primer or labeled probe
  • a signal may be provided from a label during the process of amplifying a nucleic acid to be detected, or a signal may be provided after amplification is completed.
  • the method of the present invention includes the step of (c) detecting the result of the amplification reaction.
  • detection of the amplification reaction result can be performed by a post-amplification detection method or a real-time detection method.
  • the above post-amplification detection method is a method for detecting amplification products after nucleic acid amplification.
  • Post-amplification detection methods include, but are not limited to, methods for separating amplification products by size difference (e.g., electrophoresis) or by immobilizing the amplification products.
  • the above post-amplification detection method may use a post-PCR melting analysis (US Patent No. 5,871,908, US Patent No. 6,174,670 and WO 2012/096523) that monitors the fluorescence intensity while raising or lowering the temperature at a certain interval after amplification of the target nucleic acid sequence and then detects the amplification product by the melting profile.
  • a post-PCR melting analysis US Patent No. 5,871,908, US Patent No. 6,174,670 and WO 2012/096523
  • the above post-amplification detection method or real-time detection method may use a label or labeled oligonucleotide that provides a signal dependent on the presence of the nucleic acid to be detected.
  • detection of an amplified nucleic acid can be performed by detecting a signal provided from a label during the process of amplifying the nucleic acid to be detected or by detecting a signal provided after amplification of the nucleic acid to be detected is completed.
  • Examples of methods using labeled primers include the Sunrise primer method (Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, and U.S. Pat. No. 6,117,635), the Scorpion primer method (Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999, and U.S. Pat. No. 6,326,145), and the TSG primer method (WO 2011/078441).
  • dimer formed dependently on the presence of a target nucleic acid sequence can be obtained by various methods, for example, Invader assay (U.S. Patent Nos.
  • a method can be used to detect one or more target nucleic acid sequences using a single type of label by detecting signals at different temperatures. This is disclosed in WO 2015/147412, WO 2016/093619, and WO 2016/093620, all of which are incorporated herein by reference.
  • the amplification reaction may additionally include (i) a probe for detecting a nucleic acid of the target microorganism; and (ii) a probe for detecting a nucleic acid of the Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp.
  • the amplification reaction may include 1 to 30, specifically 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10 or 1 to 5 target microorganism nucleic acid detection probes, and may include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or 30 target microorganism nucleic acid detection probes, but is not limited thereto.
  • the primer pair or probe of the nucleic acid of Corynebacterium spp. and Cutibacterium spp. comprises a nucleotide sequence that specifically hybridizes to a nucleotide sequence encoding 16s rRNA or gyrA (DNA gyrase subunit A), or a complementary sequence thereof.
  • the primer pair or probe of the nucleic acid of the Corynebacterium spp. comprises a nucleotide sequence that specifically hybridizes to a nucleotide sequence encoding 16s rRNA, or a complementary sequence thereof, or the primer pair or probe of the nucleic acid of the Cutibacterium spp. comprises a nucleotide sequence that specifically hybridizes to a nucleotide sequence encoding gyrA (DNA gyrase subunit A), or a complementary sequence thereof.
  • gyrA DNA gyrase subunit A
  • the term “specifically hybridizes” as used herein means that two or more molecules interact with each other through covalent or non-covalent bonds, for example, the binding of a single-stranded nucleotide molecule having a single-stranded target sequence and a nucleotide sequence complementary thereto.
  • the method of the present invention comprises the steps of (d) determining the validity of the amplification reaction of the target microorganism nucleic acid from the result of the amplification reaction of the internal control nucleic acid; and (i) determining whether the nucleic acid of the target microorganism is present in the sample based on the determined validity and (ii) the result of the amplification reaction of the target microorganism nucleic acid.
  • the validity of the amplification reaction result of the target microbial nucleic acid can be determined based on the amplification reaction result of the internal control group among the results of the amplification reaction.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an internal control according to the present invention should always be amplified and detected by an amplification reaction, regardless of the presence or absence of the nucleic acid of the target microorganism.
  • nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. when a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. is detected as an internal control, it can be determined that the sample collection, nucleic acid extraction, and/or nucleic acid amplification reaction were successfully performed, and the result of the amplification reaction of the target microorganism nucleic acid can be determined to be valid.
  • the nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. is not detected as an internal control, it can be determined that a problem occurred in the process of collecting a sample, extracting nucleic acid, and/or amplifying nucleic acid, and the result of the amplification reaction of the target microorganism nucleic acid can be determined to be an invalid result, i.e., invalid.
  • invalid result refers to a result in which the detection result cannot be interpreted and is therefore treated as invalid, and the subject of a sample determined to have an invalid result can re-conduct the test for detection from the sample collection stage.
  • the result of the amplification reaction of the target microbial nucleic acid can be determined to be invalid.
  • detection of the target microorganism nucleic acid means the presence (positive) of the target microorganism nucleic acid
  • non-detection of the target microorganism nucleic acid in the amplification reaction result means the absence (negative) of the target microorganism nucleic acid
  • the result in which the target microbial nucleic acid is not detected can be judged to be invalid.
  • the result in which the target microbial nucleic acid is detected can be judged to be invalid.
  • nucleic acid amplification efficiency varies depending on the target nucleic acid, and amplification efficiency also varies within the same tube depending on various factors such as the initial amount of nucleic acid in the sample and the size of the amplified product.
  • nucleic acid of the target microorganism When the nucleic acid of the target microorganism is present in a relatively large amount compared to the nucleic acid of the internal control, during the amplification process, essential reagents (e.g., polymerase, dNTP, etc.) are consumed while amplifying the nucleic acid of the excess target microorganism, and the amplification efficiency of the nucleic acid of the internal control is relatively reduced, so that the amplification of the nucleic acid of the internal control may not be detected.
  • essential reagents e.g., polymerase, dNTP, etc.
  • the nucleic acid of the target microorganism may be amplified, while amplification of the endogenous internal control nucleic acid may not be detected.
  • the method of the present invention can be performed by adding an exogenous internal control to a sample collected after sample collection in addition to the internal control described above, and can be performed by including an external positive control and/or an external negative control in the nucleic acid amplification step.
  • the above-mentioned external internal control can be used as a control for the nucleic acid extraction process, the above-mentioned external positive control can be used as a control for the nucleic acid amplification process, and the above-mentioned external negative control can be used as a control for sample contamination and non-specific reactions.
  • the external internal control can be added to the sample after sample collection together with the internal control according to the present invention and used. If the external internal control is detected and the internal control according to the present invention is not detected, the sample collection process can be determined to have failed.
  • the present invention provides a composition for amplifying a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a bacterial nucleic acid selected from the normal skin flora as an endogenous internal control nucleic acid, comprising:
  • a pair of primers for amplifying nucleic acids of bacteria selected from the normal skin flora.
  • composition for amplifying a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a bacterial nucleic acid selected from the normal skin flora as an endogenous internal control nucleic acid is manufactured to carry out the above-described aspect, "a method for detecting a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a bacterial nucleic acid selected from the normal skin flora as an endogenous internal control nucleic acid,” and therefore, the description of common contents between them is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a composition for amplifying a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an endogenous internal control nucleic acid, comprising:
  • composition for amplifying a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an endogenous internal control nucleic acid which is another embodiment of the present invention, is manufactured to carry out the "method for detecting a nucleic acid of a target microorganism from a sample collected from the skin using a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. as an endogenous internal control nucleic acid", and therefore, the common contents between them are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • composition of the present invention described herein may optionally include reagents necessary for performing a target amplification reaction (e.g., a PCR reaction), such as a buffer, a DNA polymerase cofactor, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
  • a target amplification reaction e.g., a PCR reaction
  • the composition of the present invention may also include various polynucleotide molecules, a reverse transcriptase, various buffers and reagents, and an antibody that inhibits DNA polymerase activity.
  • the composition may also include reagents necessary for performing positive and negative control reactions. The optimal amount of reagents to be used in a particular reaction can be readily determined by one of ordinary skill in the art having learned the disclosure herein.
  • the composition of the present invention is manufactured in a separate package or compartment containing the aforementioned components.
  • a nucleic acid of Corynebacterium spp. or Cutibacterium spp. is used as an endogenous internal control nucleic acid.
  • the internal control according to the present invention can be used as an internal control in a sample collection process, an internal control in a nucleic acid extraction process, and an internal control in a nucleic acid amplification process.
  • Figure 1 is a flowchart of processes for implementing the method of the present invention according to one embodiment of the present invention.
  • Example 1 From a sample taken from the skin Corynebacterium tuberculostearicum Check the detection rate
  • the present inventors confirmed that the nucleic acid of Corynebacterium tuberculostearicum , a bacterium selected from normal skin flora, can be used as an endogenous internal control nucleic acid in a method for detecting target microorganisms from a sample collected from the skin using nucleic acid amplification.
  • the nucleic acid detection rate of Corynebacterium tuberculostearicum was confirmed from samples collected from multiple human skin, and compared with the detection rates of Human beta globin (HBB) and Human Bacteroides spp. (HuBac) genes, which have been used as endogenous internal controls.
  • HBB Human beta globin
  • Human Bacteroides spp. Human Bacteroides spp.
  • a nucleic acid encoding 16s rRNA was used as the target nucleic acid of Corynebacterium tuberculostearicum (Table 1).
  • the detection of the nucleic acid was performed using TOCE TM technology (WO 2012/096523), which can detect multiple targets by utilizing signals generated by dimers formed depending on the presence of the target nucleic acid sequence.
  • primer pairs for detecting the target nucleic acid encoding the 16s rRNA of Corynebacterium tuberculostearicum are shown in Table 2.
  • HBB a primer pair for HBB detection (Allplex TM H. pylori & ClariR Assay product) and a PTO and CTO designed based on the primer pair were used.
  • HuBac a primer pair for HuBac detection (Allplex TM Entero-DR Assay product) and a PTO and CTO designed based on the primer pair were used.
  • Example 1-2 Corynebacterium tuberculostearicum Comparison of detection rates of HBB and HuBac
  • eSwab (Cat. No. 480CE; Copan) was used to collect skin samples from each site (2 axillary samples, 2 groin samples, 3 axillary and groin (mixed) samples).
  • Nucleic acid was extracted from the collected skin samples using the automated extraction equipment Seegene NIMBUS (Cat. No. 65415-03) and the extraction reagent STARMag 96X4 Universal Cartridge kit (Cat No. 744300.4.UC384). 300 ⁇ l of sample was used for nucleic acid extraction, and elution was performed in a volume of 100 ⁇ l. The obtained nucleic acid extract was used for real-time polymerase chain reaction.
  • Taq DNA polymerase with 5' nuclease activity was used for extension of forward and reverse primers, cleavage of PTO, and extension of CTO.
  • Corynebacterium tuberculostearicum on nucleic acid extracts obtained from the same sample To compare the detection rates of target nucleic acids and HBB genes and HuBac genes, three tubes containing 5 ⁇ l of the same nucleic acid extract were prepared.
  • the first tube (tube 1) contained the extract of Corynebacterium tuberculostearicum.
  • the same amount of oligonucleotide for detecting Corynebacterium tuberculostearicum (forward and reverse primers, PTO, CTO) as that for detecting HBB was added.
  • the HuBac oligonucleotide 8 pmoles of forward primer, 8 pmoles of reverse primer, 8 pmoles of PTO, 2 pmoles of CTO was added.
  • a reaction mixture was prepared by adding 5 ⁇ l of 4X enzyme mixture [finally 3.2 mM dNTPs, 14 mM MgCl 2 , and 4 U Taq DNA polymerase] and 5 ⁇ l of RNase-free water to each of three tubes to a final volume of 20 ⁇ l.
  • Real-time PCR was performed using the reaction mixture prepared above.
  • the tubes containing the reaction mixtures were placed in a real-time thermocycler (CFX96, Bio-Rad) and denatured at 95°C for 15 min, followed by 45 cycles of 95°C for 10 sec, 60°C for 15 sec, and 72°C for 10 sec. Signal detection was performed at 60°C for each cycle, and the results are summarized in Tables 3 to 7 below.
  • the detection rates of Corynebacterium tuberculostearicum for skin samples collected by site using eSwab TM were 100% for axillary samples, 100% for groin samples, and 100% for axillary and groin (mixed) samples.
  • the detection rates of HBB were 50% for axillary samples, 100% for groin samples, and 100% for axillary and groin (mixed) samples.
  • the detection rates of HuBac were 0% for axillary samples, 100% for groin samples, and 100% for axillary and groin (mixed) samples.
  • the average Ct value of Corynebacterium tuberculostearicum was 30.01 for axillary specimens, 30.55 for inguinal specimens, and 29.83 for axillary and inguinal (mixed) specimens.
  • HBB showed an average Ct value of 41.35 for axillary specimens, 35.62 for inguinal specimens, and 32.23 for axillary and inguinal (mixed) specimens.
  • HuBac showed no detection in axillary specimens, an average Ct value of 37.40 for inguinal specimens, and an average Ct value of 35.15 for axillary and inguinal (mixed) specimens, confirming that the average Ct value of Corynebacterium tuberculostearicum is lower than that of HBB and HuBac.
  • the above detection rate represents the ratio of the number of detected signals to the total number of samples.
  • Example 2 From a sample taken from the skin Cutibacterium acnes Check the detection rate
  • the present inventors confirmed that the nucleic acid of Cutibacterium acnes , a bacterium selected from normal skin flora, can be used as an endogenous internal control nucleic acid in a method for detecting target microorganisms from a sample collected from the skin using nucleic acid amplification.
  • a nucleic acid encoding DNA gyrase subunit A (gyrA) of Cutibacterium acnes was used as the target nucleic acid (Table 8).
  • the detection of the nucleic acid was performed using TOCE TM technology (WO 2012/096523), which can detect multiple targets by utilizing a signal generated by a dimer formed depending on the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the sequences of the primer pairs, PTO (Probing and Tagging Oligonucleotide) and CTO (Capturing and Templating Oligonucleotide), for detecting the target nucleic acid encoding gyrA of Cutibacterium acnes are shown in Table 9.
  • Example 2-2 Cutibacterium acnes Check the detection rate
  • eSwab (Cat. No. 480CE; Copan) was used to collect skin samples from each site (3 axillary samples, 3 groin samples, 3 axillary and groin (mixed) samples).
  • Nucleic acid extraction was performed using the automated extraction equipment Seegene NIMBUS (Cat. No. 65415-03) and the extraction reagent STARMag 96X4 Universal Cartridge kit (Cat No. 744300.4.UC384). 300 ⁇ l of sample was used for nucleic acid extraction, and elution was performed in a volume of 100 ⁇ l. The obtained nucleic acid extract was used for real-time polymerase chain reaction.
  • Tubes containing 5 ⁇ l of target nucleic acid extract of Cutibacterium acnes were prepared for nucleic acid extracts obtained from the same sample.
  • Tube 1 contained Cutibacterium acnes.
  • 4 pmoles of the forward primer (Sequence 7), 4 pmoles of the reverse primer (Sequence 8), 3 pmoles of PTO (Sequence 9), and 2 pmoles of CTO (Sequence 10) were added.
  • the detection rates of Cutibacterium acnes for skin samples collected by site using eSwab TM were 100% for the axillary samples, 100% for the groin samples, and 100% for the axillary and groin (mixed) samples.
  • the average Ct value of Cutibacterium acnes for the axillary samples was 35.43
  • the average Ct value for the groin samples was 34.73
  • the average Ct value for the axillary and groin (mixed) samples was 32.89.
  • the present inventors detected Acinetobacter baumannii as a skin microorganism, and used the oligonucleotide included in the AllplexTM MDRO Assay product (Seegene Inc, Korea) as an oligonucleotide for detecting Acinetobacter baumannii nucleic acid, and used the same oligonucleotide as used in Example 1 as an oligonucleotide for detecting internal control nucleic acid.
  • Example 3-1 As an internal control Corynebacterium tuberculostearicum Use of
  • this experiment used skin samples previously confirmed to be positive for Acinetobacter baumannii using aerobic culture and MALDI-TOF mass spectrometry, which are recognized as standard methods for detecting drug-resistant microorganisms.
  • the samples were cultured for 24 hours at 37°C under aerobic conditions using CHROMagar Acinetobacter medium for the selective isolation and identification of Acinetobacter bacteria.
  • Extraction of nucleic acids from the collected skin samples was performed using an automated extraction device, Microlab NIMBUS IVD (Cat. No. 65415-02, Hamilton) and an extraction reagent, STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit (Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene Inc.). 300 ⁇ l of each sample was used for nucleic acid extraction, and elution was performed in a volume of 100 ⁇ l. The obtained nucleic acid extracts were used for real-time polymerase chain reaction.
  • Taq DNA polymerase with 5' nuclease activity was used for extension of forward and reverse primers, cleavage of PTO, and extension of CTO.
  • Corynebacterium tuberculostearicum nucleic acid can be useful as an endogenous internal control in the detection process of Acinetobacter baumannii.

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Abstract

본 발명은 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 핵산 증폭용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 내재 내부 대조군은 처음부터 시료 내에 존재하여, 시료 채취 이후에 별도로 추가해야 하는 번거로움이 없으며, 시료 채취 과정의 내부 대조군, 핵산 추출 과정의 내부 대조군 및 핵산 증폭 과정의 내부 대조군으로 이용할 수 있다. 또한, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군으로 이용함으로써, 위음성 및 위양성 판단을 최소화하여 피부로부터 채취한 시료 내의 타겟 미생물 핵산의 존재 여부를 높은 정확도로 검출할 수 있다.

Description

내재 내부 대조군으로 CORYNEBACTERIUM SPP. 또는 CUTIBACTERIUM SPP.를 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법
관련출원에 대한 교차참조
본 특허출원은 2024년 06월 27일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제2024-0084882호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원들의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
기술분야
본 발명은 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 핵산 증폭용 조성물에 관한 것이다.
인간의 질병은 체내진단과 체외진단을 통해 검출할 수 있다. 체내진단으로는 X선과 CT촬영 등을 통해서 질병의 원인을 분석하며, 체외진단은 소변, 혈액, 조직세포 등을 통해 질병의 원인을 분석한다.
체외진단에는 면역 화학적 진단, 자가 혈당 측정, 현장진단, 분자진단 등이 있다. 이 중 분자 진단은 유전자 증폭기술인 PCR 등을 이용해 유전자를 직접 검사하는 기법으로, 바이러스나 세균에 감염된 사람의 타액, 혈액, 분변 등과 같은 시료에서 병원체의 유전자 정보를 담고 있는 핵산을 추출한 후, 이를 증폭하여 질병 감염 여부를 확인한다. 이러한 분자진단은 혈액검사 또는 소변검사보다 정확도가 높으며 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점이 있으며, 질병의 조기 진단을 통한 예방과 효율적인 치료를 가능하게 한다.
분자진단에서 정확한 검사 결과를 위해서는 검사에 대한 적절하고 정확한 시료의 채취가 필수적이다. 만약, 시료 채취 시, 시료의 용량이 부족하거나, 시료가 오염된 경우, 부정확한 검사 결과를 초래하여 재검율을 증가시키고 검사 결과 보고를 지연시킬 수 있다. 또한, 분자진단은 상술한 바와 같이, 시료로부터 핵산을 추출하여 증폭하는 과정을 포함하고 있는데, 핵산 추출 과정에서 손실이 발생하거나, 증폭 반응을 저해하는 물질 (예를 들면, 헤파린, 계면 활성제, 단백질 변성제 또는 유기 용매 등)이 시료 용액 내에 포함되어 있는 경우, 증폭 효율이 저하되기 때문에 병원체의 핵산을 충분히 증폭할 수 없게 된다. 이러한 경우, 시료 중에 병원체가 존재함에도 불구하고, 병원체의 핵산을 증폭할 수 없어 위음성(False Negative) 결과를 초래할 수 있으며, 동일한 시료를 이용한 경우라도, 핵산 추출 과정의 손실 정도에 따라 다른 결과가 얻어질 가능성이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정, 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내부 대조군을 이용하여 위음성을 확인하는 방법이 개발되었다(미국 등록 특허 제 5,770,360호). 시료에 항상 존재하거나 핵산 추출 전에 시료에 추가되는 핵산을 내부 대조군으로 이용하여, 시료 내 병원체의 존재 여부와 상관없이 대조군의 핵산은 항상 추출 및 증폭되어 검출되도록 한다. 내부 대조군의 핵산의 미검출은 추출과정에서 손실이 발생하였거나, PCR 억제물질에 의한 증폭 저하로 인해 위음성이 발생하였음을 확인할 수 있도록 한다.
본 발명자들은 인간 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물을 검출하는 데 있어, 종래 인간 세포에 존재하여 내재 내부 대조군으로 이용되고 있는 HBB 및 HuBac을 이용한 결과, 검출율이 낮아 내재 내부 대조군으로 이용할 수 없음을 확인하였고, 이에 새로운 내재 내부 대조군 개발의 필요성을 인식하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물을 검출하는 방법에서 위음성 및 위양성 판단을 최소화하여 검출의 정확성을 향상시킬 수 있는 신규한 내재 내부 대조군을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물을 검출하는 방법에 있어서, 시료를 채취하는 과정, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내재 내부 대조군으로서 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 성공적으로 이용할 수 있음을 실험적으로 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물(target microorganism)의 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물(target microorganism)의 핵산을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 피부로부터 시료를 채취하여 준비하는 단계;
(b) (ⅰ) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ⅱ) 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산인 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행하는 단계;
(c) 상기 증폭 반응의 결과를 검출하는 단계; 및
(d) 상기 내재 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 결과로부터 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고; 및 (ⅰ) 상기 판단된 유효성 및 (ⅱ) 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 타겟 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단하는 단계.
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물을 검출하는 방법에 사용될 수 있는 신규한 내재 내부 대조군을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 피부에 상재하는 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출할 수 있는 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면, 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산은 시료를 채취하는 과정, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내재 내부 대조군으로 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부의 정상세균총"은 인간 또는 동물의 피부에 형성된 세균 전체의 군집을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 피부의 정상세균총은 인간의 피부의 정상세균총이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 피부의 정상세균총은 Corynebacterium, Cutibacterium, Staphylococcus, Enhydrobacter 및 Micrococcus 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 피부의 정상세균총은 Corynebacterium spp., Cutibacterium spp., Staphylococcus spp., Enhydrobacter spp., 및 Micrococcus spp.을 포함하며, 보다 더 구체적으로 Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium fastidiosum, Corynebacterium resistens, Cutibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus warneri, Enhydrobacter aerosaccus, 및 Micrococcus luteus을 포함하며, 보다 더욱 더 구체적으로, Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium fastidiosum, Cutibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus hominis, Enhydrobacter aerosaccus, 및 Micrococcus luteus을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물(target microorganism)의 핵산을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 피부로부터 시료를 채취하여 준비하는 단계;
(b) (ⅰ) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ⅱ) 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산인 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행하는 단계;
(c) 상기 증폭 반응의 결과를 검출하는 단계; 및
(d) 상기 내재 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 결과로부터 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고; 및 (ⅰ) 상기 판단된 유효성 및 (ⅱ) 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 타겟 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단하는 단계.
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물을 검출하는 방법에 사용될 수 있는 신규한 내재 내부 대조군을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출할 수 있는 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산은 시료를 채취하는 과정, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내재 내부 대조군으로 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.는 피부의 정상세균총이다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 본 발명의 방법을 실시하는 과정들의 흐름도이다. 본 발명의 방법을 도 1을 참조하여 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 피부로부터 시료를 채취하여 준비( 110 )
우선, 본 발명의 방법은 (a) 피부로부터 시료를 채취하여 준비하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "시료"란 핵산 증폭 방법에 의해 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하고자 하는 인간 또는 동물의 검사 대상(subject)으로부터 얻은 시료를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 시료는 피부의 습한 부위(moist sites), 건조한 부위(dry sites) 또는 기름진 부위(oily sites)에서 채취된다. 보다 구체적으로, 상기 단계 (a)의 시료는 피부의 습한 부위에서 채취되며, 보다 더 구체적으로, 상기 피부의 습한 부위는 겨드랑이, 팔오금(antecubital fossa), 배꼽, 사타구니, 다리오금(popliteal fossa) 또는 발바닥이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료는 병원성 미생물의 감염이 의심되는 인간 및 동물의 검사 대상으로부터 얻은 시료이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 영장류, 가축들(예를 들어, 돼지, 양, 소, 말 및 당나귀), 실험용 동물들(예를 들어, 쥐, 생쥐, 기니피크, 햄스터 및 토끼), 애완용 동물들(예를 들어, 개 및 고양이), 사육 야생 동물들(예를 들어, 다람쥐, 여우, 캥거루 및 사슴) 및 조류 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시료 내의 핵산은 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 없이 직접 분석될 수 있다. 예컨대, Pannacio et al.(Nucleic Acids Res. 1993 September 25; 21(19): 4656) 및 Pandori et al.(BMC Infect Dis. 2006 Jun 24;6: 104)에 개시된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료의 준비는 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일-가닥 형태 또는 이중-가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머를 지칭하며, 상기 뉴클레오타이드는 자연(naturally occurring) 뉴클레오타이드와 동일한 방식으로 기능(function)할 수 있는 자연 뉴클레오타이드의 유도체, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 시료로부터 핵산을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있다. 또한, 시료의 종류에 따른 다양한 핵산 추출용 키트가 시판되고 있으며, 당업자는 시판 키트를 이용하여 다양한 시료로부터 핵산을 추출할 수 있다.
단계 (b): 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행( 120 )
그 다음, 본 발명의 방법은 (ⅰ) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ⅱ) 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산인 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 핵산의 증폭 반응은 (i) 상기 타겟 미생물의 핵산 검출용 프로브; 및 (ii) 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 검출용 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 핵산 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머 또는 프로브는 자연 NMPs (즉, AMP, GMP, CMP 및 UMP), 자연 dNMPs(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있도록 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다.
본 명세서에서 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 지칭하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 분자에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 핵산 분자"는 최종적으로 증폭 또는 검출하고자 하는 핵산 분자를 지칭하며, 특정의 혼성화 조건하에서 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "타겟 미생물"은 피부로부터 채취한 시료에서 검출하고자 하는 미생물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "타겟 미생물의 핵산"은 피부로부터 채취한 시료에서 검출하고자 하는 미생물의 핵산을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 통해 검출하고자 하는 타겟 미생물은 인간 또는 동물의 피부로부터 채취한 시료에 존재하는 미생물을 의미하며, 상기 미생물은 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 원생동물(protozoan) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 미생물은 약물 내성 미생물(drug-resistant microorganism), 피부사상균(dermatophyte) 또는 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약물 내성 미생물은 다약제 내성 미생물(multidrug resistant organism)이며, 보다 구체적으로 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 칸디다 아우리스(Candida auris), 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)를 포함한다.
상기 타겟 미생물의 핵산은 DNA 분자 또는 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 미생물의 핵산은 약물 내성을 나타내게 하는 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예컨대, 유전자의 변이, 플라스미드(plasmid) 또는 트랜스포존(transposon)이 매개하는 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내재 내부 대조군 핵산으로서 사용되는 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산은 본 발명의 방법에 따라 검출하고자 하는 타겟 미생물의 핵산과 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 타겟 미생물의 핵산 검출 방법은 1 내지 30개, 구체적으로 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개 또는 1 내지 5개의 타겟 미생물 핵산을 동시에 검출할 수 있으며, 보다 구체적으로, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개의 타겟 미생물 핵산을 검출할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 증폭 반응은 1 내지 30쌍, 구체적으로 1 내지 25쌍, 1 내지 20쌍, 1 내지 15쌍, 1 내지 10쌍 또는 1 내지 5쌍의 타겟 미생물 핵산의 증폭용 프라이머 쌍을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로, 1쌍, 2쌍, 3쌍, 4쌍, 5쌍, 6쌍, 7쌍, 8쌍, 9쌍, 10쌍, 15쌍, 20쌍, 25쌍 또는 30쌍의 타겟 미생물 핵산의 증폭용 프라이머 쌍을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "혼성화"는 소정의 혼성화 조건 또는 엄격 조건 하에 2개의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드가 상보적인 뉴클레오타이드 서열 간의 비공유 결합을 통해 이중-가닥을 형성하는 것을 지칭한다.
혼성화는 2개의 핵산 서열 간에 혼성화가 일어나는 부위(이중-가닥을 형성하는 부위)에서의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 미스매치(mismatch) 염기(예를 들어, 1-4의 미스매치)가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절된다.
본 명세서에서 용어"혼성화"와 "어닐링"은 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
타겟 핵산분자의 증폭은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관여 핵산 증폭 방법들에 따라 실시될 수 있다. 구체적으로, 타겟 핵산의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되며, PCR 방법은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시되어 있다. 다른 예로는 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction (LCR)) (미국특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification (SDA)) (Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993)), 전사 매개 증폭(transcription-mediated amplification) (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), 염기순서기반증폭(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)) (Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991)), 롤링서클 증폭(rolling circle amplification, RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999); Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) 및 Q-beta 레플리카제(Q-Beta Replicase) (Lizardi et al., BiolTechnology 6:1197 (1988)) 등이 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 핵산 증폭에 이용될 수 있으며, 이는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 상기 DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05 및 Thermus species sps 17를 포함한다.
본 발명의 일 구현에에 따르면, 상기 핵산의 증폭은 PCR을 행하여 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 fast PCR 방법에 의해 실시될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "fast PCR"은 일반 PCR 방법에 비해 PCR의 속도를 높인 PCR 방법을 지칭한다. 상기 fast PCR은 DNA 중합효소의 연장 속도(extension rate), 열순환기기의 온도변화속도(ramp speed) 및 주형의 복합성 (complexity) 등과 같은 다양한 인자들을 조절하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 분당 1kb의 표준 연장 속도를 갖는 일반 PCR에 사용되는 Taq DNA 중합효소 대신, 분당 2-4kb의 표준 연장 속도를 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하여 Fast PCR을 달성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.의 핵산은 16s rRNA 또는 gyrA(DNA gyrase subunit A)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp. 의 핵산은 16s rRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있거나, 상기 Cutibacterium spp.의 핵산은 gyrA(DNA gyrase subunit A)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 다른 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp.의 핵산은 서열목록 제 1 서열, 또는 이의 상보적인 서열을 포함하거나, 상기 Cutibacterium spp.의 핵산은 서열목록 제 6 서열, 또는 이의 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp.는 Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium fastidiosum, 또는 Corynebacterium resistens 이거나, 상기 Cutibacterium spp.는 Cutibacterium acnes 이고, 보다 구체적으로, 상기 Corynebacterium spp.는 Corynebacterium tuberculostearicum 이거나, 상기 Cutibacterium spp.는 Cutibacterium acnes 이다.
구체적인 예시로서, Corynebacterium tuberculostearicum의 16s rRNA 유전자 서열은 GenBank 접근 번호 X84247.1 등에서 확인할 수 있고, Cutibacterium acnes의 gyrA 유전자 서열은 GenBank 접근 번호 KX650495.1 등에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산은 (ⅰ) 시료를 채취하는 단계, (ⅱ) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 및/또는 (ⅲ) 추출된 핵산을 증폭하는 단계에 대한 내재 내부 대조군으로 이용될 수 있다.
본 발명자들은 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.가 피부에 상재하고 있음을 근거로 하여, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재(endogenous) 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료에서 타겟 미생물의 핵산을 검출할 수 있는 방법을 고안하였다.
본 발명에서 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp. 의 핵산은 동일한 반응 용기 내에서 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물 핵산의 증폭과 동시에 증폭된다. 이때, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp. 의 핵산의 증폭이 검출되지 않으면, 시료를 채취하는 단계, 핵산을 추출하는 단계, 및 시료 내의 핵산을 증폭하는 단계 중 적어도 어느 하나의 단계에서 목적하는 과정(process)이 정상적으로 일어나지 않았음을 시사할 수 있다. 따라서, 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp. 의 핵산은 상기 각 단계의 내부 대조군으로 사용될 수 있다. 각 단계에서의 내부 대조군으로서의 역할을 상술하면 다음과 같다.
(i) 시료를 채취하는 단계에서의 내부 대조군:
시료를 채취하는 단계에서 시료가 적절하게 채취되지 않은 경우, 예를 들어, 채취된 시료의 양이 핵산을 검출하기에 너무 적은 경우에는 피부로부터 채취한 시료 내에 타겟 미생물의 핵산이 존재할지라도 타겟 미생물의 핵산이 검출되지 않을 수 있다. 이는 결국 위음성의 결과를 초래할 수 있으며, 이러한 위음성은 내부 대조군으로서 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산의 존재 유무를 확인함으로써 판단할 수 있다.
(ii) 핵산 추출 단계에서의 내부 대조군:
핵산 추출 단계에서 핵산의 손실이 발생한 경우, 즉, 증폭 반응을 위한 주형으로서 추출된 핵산의 양이 부족한 경우, 증폭 반응의 효율이 저하되어 핵산이 검출되지 않고 위음성의 결과를 초래할 수 있다. 이러한 경우, 내부 대조군으로서 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산의 존재 유무를 확인함으로써 위음성 여부를 판단할 수 있다.
(iii) 핵산 증폭 단계에서의 내부 대조군:
핵산 증폭 과정에서 증폭 반응 용액 내에 증폭 반응을 저해하는 물질 (예를 들면, 헤파린, 계면 활성제, 단백질 변성제, 유기 용매 등)이 포함되어 있는 경우, 타겟 핵산이 존재함에도 불구하고 증폭 효율이 저하되어 핵산 증폭이 검출되지 않고 위음성 결과를 초래할 수 있다. 이러한 경우, 내부 대조군으로서 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산의 존재 유무를 확인함으로써 위음성 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 내재 내부 대조군 핵산인 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 채취된 시료 내 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 시료의 채취가 유효(valid) 또는 무효(invalid)인지를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 내재 내부 대조군 핵산인 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료로부터 추출된 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 추출이 유효 또는 무효인지를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 핵산의 증폭 반응은 검출하고자 하는 핵산의 존재에 의존적으로 시그널을 제공할 수 있는 표지 또는 표지된 올리고뉴클레오타이드 (표지된 프라이머 또는 표지된 프로브의) 존재 하에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출하고자 하는 핵산이 증폭되는 과정에서 표지로부터 시그널이 제공되거나 증폭이 완료된 후 시그널이 제공될 수 있다.
단계 (c): 증폭 반응의 결과를 검출( 130 )
그 다음, 본 발명의 방법은 (c) 상기 증폭 반응의 결과를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 핵산의 증폭 반응의 결과는 핵산이 증폭되는 과정에서 검출되거나 핵산 증폭반응이 완료된 후 검출될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과의 검출은 포스트-증폭 검출 방법 또는 실시간 검출 방법으로 실시될 수 있다.
상기 포스트-증폭 검출 방법은 핵산 증폭 후 증폭산물을 검출하는 방법이다. 포스트-증폭 검출 방법은 예를 들어 증폭산물을 크기 차이에 의해 분리하거나(예를 들어, 전기영동 방법) 또는 증폭산물의 고정화에 의하여 분리하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 포스트-증폭 검출 방법은 타겟 핵산 서열의 증폭 후 일정 구간에서 온도를 올리거나 내리면서 형광 세기를 모니터링한 다음, 멜팅 프로파일(melting profile)에 의해 증폭산물을 검출하는 post-PCR 멜팅 분석(미국 특허 제5,871,908호, 미국 특허 제6,174,670호 및 WO 2012/096523)이 사용될 수 있다.
상기 실시간 검출 방법은 실시간 방식으로 타겟 핵산의 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 방법이다.
상기 포스트 증폭 검출 방법이나 실시간 검출 방법은 검출하고자 하는 핵산의 존재에 의존적으로 시그널을 제공하는 표지 또는 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭된 핵산의 검출은 검출하고자 하는 핵산이 증폭되는 과정에서 표지로부터 제공되는 시그널을 검출하거나 검출하고자 하는 핵산의 증폭이 완료된 후 제공되는 시그널을 검출하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 타겟 핵산 서열의 증폭산물(amplicon)인 이합체(duplex)에 비특이적으로 인터칼레이팅되는 비특이적 형광염료를 이용하여 행할 수 있다.
또한, 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 표지된 프라이머 또는 표지된 프로브를 이용할 수 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
표지된 프로브를 이용한 방법의 예로는 헤어핀 구조를 형성하는 이중 표지된 프로브를 이용하는 분자 비콘(Molecular beacon) 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 공여체(donor) 또는 수여체(acceptor)로 단일 표지된 두 개의 프로브를 이용하는 혼성화 프로브(Hybridization probe) 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하는 Lux 방법(미국특허 제7,537,886호), 이중 표지된 프로브의 혼성화 뿐만 아니라 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제활성에 의한 이중 표지된 프로브의 절단반응을 이용하는 TaqMan 방법(미국특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체를 이용하여 행할 수 있다. 상기 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 증폭 반응에 의해 형성되는 타겟 서열의 증폭산물 그 자체는 아니며, 타겟 핵산서열의 증폭에 비례하여 그 양이 증가하는 이합체이다. 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 다양한 방법에 따라 얻을 수 있으며, 예컨대, Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 방법(WO 2012/096523), PCEC(PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage) 방법(WO 2012/134195), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-SC(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage) 방법(WO 2013/157821), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818), PCE-IH(PTO Cleavage and Extension-dependent Immobilized Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2015/008985) 방법에 의해 얻을 수 있으며, 상기 특허문헌들은 본 명세서에서 참조문헌으로 삽입된다.
또한, 타겟의 실시간 검출을 위하여, 상이한 온도에서의 시그널 검출을 이용하여 단일 유형의 표지만으로 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 사용할 수 있다. 이에 대한 내용은 WO 2015/147412, WO 2016/093619, WO 2016/093620에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌들은 본 명세서에 참조문헌으로 삽입된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 (i) 상기 타겟 미생물의 핵산 검출용 프로브; 및 (ii) 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 검출용 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 1 내지 30개, 구체적으로 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개 또는 1 내지 5개의의 타겟 미생물의 핵산 검출용 프로브를 포함할 수 있으며, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개 또는 30개의 타겟 미생물 핵산의 검출용 프로브를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.의 핵산의 프라이머쌍 또는 프로브는 16s rRNA 또는 gyrA(DNA gyrase subunit A)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 Corynebacterium spp. 의 핵산의 프라이머쌍 또는 프로브는 16s rRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 Cutibacterium spp.의 핵산의 프라이머쌍 또는 프로브는 gyrA(DNA gyrase subunit A)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 Corynebacterium spp.의 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 Cutibacterium spp.의 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 6 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어"특이적으로 혼성화"는 2 이상의 분자가 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 서로 상호 작용하는 것을 의미하는 것으로, 예를 들면 단일 가닥 타겟 서열 및 이와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단일 가닥 뉴클레오타이드 분자의 결합일 수 있다.
단계 (d): 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고 타겟 미생물의 존재 여부를 판단( 140 )
마지막으로, 본 발명의 방법은 (d) 상기 내재 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 결과로부터 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고; 및 (ⅰ) 상기 판단된 유효성 및 (ⅱ) 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 타겟 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 증폭 반응의 결과 중 내재 내부 대조군의 증폭 반응 결과에 따라, 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응 결과의 유효성을 판단할 수 있다.
통상적으로, 본 발명에 따른 내재 내부 대조군으로서의 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산은 타겟 미생물의 핵산 존재 여부와 상관없이, 항상 증폭 반응에 의해 증폭되고 검출되어야 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 내재 내부 대조군으로서 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산이 검출되는 경우, 시료의 채취, 핵산의 추출 및/또는 핵산의 증폭 반응이 성공적으로 수행되었다고 판단할 수 있으며, 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 유효(valid)하다고 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 내재 내부 대조군으로서 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산이 검출되지 않은 경우, 시료의 채취, 핵산 추출 및/또는 핵산의 증폭 과정에서 문제가 발생하였다고 판단할 수 있으며, 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 유효하지 않는 결과, 즉 무효(invalid)인 것으로 판단할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유효하지 않은 결과(invalid result)"란 검출 결과가 해석(interpretation)될 수 없어 무효로 처리되는 결과를 지칭하며, 유효하지 않은 결과로 판단된 시료의 검사 대상자(subject)는 시료 채취 단계부터 검출을 위한 실험(test)을 다시 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내재 내부 대조군 핵산이 검출되지 않은 경우, 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 무효인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내재 내부 대조군 핵산이 검출된 경우, 상기 타겟 미생물 핵산의 검출은 상기 타겟 미생물의 핵산의 존재(양성)를 의미하고, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 타겟 미생물 핵산의 미검출은 상기 타겟 미생물의 핵산이 존재하지 않음(음성)을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내재 내부 대조군 핵산이 검출되지 않은 경우, 상기 타겟 미생물 핵산이 검출되지 않은 결과에 대하여 무효인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내재 내부 대조군 핵산은 검출되지 않은 경우, 상기 타겟 미생물 핵산이 검출된 결과에 대하여 무효인 것으로 판단할 수 있다.
일반적으로 핵산 증폭 효율은 타겟 핵산에 따라 상이하며, 시료 내 초기 핵산 량, 증폭산물의 크기 등과 같은 다양한 인자들에 따라 동일 튜브 내에서도 증폭 효율이 서로 상이하다.
타겟 미생물의 핵산이 내재 내부 대조군 핵산보다 상대적으로 과량으로 존재하는 경우, 증폭 과정에서 과량의 타겟 미생물의 핵산을 증폭하면서 필수 시약(예컨대, 중합효소, dNTP 등)을 소모시키고 내재 내부 대조군의 핵산은 상대적으로 증폭 효율이 저하되어 내재 내부 대조군 핵산의 증폭이 검출되지 않는 경우가 발생할 수 있다.
즉, 이와 같은 경우 시료 내에 내재 내부 대조군 핵산이 존재함에도 불구하고, 타겟 미생물의 핵산은 증폭되는 반면 내재 내부 대조군 핵산의 증폭은 검출되지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내재 내부 대조군 핵산은 검출되지 않고, 상기 타겟 미생물 핵산이 검출된 결과에 대하여 상기 타겟 미생물의 핵산이 존재(양성)하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은, 전술한 내재 내부 대조군 이외에, 시료 채취 후에 채취된 시료에 외래 내부 대조군(exogenous internal control)을 추가(add)하여 실시할 수 있으며, 핵산 증폭 단계에서 외부 양성 대조군 (positive control) 및/또는 외부 음성 대조군 (negative control)을 포함시켜 실시할 수 있다.
상기 외래 내부 대조군은 핵산 추출 과정의 대조군으로서 사용될 수 있고, 상기 외부 양성 대조군은 핵산 증폭 과정의 대조군으로서 사용될 수 있으며, 상기 외부 음성 대조군은 시료의 오염 및 비특이적 반응에 대한 대조군으로 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 내재 내부 대조군과 함께 시료 채취 후 시료에 외래 내부 대조군을 추가하여 사용할 수 있으며, 외래 내부 대조군은 검출되고 본 발명에 따른 내재 내부 대조군은 검출되지 않은 경우, 시료의 채취 과정이 실패한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다:
(i) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및
(ii) 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍.
상기 본 발명의 또 다른 양태인 "피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물"은 상술한 일 양태인"피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법"을 실시하기 위해 제조되므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다:
(i) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및
(ii) Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍.
상기 본 발명의 다른 양태인 "Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물"은 상술한 일 양태인"Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법"을 실시하기 위해 제조되므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 조성물은 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 조성물은 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 조성물은 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 따른 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법에 있어서, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용한다.
(b) 본 발명에 따른 내재 내부 대조군은 시료 채취 과정의 내부 대조군, 핵산 추출 과정의 내부 대조군 및 핵산 증폭 과정의 내부 대조군으로 이용될 수 있다.
(c) 본 발명에 따른 내재 내부 대조군은 처음부터 시료 내에 존재하여, 시료 채취 과정 이후에 내부 대조군을 별도로 추가해야 하는 번거로움이 없다.
(d) 본 발명에 따르면, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군으로 이용함으로써, 위음성 및 위양성 판단을 최소화하여 피부로부터 채취한 시료 내의 타겟 미생물 핵산의 존재 여부를 높은 정확도로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 본 발명의 방법을 실시하는 과정들의 흐름도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 피부로부터 채취한 시료로부터 Corynebacterium tuberculostearicum 의 검출율 확인
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물 검출 방법에 있어서, 피부 정상세균총으로부터 선택된 박테리아인 Corynebacterium tuberculostearicum 의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 사용할 수 있는지 확인하였다.
이를 위하여, 복수의 인간의 피부에서 채취한 시료로부터 Corynebacterium tuberculostearicum 의 핵산 검출율을 확인하였으며, 이를 종래 내재 내부 대조군(Endogenous Internal Control)으로 사용되고 있는 Human beta globin(HBB) 및 Human Bacteroides spp.(HuBac) 유전자의 검출율과 비교하였다.
실시예 1-1: 올리고뉴클레오타이드의 준비
Corynebacterium tuberculostearicum 의 타겟 핵산으로 16s rRNA를 코딩하는 핵산을 이용하였다(표 1). 상기 핵산의 검출은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체에 의한 시그널을 이용하여 복수의 타겟을 검출할 수 있는 TOCETM 기술(WO 2012/096523)을 이용하였다.
Corynebacterium tuberculostearicum 의 16s rRNA을 코딩하는 타겟 핵산을 검출하기 위한 프라이머 쌍, PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide) 및 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 서열은 표 2와 같다. HBB는 HBB 검출용 프라이머 쌍(AllplexTM H.pylori & ClariR Assay 제품) 및 상기 프라이머 쌍 기반으로 디자인된 PTO 및 CTO를 사용하였다. HuBac은 HuBac 검출용 프라이머쌍(AllplexTM Entero-DR Assay 제품) 및 상기 프라이머 쌍 기반으로 디자인된 PTO 및 CTO를 사용하였다.
서열
목록		 설명 서열(5’-3’)
1 Corynebacterium tuberculostearicum 의 16s rRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부 AGGCGGCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGGACGGCCACATTGGGACT
GAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA
ATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCG
GGTTGTAAACTCCTTTCGCTAGGGACGAAGCTTTTTGTGACGGTACCTAG
ATAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG
TGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGTGGTTTG
TCGCGTCGTCTGTGAAATTCCGGGGCTTAACTCCGGGCGTGCAGGCGATA
CGGGCATAACTTGAGTACTGTAGGGGTAACTGGAATTCCTGGTGTAGCGG
TGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTTACTG
GGCAGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAG
ATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGAGGGTCT
TTTCACGACTTTCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGA
GTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG
CGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGG
CTTGACATACACCGGATCGGGCTAGAGATAGTCTTTCCCTTTGTGGCTGG
TGTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATGTT
피부 정상세균총 서열
목록		 올리고
종류		 서열(5’-3’)
Corynebacterium tuberculostearicum 2 전방향
프라이머		 TACGGGCATAACTTGAGTACIIIIIGGGTAACTG
3 역방향
프라이머		 TTCTTCGCGTTGCATCGIIIIIATCCACATG
4 PTO CCATGCGCACTAGAGGGTCTTTTCACGACTTTCGT
5 CTO [BHQ-1]TTTTTTTATTATT[iCy5_T]ATTTTTTGACTCT
AGTGCGCATGG[C3 spacer]
실시예 1-2: Corynebacterium tuberculostearicum 와 HBB 및 HuBac의 검출율 비교
피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물 검사를 위해 eSwab(Cat. No. 480CE; Copan)을 이용하여 채취된 부위별 피부검체(겨드랑이 검체 2개, 사타구니 검체 2개, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 3개)를 이용하여 채취된 부위별 피부 검체를 추출자동화 장비 Seegene NIMBUS(Cat. No.65415-03) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge kit(Cat No.744300.4.UC384)을 이용하여 핵산 추출을 실시하였다. 핵산 추출을 위한 시료는 300 ㎕를 사용하였고, 용리는 100 ㎕ 용량으로 실시하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO의 연장을 위해 5'뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
동일한 시료로부터 얻은 핵산 추출물에 대해 Corynebacterium tuberculostearicum 의 타겟 핵산과 HBB 유전자 및 HuBac 유전자의 검출율을 비교하기 위하여, 동일한 핵산 추출물 5 ㎕를 담은 3개의 튜브를 준비하였다. 첫 번째 튜브(튜브 1)에는 Corynebacterium tuberculostearicum 의 16s rRNA를 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 2 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 3 서열) 4 pmole, PTO(서열목록 제 4 서열) 3 pmole 및 CTO(서열목록 제 5 서열) 2 pmole을 넣고, 두 번째 튜브(튜브 2)에는 Corynebacterium tuberculostearicum 검출용 올리고뉴클레오타이드와 동일 양으로 HBB 검출용 올리고뉴클레오타이드(전방향 및 역방향 프라이머, PTO, CTO)를 넣었다. 세 번째 튜브(튜브 3)에는 HuBac 올리고뉴클레오타이드(전방향 프라이머 8 pmole, 역방향 프라이머 8 pmole, PTO 8 pmole, CTO 2 pmole)를 넣었다. 3개의 튜브 각각에 4Х효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 14 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 RNase-free Water 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피 20 ㎕가 되도록 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 제조한 반응 혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃에서 실시하였고 그 결과는 아래 표 3 내지 7에 정리하였다.
아래 표 3 내지 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, eSwabTM을 이용하여 채취된 부위별 피부 검체에 대한 Corynebacterium tuberculostearicum 의 검출율은 겨드랑이 검체 100%, 사타구니 검체 100%, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 100%이며, HBB의 검출율은 겨드랑이 검체 50%, 사타구니 검체 100%, 겨드랑이 및 사타구니(혼합)검체 100% 이며, HuBac의 검출율은 겨드랑이 검체 0%, 사타구니 검체 100%, 겨드랑이 및 사타구니(혼합)검체 100% 인 것을 확인하였다. 또한 Corynebacterium tuberculostearicum 의 겨드랑이 검체 평균 Ct값 30.01, 사타구니 검체 평균 Ct값 30.55, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 평균 Ct값 29.83으로 나타났으며, HBB의 겨드랑이 검체 평균 Ct값 41.35, 사타구니 검체 평균 Ct값 35.62, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 평균 Ct값 32.23으로 나타났으며, HuBac의 겨드랑이 검체 미검출, 사타구니 검체 평균 Ct값 37.40, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 평균 Ct값 35.15로 나타나 Corynebacterium tuberculostearicum 의 평균 Ct값이 HBB 및 HuBac의 평균 Ct값 보다 낮은 것을 확인하였다.
이러한 결과는 Corynebacterium tuberculostearicum 의 핵산이 내부 대조군으로 HBB 및 HuBac의 유전자보다 더 안정적인 수준(즉, HBB 및 HuBac보다 낮은 Ct값)으로 우수한 검출율을 가지는 것을 의미하며, 이는 일반적으로 내부 대조군으로서 많이 사용하고 있는 HBB 유전자 및 HuBac 유전자 보다, Corynebacterium tuberculostearicum 의 핵산이 내재 내부 대조군으로서 더욱 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
시료 번호 Ct 값
튜브1 튜브2 튜브3
Corynebacterium tuberculostearicum HBB HuBac
eSwab_1_겨드랑이 검체 32.33 41.35 N/A
eSwab_2_겨드랑이 검체 27.87 N/A N/A
시료 번호 Ct 값
튜브1 튜브2 튜브3
Corynebacterium tuberculostearicum HBB HuBac
eSwab_1_사타구니 검체 31.89 38.11 36.41
eSwab_2_사타구니 검체 29.2 33.13 38.38
시료 번호 Ct 값
튜브1 튜브2 튜브3
Corynebacterium tuberculostearicum HBB HuBac
eSwab_1_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 30.36 31.49 34.92
eSwab_2_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 29.30 32.48 34.27
eSwab_3_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 29.83 32.72 36.26
시료 번호 검출율(%)
튜브1 튜브2 튜브3
Corynebacterium tuberculostearicum HBB HuBac
eSwab_겨드랑이 검체 2/2(100%) 1/2(50%) 0/2(0%)
eSwab_사타구니 검체 2/2(100%) 2/2(100%) 2/2(100%)
eSwab_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 3/3(100%) 3/3(100%) 3/3(100%)
상기 검출율은 시료 전체 수에 대한 검출된 시그널 수의 비를 나타낸다.
시료 번호 Ct 값
튜브1 튜브2 튜브3
Corynebacterium tuberculostearicum HBB HuBac
eSwab_겨드랑이 검체 검출된 Ct 범위 27.87-32.33 41.35 N/A
평균 Ct 30.10 41.35 N/A
eSwab_사타구니 검체 검출된 Ct 범위 29.2-31.89 33.13-38.11 36.41-38.38
평균 Ct 30.55 35.62 37.40
eSwab_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 검출된 Ct 범위 29.3-30.36 31.49-32.72 34.27-36.26
평균 Ct 29.83 32.23 35.15
실시예 2: 피부로부터 채취한 시료로부터 Cutibacterium acnes 의 검출율 확인
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물 검출 방법에 있어서, 피부 정상세균총으로부터 선택된 박테리아인 Cutibacterium acnes 의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 사용할 수 있는지 확인하였다.
이를 위하여, 복수의 인간의 피부에서 채취한 시료로부터 Cutibacterium acnes 의 핵산 검출율을 확인하였다.
실시예 2-1: 올리고뉴클레오타이드의 준비
Cutibacterium acnes 의 타겟 핵산으로 DNA gyrase subunit A (gyrA)를 코딩하는 핵산을 이용하였다(표 8). 상기 핵산의 검출은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체에 의한 시그널을 이용하여 복수의 타겟을 검출할 수 있는 TOCETM 기술(WO 2012/096523)을 이용하였다.
Cutibacterium acnes 의 gyrA를 코딩하는 타겟 핵산을 검출하기 위한 프라이머 쌍, PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide) 및 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 서열은 표 9와 같다.
서열
목록		 설명 서열(5’-3’)
6 Cutibacterium acnes의 gyrA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부 GTGACGATGCGTGCCGTCATCGACATGGAAGAGGACAAGAAGGGACGCCA
GTGCCTGGTCGTCACCGAGTTGCCTTATATGTGCAACCCGGACAACCTCG
CCACCAAGATCGCCGACCTGGTGAACTCCGGTCGCATCAACGGTATCGCC
GACATCCGTGACGACTCCTCAGCCCGTACTGGTCAGCGTTTAGTCATCGT
CCTCAAGCGTGACGCTCAGCCGCGTGTCGTCATGAACAACCTGTACAAGC
ACACGGCTTTGCA
피부 정상세균총 서열
목록		 올리고
종류		 서열(5’-3’)
Cutibacterium Acnes 7 전방향
프라이머		 GTGACGATGCGTGCCIIIIICGACATGGAA
8 역방향
프라이머		 TGCAAAGCCGTGTGCIIIIICAGGTTGTTC
9 PTO CCGATGTGTTGGAGCCCGTACTGGTCAGCGTYTA
10 CTO [BHQ-1]ATTTTTTTTTTAT[iQS670_T]TATTATTCAGCTCCA
ACACATCGG
실시예 2-2: Cutibacterium acnes 의 검출율 확인
피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물 검사를 위해 eSwab(Cat. No. 480CE; Copan)을 이용하여 채취된 부위별 피부검체(겨드랑이 검체 3개, 사타구니 검체 3개, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 3개)를 이용하여 채취된 부위별 피부 검체를 추출자동화 장비 Seegene NIMBUS(Cat. No.65415-03) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge kit(Cat No.744300.4.UC384)을 이용하여 핵산 추출을 실시하였다. 핵산 추출을 위한 시료는 300 ㎕를 사용하였고, 용리는 100 ㎕ 용량으로 실시하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO의 연장을 위해 5'뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
동일한 시료로부터 얻은 핵산 추출물에 대해 Cutibacterium acnes 의 타겟 핵산 추출물 5 ㎕를 담은 튜브를 준비하였다. 튜브 1에는 Cutibacterium acnes 의 gyrA를 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 7 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 8 서열) 4 pmole, PTO(서열목록 제 9 서열) 3 pmole 및 CTO(서열목록 제 10 서열) 2 pmole을 넣었다. 튜브에 4Х효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 14 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 RNase-free Water 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피 20 ㎕가 되도록 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 제조한 반응 혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃에서 실시하였고 그 결과는 아래 표 10 내지 14에 정리 하였다.
아래 표 10 내지 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, eSwabTM을 이용하여 채취된 부위별 피부 검체에 대한 Cutibacterium acnes 의 검출율은 겨드랑이 검체 100%, 사타구니 검체 100%, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 100%인 것을 확인하였다. 또한 Cutibacterium acnes 의 겨드랑이 검체 평균 Ct값 35.43, 사타구니 검체 평균 Ct값 34.73, 겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 평균 Ct값 32.89로 확인하였다.
이러한 결과로부터 Cutibacterium acnes 의 핵산도 내재 내부 대조군으로서 사용될 수 있음을 보여준다.
시료 번호 Ct 값
튜브1
Cutibacterium acnes
eSwab_1_겨드랑이 검체 35.70
eSwab_2_겨드랑이 검체 36.51
eSwab_3_겨드랑이 검체 34.09
시료 번호 Ct 값
튜브1
Cutibacterium acnes
eSwab_1_사타구니 검체 36.15
eSwab_2_사타구니 검체 34.87
eSwab_3_사타구니 검체 33.16
시료 번호 Ct 값
튜브1
Cutibacterium acnes
eSwab_1_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 35.18
eSwab_2_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 30.48
eSwab_3_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 33
시료 번호 검출율(%)
튜브1
Cutibacterium acnes
eSwab_겨드랑이 검체 3/3(100%)
eSwab_사타구니 검체 3/3(100%)
eSwab_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 3/3(100%)
상기 검출율은 시료 전체 수에 대한 검출된 시그널 수의 비를 나타낸다.
시료 번호 Ct 값
튜브1
Cutibacterium acnes
eSwab_겨드랑이 검체 검출된 Ct 범위 34.09-36.51
평균 Ct 35.43
eSwab_사타구니 검체 검출된 Ct 범위 33.16-36.15
평균 Ct 34.73
eSwab_겨드랑이 및 사타구니(혼합) 검체 검출된 Ct 범위 30.48-35.18
평균 Ct 32.89
실시예 3: 내재 내부 대조군으로서 Corynebacterium spp.의 이용
본 발명자들은 피부 미생물의 핵산 검출과 함께 내부 대조군으로서 피부의 정상세균총으로부터 선택된 박테리아인 Corynebacterium spp.의 핵산을 검출하였다.
본 발명자들은 피부 미생물로 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)를 검출하였으며, 아시네토박터 바우마니 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드로 Allplex™ MDRO Assay 제품 (Seegene Inc, 한국)에 포함된 올리고뉴클레오타이드를 사용하였으며, 내부 대조군 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 상기 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.
실시예 3-1. 내부 대조군으로서 Corynebacterium tuberculostearicum 의 이용
본 실험의 객관성과 명확성을 확보하기 위해, 약제 내성 미생물 검출의 표준 방법으로 인정되는 호기성 배양(aerobic culture) 및 MALDI-TOF 질량분석을 통해 아시네토박터 바우마니의 존재가 사전에 확인된 피부 시료를 사용하였다. 해당 시료는 아시네토박터 속 세균의 선택적 분리 및 식별을 위해 CHROMagar Acinetobacter 배지를 이용하여 37℃, 호기성 조건에서 24시간 배양하였다.
상기 수집된 피부 시료로부터 핵산의 추출은 추출 자동화 장비 Microlab NIMBUS IVD(Cat. No. 65415-02, Hamilton) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit(Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene Inc.)을 이용하여 행하였다. 핵산 추출을 위한 각 시료는 300 ㎕을 사용하였고, 용리는 100 ㎕ 용량으로 행하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO의 연장을 위해 5'뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
아시네토박터 바우마니의 존재가 확인된 시료 및 아시네토박터 바우마니의 존재가 확인되지 않은 시료로부터 얻은 핵산 추출물 5 ㎕ 각각에 대하여, (i) Corynebacterium tuberculostearicum 의 16s rRNA를 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 2 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 3 서열) 4 pmole, PTO(서열목록 제 4 서열) 3 pmole 및 CTO(서열목록 제 5 서열) 2 pmole 및 (ii) 상기 Corynebacterium tuberculostearicum 에 대한 올리고뉴클레오타이드와 동일 양으로 아시네토박터 바우마니 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드(전방향 및 역방향 프라이머, PTO, CTO)를 넣고, 4Х효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 14 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 Rnase-free Water 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 20 ㎕이 되도록 반응혼합물을 제조하였다. 상기 제조한 반응혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃와 72℃에서 실시하였고, 그 결과는 아래 표 15에 정리하였다:
시료 아시네토박터 바우마니 Corynebacterium tuberculostearicum
아시네토박토 바우마니 양성 시료 20.23 31.23
아시네토박토 바우마니 음성 시료 - -
표 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아시네토박터 바우마니의 존재가 확인된 시료의 경우, 아시네토박터 바우마니의 핵산(Ct 값 20.23) 및 Corynebacterium tuberculostearicum 의 핵산(Ct값 31.23)이 검출되었다.반면, 아시네토박터 바우마니의 존재가 확인되지 않았던 시료의 경우, 아시네토박터 바우마니의 핵산 및 Corynebacterium tuberculostearicum 의 핵산 모두가 검출되지 않았다. 내부 대조군이 검출되지 않는 경우, 시료 채취 과정, 핵산 추출 과정 또는 핵산 증폭 과정에서 문제가 발생한 것을 의미하는데, 해당 시료를 호기성 배양(aerobic culture)을 수행한 결과, 배지에서 자라는 균이 없는 것을 확인하였다. 이는 시료 채취 과정에서 채취가 정상적으로 이루어지지 않은 것을 의미하며, 내부 대조군 핵산이 검출되지 않았으므로, 타겟 핵산 검출 결과를 유효하지 않은 결과(invalid result)로 판단할 수 있다.
이러한 실험 결과는 Corynebacterium tuberculostearicum 핵산이 아시네토박터 바우마니의 검출 과정에서 내재 내부 대조군으로서 유용하게 사용될 수 있음을 증명한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (27)

  1. 다음의 단계를 포함하는 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물(target microorganism)의 핵산을 검출하는 방법:
    (a) 피부로부터 시료를 채취하여 준비하는 단계;
    (b) (ⅰ) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ⅱ) 내재 내부 대조군(endogenous internal control) 핵산인 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행하는 단계;
    (c) 상기 증폭 반응의 결과를 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 내재 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 결과로부터 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고; 및 (ⅰ) 상기 판단된 유효성 및 (ⅱ) 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 타겟 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.는 피부의 정상세균총인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료는 피부의 습한 부위(moist sites), 건조한 부위(dry sites) 또는 기름진 부위(oily sites)에서 채취되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료는 피부의 습한 부위에서 채취되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 피부의 습한 부위는 겨드랑이, 팔오금(antecubital fossa), 배꼽, 사타구니, 다리오금(popliteal fossa) 또는 발바닥인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료의 준비는 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산은 (ⅰ) 시료를 채취하는 단계, (ⅱ) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 및/또는 (ⅲ) 추출된 핵산을 증폭하는 단계에 대한 내재 내부 대조군으로 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 내재 내부 대조군 핵산인 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 채취된 시료 내 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 시료의 채취가 유효(valid) 또는 무효(invalid)인지를 판단할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 내재 내부 대조군 핵산인 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 채취된 시료 내 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 추출이 유효 또는 무효인지를 판단할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 내재 내부 대조군 핵산이 검출되지 않은 경우, 상기 타겟 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 무효인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 피부의 정상세균총은 인간 피부의 정상세균총인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.의 핵산은 16s rRNA 또는 gyrA(DNA gyrase subunit A)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp.는 Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium fastidiosum, 또는 Corynebacterium resisten 이거나, 상기 Cutibacterium spp.는 Cutibacterium acnes 인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭 반응 결과의 검출은 포스트-검출 방법 또는 실시간 검출 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭 반응은 (i) 상기 타겟 미생물의 핵산 검출용 프로브; 및 (ii) 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 검출용 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp.의 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 Cutibacterium spp.의 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 6 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭 반응은 PCR 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 미생물은 약물 내성 미생물(drug-resistant microorganism), 피부사상균(dermatophyte) 또는 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 다음을 포함하는, Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산을 내재 내부 대조군 핵산으로 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물:
    (i) 타겟 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및
    (ii) Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 증폭용 프라이머 쌍.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.는 피부의 정상세균총인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산은 (ⅰ) 시료를 채취하는 단계, (ⅱ) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 및/또는 (ⅲ) 추출된 핵산을 증폭하는 단계에 대한 내재 내부 대조군으로 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 피부의 정상세균총은 인간 피부의 정상세균총인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp. 및 Cutibacterium spp.의 핵산은 16s rRNA 또는 gyrA(DNA gyrase subunit A)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp.는 Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium fastidiosum, 또는 Corynebacterium resisten 이거나, 상기 Cutibacterium spp.는 Cutibacterium acnes 인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 조성물은 (i) 상기 타겟 미생물의 핵산 검출용 프로브 및 (ii) 상기 Corynebacterium spp. 또는 Cutibacterium spp.의 핵산 검출용 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 Corynebacterium spp.의 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 Cutibacterium spp.의 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 6 서열, 또는 이의 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟 미생물은 약물 내성 미생물(drug-resistant microorganism), 피부사상균(dermatophyte) 또는 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 방법.
PCT/KR2025/008138 2024-06-27 2025-06-13 내재 내부 대조군으로 corynebacterium spp. 또는 cutibacterium spp.를 이용하여 피부로부터 채취한 시료로부터 타겟 미생물의 핵산을 검출하는 방법 Pending WO2026005351A1 (ko)

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