WO2025239362A1 - フコシル化多糖の製造方法 - Google Patents

フコシル化多糖の製造方法

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WO2025239362A1
WO2025239362A1 PCT/JP2025/017423 JP2025017423W WO2025239362A1 WO 2025239362 A1 WO2025239362 A1 WO 2025239362A1 JP 2025017423 W JP2025017423 W JP 2025017423W WO 2025239362 A1 WO2025239362 A1 WO 2025239362A1
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WO
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amino acid
seq
residue
protein
chondroitin
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PCT/JP2025/017423
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English (en)
French (fr)
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研一郎 清水
健人 纐纈
誠 山下
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Kirin Holdings Co Ltd
Original Assignee
Kirin Holdings Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • This disclosure relates to a method for producing fucosylated polysaccharides.
  • Fucosylated polysaccharides such as fucosylated chondroitin sulfate and fucosylated heparan sulfate, are compounds that are increasingly in demand as raw materials for functional foods, pharmaceuticals, and cosmetics.
  • Fucosylated chondroitin sulfate a sulfated polysaccharide specifically present in sea cucumber body walls, is known to have various health benefits.
  • the amount of fucosylated chondroitin sulfate contained in sea cucumber body walls is small and its quality varies depending on the sea cucumber species and growing environment, no industrial production method for fucosylated chondroitin sulfate by extraction has been established (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 enzymatic bioprocessing, which can provide stable quality and requires fewer steps, has attracted attention. It has been reported that fucosyltransferases derived from Bacteroides fragilis and Helicobacter pylori produce fucosylated chondroitin, the substrate for fucosylated chondroitin sulfate, in purified enzymatic reactions (Patent Document 1). However, no other enzymes have been found that can be used to produce fucosylated polysaccharides.
  • the present disclosure relates to a method for producing fucosylated polysaccharides using a protein with fucosyltransferase activity.
  • the present disclosure includes the following: (1A) A method for producing a fucosylated polysaccharide from a substrate using at least one protein selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3], wherein the substrate is a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan. [1] A protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197.
  • a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, in which 1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • (1B) A method for producing a fucosylated polysaccharide from a substrate using at least one protein selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3], wherein the substrate is a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • [1] A protein comprising an amino acid sequence represented by one of SEQ ID NOs: 1 to 22.
  • [2] A protein comprising an amino acid sequence represented by one of SEQ ID NOs: 1 to 22 in which 1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • [3] A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to an amino acid sequence represented by one of SEQ ID NOs: 1 to 22, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • (1C) A method for producing a fucosylated polysaccharide from a substrate using at least one protein selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3], wherein the substrate is a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids are deleted, substituted, inserted, and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 66 in SEQ ID NO: 4 is a valine residue.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 13 in SEQ ID NO: 4 is an aspartic acid residue.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 13 in SEQ ID NO: 4 is a phenylalanine residue. [7] The amino acid residue at the position corresponding to position 13 in SEQ ID NO: 4 is a glutamic acid residue. [8] The amino acid residue at the position corresponding to position 13 in SEQ ID NO: 4 is an asparagine residue. [9] The amino acid residue at the position corresponding to position 50 in SEQ ID NO: 4 is an asparagine residue. [10] The amino acid residue at the position corresponding to position 84 in SEQ ID NO: 4 is a glycine residue.
  • the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan is chondroitin
  • the glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan is chondroitin sulfate
  • the fucosylated polysaccharide is fucosylated chondroitin or fucosylated chondroitin sulfate, or the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan is chondroitin
  • the fucosylated polysaccharide is fucosylated chondroitin
  • a genetically modified microorganism that meets the following criteria (A) or (B): (A) A genetically modified microorganism having a protein having fucosyltransferase activity against a substrate and producing a fucosylated polysaccharide from the substrate, wherein the substrate is a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan. (B) A genetically modified microorganism having a protein having fucosyltransferase activity on a substrate, wherein the substrate is a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • the genetically modified microorganism according to (6), wherein the protein having fucosyltransferase activity on the substrate is at least one selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3]: [1] A protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197. [2] A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added in an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • 7B The genetically modified microorganism according to (6), wherein the protein having fucosyltransferase activity on the substrate is at least one selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3]: [1] A protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22.
  • a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 in which 1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • the genetically modified microorganism according to (6), wherein the protein having fucosyltransferase activity on the substrate is at least one selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3]: [1] A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 197. [2] A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids are deleted, substituted, inserted, and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate. [3] A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 197, and having fucosyltransferase activity for the substrate.
  • the genetically modified microorganism according to (6) which has a protein having fucosyltransferase activity against the substrate, and which contains at least one amino acid residue selected from the group consisting of [4] to [10] when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid residue at position 66 in SEQ ID NO:4 is a valine residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is an aspartic acid residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is a phenylalanine residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is a glutamic acid residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is an asparagine residue.
  • the amino acid residue at position 50 in SEQ ID NO:4 is an asparagine residue.
  • the amino acid residue at position 84 in SEQ ID NO:4 is a glycine residue.
  • the genetically modified microorganism according to (6) which has a protein having fucosyltransferase activity against the substrate and into which at least one mutation selected from the group consisting of [11] to [16] below has been introduced in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan is chondroitin
  • the glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan is chondroitin sulfate
  • the fucosylated polysaccharide is fucosylated chondroitin or fucosylated chondroitin sulfate, or the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan is chondroitin
  • the fucosylated polysaccharide is fucosylated chondroitin
  • An enzyme preparation comprising a culture of a genetically modified microorganism according to any one of (6), (7A), (7B), (7C), (8), (9), (10) or (11) or a processed product of the culture, the culture comprising a protein having fucose transfer activity against the substrate.
  • (13) A method for producing fucosylated polysaccharides from a substrate using a genetically modified microorganism described in any one of (6), (7A), (7B), (7C), (8), (9), (10) or (11).
  • a protein having fucosyltransferase activity against a substrate, the substrate is a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan;
  • a method for producing a fucosylated polysaccharide according to (13), comprising co-expressing a protein having fucosyltransferase activity for the substrate with at least one chaperone protein selected from group I chaperonins in a genetically modified microorganism according to any one of (6), (7A), (7B), (7C), (8), (9), (10) or (11).
  • the group I chaperonin is at least one of the chaperone proteins of SEQ ID NOs: 201 and 202.
  • the present disclosure provides a method for producing fucosylated polysaccharides using a protein with fucosyltransferase activity.
  • SEQ ID NOs: 1 to 10 are shown.
  • SEQ ID NOs: 11 to 20 are shown.
  • SEQ ID NOs: 21 to 28 are shown.
  • SEQ ID NOs: 29 to 33 are shown.
  • SEQ ID NOs: 34 to 40 are shown.
  • SEQ ID NOs: 41 to 60 are shown.
  • SEQ ID NOs: 61 to 70 are shown.
  • SEQ ID NOs: 71 to 80 are shown.
  • SEQ ID NOs: 81 to 90 are shown.
  • SEQ ID NOs: 91 to 120 are shown.
  • SEQ ID NOs: 121 to 130 are shown.
  • SEQ ID NOs: 131 to 140 are shown.
  • Sequence numbers 141 to 150 are shown.
  • Sequence numbers 151 to 160 are shown.
  • SEQ ID NOs: 161 to 196 are shown.
  • SEQ ID NOs: 197 to 202 are shown.
  • the present disclosure includes a method for producing fucosylated polysaccharides using a protein with fucosyltransferase activity and a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan as a substrate.
  • Glycosaminoglycan refers to a polysaccharide composed of repeating disaccharide units containing an amino sugar (e.g., N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine) and an uronic sugar (e.g., glucuronic acid or iduronic acid) or galactose.
  • amino sugar e.g., N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine
  • uronic sugar e.g., glucuronic acid or iduronic acid
  • glucuronic acid-containing glycosaminoglycans refer to glycosaminoglycans containing glucuronic acid as a constituent sugar, and examples thereof include chondroitin and heparosan, with chondroitin being preferred.
  • the glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan refers to a substance that can be produced by sulfated the above-mentioned glucuronic acid-containing glycosaminoglycan, and examples thereof include chondroitin sulfate and heparin-like substances, with chondroitin sulfate being preferred.
  • Chondroitin is a sugar chain having a basic structure in which the disaccharides glucuronic acid (GlcA) and N-acetyl-galactosamine (GalNAc) are alternately repeated, and refers to a sugar chain having a disaccharide structure or more.
  • the term "chondroitin” simply refers to non-sulfated chondroitin.
  • the GlcA and GalNAc that constitute chondroitin are D-type.
  • GalNAc is present at the right end of chondroitin, forming the so-called reducing end of the sugar chain.
  • Chondroitin sulfate has a structure in which a sulfate group is bound to chondroitin, and the sulfate group can be bound to the hydroxy group at position 4 and/or 6 of GalNAc. Both the hydroxy groups at positions 4 and 6 may be sulfated, or only one of them may be sulfated.
  • Heparosan refers to a linear polysaccharide having a disaccharide unit consisting of glucuronic acid (GlcA) and N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) linked together by repeated ⁇ - or ⁇ -1,4 bonds, and refers to a polysaccharide having a disaccharide structure or more.
  • GlcA glucuronic acid
  • GlcNAc N-acetyl-glucosamine
  • heparosan simply refers to non-sulfated heparosan.
  • the GlcA and GlcNAc constituting heparosan are D-type.
  • GlcNAc be present at the right end of heparosan, forming the so-called reducing end of the sugar chain.
  • known methods may be used, such as those described in JP-A No. 2023-519632, Japanese Patent No. 5830464, Applied Microbiology and Biotechnology 103 (2019) 6771-6782, and U.S. Pat. No. 9,975,928.
  • Heparin-like substances refer to mixtures of heparin and heparan sulfate, and have a structure in which sulfate groups are bound to heparosan, and the sulfate groups can be bound to the hydroxy groups at positions 3 and/or 6 of GlcNAc. Both the hydroxy groups at positions 3 and 6 may be sulfated, or only one may be sulfated. Heparan sulfates that are highly sulfated are sometimes called heparin.
  • Fucosylated polysaccharides are sugar chains formed by binding one or more fucose units to a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • sugar chains include fucosylated chondroitin, fucosylated chondroitin sulfate, fucosylated heparosan, fucosylated heparan sulfate, and fucosylated heparin.
  • Fucosylated polysaccharides may also refer to compounds in which these sugar chains have been further modified.
  • the fucosylated polysaccharide is preferably fucosylated chondroitin or fucosylated chondroitin sulfate.
  • Fucosylated chondroitin is a sugar chain having a structure in which one or more fucose units are bound to chondroitin.
  • fucosylated chondroitin when simply referring to "fucosylated chondroitin" in this specification, it means non-sulfated fucosylated chondroitin, as distinguished from fucosylated chondroitin sulfate.
  • the number of fucose units contained in the fucosylated chondroitin is not particularly limited, and can be determined depending on the number of hydroxy groups in the chondroitin to which fucose units can be bound.
  • the fucose may be bound to GlcA or GalNAc, and it is preferable that the fucose is bound to GlcA.
  • the fucosylated chondroitin contains two or more fucose units
  • multiple fucose units may be bound to one GlcA or GalNAc, or multiple fucose units may be bound to multiple GlcA or GalNAc, but it is preferable that one fucose unit is bound to one GlcA or GalNAc.
  • the fucosylated chondroitin contains two or more fucoses
  • one or two or more fucose may be bound to each of multiple adjacent GlcAs and/or GalNAcs, or one or two or more fucose may be bound to each of multiple non-adjacent GlcAs and/or GalNAcs.
  • one or two or more fucose is bound to each of multiple non-adjacent GlcAs and/or GalNAcs, and more preferably that one or two or more fucose is bound to each of multiple non-adjacent GlcAs.
  • a schematic diagram of a fucosylated chondroitin composed of seven sugars, in which one fucose is bound to each of multiple non-adjacent GlcAs, is shown below.
  • the circle ( ⁇ ) represents GalNAc
  • the square ( ⁇ ) represents GlcA
  • the triangle ( ⁇ ) represents fucose.
  • the GalNAc on the right represents the reducing end of the glycan.
  • the bond type of fucose in fucosylated chondroitin is not particularly limited, and may be an ⁇ -bond and/or a ⁇ -bond, or a 1,2-bond, a 1,3-bond, a 1,4-bond and/or a 1,6-bond.
  • a 1,3-bond is preferred.
  • Fucosylated chondroitin sulfate is a polysaccharide having a structure in which sulfate groups and fucose are bound to chondroitin.
  • the molecular weight is not particularly limited, but varies from 0.5 to 300 kDa depending on the chain length, with an average of 20 to 100 kDa.
  • Fucosylated chondroitin sulfate is produced from at least one selected from chondroitin, fucosylated chondroitin, and chondroitin sulfate. When produced from fucosylated chondroitin, it can be produced by sulfating fucosylated chondroitin as a substrate.
  • chondroitin sulfate When produced from chondroitin sulfate, it can be produced by reacting an enzyme having fucosyltransferase activity with chondroitin sulfate as a substrate. Alternatively, it may be reacted with an enzyme having fucosyltransferase activity with chondroitin sulfate as a substrate to produce fucosylated chondroitin sulfate, which may then be re-sulfated.
  • sulfate groups can be bound to hydroxy groups at position 4 of GalNAc, position 6 of GalNAc, position 2 of fucose, position 3 of fucose, and position 4 of fucose.
  • All of these hydroxy groups may be sulfated, or one or more of them may be sulfated. Furthermore, the sulfation of the hydroxyl groups at the 2-position of fucose, the 3-position of fucose, and the 4-position of fucose may be carried out after the fucose structure is bound to chondroitin or chondroitin sulfate, or the sulfated fucose structure may be bound to chondroitin or chondroitin sulfate.
  • the fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan refers to the activity of transferring fucose to GDP-fucose and a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan as substrates to produce a fucosylated polysaccharide.
  • the fucosylation activity for chondroitin refers to the activity of transferring fucose to chondroitin using GDP-fucose and chondroitin as substrates to produce fucosylated chondroitin.
  • fucose is transferred to the hydroxy group of GlcA or GalNAc.
  • fucose it may be bound to either the hydroxy group of GlcA or GalNAc constituting chondroitin, and it is preferable that fucose be bound to the hydroxy group of GlcA.
  • the number of GlcAs and GalNAcs constituting the chondroitin used as a substrate is not particularly limited, but may be chondroitin composed of 20 or more GlcAs and GalNAcs, chondroitin composed of 15 or more GlcAs and GalNAcs, or chondroitin composed of 10 or more GlcAs and GalNAcs.
  • the number of GlcAs and GalNAcs constituting the chondroitin used as a substrate is not particularly limited, but is preferably chondroitin composed of 3 to 15 GlcAs and GalNAcs, more preferably chondroitin composed of 5 to 11 GlcAs and GalNAcs, and even more preferably chondroitin composed of 5 to 9 GlcAs and GalNAcs.
  • the number of fucose units transferred to chondroitin is not particularly limited and may be determined according to the number of hydroxyl groups in chondroitin to which fucose can bind, or may be adjusted by the amount of fucose.
  • a protein has fucosyltransferase activity toward glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans can be confirmed, for example, by the following method.
  • chondroitin is used as the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan
  • recombinant DNA containing DNA encoding the protein whose fucosyltransferase activity toward chondroitin is to be confirmed is prepared by the method described below.
  • a microorganism that does not have fucosyltransferase activity toward chondroitin such as Escherichia coli BL21(DE3), is transformed with the recombinant DNA to produce a microorganism, and a cell extract containing the protein is prepared from the resulting culture.
  • the cell extract containing the protein is contacted with an aqueous solution containing the substrates GDP-fucose and chondroitin to produce fucosylated chondroitin in the aqueous solution.
  • fucosylated chondroitin in the reaction solution is detected using the sugar analyzer described below, and the amount produced is determined, thereby confirming that the protein has fucosyltransferase activity toward chondroitin.
  • the protein represented by at least one selected from the group consisting of the following (1) to (4) has fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans. That is, the protein represented by at least one selected from the group consisting of the following (1) to (4) may be a fucosyltransferase (fucT).
  • fucT fucosyltransferase
  • the protein in this embodiment is a protein represented by at least one selected from the group consisting of the following (1) to (4): (1) At least one protein selected from the group consisting of proteins represented by the following [1] to [3]: [1] A protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197. [2] A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added in the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and having fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • [3] A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and having fucosyltransferase activity for chondroitin substrates.
  • the above [1] to [3] may be the following [1'] to [3'], respectively.
  • [1'] A protein consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197.
  • [2'] A protein consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, in which 1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added, and which has fucosyltransferase activity for the substrate.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and which has fucosyltransferase activity for the substrate.
  • the amino acid residue at position 66 in SEQ ID NO:4 is a valine residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is an aspartic acid residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is a phenylalanine residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is a glutamic acid residue.
  • the amino acid residue at position 13 in SEQ ID NO:4 is an asparagine residue.
  • the amino acid residue at position 50 in SEQ ID NO:4 is an asparagine residue.
  • the amino acid residue at position 84 in SEQ ID NO:4 is a glycine residue.
  • a protein having fucosyltransferase activity for a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan comprising, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4, at least one amino acid residue selected from the group consisting of [11] to [16] below.
  • the amino acid residue at position 13 of SEQ ID NO: 4 is an aspartic acid residue (SEQ ID NO: 14).
  • the amino acid residue at position 13 of SEQ ID NO: 4 is a phenylalanine residue (SEQ ID NO: 15).
  • the amino acid residue at position 13 of SEQ ID NO: 4 is a glutamic acid residue (SEQ ID NO: 16). [14] The amino acid residue at position 13 of SEQ ID NO: 4 is an asparagine residue (SEQ ID NO: 17). [15] The amino acid residue at position 50 of SEQ ID NO: 4 is an asparagine residue (SEQ ID NO: 21). [16] The amino acid residue at position 84 of SEQ ID NO: 4 is a glycine residue (SEQ ID NO: 22).
  • a protein derived from Fusobacterium mortiferum and having fucosyltransferase activity on glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans is preferably a protein represented by [1].
  • the protein represented by (2) is preferably a protein represented by [5].
  • fucT is selected from the group consisting of fucosyltransferase derived from Helicobacter acinonychis, fucosyltransferase derived from Helicobacter ailurogastricus, fucosyltransferase derived from Helicobacter baculiformis, fucosyltransferase derived from Helicobacter bizzozeronii, fucosyltransferase derived from Helicobacter cetorum MIT 99-5656, fucosyltransferase derived from Helicobacter cynogastricus, fucosyltransferase derived from Helicobacter felis, and fucosyltransferase derived from Helicobacter heil mannii fucosyltransferase, Helicobacter labacensis fucosyltransferase, Helicobacter mehlei fucosyltransferase, Helicobacter salomonis fucosyltransferase, Helicobacter sp.
  • 80% or more identity means that the number of overlapping amino acids with the amino acid sequence represented by the specific SEQ ID NO is at least 80% of the total number of amino acids in the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO.
  • 80% or more identity means that it may be a sequence of 80 amino acids in which 80 amino acids are identical (80% identity), or it may be a sequence of 120 amino acids in which 100 amino acids are identical (100% identity), or it may be a sequence of 100 amino acids in which 80 amino acids are identical (80% identity).
  • a sequence when a sequence "has 80% or more identity with the amino acid sequence represented by a SEQ ID NO:,” the identity is preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 100%. "Having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO” includes having 100% identity, and therefore, unless otherwise specified, it may also be “the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO.” When a sequence has "80% or more identity with the amino acid sequence represented by a SEQ ID NO,” 1 to 30 amino acids may be deleted, substituted, inserted, and/or added in the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO. Furthermore, the term “having identity” may be read as “having homology,” and the explanations set forth in this specification may be applied.
  • the percentage of sequence identity between two amino acid sequences or two nucleotide sequences is calculated as the ratio of matching residues when the two sequences are aligned so that the residues contained in the sequences are most identical.
  • the percentage of sequence identity can be determined using a mathematical algorithm. Examples of such mathematical algorithms include the local homology algorithm of Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, and the algorithm of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Examples of mathematical algorithms include the similarity search method described in [PubMed], ...
  • Such programs include, but are not limited to, the PC/Gene program CLUSTAL (available from Intelligenetics, Mountain View, Calif.), MAFFT (Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., & Miyata, T. (2002), 30(14), 3059-3066., http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/), and MUSCLE (Edgar R. C. (2004). Nucleic acids research, 32(5), 1792-1797., http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/), BLAST, FASTA, and TFASTA. Alignment using these programs can be performed, for example, using default parameters.
  • the CLUSTAL program is described in Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244, Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, and Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331.
  • BLAST is described in Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). 215(3), 403-410., Mount D. W. (2007). CSH protocols, 2007, pdb. top17., etc.
  • Programs called BLASTP and BLASTN have been developed based on BLAST, and the percentage of sequence identity can be calculated using these programs with default settings.
  • the phrase "1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added in the amino acid sequence represented by a SEQ ID NO” means that amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added at a terminal or non-terminal position in the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted, and/or added is not particularly limited as long as the resulting protein exhibits the effects of the present invention.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted, and/or added may be 30 or less, 25 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, or 5 or less, or 1 to 5, 1 to 10, 1 to 15, 1 to 20, or 1 to 25 amino acids may be deleted, substituted, inserted, and/or added. Furthermore, the number of sites for deletion, substitution, insertion, and/or addition may be one or more.
  • the amino acids to be substituted, inserted, or added may be natural amino acids or non-natural amino acids.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, and L-cysteine. Examples of groups of amino acids that can be substituted for each other are shown below. Amino acids in the same group may be substituted for each other.
  • Group A Hydrophobic amino acids
  • Group B Acidic amino acids
  • Group C Polar amino acids
  • Group D Basic amino acids
  • Group E Secondary amino acids
  • Group F Amino acids with hydroxyl groups
  • Group G Aromatic amino acids
  • Group H Sulfur-containing amino acids
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • Group C asparagine, glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine, tryptophan;
  • Group H methionine, cyste
  • the overlapping region with the amino acid sequence represented by a SEQ ID NO can be determined by a method known to those skilled in the art.
  • the region can be aligned to maximize amino acid identity, and the percentage of overlapping amino acids with the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO can be determined.
  • whether an amino acid sequence represented by a SEQ ID NO has been substituted with another amino acid residue can be confirmed, for example, by aligning the amino acid sequence in which substitution with another amino acid residue is to be confirmed with the amino acid sequence of the original protein.
  • Amino acid sequence alignments can be created using, for example, the well-known alignment program ClustalW [Nucleic Acids Research 22, 4673, (1994)].
  • ClustalW is available, for example, from http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute).
  • the parameters can be set to, for example, default values.
  • amino acid residue at position X of SEQ ID NO: Y refers to the amino acid at position X of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: Y, counting from the N-terminus.
  • amino acid residue at a position corresponding to position X in a SEQ ID NO: Y when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: Y refers to an amino acid residue in the specific amino acid sequence that is arranged at the same position as the Xth amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: Y when the specific amino acid sequence is aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: Y.
  • amino acid residue at the position corresponding to position 66 of SEQ ID NO: 4 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4" means an amino acid residue in the specific amino acid sequence, which, when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, is arranged at the same position as the 66th valine residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • amino acid residue at the position corresponding to position X in a particular SEQ ID NO refers to the Xth amino acid itself in the amino acid sequence represented by the particular SEQ ID NO.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position X in SEQ ID NO: Y is an AA residue
  • the position substituted with an AA residue does not indicate an absolute position in the specific amino acid sequence, but may indicate a relative position based on the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO.
  • the position substituted with an AA residue may vary accordingly.
  • the protein represented by (1) is preferably at least one protein selected from the group consisting of proteins represented by the following [17] to [19], in view of having a higher fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans: [17]
  • a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5, 8, and 12.
  • a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5, 8, and 12 in which 1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added, and which has fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5, 8, and 12, and which has fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • a protein containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5, 8, and 12 not only one fucose but two or more fucoses can be transferred to a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan with high efficiency.
  • a fucosylated polysaccharide to which multiple fucoses are bound can be produced with high efficiency. Furthermore, by using a protein containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5, 8, and 12, one or more fucoses can be transferred to chondroitin with high efficiency, even for chondroitin composed of a polysaccharide of 11 or more sugars. Furthermore, the protein represented by (1) is more preferably a protein represented by [17].
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a wild-type fucosyltransferase (fucT) derived from Fusobacterium mortiferum.
  • fucT fucosyltransferase
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 66 in SEQ ID NO: 4 is preferably a valine residue.
  • the protein can maintain its fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans, and can be conferred with higher fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • proline at position 13, the histidine at position 50, and/or the glutamic acid at position 84 of SEQ ID NO: 4 to other amino acids, it is possible to obtain a protein with higher fucosyltransferase activity toward glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • other amino acids that can be changed include, but are not limited to, asparagine, aspartic acid, phenylalanine, glutamic acid, and glycine.
  • proteins represented by (2) and (3) above are preferred, and proteins represented by (3) above are more preferred.
  • the protein represented by (2) or (3) above is preferably a protein represented by (5) or (6) below, more preferably a protein represented by (6) below, in view of having higher fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • a protein having fucosyltransferase activity for a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan having an identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and containing the amino acid residues [20] below when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan in which the amino acid residue at the position corresponding to position 13 of SEQ ID NO: 4 is an aspartic acid residue (6), and which contains the amino acid residue [21] below in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4: [21]
  • the amino acid residue at position 13 of SEQ ID NO: 4 is an aspartic acid residue (SEQ ID NO: 14).
  • the method of the present disclosure for producing a fucosylated polysaccharide from a substrate may be a method for producing a fucosylated polysaccharide by using a protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan as a substrate and transferring fucose from GDP-fucose to the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan as a substrate.
  • a method for producing fucosylated chondroitin by using the above-mentioned protein having fucosyltransferase activity to transfer fucose from GDP-fucose to chondroitin as a substrate.
  • the protein having fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans is preferably at least one selected from the above-mentioned (1) to (4).
  • fucosylated polysaccharides examples include fucosylated chondroitin, fucosylated chondroitin sulfate, fucosylated heparosan, fucosylated heparan sulfate, and fucosylated heparin.
  • the method for producing fucosylated polysaccharides of the present disclosure comprises using a microorganism having a "protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.” Fucosylated polysaccharides may be produced in the microorganism, or may be produced using the microorganism as an enzyme preparation.
  • the method for producing fucosylated polysaccharides in the microorganism is sometimes called a fermentation method, and the method for producing fucosylated polysaccharides using the microorganism as an enzyme preparation is sometimes called an enzymatic method.
  • microorganisms used for producing fucosylated polysaccharides include those produced by the methods described below in "Method for producing genetically modified microorganisms.”
  • the microorganism may be a microorganism that has a protein having fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans, and is preferably at least one selected from the above-mentioned (1) to (4).
  • the microorganism having a protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan may be a microorganism that originally has a protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • the microorganism may be a genetically modified microorganism in which the protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan has been artificially enhanced.
  • the microorganism may be a genetically modified microorganism that originally has a protein having fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans, and that further enhances the protein having fucosyltransferase activity for glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • an enzyme preparation which is a culture of a microorganism having a protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan, or a processed product of the culture, and which contains the protein having fucosyltransferase activity on a glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or a glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • Fucosylated polysaccharides can also be produced by using the enzyme preparation.
  • chondroitin is a preferred glucuronic acid-containing glycosaminoglycan
  • chondroitin sulfate is a preferred glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan.
  • the fucosylated polysaccharide to be produced is preferably fucosylated chondroitin or fucosylated chondroitin sulfate.
  • a method for producing fucosylated chondroitin will be specifically described.
  • Examples of methods for producing fucosylated chondroitin according to the present embodiment include methods for producing fucosylated chondroitin by fermentation, which include culturing the genetically modified microorganism according to the present embodiment in a medium and producing fucosylated chondroitin in the culture.
  • the microorganism used in producing the fucosylated chondroitin of the present disclosure by fermentation is a microorganism that has a protein having fucosyltransferase activity on chondroitin and produces fucosylated chondroitin.
  • the microorganism may be a microorganism in which the activity of the protein having fucosyltransferase activity on chondroitin is enhanced compared to a parent strain and the productivity of fucosylated chondroitin is improved.
  • the microorganism having a protein having fucosyltransferase activity on chondroitin may be a microorganism that originally has a protein having fucosyltransferase activity on chondroitin.
  • the type strain used is a microorganism that does not originally have a protein having fucosyltransferase activity on chondroitin, it may be a genetically modified microorganism to which a protein having fucosyltransferase activity on chondroitin has been artificially added.
  • the genetically modified microorganism used in the fermentation method for producing fucosylated chondroitin is preferably a genetically modified microorganism capable of producing GDP-fucose and/or chondroitin. If the microorganism used does not inherently have the ability to produce GDP-fucose and/or chondroitin, the ability to produce GDP-fucose and/or chondroitin may be imparted to the microorganism. Furthermore, if the microorganism used inherently has the ability to produce GDP-fucose and/or chondroitin, the ability to produce GDP-fucose and/or chondroitin may be further enhanced.
  • GDP-fucose may be added to the medium during culture as a substrate for fucosylated chondroitin, or GTP, mannose, or the like, which are substrates for GDP-fucose, may be added to the medium.
  • GDP-fucose may be supplied to the genetically modified microorganism by simultaneously culturing a microorganism capable of producing GDP-fucose with the genetically modified microorganism.
  • microorganisms capable of producing GTP may be simultaneously cultured.
  • microorganisms capable of producing GTP include known microorganisms such as microorganisms in which the expression of enzymes involved in the GTP biosynthetic pathway has been enhanced by various genetic manipulations (Biotechnol Bioeng (2019) Sep 3).
  • chondroitin may be added to the medium during cultivation as a substrate for fucosylated chondroitin, or chondroitin substrates such as UDP-glucuronic acid and UDP-N-acetylgalactosamine may be added to the medium.
  • chondroitin substrates such as UDP-glucuronic acid and UDP-N-acetylgalactosamine may be added to the medium.
  • chondroitin may be supplied during culture by the following method instead of adding chondroitin to the medium.
  • chondroitin can be supplied to the genetically modified microorganism by simultaneously culturing a microorganism capable of producing chondroitin with the genetically modified microorganism of this embodiment.
  • the genetically modified microorganism can be cultured according to a conventional method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing genetically modified microorganisms either a natural medium or a synthetic medium may be used, as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be utilized by the genetically modified microorganisms and allows the genetically modified microorganisms to be cultivated efficiently.
  • the carbon source may be any that can be assimilated by the genetically modified microorganism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch, or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, and alcohols such as glycerol, ethanol, or propanol.
  • the genetically modified microorganism such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch, or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, and alcohols such as glycerol, ethanol, or propanol.
  • nitrogen sources include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, soybean meal, soybean meal hydrolysate, various fermentation bacteria and digested products thereof, and the like.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as shaking culture or submerged aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40°C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during cultivation is usually maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during culture as needed.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Fucosylated chondroitin can be produced by culturing as described above, producing and accumulating fucosylated chondroitin in the culture, and then harvesting the fucosylated chondroitin from the culture.
  • the obtained fucosylated chondroitin can be analyzed by conventional methods such as carbohydrate ion chromatography or gel filtration chromatography. Fucosylated chondroitin can be collected from cultures or treated cultures by conventional methods using activated carbon or ion exchange resins. When fucosylated chondroitin accumulates within the bacterial cells, the cells can be disrupted, for example, by ultrasonication or chemical treatment, and the cells removed by centrifugation. The resulting supernatant can then be used to collect fucosylated chondroitin using activated carbon or ion exchange resins.
  • the circle ( ⁇ ) represents GalNAc
  • the square ( ⁇ ) represents GlcA
  • the triangle ( ⁇ ) represents fucose.
  • the GalNAc at the right end represents the reducing end of the sugar chain.
  • GalNAc is attached to the disaccharide by the action of chondroitin synthase (CS), producing a trisaccharide.
  • fucose is transferred to the second GlcA from the left end of the trisaccharide by the action of fucosyltransferase (FucT), resulting in fucosylated chondroitin with one fucose attached.
  • GlcA and GalNAc are attached by the action of CS, resulting in the production of a pentasaccharide with an elongated chondroitin sugar chain.
  • fucose is transferred to the second GlcA from the left end of the pentasaccharide by the action of FucT, resulting in fucosylated chondroitin with two fucose bonds.
  • the schematic diagram is a simplified example of the process for producing fucosylated chondroitin by fermentation, and in reality, CS and FucT may work simultaneously to transfer fucose to chondroitin while the chondroitin is elongated. As a result, fucosylated chondroitin of several tens to several hundreds of kDa can be obtained.
  • all GlcAs are bound to fucose, but fucosylated chondroitin may contain GlcAs that are not bound to fucose.
  • the method for producing fucosylated chondroitin of this embodiment also includes a method for producing fucosylated chondroitin using GDP-fucose and chondroitin as substrates.
  • the method for producing the fucosylated chondroitin of the present disclosure by an enzymatic method uses, as the enzyme source, an enzyme source containing a protein having fucosyltransferase activity for chondroitin produced in a cell-free protein synthesis system, or an enzyme preparation containing a culture of a microorganism capable of producing a protein having fucosyltransferase activity for chondroitin or a processed product of said culture.
  • the production method involves causing a substrate and the enzyme source to be present in an aqueous medium and producing fucosylated chondroitin in the aqueous medium.
  • the production method may also include, for example, producing fucosylated chondroitin in the aqueous medium, accumulating it, and collecting the fucosylated chondroitin from the aqueous medium.
  • GDP-fucose and chondroitin may be of any origin, as long as they serve as substrates for the proteins of this embodiment possessed by the genetically modified microorganism.
  • a culture or a processed culture of a microorganism capable of producing GDP-fucose or chondroitin may be used as is, or GDP-fucose and chondroitin extracted from the culture or a processed culture may be used.
  • processed culture products include concentrates of cultures, dried cultures, bacterial cells obtained by centrifuging the cultures, dried bacterial cells, freeze-dried bacterial cells, surfactant-treated bacterial cells, ultrasonically treated bacterial cells, mechanically ground bacterial cells, solvent-treated bacterial cells, enzyme-treated bacterial cells, protein fractions of bacterial cells, immobilized bacterial cells, and isolated and purified enzymes obtained by extraction from bacterial cells.
  • solvent-treated bacterial cells and isolated and purified enzymes obtained by extraction from bacterial cells are preferred.
  • Examples of the solvent-treated bacterial cells include those treated with xylene. Treating bacterial cells with xylene allows GDP-fucose and chondroitin to be incorporated into the bacterial cells without completely disrupting the cells, and also allows the fucosyltransferase activity of the bacterial cells to be maintained.
  • the purified enzyme can be obtained using the genetically modified microorganism of this embodiment described above, but the following method is preferred, for example.
  • a recombinant DNA is prepared which contains DNA encoding at least one protein selected from (1) to (4) above and a tag sequence for enzyme purification.
  • a microorganism obtained by transforming the recombinant DNA is cultured, and the protein is prepared as a purified enzyme from the resulting culture.
  • Tag sequences for the purification of such enzymes are described in the literature and known to those skilled in the art. Examples are sequences that can be used to (affinity) purify the polypeptide chain (see, e.g., Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013; 73:9.9.1-9.9.23. Published 2013 Sep 24.
  • a His tag is a polyhistidine amino acid motif in proteins, typically consisting of at least six histidine (His) residues, often located at the N- or C-terminus of the protein.
  • Polyhistidine tags are often used for affinity purification of polyhistidine-tagged recombinant proteins expressed in Escherichia coli and other prokaryotic expression systems by incubation with affinity resins containing bound divalent nickel or cobalt ions, of which various types are commercially available.
  • These resins are generally Sepharose/agarose functionalized with chelators such as iminodiacetic acid (Ni-IDA) and nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) for nickel and carboxymethylaspartic acid (Co-CMA) for cobalt, to which polyhistidine tags bind with micromolar affinity.
  • chelators such as iminodiacetic acid (Ni-IDA) and nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) for nickel and carboxymethylaspartic acid (Co-CMA) for cobalt, to which polyhistidine tags bind with micromolar affinity.
  • the resin is then typically washed with phosphate buffer to remove proteins that do not specifically interact with cobalt or nickel ions.
  • the addition of 20 mM imidazole can improve wash efficiency (proteins are typically eluted at 150-300 mM imidazole).
  • Aqueous media include, for example, water, buffer solutions such as phosphates, carbonates, acetates, borates, citrates, and Tris, alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetamide.
  • buffer solutions such as phosphates, carbonates, acetates, borates, citrates, and Tris
  • alcohols such as methanol and ethanol
  • esters such as ethyl acetate
  • ketones such as acetone
  • amides such as acetamide
  • the analysis and collection methods for the fucosylated chondroitin produced in the aqueous medium are the same as those in 1. Production method of fucosylated chondroitin by fermentation.
  • the production method of this embodiment can be used as a method for industrially producing fucosylated chondroitin.
  • the fucosylated chondroitin obtained by the production method of this embodiment can be used to produce fucosylated chondroitin sulfate, which can be used as a pharmaceutical, health food, etc.
  • Fucosylated chondroitin sulfate can be produced by chemical reaction, enzymatic reaction, or the like, using fucosylated chondroitin as a substrate.
  • fucosylated chondroitin sulfate either chondroitin or chondroitin sulfate may be used as the substrate.
  • Chondroitin may be reacted with an enzyme having fucosyltransferase activity to produce fucosylated chondroitin, and then the fucosylated chondroitin may be used as a substrate for sulfate conversion.
  • Fucosylated chondroitin sulfate may also be produced by reacting chondroitin sulfate with an enzyme having fucosyltransferase activity to produce fucosylated chondroitin sulfate.
  • Chondroitin sulfate may also be reacted with an enzyme having desulfating activity to produce non-sulfated chondroitin, followed by reaction with an enzyme having fucosyltransferase activity to produce fucosylated chondroitin, which may then be re-sulfated.
  • the genetically modified microorganism having a protein of interest may be a genetically modified microorganism in which the protein of interest has been enhanced.
  • the activity of a protein is enhanced may mean that the activity of the protein is enhanced compared to that of a parent strain.
  • the activity of a protein is enhanced may mean that the activity of the protein per cell is enhanced compared to that of a parent strain.
  • the term "parent strain” as used herein refers to a strain that is the target of genetic modification to enhance the activity of the protein of interest.
  • the parent strain may refer to a type strain (i.e., a type strain of the species to which the microorganism belongs) that is the target of genetic modification, or a strain that has already been genetically modified from the type strain.
  • the strains exemplified in the description of the parent strain below can be used, but are not limited thereto.
  • enhanced protein activity may more specifically mean that the number of molecules of the protein per cell is increased and/or the function of the protein per molecule is enhanced compared to that of the parent strain. That is, the "activity" in “enhanced protein activity” is not limited to the catalytic activity of the protein, but may also mean the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. Furthermore, “enhanced protein activity” encompasses not only further enhancing the activity of a target protein in a parent strain that originally has the activity of the protein, but also imparting the activity of the target protein to a parent strain that does not originally have the activity of the protein.
  • the degree of enhancement of protein activity is not particularly limited as long as the protein activity is enhanced compared to that of the parent strain.
  • the protein activity may be increased, for example, by 1.2 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more compared to the activity of the protein in the parent strain.
  • the gene encoding the protein may be introduced to be genetically modified so that the protein is produced, as long as the protein is produced to an extent that its activity can be measured.
  • Enhanced protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein is increased compared to the parent strain. Increased gene expression can be confirmed by confirming that the transcription level of the gene is increased compared to the parent strain, or by confirming that the amount of the protein expressed from the gene is increased compared to the parent strain. As used herein, "increased gene expression” may more specifically mean that the amount of gene transcription (mRNA amount) is increased and/or the amount of gene translation (protein amount) is increased. Recombination that enhances protein activity can also be achieved by, for example, enhancing the specific activity of the protein. Enhancement of specific activity may also include desensitization to feedback inhibition.
  • the activity of the protein can be enhanced by having the host harbor a gene encoding a mutant protein in which feedback inhibition is desensitized.
  • “desensitization to feedback inhibition” may include cases where feedback inhibition is completely released and cases where feedback inhibition is reduced.
  • “desensitization to feedback inhibition” i.e., feedback inhibition is reduced or released
  • Proteins with enhanced specific activity can be obtained, for example, by searching various organisms. Alternatively, highly active proteins can be obtained by introducing mutations into existing proteins.
  • the mutations introduced may be, for example, substitutions, deletions, insertions, or additions of one or several amino acids at one or several positions in the protein. Furthermore, when enhancing protein activity, efforts may be made to express the protein in a soluble fraction and ensure correct folding of the protein, etc. Specific examples include co-expression with a chaperone protein, investigation of gene inducers, refolding techniques, deletion of the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of the protein, selection of a protein expression vector, optimization of purification conditions, and optimization of codons.
  • the protein having fucosyltransferase activity on the substrate may be coexpressed with a chaperone protein. That is, the genetically modified microorganism in this embodiment may be a genetically modified microorganism having a protein having fucosyltransferase activity on the substrate, in which the protein is coexpressed with a chaperone protein.
  • chaperone proteins include heat shock proteins, and among heat shock proteins, group I chaperonins are preferred.
  • group I chaperonins examples include groEL (e.g., SEQ ID NO: 201), groES (e.g., SEQ ID NO: 202), HSP10, HSP60, and Cpn60, with groEL and groES being preferred.
  • a microorganism with enhanced activity of a target protein can also be produced by transforming a parent strain of a microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding the protein, thereby increasing the expression of the DNA encoding the protein compared to the parent strain.
  • “Increased DNA expression” is also referred to as “increased gene expression.”
  • "Increasing gene expression” is also referred to as “enhancing gene expression.”
  • gene expression may be increased, for example, by 1.2 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more compared to the expression of the gene in the parent strain.
  • “increasing gene expression” encompasses not only increasing the expression level of a gene of interest in a strain in which the gene is originally expressed, but also expressing the gene in a strain in which the gene of interest is not originally expressed.
  • “increasing gene expression” may mean, for example, introducing the gene of interest into a strain that does not harbor the gene and expressing the gene.
  • Increased gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene, selecting a promoter with a high frequency of transcription initiation, or disrupting or enhancing the expression of a transcriptional regulatory factor involved in controlling the expression of the target gene. That is, in the case of a transcriptional regulatory factor that contributes to suppressing the expression of the target gene, this can be achieved by disruption, and in the case of a transcriptional regulatory factor that contributes to promoting the expression of the target gene, this can be achieved by enhancement.
  • microorganisms in which the copy number of DNA encoding a protein is increased compared to the parent strain include microorganisms in which the copy number of DNA encoding the protein on the chromosomal DNA is increased by transforming the parent strain of the microorganism with recombinant DNA containing a gene encoding the protein, and microorganisms in which the DNA encoding the protein is carried outside the chromosomal DNA as plasmid DNA.
  • DNA encoding proteins comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197 can be obtained, for example, by Southern hybridization to a microbial chromosomal DNA library using a probe that can be designed based on the base sequence of DNA encoding proteins comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, or by PCR using DNA as a template and primer DNA that can be designed based on DNA encoding proteins comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197 [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • DNA can be obtained by using DNA encoding proteins containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, and introducing mutations into the base sequence of a portion of the DNA encoding a specific amino acid residue by site-directed mutagenesis, as described in, for example, Molecular Cloning, 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) and Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.), and replacing the mutations with base sequences encoding other amino acid residues.
  • a mutant protein containing an amino acid sequence represented by one of the amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197 as described in (1) [2] or [3] above, in which 1 to 30 amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added, or a DNA encoding a mutant protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity to an amino acid sequence represented by one of the amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197, can be obtained by subjecting DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 22 and 197 as a template to error-prone PCR or the like.
  • DNA encoding the mutant protein described in (1), [2], or [3] above can also be obtained by site-specific mutagenesis using a pair of PCR primers each having a base sequence at its 5' end designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion, and/or addition) [Gene, 77, 51 (1989)].
  • the DNA can be obtained by following the instructions attached to a commercially available site-directed mutagenesis kit. That is, first, a pair of mutagenesis primers is designed with a template of a plasmid having a base sequence designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion, or addition), with a 15-base overlap on the 5' side. The overlapping portion contains the desired mutation. Next, PCR is performed using the mutagenesis primers and a template of a plasmid having the base sequence into which the desired mutation is to be introduced. The amplified fragment obtained in this way is transformed into Escherichia coli, whereby a plasmid having the base sequence into which the desired mutation has been introduced can be obtained.
  • a pair of mutagenesis primers is designed with a template of a plasmid having a base sequence designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion, or addition), with a 15-base overlap on the 5' side.
  • the overlapping portion contains the desired mutation
  • the DNA of this embodiment obtained by the above method can be used as is or cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like and inserted into a vector by standard methods.
  • the resulting recombinant DNA can then be introduced into a parent strain, and the base sequence of the DNA can be determined by a commonly used base sequence analysis method, such as the dideoxy method [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)], or by analysis using a base sequence analyzer such as an Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or an Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • recombinant DNA obtained by incorporating DNA can be introduced into a parent strain by any method that introduces DNA into a host cell, such as a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 63-248394), or the electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like against a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the desired DNA can be prepared by chemical synthesis using an NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd., based on the determined DNA base sequence.
  • recombinant DNA is DNA that can autonomously replicate within a parent strain, and is DNA in which the DNA of this embodiment is incorporated into an expression vector containing a promoter at a position where the DNA of this embodiment can be transcribed.
  • DNA that can be integrated into the chromosome of a parent strain and that contains the DNA of this embodiment is also recombinant DNA of this embodiment.
  • the recombinant DNA is capable of being integrated into a chromosome, it may not contain a promoter.
  • the recombinant DNA is preferably a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of this embodiment, and a transcription termination sequence. It may further contain a gene that controls the promoter.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA in this embodiment, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately downstream of the structural gene.
  • examples of the expression vector include pColdI, pSTV28, pUC118 (all manufactured by Takara Bio Inc.), pET21a, pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, pTrc99A (all manufactured by GE Healthcare Biosciences), pTrcHis, pSE280 (all manufactured by Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30, pQE-60, pQE80L (all manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescriptII SK(+), and pBluescriptII.
  • KS(-) (all manufactured by Agilent Technologies), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • pTrS30 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)
  • pTrS32 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)
  • pTK31 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, No. 20, p6378-6385
  • pPE167 Appl. Environ. Microbiol.
  • the promoter used in the expression vector is not particularly limited as long as it functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Escherichia, and examples of promoters that can be used include promoters derived from Escherichia coli or phages, such as the trp promoter, gapA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and PSE promoter.
  • Promors such as a promoter in which two trp promoters are connected in tandem, the tac promoter, the trc promoter, the lacT5 promoter, the lacT7 promoter, and the let I promoter can also be used.
  • examples of the expression vector include pCG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197), pCG4 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all Japanese Patent Laid-Open No.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in the cells of coryneform bacteria.
  • the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, pp. 674-679 (2000)] can be used.
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in the cells of the yeast strain, and examples thereof include promoters such as the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter.
  • the recombinant DNA in this embodiment can be produced, for example, by treating the prepared DNA fragment with a restriction enzyme and inserting it downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a restriction enzyme for example, by substituting bases in the base sequence of the DNA in this embodiment so that the codons are optimal for expression in the parent strain, the expression level of the protein encoded by the DNA can also be improved. Information on codon usage in parent strains is available through public databases.
  • the genetically modified microorganism in this embodiment is a genetically modified microorganism obtained by transforming a parent strain with recombinant DNA containing the DNA in this embodiment.
  • the parent strain into which the recombinant DNA is introduced may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like.
  • prokaryotes or yeast strains are preferred, and prokaryotes belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, or Pseudomonas, or yeast strains belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, or Candida are more preferred, and examples thereof include Escherichia coli BL21 codon plus, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (all manufactured by Agilent Technologies), ...
  • prokaryotes such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, or Candida utilis.
  • the parent strain can be a genetically modified microorganism that has been artificially imparted or enhanced with the ability to produce GDP-fucose, which is the substrate for the fucosyltransferase reaction on glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce GDP-fucose to a microorganism used as a parent strain include (a) a method for alleviating or deactivating at least one of the mechanisms controlling the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose, (b) a method for enhancing the expression of at least one of the enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose, (c) a method for increasing the copy number of at least one gene that encodes an enzyme involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose, and (d) a method for weakening or blocking at least one of the metabolic pathways that branch off from the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose to a metabolic product other than the target substance, and the above known methods can be used alone or in combination.
  • Mechanisms that control the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose include known mechanisms such as a control mechanism by a transcriptional regulatory factor (RcsA, etc.) involved in the control of the biosynthetic pathway.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose include known enzymes such as mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannomutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, GDP mannose-4,6-dehydratase, and GDP-L-fucose synthase.
  • metabolic pathways that branch off from the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose to metabolites other than the target substance include known metabolic pathways such as the metabolic pathway from GDP-fucose to colanic acid.
  • methods for imparting or enhancing the ability to produce GDP-fucose include known methods such as various genetic engineering methods (Metabolic Engineering (2017) 41: 23-38).
  • genetically modified microorganisms that have been artificially imparted or enhanced with the ability to produce glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans, which are substrates for the fucosyltransferase reaction on glucuronic acid-containing glycosaminoglycans or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycans, can also be used as parent strains.
  • chondroitin is used as the glucuronic acid-containing glycosaminoglycan or glucuronic acid-containing sulfated glycosaminoglycan will be described.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability of a microorganism used as a parent strain to supply chondroitin include (a) a method for alleviating or deactivating at least one of the mechanisms controlling the biosynthetic pathway that produces chondroitin, (b) a method for enhancing the expression of at least one enzyme involved in the biosynthetic pathway that produces chondroitin, (c) a method for increasing the copy number of at least one gene encoding an enzyme involved in the biosynthetic pathway that produces chondroitin, (d) a method for alleviating or deactivating at least one of the mechanisms that degrade chondroitin, (e) a method for enhancing the expression of at least one enzyme involved in the cellular uptake of chondroitin, (f) a method for increasing the copy number of at least one gene encoding an enzyme involved in the cellular uptake of chondroitin, and (g) a method for weakening or blocking at least one metabolic pathway that branches off from chondroitin to a
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces chondroitin include known enzymes such as chondroitin synthase, which has the activity of producing chondroitin using a carbon source that can be assimilated by the microorganism as a substrate.
  • Methods for introducing recombinant DNA into a parent strain as an autonomously replicating plasmid include, for example, the calcium ion method mentioned above, the protoplast method, electroporation, the spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], and the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)].
  • Methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of a parent strain include, for example, homologous recombination.
  • homologous recombination include using a homologous recombination plasmid, which can be created by linking plasmid DNA containing a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the parent strain to be introduced.
  • a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli is, for example, the use of the lambda phage homologous recombination system to introduce recombinant DNA [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • E. coli in which the target region on the chromosomal DNA of the parent strain has been replaced with recombinant DNA can be obtained using selection methods such as a method that utilizes the fact that E. coli becomes sucrose-sensitive due to Bacillus subtilis levansucrase incorporated into the chromosome along with recombinant DNA, or a selection method that utilizes the fact that E. coli becomes streptomycin-sensitive by incorporating a wild-type rpsL gene into E. coli that has a mutant rpsL gene that confers streptomycin resistance [Mol. Microbiol., 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)].
  • the mixing ratio of solution A to solution B was changed from 10:90 to 28:72 gradient from 0 to 5 minutes, from 28:72 to 38:62 gradient from 5 to 11 minutes, constant at 38:62 from 11 to 26 minutes, from 38:62 to 10:90 gradient from 26 to 28 minutes, and constant at 10:90 from 28 to 30 minutes.
  • Flow rate 0.5 mL/min.
  • Injection volume 10 ⁇ L.
  • Detection The table below shows the target compounds to be detected and the mass (m/z) values of the compounds detected by mass spectrometry.
  • 1x Fucose adduct means chondroitin to which one fucose has been added
  • 2x Fucose adduct means chondroitin to which two fucose has been added
  • 3x Fucose adduct means chondroitin to which three fucose has been added.
  • Example 1 Evaluation of Fucosyltransferase (fucT) Activity (1) Construction of a fucT-Expressing Strain Using the expression vector pET28a (Novagen) containing a T7 promoter as a template and oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOS: 23 and 24 as a primer set, a PCR reaction was performed to obtain fragment 1. Escherichia coli carrying gene expression plasmids encoding fucTs consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1 to 11 was constructed by the following method.
  • PCR was performed to obtain each amplified DNA fragment.
  • the artificially synthesized genes listed in the table below were synthesized by optimizing the base sequences encoding the respective amino acid sequences for E. coli using the artificial synthetic gene service of Eurofins Genomics.
  • Primers 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, and 58 have a base sequence of 15 residues from the 3' end of pET28a fragment 1 added to the 5' end of the region containing the start codon of the fucT gene.
  • Primers 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, and 59 have a base sequence complementary to 15 residues from the 5' end of pET28a fragment 1 added to the 5' end of a base sequence complementary to a sequence containing the stop codon of the fucT gene.
  • the amplification product obtained by PCR and pET28a fragment 1 were each reacted at 50°C for 15 minutes using an In-fusion Kit (Takara Bio Inc.) and ligated to the expression vector pET28a to obtain the expression plasmids pET28a-BnfucT, pET28a-BrfucT, pET28a-JlfucT, pET28a-FmfucT2, pET28a-CxfucT, pET28a-BcbfucT5, pET28a-CbfucT, pET28a-LbfucT5, pET28a-BffucT3, pET28a-BcbfucT6, pET28a-DmfucT, and pET28a-BacfucT.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the expression plasmids obtained above, and the following plasmids were expressed: BL21 (DE3) / pET28a-BnfucT, BL21 (DE3) / pET28a-BrfucT, BL21 (DE3) / pET28a-JlfucT, BL21 (DE3) / pET28a-FmfucT2, BL21 (DE3) / pET28a-CxfucT, BL21 (DE3) / pET28a-Bcb fucT5, BL21(DE3)/pET28a-CbfucT, BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5, BL21(DE3)/pET28a-BffucT3, BL21(DE3)/pET28a-BcbfucT6, BL21(DE3)/pET28a-Dm
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and the cultured at 15°C for an additional 24 hours.
  • the culture medium was centrifuged to obtain wet cells, to which xylene was added to give a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM non-sulfated pentasaccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 10 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 24 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed using the method described in [Analysis Example]. The analysis results are shown in the table below.
  • Example 2 Evaluation of activity of four types of fucT derived from Fusobacterium mortiferum (1) Construction of strains expressing FmfucT, FmfucT3, and FmfucT4 Escherichia coli carrying gene expression plasmids encoding fucT consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 12-13 and 62 were constructed by the following method. PCR was performed using the DNA listed in the "Template” column in the table below as a template and DNA consisting of the base sequences represented by the "Primer Set” column in the table below as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • Primers 66, 68, and 70 comprise the 15-residue base sequence from the 3' end of pET28a fragment 1 in Example 1(1) added to the 5' end of the region containing the start codon of the fucT gene.
  • Primers 67, 69 and 71 have a base sequence complementary to 15 residues from the 5' end of pET28a fragment 1 of Example 1(1) added to the 5' end of a base sequence complementary to a sequence including the termination codon of the fucT gene.
  • the amplification product obtained by PCR and pET28a fragment 1 were each reacted at 50°C for 15 minutes using an In-fusion Kit (Takara Bio Inc.), and ligated to the expression vector pET28a to obtain expression plasmids pET28a-FmfucT, pET28a-FmfucT3, and pET28a-FmfucT4.
  • Escherichia coli BL21(DE3) was transformed with the expression plasmids obtained above to obtain BL21(DE3)/pET28a-FmfucT, BL21(DE3)/pET28a-FmfucT3, and BL21(DE3)/pET28a-FmfucT4.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and cultured for an additional 24 hours at 15°C.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30°C and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.25 mM non-sulfated pentasaccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 10 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 24 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed by the method described in [Analysis Example]. The results are shown in the table below. It was revealed that FmfucT2 had the highest activity.
  • Example 3 Evaluation of Activity of FmfucT2 Mutants (1) Construction of Strains Expressing FmfucT2 Mutants A mutation introduction system using PrimeSTAR MAX (Takara Bio Inc.) was used to create the mutants. Specifically, PCR was performed using the pET28a-FmfucT2 plasmid constructed in Example 1(1) as a template and DNAs consisting of the base sequences shown in the "Primer Set" in the table below as a primer set to obtain a circular double-stranded construct.
  • Escherichia coli having a plasmid for expressing a gene encoding FmfucT2_P13X (X represents any amino acid except proline (P)) consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 14 to 18 and 72 to 85, Escherichia coli having a plasmid for expressing a gene encoding FmfucT2_H50N consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and Escherichia coli having a plasmid for expressing a gene encoding FmfucT2_E84G consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 were constructed, and expression plasmids pET28a-FmfucT2_P13X, pET28a-FmfucT2_H50N, and pET28a-FmfucT2_E84G were obtained.
  • X represents any amino acid except proline (P)
  • Escherichia coli BL21(DE3) was transformed with the expression plasmids obtained above to obtain BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_P13X, BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_H50N, and BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_E84G.
  • Example 2 Comparison of fucosylated chondroitin production by resting cell reaction using FmfucT2- and FmfucT2_P13X-expressing strains BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2 and BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_P13X obtained in Example 1(1) and Example 3(1) were inoculated into test tubes containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • FmfucT2_P13D, FmfucT2_P13F, and FmfucT2_P13N were found to have higher production yields and higher activity than FmfucT2. Among them, FmfucT2_P13D was found to have the highest activity.
  • FmfucT2_P13D and FmfucT2_P13F are mutants that produce a greater amount of 2x fucose adduct than FmfucT2, and FmfucT2_P13D is the mutant that produces the greatest amount of 2x fucose adduct.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM non-sulfated pentasaccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 24 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed by the method described in [Analysis Example]. The results are shown in the table below. FmfucT2_H50N and FmfucT2_E84G were found to have higher production yields and higher activity than FmfucT2.
  • FmfucT2_V66X (X represents all amino acids except V) expression strain
  • the mutant was prepared using a PrimeSTAR MAX (Takara Bio Inc.) mutagenesis system. Specifically, PCR was performed using the pET28a-FmfucT2 plasmid constructed in Example 1(1) as a template and DNA consisting of the base sequence shown in the "Primer Set" in the table below as a primer set to obtain a circular double-stranded construct.
  • This circular double-stranded construct was used to construct Escherichia coli carrying a gene expression plasmid encoding FmfucT2_V66X consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 140 to 158, and the expression plasmid pET28a-FmfucT2_V66X was obtained.
  • Escherichia coli BL21(DE3) was transformed with the expression plasmid obtained above to obtain BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_V66X.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.25 mM non-sulfated pentasaccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 10 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 24 hours. After the reaction was completed, the reaction product was analyzed in the same manner as in Example 1 (2). The results are shown in the table below. Since the native sequence of FmfucT2 had the highest activity, it was revealed that V is optimal for the 66th amino acid of FmfucT2.
  • Example 4 Evaluation of Activity Against Heptasaccharide Non-Sulfated Chondroitin BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2, BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_P13D, and BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5 obtained in Example 1(1) and Example 3(1) were inoculated into test tubes containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet bacterial cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.75 mM non-sulfated 7-saccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 48 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed using the method described in [Analysis Example]. The analytical results are shown in the table below.
  • FmfucT2, FmfucT2_P13D, and LbfucT5 all fucosylated non-sulfated heptasaccharide chondroitin.
  • FmfucT2_P13D produced the highest amounts of 1x fucose adduct and 2x fucose adduct, while LbfucT5 produced the highest amount of 3x fucose adduct.
  • Example 5 Evaluation of Activity Against Non-Sulfated Nine-Sugar Chondroitin BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2, BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_P13D, and BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5 obtained in Example 1(1) and Example 3(1) were inoculated into test tubes containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet bacterial cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.375 mM non-sulfated 9-saccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAcA-GlcA-GalNAcA-GalNAc), 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube and reacted at 37°C and 850 rpm for 48 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed using the method described in [Analysis Example]. The analytical results are shown in the table below.
  • FmfucT2_P13D produced the highest amounts of 1x fucose adduct and 2x fucose adduct, while LbfucT5 produced the highest amount of 3x fucose adduct.
  • Example 6 Evaluation of Activity Against 11-Sugar Non-Sulfated Chondroitin BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2, BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_P13D, and BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5 obtained in Example 1(1) and Example 3(1) were inoculated into test tubes containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet bacterial cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.125 mM 11-saccharide non-sulfated chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAcA-GlcA-GalNAcA-GalNAcA-GalNAc), 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube and reacted at 37°C and 850 rpm for 48 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed using the method described in [Analysis Example]. The analytical results are shown in the table below.
  • FmfucT2, FmfucT2_P13D, and LbfucT5 were all capable of fucosylation of 11-sugar non-sulfated chondroitin, and that polysaccharides with more than 10 sugars could also be used as substrates. Furthermore, FmfucT2_P13D produced the highest yields of all 1x fucose adducts, 2x fucose adducts, and 3x fucose adducts.
  • Example 7 Evaluation of the Activity of Sea Cucumber-Derived fucT
  • Construction of a Strain Expressing Sea Cucumber-Derived fucT A PCR reaction was performed using the expression vector pET28a (Novagen) containing a T7 promoter as a template and oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 124 and 125 as a primer set to obtain fragment 2.
  • Escherichia coli carrying gene expression plasmids encoding fucT consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 19, 20, and 126 was constructed by the following method.
  • PCR was performed using the DNA listed in the "Template” column in the table below as a template and DNA consisting of the base sequences represented by the "Primer Set” column in the table below as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • the artificially synthesized genes listed in the table below were synthesized by optimizing the base sequences encoding the respective amino acid sequences for E. coli using the artificial synthetic gene service of Eurofins Genomics.
  • Primers 130 and 132 have a nucleotide sequence of 15 residues from the 3' end of pET28a fragment 1 of Example 1(1) added to the 5' end of the region containing the start codon of the fucT gene.
  • Primers 131 and 133 have a nucleotide sequence complementary to 15 residues from the 5' end of pET28a fragment 1 of Example 1(1) added to the 5' end of a nucleotide sequence complementary to a sequence containing the stop codon of the fucT gene.
  • Primer 134 has a nucleotide sequence of 15 residues from the 3' end of pET28a fragment 2 added to the 5' end of a region containing the start codon of the fucT gene.
  • Primer 135 has a nucleotide sequence complementary to 15 residues from the 5' end of pET28a fragment 2 added to the 5' end of a nucleotide sequence complementary to a sequence containing the stop codon of the fucT gene.
  • the amplification products obtained by PCR, pET28a fragment 1, AjfucT2, and AjfucT7, and pET28a fragment 2 and AjfucT15 were reacted at 50°C for 15 minutes using an In-fusion Kit (Takara Bio Inc.), and ligated to the expression vector pET28a to obtain expression plasmids pET28a-AjfucT2, pET28a-AjfucT7, and pET28a-AjfucT15.
  • Escherichia coli BL21(DE3) was transformed with the expression plasmids obtained above to obtain BL21(DE3)/pET28a-AjfucT2, BL21(DE3)/pET28a-AjfucT7, and BL21(DE3)/pET28a-AjfucT15.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30° C. for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was further cultured at 15° C. for 24 hours.
  • the culture medium was centrifuged to obtain wet cells, to which xylene was added to give a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30°C and 850 rpm for 30 minutes.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.25 mM non-sulfated pentasaccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 10 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 24 hours. After the reaction was completed, the analytical fractions were analyzed using the method described in [Analysis Example]. The analysis results are shown in the table below.
  • Example 8 Evaluation of the activity of fucosyltransferase (EsfucT) derived from Epulopiscium sp. AS2M-Bin002
  • EsfucT-expressing strain Using the expression vector pET28a (Novagen) containing the T7 promoter as a template and oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 23 and 24 as a primer set, a PCR reaction was performed to obtain fragment 1.
  • Escherichia coli carrying a plasmid for expressing a gene encoding EsfucT consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 197 was constructed by the following method.
  • the primer (SEQ ID NO: 199) has a base sequence of 15 residues from the 3' end of pET28a fragment 1 added to the 5' end of the region containing the start codon of the fucT gene.
  • the primer (SEQ ID NO: 200) has a base sequence complementary to 15 residues from the 5' end of pET28a fragment 1 added to the 5' end of a base sequence complementary to a sequence containing the stop codon of the fucT gene.
  • the PCR amplification product and pET28a fragment 1 were each reacted at 50°C for 15 minutes using an In-fusion Kit (Takara Bio Inc.), and ligated with the expression vector pET28a to obtain the expression plasmid pET28a-EsfucT.
  • Escherichia coli BL21(DE3) was transformed with the expression plasmid obtained above to obtain BL21(DE3)/pET28a-EsfucT.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was performed for 30 minutes at 30°C and 850 rpm.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.75 mM non-sulfated 7-saccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 48 hours.
  • LC-MS analysis was performed using a HILICpak VN-50 4D, 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 150 mm (Resonac) separation column at 60°C.
  • the LC eluent was 25 mM ammonium formate/H 2 O (Solution A) and acetonitrile (Solution B), with a flow rate of 0.5 mL/min.
  • the mixing ratio of Solution A to Solution B varied from 10:90 to 28:72 gradient from 0 to 5 min, from 28:72 to 38:62 gradient from 5 to 11 min, at a constant 38:62 from 11 to 21 min, from 38:62 to 10:90 gradient from 21 to 23 min, and at a constant 10:90 from 23 to 30 min.
  • Detection by MS was performed in negative mode, with detection of heptasaccharide non-sulfated chondroitin at 678.3 > 576.75 m / z, detection of fucosylated chondroitin in which one fucose was added to heptasaccharide non-sulfated chondroitin (hereinafter referred to as 1 x Fucose adduct) at 751.5 m / z, detection of fucosylated chondroitin in which two fucose was added to heptasaccharide non-sulfated chondroitin (hereinafter referred to as 2 x Fucose adduct) at 824.5 m / z, and detection of fucosylated chondroitin in which three fucose was added to heptasaccharide non-sulfated chondroitin (hereinafter referred to as 3 x Fucose adduct) at 897.5 m /
  • Example 9 Examination of improvement of LbfucT5 activity by chaperone proteins (1) Introduction of chaperone plasmid into LbfucT5-expressing strain BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5 was transformed with chaperone plasmids pG-KJE8 and pGro7 (both from Takara Bio Inc.), respectively, to obtain BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5+pG-KJE8 and BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5+pGro7.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin, 30 mg/L chloramphenicol, 0.5 g/L L-arabinose, and 5 ng/mL tetracycline, and cultured at 30°C for 5 hours. After incubation at 30°C for 5 hours, IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was further incubated at 15°C for 24 hours. The culture was centrifuged to obtain wet cells. Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was performed for 30 minutes at 30°C and 850 rpm.
  • BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5+pGro7 obtained in (1) was inoculated into a test tube containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and 30 mg/L chloramphenicol, and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin, 30 mg/L chloramphenicol, and 0.5 g/L L-arabinose, and cultured at 30°C for 5 hours.
  • IPTG was then added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was further cultured at 15°C for 24 hours. The culture was centrifuged to obtain wet cells. Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was performed for 30 minutes at 30°C and 850 rpm. Furthermore, as a control, BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5 without chaperone protein was inoculated into a test tube containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours, after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and further cultured at 15°C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was performed for 30 minutes at 30°C and 850 rpm.
  • a 0.2 mL reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.175 mM non-sulfated 7-saccharide chondroitin (GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc-GlcA-GalNAc), 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube, and the reaction was carried out at 37°C and 850 rpm for 24 hours. After the reaction was completed, the reaction mixture was appropriately diluted and centrifuged, and the supernatant reaction product was analyzed by LC-MS.
  • LC-MS analysis was performed using a HILICpak VN-50 4D, 5 ⁇ m, 4.6 x 150 mm (Resonac) separation column at 60°C.
  • the LC eluent was 25 mM ammonium formate/H 2 O (Solution A) and acetonitrile (Solution B), with a flow rate of 0.5 mL/min.
  • the mixing ratio of Solution A to Solution B varied from 10:90 to 28:72 with a gradient from 0 to 5 min, from 28:72 to 38:62 with a gradient from 5 to 11 min, and a constant ratio of 38:62 from 11 to 21 min, from 38:62 to 10:90 with a gradient from 21 to 23 min, and a constant ratio of 10:90 with a gradient from 23 to 30 min.
  • Example 10 Evaluation of activity against non-sulfated chondroitin containing multiple molecular weights (5, 7, 9, 11, 13, 15 sugars) (hereinafter referred to as CS-0 MIX) BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5+pGro7 obtained in Example 9(1) was inoculated into a test tube containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and 30 mg/L chloramphenicol and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • CS-0 MIX non-sulfated chondroitin containing multiple molecular weights (5, 7, 9, 11, 13, 15 sugars)
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin, 30 mg/L chloramphenicol, and 0.5 g/L L-arabinose and cultured at 30°C for 5 hours. IPTG was then added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was further cultured at 15°C for 24 hours. The culture was centrifuged to obtain wet bacterial cells. Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was performed for 30 minutes at 30°C and 850 rpm.
  • BL21(DE3)/pET28a-FmfucT2_P13D and BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5, which also show activity with 11 sugars, were inoculated into test tubes containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and cultured at 30°C for 5 hours. IPTG was then added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was further cultured at 15°C for 24 hours. The culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • LC-MS analysis was performed using a HILICpak VN-50 4D, 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 150 mm (Resonac) separation column at 60°C.
  • LC eluents used were 25 mM ammonium formate/H 2 O as solution A and acetonitrile as solution B, at a flow rate of 0.5 mL/min.
  • the mixing ratio of solution A to solution B varied from 0 to 5 minutes with a gradient of 10:90 to 28:72, from 5 to 11 minutes with a gradient of 28:72 to 38:62, from 11 to 23 minutes with a constant 38:62, from 23 to 25 minutes with a gradient of 38:62 to 50:50, from 25 to 35 minutes with a constant 50:50, from 35 to 36 minutes with a gradient of 50:50 to 10:90, and from 36 to 40 minutes with a constant 10:90.
  • MS detection was performed in negative mode using the m/z values listed in Table 20. The analytical results are shown in Table 21.
  • Table 21 demonstrates that co-expression of LbfucT5 with a chaperone protein improves activity even when pentasaccharides, heptasaccharides, nonasaccharides, 11-saccharides, 13-saccharides, and 15-saccharides were used as substrates.
  • Table 21 shows that FmfucT2_P13D has high activity with low molecular weight substrates, and LbfucT5+pGro7 has high activity with high molecular weight substrates.
  • Example 11 Evaluation of Optimal pH for Reaction of LbfucT5+pGro7 BL21(DE3)/pET28a-LbfucT5+pGro7 obtained in Example 9(1) was inoculated into a test tube containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and 30 mg/L chloramphenicol and cultured with shaking at 30°C for 16 hours. The culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin, 30 mg/L chloramphenicol, and 0.5 g/L L-arabinose and cultured at 30°C for 5 hours.
  • IPTG was then added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was continued for an additional 24 hours at 15°C.
  • the culture was centrifuged to obtain wet bacterial cells.
  • Xylene was added to the wet cells to a final concentration of 10 mL/L, and membrane treatment was carried out at 30° C. and 850 rpm for 30 minutes.
  • 0.2 mL of reaction solution consisting of 100 g/L of each wet bacterial cell, 50 mM buffer (pH 7, 7.5, 8), 5 g/L CS-0 MIX, 20 mM GDP-fucose, and 10 mM magnesium chloride was placed in an Eppendorf tube and reacted for 24 hours at 37°C and 850 rpm.
  • the buffer solutions used were Bis-Tris-HCl (pH 7), Tris-HCl (pH 7.5), and Tris-HCl (pH 8).
  • the reaction mixture was appropriately diluted and centrifuged, and the reaction product in the supernatant was analyzed by LC-MS.
  • LC-MS analysis was performed using a HILICpak VN-50 4D, 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 150 mm (Resonac) separation column at 60°C.
  • LC eluents used were 25 mM ammonium formate/H 2 O as solution A and acetonitrile as solution B, with a flow rate of 0.5 mL/min.
  • the mixing ratio of solution A to solution B varied from 0 to 5 minutes with a gradient of 10:90 to 28:72, from 5 to 11 minutes with a gradient of 28:72 to 38:62, from 11 to 23 minutes with a constant 38:62, from 23 to 25 minutes with a gradient of 38:62 to 50:50, from 25 to 35 minutes with a constant 50:50, from 35 to 36 minutes with a gradient of 50:50 to 10:90, and from 36 to 40 minutes with a constant 10:90.
  • MS detection was performed in negative mode using the m/z values listed in Table 20 of Example 10. The analytical results are shown in Table 22.
  • Table 22 reveals that LbfucT5 + pGro7 was active against all non-sulfated chondroitin substrates containing 5, 7, 9, 11, 13, and 15 sugars at pH 7, 7.5, and 8, with the highest activity observed at pH 7.5.

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Abstract

本発明は、配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列等を含む蛋白質を用い、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンを基質としてフコシル化多糖を製造する方法に関する。

Description

フコシル化多糖の製造方法
　本開示はフコシル化多糖の製造方法に関する。
　フコシル化多糖であるフコシル化コンドロイチン硫酸やフコシル化ヘパラン硫酸は、機能性食品や医薬品、化粧品の原料として需要が増大している化合物である。
　中でも、フコシル化コンドロイチン硫酸はナマコ体壁に特異的に存在する硫酸化多糖であり、様々な健康機能が知られている。一方、ナマコ体壁に含有されているフコシル化コンドロイチン硫酸の量はわずかであること、ナマコの種や生育環境によって品質が異なることから、抽出によるフコシル化コンドロイチン硫酸の工業化製法は確立されていない（非特許文献１）。また、有機合成によるフコシル化コンドロイチン硫酸の製法研究も行われているが、工程数が非常に多く、反応率も低いため、工業化製法は確立されていない（非特許文献２）。このような状況から、安定した品質を提供でき、かつ、工程数も少ない製法である酵素によるバイオプロセス製法が注目されている。これまで、Bacteroides fragilis由来フコース転移酵素、Helicobacter pylori由来フコース転移酵素が、精製酵素反応にてフコシル化コンドロイチン硫酸の基質であるフコシル化コンドロイチンを生成することが報告されている（特許文献１）。しかしこれら以外に、フコシル化多糖の生成に用いることのできる酵素は、見出されていない。
中国特許出願公開第１１５０５８４６５号
Carbohydrate Polymers (2022) 275, 118691. Angew Chem Int Ed Engl (2018) 57(39), 12880-12885.
　本開示は、フコース転移活性を有する蛋白質を用いたフコシル化多糖の製造方法を提供することに関する。
　本開示は以下を含む。
（１Ａ）
　下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つの蛋白質を用い、基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
［１］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（１Ｂ）
　下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つの蛋白質を用い、基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
［１］　配列番号１～２２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１～２２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１～２２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（１Ｃ）
　下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つの蛋白質を用い、基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
［１］　配列番号１９７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１９７で表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１９７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（２）
　前記基質に対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、（１Ａ）、（１Ｂ）又は（１Ｃ）に記載の蛋白質であって、前記アミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、［４］～［１０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、蛋白質を用い、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法。
［４］　配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基である
［５］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である
［６］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である
［７］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である
［８］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
［９］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
［１０］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基である
（３）
　基質に対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記［１１］～［１６］からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を導入した蛋白質を用い、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
［１１］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン酸残基へ置換
［１２］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基へ置換
［１３］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をグルタミン酸残基へ置換
［１４］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
［１５］　配列番号４の５０位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
［１６］　配列番号４の８４位のアミノ酸残基をグリシン残基へ置換
（４）
　Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来であって、基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を用い、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
（５）
　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、前記グルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸であり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチン又はフコシル化コンドロイチン硫酸である、又は、
　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチンである、
（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（２）、（３）又は（４）に記載のフコシル化多糖を製造する方法。
（６）
　以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子改変微生物。
（Ａ）基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を有し、前記基質からフコシル化多糖を生産する、遺伝子改変微生物であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、遺伝子改変微生物。
（Ｂ）基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を有する、遺伝子改変微生物であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、遺伝子改変微生物。
（７Ａ）
　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質が、下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される、（６）に記載の遺伝子改変微生物。
［１］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（７Ｂ）
　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質が、下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される、（６）に記載の遺伝子改変微生物。
［１］　配列番号１～２２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１～２２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１～２２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（７Ｃ）
　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質が、下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される、（６）に記載の遺伝子改変微生物。
［１］　配列番号１９７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１９７で表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１９７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（８）
　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質であって、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、［４］～［１０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、蛋白質を有する、（６）に記載の遺伝子改変微生物。
［４］　配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基である
［５］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である
［６］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である
［７］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である
［８］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
［９］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
［１０］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基である
（９）
　前記基質に対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記［１１］～［１６］からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を導入した蛋白質を有する、（６）に記載の遺伝子改変微生物。
［１１］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン酸残基へ置換
［１２］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基へ置換
［１３］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をグルタミン酸残基へ置換
［１４］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
［１５］　配列番号４の５０位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
［１６］　配列番号４の８４位のアミノ酸残基をグリシン残基へ置換
（１０）
　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質が、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来である、（６）に記載の遺伝子改変微生物。
（１１）
　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、前記グルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸であり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチン又はフコシル化コンドロイチン硫酸である、又は、
　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチンである、
（６）、（７Ａ）、（７Ｂ）、（７Ｃ）、（８）、（９）又は（１０）に記載の遺伝子改変微生物。
（１２）
　（６）、（７Ａ）、（７Ｂ）、（７Ｃ）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物の培養物又は前記培養物の処理物であって、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を含む、酵素調製物。
（１３）
　（６）、（７Ａ）、（７Ｂ）、（７Ｃ）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を用いた、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法。
（１４）
　基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質であって、
　前記基質は、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンであり、
　配列番号４で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、下記［１］～［６］からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を導入した蛋白質。
［１］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸残基へ置換
［２］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基へ置換
［３］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミン酸残基へ置換
［４］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
［５］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
［６］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシン残基へ置換
（１５）
　（６）、（７Ａ）、（７Ｂ）、（７Ｃ）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物において、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を、グループI型シャペロニンから選ばれる少なくとも１つのシャペロン蛋白質と共発現させる、（１３）に記載のフコシル化多糖を製造する方法。
（１６）
　前記グループI型シャペロニンが、配列番号２０１及び２０２のいずれか少なくとも１つのシャペロン蛋白質である、（１５）に記載のフコシル化多糖を製造する方法。
　本開示によれば、フコース転移活性を有する蛋白質を用いたフコシル化多糖の製造方法を提供することができる。
配列番号１～１０を示す。 配列番号１１～２０を示す。 配列番号２１～２８を示す。 配列番号２９～３３を示す。 配列番号３４～４０を示す。 配列番号４１～６０を示す。 配列番号６１～７０を示す。 配列番号７１～８０を示す。 配列番号８１～９０を示す。 配列番号９１～１２０を示す。 配列番号１２１～１３０を示す。 配列番号１３１～１４０を示す。 配列番号１４１～１５０を示す。 配列番号１５１～１６０を示す。 配列番号１６１～１９６を示す。 配列番号１９７～２０２を示す。
　以下、本開示の実施形態について説明するが、以下の例示によって本開示は限定されない。
　本開示は、フコース転移活性を有する蛋白質を用い、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンを基質としてフコシル化多糖を製造する方法を含む。
＜グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカン＞
　グリコサミノグリカンとは、アミノ糖（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミンなど）と、ウロン（ｕｒｏｎｉｃ）糖（例えば、グルクロン酸またはイズロン酸など）またはガラクトースとを含む反復する二糖単位から構成される多糖を示す。単に「グリコサミノグリカン」という場合、非硫酸化グリコサミノグリカンを意味する。
　中でもグルクロン酸含有グリコサミノグリカンとは、構成糖としてグルクロン酸を含有するグリコサミノグリカンを指し、コンドロイチン、ヘパロサン等が挙げられ、コンドロイチンが好ましい。
　グルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンとは、上述したグルクロン酸含有グリコサミノグリカンが硫酸化されて生成し得るものを指し、コンドロイチン硫酸、ヘパリン様物質等が挙げられ、コンドロイチン硫酸が好ましい。
＜コンドロイチン＞
　コンドロイチンとは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の２糖が交互に反復する基本構造を有する糖鎖であり、２糖構造以上のものを指す。また、本明細書において、単に「コンドロイチン」という場合、非硫酸化コンドロイチンを意味する。通常、コンドロイチンを構成するＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃは、Ｄ型である。また、コンドロイチンの右端にＧａｌＮＡｃが存在して、いわゆる糖鎖の還元末端を形成することが好ましい。
＜コンドロイチン硫酸＞
　コンドロイチン硫酸とは、コンドロイチンに硫酸基が結合した構造を有し、硫酸基はＧａｌＮＡｃの４位及び／又は６位のヒドロキシ基に結合し得る。４位と６位のヒドロキシ基の両方が硫酸化されていてもよく、片方のみが硫酸化されていてもよい。
＜ヘパロサン、ヘパリン様物質＞
　ヘパロサンとは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ－アセチル－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の２糖が１単位となって、それらがα又はβ－１，４結合を繰り返した直鎖状の多糖であり、２糖構造以上のものを指す。また、本明細書において、単に「ヘパロサン」という場合、非硫酸化ヘパロサンを意味する。通常、ヘパロサンを構成するＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃは、Ｄ型である。また、ヘパロサンの右端にＧｌｃＮＡｃが存在して、いわゆる糖鎖の還元末端を形成することが好ましい。ヘパロサンの製造方法としてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を用いる方法としては、特表２０２３－５１９６３２号公報、特許第５８３０４６４号公報、Applied Microbiology and Biotechnology 103 (2019) 6771-6782、米国特許第９，９７５，９２８号明細書に記載の製造方法等の公知の方法を用いてよい。
　ヘパリン様物質とは、ヘパリン及びヘパラン硫酸の混合物をいい、ヘパロサンに硫酸基が結合した構造を有し、硫酸基はＧｌｃＮＡｃの３位及び／又は６位のヒドロキシ基に結合し得る。３位と６位のヒドロキシ基の両方が硫酸化されていてもよいし、片方のみが硫酸化されていてもよい。ヘパラン硫酸のなかでも高度に硫酸化されたものを、ヘパリンと呼ぶことがある。
＜フコシル化多糖＞
　フコシル化多糖とは、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに１つ又は２つ以上のフコースが結合することで生成される糖鎖である。フコシル化コンドロイチン、フコシル化コンドロイチン硫酸、フコシル化ヘパロサン、フコシル化ヘパラン硫酸、及びフコシル化ヘパリン等が挙げられる。また、これらの糖鎖がさらに修飾された化合物を指してもよい。
　本実施形態において、フコシル化多糖として、フコシル化コンドロイチン又はフコシル化コンドロイチン硫酸が好ましい。
＜フコシル化コンドロイチン＞
　フコシル化コンドロイチンとは、コンドロイチンに１つ又は２つ以上のフコースが結合した構造を有する糖鎖である。また、本明細書において、単に「フコシル化コンドロイチン」という場合、フコシル化コンドロイチン硫酸と区別して、非硫酸化フコシル化コンドロイチンを意味する。
　フコシル化コンドロイチンに含まれるフコースの数は、特に限定されない。フコシル化コンドロイチンに含まれるフコースの数は、コンドロイチンにおけるフコースが結合することができるヒドロキシ基の数に応じて決定することができる。
　フコシル化コンドロイチンに含まれるフコースが１つである場合、ＧｌｃＡ又はＧａｌＮＡｃにフコースが結合していてもよく、ＧｌｃＡにフコースが結合していることが好ましい。
　フコシル化コンドロイチンに含まれるフコースが２つ以上である場合、１つのＧｌｃＡ又はＧａｌＮＡｃに複数のフコースが結合していてもよく、複数のＧｌｃＡ又はＧａｌＮＡｃに複数のフコースが結合していてもよいが、１つのＧｌｃＡ又はＧａｌＮＡｃに対して１つのフコースが結合することが好ましい。
　また、フコシル化コンドロイチンに含まれるフコースが２つ以上である場合、隣り合った複数のＧｌｃＡ及び／又はＧａｌＮＡｃのそれぞれに、フコースが１つ又は２つ以上結合していてもよく、隣り合わない複数のＧｌｃＡ及び／又はＧａｌＮＡｃのそれぞれに、フコースが１つ又は２つ以上結合していてもよい。また、隣り合わない複数のＧｌｃＡ及び／又はＧａｌＮＡｃのそれぞれに、フコースが１つ又は２つ以上結合していていることが好ましく、隣り合わない複数のＧｌｃＡのそれぞれに、フコースが１つ又は２つ以上結合していていることがより好ましい。以下に、７糖で構成されるフコシル化コンドロイチンにおいて、隣り合わない複数のＧｌｃＡのそれぞれに、フコースが１つ結合している場合の模式図を示す。
 
　〇（丸）がＧａｌＮＡｃを意味し、□（四角）がＧｌｃＡを意味し、△（三角）がフコース（Ｆｕｃｏｓｅ）を意味する。右端に存在するＧａｌＮＡｃは、いわゆる糖鎖の還元末端を意味する。
　フコシル化コンドロイチンにおけるフコースの結合様式は、特に限定されず、α結合及び／又はβ結合であってよく、１，２結合、１，３結合、１，４結合及び／又は１，６結合であってもよい。ＧｌｃＡにフコースが結合する場合は１，３結合が好ましい。
＜フコシル化コンドロイチン硫酸＞
　フコシル化コンドロイチン硫酸は、コンドロイチンに硫酸基及びフコースが結合した構造を有する多糖である。分子量は特に限定されないが、鎖長の違いによって０．５～３００ｋＤａと様々であり、平均２０～１００ｋＤａである。
　フコシル化コンドロイチン硫酸はコンドロイチン、フコシル化コンドロイチン、及びコンドロイチン硫酸から選択される少なくともいずれか１つから生成される。フコシル化コンドロイチンから生成する場合は、フコシル化コンドロイチンを基質として硫酸化させることで生成され得る。コンドロイチン硫酸から生成する場合は、コンドロイチン硫酸を基質としてフコース転移活性を有する酵素を反応させることで生成され得る。また、コンドロイチン硫酸を基質としてフコース転移活性を有する酵素を反応させ、フコシル化コンドロイチン硫酸を生成させたのちに、再度硫酸化させてもよい。
　フコシル化コンドロイチン硫酸において、硫酸基はフコシル化コンドロイチンのＧａｌＮＡｃの４位、ＧａｌＮＡｃの６位、フコースの２位、フコースの３位及び、フコースの４位のヒドロキシ基に結合し得る。これらすべてのヒドロキシ基が硫酸化されていてもよいし、いずれか一つ以上が硫酸化されていてもよい。
　また、フコースの２位、フコースの３位及び、フコースの４位のヒドロキシ基の硫酸化は、フコース構造がコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸に結合したのちに硫酸化されてもよいし、硫酸化されたフコース構造がコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸に結合してもよい。硫酸化されたフコース構造がコンドロイチン硫酸に結合する場合、具体的には、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸を基質としてフコシル化する際に、ＧＤＰ－フコースを予め硫酸化したものを基質として用いることができる。
＜グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性＞
　グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性とは、ＧＤＰ－フコースとグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンを基質として、フコースを転移し、フコシル化多糖を生成する活性をいう。
　具体的に、コンドロイチンに対するフコース転移活性とは、ＧＤＰ－フコースとコンドロイチンを基質として、コンドロイチンにフコースを転移し、フコシル化コンドロイチンを生成する活性をいう。
　また、通常、フコースはＧｌｃＡ又はＧａｌＮＡｃのヒドロキシ基に転移する。フコースが結合することができれば、コンドロイチンを構成するＧｌｃＡ又はＧａｌＮＡｃのいずれのヒドロキシ基にフコースが結合してもよく、ＧｌｃＡのヒドロキシ基にフコースが結合することが好ましい。
　基質として用いられるコンドロイチンを構成するＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃの数は、特に限定されないが、２０個以上のＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃで構成されるコンドロイチンであってもよく、１５個以上のＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃで構成されるコンドロイチンであってもよく、１０個以上のＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃで構成されるコンドロイチンであってもよい。また、基質として用いられるコンドロイチンを構成するＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃの数は、特に限定されないが、３～１５個のＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃで構成されるコンドロイチンであることが好ましく、５～１１個のＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃで構成されるコンドロイチンであることがより好ましく、５～９個のＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃで構成されるコンドロイチンであることがさらに好ましい。
　コンドロイチンに転移するフコースの数は、特に限定されず、コンドロイチンにおけるフコースが結合することができるヒドロキシ基の数に応じて決定してもよく、フコースの量によって調整してもよい。
　蛋白質がグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有することは、例えば以下の方法により確認できる。例えばグルクロン酸含有グリコサミノグリカンとしてコンドロイチンを用いる場合、まず、後述の方法により、コンドロイチンに対するフコース転移活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡを作製する。次に、組換えＤＮＡで、コンドロイチンに対するフコース転移活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。当該蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンを含む水溶液と接触させ、水溶液中にフコシル化コンドロイチンを生成させる。最後に、後述の糖分析装置を用いて反応液中のフコシル化コンドロイチンを検出し、その生成量を求めることで、蛋白質のコンドロイチンに対するフコース転移活性を有していることを確認できる。
＜目的の蛋白質＞
　以下の（１）～（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される蛋白質は、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有することが好ましい。すなわち、以下の（１）～（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される蛋白質は、フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃＴ）であってもよい。以下、以下の（１）～（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される蛋白質について説明する。
　本実施形態における蛋白質は、以下の（１）～（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される蛋白質である。
（１）下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つの蛋白質。
［１］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列含み、かつ、コンドロイチン基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
　上記［１］～［３］は、それぞれ、下記［１’］～［３’］であってもよい。
［１’］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２’］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
［３’］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
（２）グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、前記アミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、［４］～［１０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、蛋白質。
［４］　配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基である
［５］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である
［６］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である
［７］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である
［８］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
［９］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
［１０］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基である
（３）グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記［１１］～［１６］からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、蛋白質。
［１１］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である（配列番号１４）
［１２］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である（配列番号１５）
［１３］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である（配列番号１６）
［１４］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基がアスパラギン残基である（配列番号１７）
［１５］　配列番号４の５０位のアミノ酸残基がアスパラギン残基である（配列番号２１）
［１６］　配列番号４の８４位のアミノ酸残基がグリシン残基である（配列番号２２）
（４）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来であって、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有する蛋白質。
　また、前記（１）で表される蛋白質は、［１］で表される蛋白質であることが好ましい。また、前記（２）で表される蛋白質は、［５］で表される蛋白質であることが好ましい。
　一実施形態のｆｕｃＴは、Helicobacter acinonychis由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter ailurogastricus由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter baculiformis由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter bizzozeronii由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter cetorum MIT 99-5656由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter cynogastricus由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter felis由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter heilmannii由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter labacensis由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter mehlei由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter salomonis由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter sp.219-2由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter sp.L8由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter sp.NHP19-003由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter suis由来フコシルトランスフェラーゼ、Helicobacter vulpis由来フコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
　本明細書において、「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する」とは、特定の配列番号において変異が許容されることを意味する。
　ここで、「８０％以上の同一性」とは、当該特定の配列番号で表されるアミノ酸配列との重複するアミノ酸が、当該配列番号で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸の総数に対して、少なくとも８０％において重複していることを意味する。
　例えば、配列番号で表されるアミノ酸配列が１００個のアミノ酸からなるとき、８０％以上の同一性とは、８０個のアミノ酸が同一である８０個のアミノ酸からなる配列であってもよいことを意味し（同一性は８０％）、１００個のアミノ酸が同一である１２０個のアミノ酸からなる配列であってもよいことを意味する（同一性は１００％）。また、８０個のアミノ酸が同一である１００個のアミノ酸からなる配列であってもよい（同一性は８０％）。
　本明細書において、「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する」場合、同一性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、１００％であることが好ましい。
　「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する」場合、１００％の同一性を有する場合が含まれるので、特に限定されない限り、「配列番号で表されるアミノ酸配列」であってもよい。
　「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する」場合、配列番号で表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよい。
　また、「同一性を有する」との文言は、「相同性を有する」と読み替えて、本明細書に記載の説明を適用してもよい。
　本実施形態において、２つのアミノ酸配列又は２つの塩基配列の配列同一性のパーセンテージは、当該２つの配列に含まれる残基が最も一致するようにアライメントしたときに、当該一致する残基の比率として算出される。例えば、配列同一性のパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの例としては、Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ　（１９８１）　Ａｄｖ．　Ａｐｐｌ．　Ｍａｔｈ．　２：４８２　の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ　（１９７０）　　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　４８：４４３－４５３のホモロジーアライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　（１９８８）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８５：２４４４－２４４８の類似性を検索する方法、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ　（１９９３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３－５８７７に記載されているような、改良された、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ　（１９９０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４のアルゴリズムが挙げられる。ただし、数学的アルゴリズムとしては上記の例には限定されない。これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性のパーセンテージを決定するためのアライメントを行うことができる。当該プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，　Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ＭＡＦＦＴ（Ｋａｔｏｈ，　Ｋ．，　Ｍｉｓａｗａ，　Ｋ．，　Ｋｕｍａ，　Ｋ．，　＆　Ｍｉｙａｔａ，　Ｔ．　（２００２），　３０（１４），　３０５９－３０６６．、ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）、ＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ　Ｒ．　Ｃ．　（２００４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３２（５），　１７９２－１７９７．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。
　これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｇｅｎｅ　７３：２３７－２４４、Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１－１５３、Ｃｏｒｐｅｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６：１０８８１－９０、Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　ＣＡＢＩＯＳ　８：１５５－６５、及びＰｅａｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｍｅｔｈ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２４：３０７－３３１に記載されている。
　ＢＬＡＳＴについては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．　Ｆ．，　Ｇｉｓｈ，　Ｗ．，　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｗ．，　Ｍｙｅｒｓ，　Ｅ．　Ｗ．，　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　（１９９０）．　２１５（３），　４０３－４１０．、Ｍｏｕｎｔ　Ｄ．　Ｗ．　（２００７）．　ＣＳＨ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　２００７，　ｐｄｂ．ｔｏｐ１７．等に記載されている。ＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、配列同一性のパーセンテージを計算できる。
　本明細書において、「配列番号で表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された」とは、当該配列番号で表されるアミノ酸配列の末端又は非末端において、アミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は、結果として得られる蛋白質が本発明における効果を奏する限り特に限定されず、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよく、１～５個、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよい。また、欠失、置換、挿入及び／又は付加される部位は、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
　置換、挿入又は付加されるアミノ酸は、天然型アミノ酸であっても非天然型アミノ酸であってもよい。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
　以下に、相互に置換可能となるアミノ酸の群の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換してもよい。
・Ａ群：　疎水性アミノ酸
・Ｂ群：　酸性アミノ酸
・Ｃ群：　極性アミノ酸
・Ｄ群：　塩基性アミノ酸
・Ｅ群：　二級アミノ酸
・Ｆ群：　ヒドロキシル基を持つアミノ酸
・Ｇ群：　芳香族アミノ酸
・Ｈ群：　含硫アミノ酸
　より具体的には以下の通りである。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
　Ｈ群：メチオニン、システイン、ホモシステイン
　本明細書において、配列番号で表されるアミノ酸配列との重複する領域は、当業者に公知の方法で求めることができる。例えば、最もアミノ酸が一致するようにアライメントして、当該配列番号で表されるアミノ酸配列と重複するアミノ酸の割合を求めることができる。
　本明細書において、配列番号で表されるアミノ酸配列において、他のアミノ酸残基に置換されていることは、例えば、他のアミノ酸残基に置換されていることを確認しようとするアミノ酸配列と、元となる蛋白質のアミノ酸配列とをアライメントすることにより確認することができる。
　アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成できる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ.ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用できる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメーターは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
　本明細書において、「配列番号ＹのＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号Ｙに記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。
　本明細書において、特定のアミノ酸配列における「配列番号Ｙで表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、配列番号のＸ位に相当する位置のアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号Ｙで表されるアミノ酸配列とのアライメントにおいて配列番号Ｙに示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。
　例えば、特定のアミノ酸配列における「配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号４で表されるアミノ酸配列とのアライメントにおいて、配列番号４で表されるアミノ酸配列における６６番目のバリン残基と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。
　なお、特定の配列番号における「配列番号のＸ位に相当する位置のアミノ酸残基」とは、当該特定の配列番号で表されるアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。
　本明細書において、特定のアミノ酸配列において、「配列番号Ｙで表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、配列番号のＸ位に相当する位置のアミノ酸残基がＡＡ残基である」とは、当該特定のアミノ酸配列において、配列番号ＹのＸ位に相当する位置のアミノ酸残基がＡＡ残基に置換されていることを意味してもよい。
　また、当該特定のアミノ酸配列において、ＡＡ残基に置換される位置は、当該特定のアミノ酸配列における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号で表されるアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示してもよい。例えば、当該特定のアミノ酸配列において、ＡＡ残基に置換される位置よりもＮ末端側に、アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む場合、それに応じてＡＡ残基に置換される位置は変動してもよい。
　前記（１）で表される蛋白質は、より高いグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する観点で、下記［１７］～［１９］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つの蛋白質であることが好ましい。
［１７］　配列番号４、５、８、及び１２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［１８］　配列番号４、５、８、及び１２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有する蛋白質
［１９］　配列番号４、５、８、及び１２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有する蛋白質
　配列番号４、５、８、及び１２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を用いることで、１つのフコースだけでなく、２つ以上のフコースがグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンにより高い効率で転移することができる。その結果、複数のフコースが結合するフコシル化多糖を、より高い効率で製造することができる。また、配列番号４、５、８、及び１２からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を用いることで、例えば１１糖以上の多糖で構成されるコンドロイチンに対しても、１つ又は２つ以上のフコースをコンドロイチンにより高い効率で転移させることができる。
　また、前記（１）で表される蛋白質は、［１７］で表される蛋白質であることがより好ましい。
　配列番号４で表されるアミノ酸配列は、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍに由来する野生型のフコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃＴ）である。
　前記［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質において、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基である蛋白質であることが好ましい。配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基であると、蛋白質のグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を維持することができるとともに、蛋白質に、より高いグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を付与することができる。
　また、配列番号４の１３位のプロリン、５０位のヒスチジン、及び／又は８４位のグルタミン酸を、他のアミノ酸に変更することで、より高いグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を得ることができる。また、変更される他のアミノ酸としては、特に限定されないが、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グルタミン酸、及びグリシン等が挙げられる。２つ以上のフコースが、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンにより高い効率で転移し、複数のフコースが結合するフコシル化多糖をより高い効率で製造することができる観点で、前記（２）及び（３）で表される蛋白質であることが好ましく、前記（３）で表される蛋白質であることがより好ましい。
　前記（２）又は（３）で表される蛋白質は、より高いグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する観点で、以下の（５）又は（６）で表される蛋白質であることが好ましく、以下の（６）で表される蛋白質であることがより好ましい。
（５）グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であって、かつ、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、下記［２０］のアミノ酸残基を含む、蛋白質。
［２０］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である
（６）グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記［２１］のアミノ酸残基を含む、蛋白質。
［２１］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である（配列番号１４）
　前記（５）又は（６）で表される蛋白質を用いることで、１つのフコースだけでなく、２つ以上のフコースがグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンにより高い効率で転移することができる。その結果、複数のフコースが結合するフコシル化多糖をより高い効率で製造することができる。また、例えば１１糖以上の多糖で構成されるコンドロイチンに対しても、１つ又は２つ以上のフコースをコンドロイチンにより高い効率で転移させることができる。
　これらの蛋白質は、遺伝子改変微生物を用いて生産することで取得しても良いし、無細胞蛋白質合成系を用いて生産しても良い。
＜フコシル化多糖を製造する方法＞
　本開示の、基質からフコシル化多糖を製造する製造方法は、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を用い、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンを基質として、ＧＤＰ－フコースからフコースを転移することでフコシル化多糖を製造する方法であってもよい。例えば、上述のフコース転移活性を有する蛋白質を用い、コンドロイチンを基質として、ＧＤＰ－フコースからフコースを転移することで、フコシル化コンドロイチンを生産する方法が挙げられる。
　グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質としては、好ましくは上述した（１）～（４）から選ばれる少なくともいずれか１つである。
　フコシル化多糖として、フコシル化コンドロイチン、フコシル化コンドロイチン硫酸、フコシル化ヘパロサン、フコシル化ヘパラン硫酸、及びフコシル化ヘパリン等が挙げられる。
　本開示のフコシル化多糖の製造方法は、「グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質」を有する微生物を用いることを含む。
　当該微生物中でフコシル化多糖を生産してもよいし、当該微生物を酵素調製物として用いてフコシル化多糖を生産してもよい。当該微生物中でフコシル化多糖を生産する方法を発酵法、当該微生物を酵素調製物として用いてフコシル化多糖を生産する方法を酵素法と呼ぶことがある。
　フコシル化多糖を製造する際に用いる微生物としては、例えば後述する「遺伝子改変微生物の作製方法」に記載の方法で作製された微生物が挙げられる。また、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を有し、好ましくは上述した（１）～（４）から選ばれる少なくともいずれか１つである、微生物であってもよい。
　グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を有する微生物としては、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を元来有する微生物であってもよい。また、用いる基準株がグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を元来有さない微生物の場合は、人工的にグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を増強した遺伝子改変微生物であってもよい。グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を元来有する微生物に対し、更にグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を増強した遺伝子改変微生物であってもよい。
　また、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を有する微生物の培養物又は前記培養物の処理物であって、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対してフコース転移活性を有する蛋白質を含む、酵素調製物を得ることが可能である。該酵素調製物を用いることによっても、フコシル化多糖を製造することが可能である。
　フコシル化多糖を製造する際の基質としては、グルクロン酸含有グリコサミノグリカンとしてはコンドロイチンが好ましく、グルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンとしてはコンドロイチン硫酸が好ましい。製造するフコシル化多糖としては、フコシル化コンドロイチン又はフコシル化コンドロイチン硫酸が好ましい。
　フコシル化多糖の製造方法について、具体的にフコシル化コンドロイチンを製造する方法について説明する。
＜フコシル化コンドロイチンを製造する方法＞
　本実施形態の蛋白質を用い、コンドロイチンを基質としてフコシル化コンドロイチンを製造する方法の一例を説明する。
１．発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法
　本実施形態のフコシル化コンドロイチンの製造方法としては、本実施形態における遺伝子改変微生物を培地に培養し、培養物中にフコシル化コンドロイチンを生成させることを含む、発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法が挙げられる。
　本開示のフコシル化コンドロイチンを発酵法により製造する際に用いる微生物としては、コンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を有し、フコシル化コンドロイチンを製造する微生物である。該微生物は、親株に比べてコンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質の活性が増強され、かつ、フコシル化コンドロイチンの生産性が向上した微生物であってもよい。
　コンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を有する微生物としては、コンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を元来有する微生物であっても良い。また、用いる基準株がコンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を元来有さない微生物の場合は、人工的にコンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を付与した遺伝子改変微生物であっても良い。コンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を元来有する微生物に対し、更にコンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を増強した遺伝子改変微生物であっても良い。
　発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法に用いる、遺伝子改変微生物としては、ＧＤＰ－フコース及び／又は、コンドロイチンを生成する能力を有する遺伝子改変微生物であることが好ましい。用いる微生物が、ＧＤＰ－フコース及び／又は、コンドロイチンを生成する能力を元来有しない場合は、ＧＤＰ－フコース及び／又は、コンドロイチンを生成する能力を付与しても良い。また、用いる微生物が、ＧＤＰ－フコース及び／又は、コンドロイチンを生成する能力を元来有している場合に、更にＧＤＰ－フコース及び／又は、コンドロイチンを生成する能力を増強しても良い。
　発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法において、用いる遺伝子改変微生物がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、フコシル化コンドロイチンの基質として培養中にＧＤＰ－フコースを培地に添加してもよく、ＧＤＰ－フコースの基質であるＧＴＰやマンノース等を培地に添加してもよい。
　また、発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法において、用いる遺伝子改変微生物がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する代わりに、ＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する微生物を、遺伝子改変微生物と同時に培養することにより、遺伝子改変微生物にＧＤＰ－フコースを供給してもよい。
　また、ＧＤＰ－フコースの基質であるＧＴＰの供給を強化するために、ＧＴＰを生成する能力を有する微生物を同時に培養してもよい。ＧＴＰを生成する能力を有する微生物としては、例えば、各種遺伝子操作によりＧＴＰの生合成経路に関与する酵素の発現が増強された微生物（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ（２０１９）Ｓｅｐ３）等、公知の微生物が挙げられる。
　発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法において、用いる遺伝子改変微生物がコンドロイチンを生成する能力を有していない場合には、フコシル化コンドロイチンの基質として、培養中にコンドロイチンを培地に添加してもよく、コンドロイチンの基質であるＵＤＰ－グルクロン酸やＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン等を培地に添加してもよい。
　また、発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法において、用いる遺伝子改変微生物がコンドロイチンを生成する能力を有していない場合には、培養中に、コンドロイチンを培地に添加する代わりに、次の方法で供給してもよい。具体的には、コンドロイチンを生成する能力を有する微生物を、本実施形態における遺伝子改変微生物と同時に培養することにより、遺伝子改変微生物にコンドロイチンを供給することができる。
　遺伝子改変微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　遺伝子改変微生物を培養する培地としては、遺伝子改変微生物が資化し得る炭素源、窒素原、無機塩類等を含有し、遺伝子改変微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、遺伝子改変微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、及び、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素原としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸、有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、及び炭酸カルシウム等が挙げられる。
　培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を培地に添加してもよい。ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　上記の培養により、培養物中にフコシル化コンドロイチンを生成、蓄積させ、培養物中からフコシル化コンドロイチンを採取することにより、フコシル化コンドロイチンを製造できる。
　得られたフコシル化コンドロイチンは、糖質イオンクロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーなどを用いる通常の方法によって分析できる。培養物又は培養物の処理物中からのフコシル化コンドロイチンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。菌体内にフコシル化コンドロイチンが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波や薬剤処理などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から活性炭やイオン交換樹脂等によって、フコシル化コンドロイチンを採取できる。
　発酵法によってフコシル化コンドロイチンが製造される過程の模式図を以下に示す。
 
　〇（丸）がＧａｌＮＡｃを意味し、□（四角）がＧｌｃＡを意味し、△（三角）がフコース（Ｆｕｃｏｓｅ）を意味する。右端に存在するＧａｌＮＡｃは、いわゆる糖鎖の還元末端を意味する。
　微生物中において、コンドロイチン合成酵素（ＣＳ）の働きによって２糖にＧａｌＮＡｃが結合し、３糖が生成する。次いで、フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の働きによって３糖の左端から２番目のＧｌｃＡにフコースが転移し、１つのフコースが結合したフコシル化コンドロイチンが得られる。
　さらに、ＣＳの働きによって、ＧｌｃＡ及びＧａｌＮＡｃが結合し、コンドロイチンの糖鎖が伸長した５糖が生成する。次いで、ＦｕｃＴの働きによって５糖の左端から２番目のＧｌｃＡにフコースが転移し、２つのフコースが結合したフコシル化コンドロイチンが得られる。
　模式図は発酵法によってフコシル化コンドロイチンが製造される過程を簡易的に示した一例であって、実際には、ＣＳ及びＦｕｃＴが同時に働いて、フコースがコンドロイチンに転移しながらコンドロイチンが伸長してもよい。その結果、数１０ｋＤａ～数１００ｋＤａのフコシル化コンドロイチンを得ることもできる。
　また、模式図では、すべてのＧｌｃＡにフコースが結合しているが、フコシル化コンドロイチンには、フコースが結合していないＧｌｃＡが含まれていてもよい。
２．酵素法によるＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンを基質として用いるフコシル化コンドロイチンの製造方法
　本実施形態のフコシル化コンドロイチンの製造方法としては、また、ＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンを基質として用いるフコシル化コンドロイチンの製造方法が挙げられる。
　具体的には、酵素法により本開示のフコシル化コンドロイチンを製造する方法は、無細胞蛋白質合成系によって作製したコンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を含む酵素源又は、コンドロイチンに対するフコース転移活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を含む酵素調製物を酵素源として用いる。該製造方法は、基質及び該酵素源を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にフコシル化コンドロイチンを生成させることを含む。該製造方法は、例えば、水性媒体中にフコシル化コンドロイチンを生成させたのち、蓄積せしめ、該水性媒体中からフコシル化コンドロイチンを採取することを含んでいてもよい。
　ＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンとしては、遺伝子改変微生物が有する本実施形態における蛋白質の基質となるものであればその由来は問わない。例えば、ＧＤＰ－フコース又はコンドロイチンを生産する能力を有する微生物の培養物又は培養物の処理物をそのまま用いてもよく、前記培養物又は前記培養物の処理物から採取したＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンを用いてもよい。
　培養物の処理物としては、例えば、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、菌体の乾燥物、菌体の凍結乾燥物、菌体の界面活性剤処理物、菌体の超音波処理物、菌体の機械的摩砕処理物、菌体の溶媒処理物、菌体の酵素処理物、菌体の蛋白質分画物、菌体の固定化物あるいは菌体より抽出して得られる単離精製した精製酵素などが挙げられる。その中でも、該菌体の溶媒処理物及び該菌体より抽出して得られる単離精製した精製酵素が好ましい。
　菌体の溶媒処理物としては、キシレンによる処理物が挙げられる。キシレンにより菌体を処理することで、菌体を完全に破砕することなく、菌体中にＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンが取り込まれるとともに、菌体のフコシルトランスフェラーゼを維持することができる。
　酵素調製物として単離精製した精製酵素を用いる場合、精製酵素は、上述した本実施形態の遺伝子改変微生物を用いて取得できるが、例えば下記の方法が好ましい。
　前記（１）～（４）から選ばれる少なくとも１で表される蛋白質をコードするＤＮＡ及び酵素精製用のタグ配列を含む組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡを形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を精製酵素として調製する。
　前記酵素精製用のタグ配列は、文献に記載されており、当業者に公知である。例は、前記ポリペプチド鎖（例えば、Ｋｉｍｐｌｅ　ＭＥ，Ｂｒｉｌｌ　ＡＬ，Ｐａｓｋｅｒ　ＲＬ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｔａｇｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔｏｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．２０１３；７３：９．９．１－９．９．２３．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　２０１３　Ｓｅｐ　２４．ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４０８６４．ｐｓ０９０９ｓ７３を参照）、カルモジュリン結合ペプチド、６ＨｉｓタグなどのＨｉｓタグ、及び／又はマルトース結合蛋白質配列を（親和性）精製するために使用され得る配列である。
　例えばＨｉｓタグ（ポリヒスチジンタグ）は、少なくとも６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基から典型的になり、蛋白質のＮ末端またはＣ末端にあることが多い、蛋白質におけるポリヒスチジンアミノ酸モチーフである。ポリヒスチジンタグは、様々な種類で市販されている、結合した二価ニッケルまたはコバルトイオンを含有する親和性樹脂とのインキュベーションによる、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及び他の原核性発現系において発現されるポリヒスチジンタグ付き組換え蛋白質の親和性精製に使用されることが多い。
　これらの樹脂は、一般に、ポリヒスチジンタグがマイクロモル親和性で結合する、ニッケル用のイミノ二酢酸（Ｎｉ－ＩＤＡ）及びニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）、ならびにコバルト用のカルボキシメチルアスパラギン酸（Ｃｏ－ＣＭＡ）などのキレート剤で官能化された、セファロース／アガロースである。樹脂は次いで典型的に、コバルトまたはニッケルイオンと特異的に相互作用しない蛋白質を除去するために、リン酸緩衝液で洗浄される。Ｎｉ系の方法の場合、２０ｍＭイミダゾールの添加によって洗浄効率を改善することができる（蛋白質は通常、１５０～３００ｍＭイミダゾールで溶出される）。
　水性媒体としては、例えば、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、例えば、酵素調製物として用いた微生物の培養液が水性媒体として挙げられる。
　水性媒体中に生成したフコシル化コンドロイチンの分析及び採取方法は１．発酵法によるフコシル化コンドロイチンの製造方法と同様である。
　本実施形態の製造方法は、フコシル化コンドロイチンを工業的に生産する方法として利用可能である。また、本実施形態の製造方法により得られるフコシル化コンドロイチンは、医薬品、健康食品等として利用可能な、フコシル化コンドロイチン硫酸を製造するために用いることができる。
　フコシル化コンドロイチン硫酸は、化学反応や酵素反応などにより、フコシル化コンドロイチンを基質として製造することができる。また、フコシル化コンドロイチン硫酸を生産する際、基質としてはコンドロイチンを用いても良いし、コンドロイチン硫酸を用いても良い。コンドロイチンを基質としフコース転移活性を有する酵素を反応させ、フコシル化コンドロイチンを生成した後、フコシル化コンドロイチンを基質として硫酸化させても良い。また、コンドロイチン硫酸を基質としフコース転移活性を有する酵素を反応させ、フコシル化コンドロイチン硫酸を生成させても良い。また、コンドロイチン硫酸を基質とし脱硫酸化活性を有する酵素を反応させ、非硫酸化コンドロイチンを生成させたのちに、フコース転移活性を有する酵素を反応させ、フコシル化コンドロイチンを生成させ、その後再度硫酸化させても良い。
＜遺伝子改変微生物の作製方法＞
　以下、具体的に目的の蛋白質、すなわち前記（１）～（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される蛋白質を有する遺伝子改変微生物の作製方法の一例を説明する。
　目的の蛋白質を有する遺伝子改変微生物は、目的の蛋白質を増強した遺伝子改変微生物であっても良い。
　本明細書において、「蛋白質の活性が増強している」とは、同蛋白質の活性が親株と比較して増強することを意味してよい。本明細書において、「蛋白質の活性が増強している」とは、具体的には、同蛋白質の細胞当たりの活性が親株に対して増強していることを意味してよい。
　目的の蛋白質の活性を増強した遺伝子改変微生物において、「親株」とは、本明細書において、目的の蛋白質の活性を増強するための遺伝子改変の対象となる株をいう。親株は、遺伝子改変の対象となる基準株（ｔｙｐｅ　ｓｔｒａｉｎ、すなわち微生物が属する種の基準株）又は、基準株に対し既に遺伝子改変が加えられた株を意味してよく、具体的には後述する（親株）の説明において例示した菌株を用いることができるが、これに限定されない。
　本明細書において、「蛋白質の活性が増強している」とは、より具体的には、親株と比較して、同蛋白質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同蛋白質の分子当たりの機能が増強していることを意味してよい。すなわち、「蛋白質の活性が増強している」という場合の「活性」とは、蛋白質の触媒活性に限られず、蛋白質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（蛋白質の量）を意味してもよい。
　また、「蛋白質の活性が増強している」ことには、もともと目的の蛋白質の活性を有する親株において同蛋白質の活性をさらに増強させることだけでなく、もともと目的の蛋白質の活性が存在しない親株に同蛋白質の活性を付与することも包含される。また、結果として蛋白質の活性が増強する限り、宿主が元来有する目的の蛋白質の活性を低下または消失させた上で、目的の蛋白質の活性を再度付与してもよい。
　本実施形態において、蛋白質の活性の増強の程度は、蛋白質の活性が親株と比較して増強していれば特に制限されない。蛋白質の活性は、例えば、親株の該蛋白質の活性の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、親株が目的の蛋白質の活性を有していない場合は、同蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより同蛋白質が生産されるよう遺伝子改変されてよいが、例えば、同蛋白質はその活性が測定できる程度に生産されていればよい。
　蛋白質の活性が増強したことは、同蛋白質をコードする遺伝子の発現が親株と比較して上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が親株と比較して上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現する蛋白質の量が親株と比較して上昇したことを確認することにより確認できる。
　本明細書において、「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増強すること、および／または、遺伝子の翻訳量（蛋白質の量）が増強することを意味してよい。
　また、蛋白質の活性が増強するような組換えは、例えば、蛋白質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）も包含されてよい。すなわち、蛋白質が代謝物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が脱感作された変異蛋白質をコードする遺伝子を宿主に保持させることにより、蛋白質の活性を増強させることができる。
　なお、「フィードバック阻害の脱感作」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含されてよい。また、「フィードバック阻害が脱感作されている」（すなわちフィードバック阻害が低減又は解除されている）ことを「フィードバック阻害に耐性がある」ともいう。
　比活性が増強された蛋白質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の蛋白質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、蛋白質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。
　また、蛋白質の活性を増強する際、可溶性画分への発現及び、蛋白質の正しいフォールディングのための工夫等をしてもよい。具体的には例えば、シャペロン蛋白質との共発現、遺伝子誘導物質の検討、リフォールディング技術、蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端の削除や蛋白質発現ベクターの選定、精製条件の最適化、コドンの最適化などが挙げられる。
　遺伝子改変微生物において、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を、シャペロン蛋白質と共発現させてもよい。すなわち、本実施形態における遺伝子改変微生物は、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を有する遺伝子改変微生物であって、前記蛋白質をシャペロン蛋白質と共発現させた、遺伝子改変微生物であってもよい。
　シャペロン蛋白質としては、例えば、ヒートショック蛋白質が挙げられ、ヒートショック蛋白質の中でもグループI型シャペロニンが好ましい。グループI型シャペロニンとしては、例えば、ｇｒｏＥＬ（例えば、配列番号２０１）、ｇｒｏＥＳ（例えば、配列番号２０２）、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６０、Ｃｐｎ６０が挙げられ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳが好ましい。
　目的の蛋白質の活性が増強した微生物は、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株に比べ該蛋白質をコードするＤＮＡの発現を上昇させることによっても製造できる。「ＤＮＡの発現が上昇する」ことは、「遺伝子の発現が上昇する」ともいう。
　なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。本実施形態において、遺伝子の発現は、例えば、親株の該遺伝子の発現の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと目的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと目的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、目的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
　遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させること、転写開始の頻度の高いプロモーターを選択すること、目的遺伝子の発現の制御に関与する転写調節因子の破壊および発現強化により達成できる。即ち、目的遺伝子の発現の抑制に寄与する転写調節因子の場合は破壊により達成でき、目的遺伝子の発現の促進に寄与する転写調節因子の場合は強化により達成できる。
　親株よりも蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増加した微生物としては、該蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増加した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記蛋白質をコードするＤＮＡを保有させた微生物を挙げることができる。
　配列番号１～２２、及び１９７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１～２２、及び１９７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号１～２２、及び１９７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。
　本実施形態において、ＤＮＡは、例えば、配列番号１～２２、及び１９７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、当該ＤＮＡ上に位置する特定のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＥＹ　＆　ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得できる。
　例えば、前記（１）［２］又は［３］に記載の、配列番号１～２２、及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む変異蛋白質、あるいは、配列番号１～２２、及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異蛋白質をコードするＤＮＡは、配列番号１～２２、及び１９７で表される塩基配列を含むＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入及び／又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部分特異的変異導入法［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、前記（１）［２］又は［３］に記載の変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
　例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上である変異蛋白質であり、かつ、コンドロイチンに対してフコース転移活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、当該変異蛋白質のアミノ酸配列と、その元となる配列番号４で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、当該変異蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号４の１３番目、５０番目、６６番目、及び８４番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することによっても取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、当該ＤＮＡを取得できる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、当該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドを得ることができる。
　上記の方法で取得した本実施形態におけるＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを親株に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、当該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　本実施形態におけるＤＮＡを組み込んで得られる、組換えＤＮＡの親株への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　さらに、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　また、組換えＤＮＡは、親株内において自律複製可能なＤＮＡであって、本実施形態におけるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本実施形態におけるＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
　親株において染色体への組込が可能なＤＮＡであって、本実施形態におけるＤＮＡを有するＤＮＡもまた、本実施形態における組換えＤＮＡである。
　組換えＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換えＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、組換えＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、本実施形態におけるＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組み換えＤＮＡであることが好ましい。さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。
　また、組換えＤＮＡにおいては、本実施形態におけるＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　本実施形態における組換えＤＮＡを導入する親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ (いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等が挙げられる。
　前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであれば特に限定されないが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
　本実施形態における組換えＤＮＡを導入する親株としてコリネ型細菌を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、及びｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。
　前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであれば特に限定されないが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
　本実施形態における組換えＤＮＡを導入する親株として酵母菌株を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、及びｐＨＳ１５等が挙げられる。
　前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであれば特に限定されないが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、及びＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
　本実施形態における組換えＤＮＡは、例えば、調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製できる。
　ここで、本実施形態におけるＤＮＡの塩基配列を親株の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、当該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　本実施形態における遺伝子改変微生物は、本実施形態におけるＤＮＡを含有する組換えＤＮＡで親株を形質転換して得られる遺伝子改変微生物である。
　本実施形態における組換えＤＮＡを導入する親株は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、及び植物細胞等のいずれであってもよいが、原核生物又は酵母菌株が好ましく、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３５９１（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０６２）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株がさらに好ましい。
　親株としては、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移反応の基質であるＧＤＰ－フコースを生成する能力を人工的に付与又は強化した遺伝子改変微生物を用いることができる。
　親株として用いる微生物に、ＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などが挙げられ、前記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
　ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（ＲｃｓＡ等）による制御機構等の公知の機構が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、及びＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等の公知の酵素が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等の公知の代謝経路が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを生成する能力を付与又は強化する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　また、親株として、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンに対するフコース転移反応の基質であるグルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンを生成する能力を人工的に付与又は強化した遺伝子改変微生物も用いることができる。
　グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンとして具体的にコンドロイチンを用いる場合について、説明する。
　親株として用いる微生物に、コンドロイチンを供給する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）コンドロイチンを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）コンドロイチンを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）コンドロイチンを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）コンドロイチンを分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｅ）コンドロイチンの細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｆ）コンドロイチンの細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｇ）コンドロイチンから目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などが挙げられ、前記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
　コンドロイチンを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、該微生物が資化し得る炭素源を基質としてコンドロイチンを生成する活性を有するコンドロイチン合成酵素等の公知の酵素が挙げられる。
　組換えＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、上述のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、並びに、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、及び酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等の方法が挙げられる。
　組換えＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい親株内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換えＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換えＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換えＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　上記の方法で得られた遺伝子改変微生物が、本実施形態におけるＤＮＡを導入することによって得られた微生物であることは、例えば、遺伝子改変微生物がＧＤＰ－フコースやコンドロイチンを生成する能力を有している親株を形質転換して得られた遺伝子改変微生物の場合、遺伝子改変微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したフコシル化コンドロイチンの生成量を、形質転換前の微生物のそれと比較することにより確認できる。または、培養物から本実施形態における蛋白質を含有する抽出液を調製し、抽出液、ＧＤＰ－フコース及びコンドロイチンを水性媒体中に存在させ、水性媒体中に蓄積したフコシル化コンドロイチンの生成量を、形質転換前の微生物のそれと比較することによっても確認できる。
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［分析例］
　実施例において、各酵素のフコース転移活性評価は、以下に示す手順で行った。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心分離し、上清の反応生成物を回収したものを分析画分とした。
［分析条件］
カラム：ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＮ－５０　４Ｄ，　５μｍ　４．６×１５０　ｍｍ（Ｒｅｓｏｎａｃ社製）
カラム温度：６０℃
移動相：Ａ液　２５ｍＭ　ギ酸アンモニウム／Ｈ２Ｏ　Ｂ液：アセトニトリル
（実施例１～５、７）
Ａ液とＢ液の混合比は０～５分は１０：９０から２８：７２の勾配、５～１１分は２８：７２から３８：６２の勾配、１１～２１分は３８：６２の一定で、２１～２３分は３８：６２から１０：９０の勾配、２３～３０分は１０：９０の一定に変化
（実施例６）
Ａ液とＢ液の混合比は０～５分は１０：９０から２８：７２の勾配、５～１１分は２８：７２から３８：６２の勾配、１１～２６分は３８：６２の一定で、２６～２８分は３８：６２から１０：９０の勾配、２８～３０分は１０：９０の一定に変化
流速：０．５　ｍＬ／分
注入量：１０　μL
検出：下記表に検出する対象化合物及び、質量分析よって検出される化合物の質量（ｍ／ｚ）の値を示した。なお、例えば、「１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体」とは、１つのフコースが付加したコンドロイチンであることを意味し、「２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体」とは、２つのフコースが付加したコンドロイチンであることを意味し、「３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体」とは、３つのフコースが付加したコンドロイチンであることを意味する。
［実施例１］フコース転移酵素（ｆｕｃＴ）の活性評価
（１）ｆｕｃＴ発現株の造成
　Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を鋳型とし、配列番号２３及び２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、断片１を得た。配列番号１～１１で表されるアミノ酸配列からなるｆｕｃＴをそれぞれコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。下記表の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、下記表の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。下記表に記載の人工合成遺伝子はそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列をユーロフィンジェノミクス社の人工合成遺伝子サービスにて大腸菌に最適化して合成した。プライマー３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、及び５８はｆｕｃＴ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端に、ｐＥＴ２８ａ断片１の３’末端から１５残基の塩基配列を付加したものである。プライマー３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、及び５９はｆｕｃＴ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補な塩基配列の５’末端に、ｐＥＴ２８ａ断片１の５’末端から１５残基と相補な塩基配列を付加したものである。
 
　前記ＰＣＲによって得られた増幅産物とｐＥＴ２８ａ断片１をそれぞれＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて５０℃で１５分間反応させ、発現ベクターｐＥＴ２８ａと連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＢｎｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＢｒｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＪｌｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ｐＥＴ２８ａ－ＣｘｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＢｃｂｆｕｃＴ５、ｐＥＴ２８ａ－ＣｂｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５、ｐＥＴ２８ａ－ＢｆｆｕｃＴ３、ｐＥＴ２８ａ－ＢｃｂｆｕｃＴ６、ｐＥＴ２８ａ－ＤｍｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＢａｃｆｕｃＴを得た。
　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｎｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｒｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＪｌｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＣｘｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｃｂｆｕｃＴ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＣｂｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｆｆｕｃＴ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｃｂｆｕｃＴ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＤｍｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢａｃｆｕｃＴを得た。また、ネガティブコントロールとしてｆｕｃＴを導入していないｐＥＴ２８ａベクターでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａを得た。
（２）ｆｕｃＴ発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産
　（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｎｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｒｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＪｌｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＣｘｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｃｂｆｕｃＴ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＣｂｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｆｆｕｃＴ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢｃｂｆｕｃＴ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＤｍｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＢａｃｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａを１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭの５糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、１０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。分析結果を下記表に示した。下記表より、（１）で造成した１２種のｆｕｃＴ発現菌株を用いた静止菌体反応において、ＢａｃｆｕｃＴ以外のすべてのｆｕｃＴ発現菌株で空ベクター発現菌株よりも高いフコシル化コンドロイチンの生産を確認できた。特にＦｍｆｕｃＴ２は、１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量が他の酵素と比較して非常に高いことが明らかとなった。また、ＬｂｆｕｃＴ５は、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量が他の酵素と比較して高いことが明らかとなった。
［実施例２］４種のＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来ｆｕｃＴの活性評価
（１）ＦｍｆｕｃＴ、ＦｍｆｕｃＴ３、ＦｍｆｕｃＴ４発現株の造成
　配列番号１２～１３、６２で表されるアミノ酸配列からなるｆｕｃＴをそれぞれコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。下記表の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、下記表の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。下記表に記載の人工合成遺伝子はそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列をユーロフィンジェノミクス社の人工合成遺伝子サービスにて大腸菌に最適化して合成した。プライマー６６、６８及び７０はｆｕｃＴ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端に、実施例１（１）のｐＥＴ２８ａ断片１の３’末端から１５残基の塩基配列を付加したものである。プライマー６７、６９及び７１はｆｕｃＴ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補な塩基配列の５’末端に、実施例１（１）のｐＥＴ２８ａ断片１の５’末端から１５残基と相補な塩基配列を付加したものである。
　該ＰＣＲによって得られた増幅産物とｐＥＴ２８ａ断片１をそれぞれＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて５０℃で１５分間反応させ、発現ベクターｐＥＴ２８ａと連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ、ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ３、ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ４を得た。
　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ４を得た。
（２）４種のＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来ｆｕｃＴを用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産比較
　実施例１（１）と実施例２（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ４を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍＭの５糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、１０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。結果を下記表に示した。ＦｍｆｕｃＴ２が最も高活性であることが明らかとなった。なお、本試験では基質である５糖非硫酸化コンドロイチンを実施例１（２）の１割しか添加していないため、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産はみられなかった。本試験においても、５糖非硫酸化コンドロイチンを実施例１（２）と同量添加すれば、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体が生産されると考えられる。
［実施例３］ＦｍｆｕｃＴ２変異体の活性評価
（１）ＦｍｆｕｃＴ２変異体発現株の造成
　変異体はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ（タカラバイオ社）による変異導入システムを使用した。具体的には、実施例１（１）で造成したｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２プラスミドを鋳型とし、下記表の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、環状二本鎖を得た。この環状二本鎖を用いて、配列番号１４～１８及び７２～８５で表されるアミノ酸配列からなるＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｘ（Ｘはプロリン（Ｐ）以外の全てのアミノ酸）をコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるＦｍｆｕｃＴ２＿Ｈ５０Ｎをコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるＦｍｆｕｃＴ２＿Ｅ８４Ｇをコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を造成し、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｘ、ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｈ５０Ｎ、ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｅ８４Ｇを得た。
　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｘ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｈ５０Ｎ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｅ８４Ｇを得た。
（２）ＦｍｆｕｃＴ２とＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｘ発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産比較
　実施例１（１）と実施例３（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｘを１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍＭの５糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、１０　ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。結果を下記表７に示した。ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｆ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３ＮはＦｍｆｕｃＴ２よりも生産量が高く、高活性であることが明らかとなった。その中でもＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄは最も活性が高いことが明らかとなった。
（３）ＦｍｆｕｃＴ２とＦｍｆｕｃＴ２変異体（Ｐ１３Ｄ、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１３Ｎ、Ｐ１３Ｅ）発現株を用いた菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産比較
　実施例３（２）の結果より、高活性であったＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｆ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｎ、Ｐ１３Ｄと同じ酸性アミノ酸変異体であるＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｅの４種を使用し、５糖非硫酸化コンドロイチンを、実施例３（２）の１０倍量、ＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅを実施例３（２）の２倍量添加した条件で２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量を比較する静止菌体反応を実施した。５糖非硫酸化コンドロイチンとＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅの濃度以外はすべて実施例３（２）と同様の反応条件で実施した。反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。結果を下記表に示した。ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｆ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｎ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３ＥはＦｍｆｕｃＴ２よりも２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量を増加する変異体であることが明らかとなった。その中でもＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｆは、ＦｍｆｕｃＴ２よりも２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量をより増加する変異体であり、更にＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄは最も２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量を増加する変異体である。
（４）ＦｍｆｕｃＴ２とＦｍｆｕｃＴ２変異体（Ｈ５０Ｎ、Ｅ８４Ｇ）発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産比較
　実施例３（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｈ５０Ｎ及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｅ８４Ｇを１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０　ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭの５糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。結果を下記表に示した。ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｈ５０Ｎ、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｅ８４ＧはＦｍｆｕｃＴ２よりも生産量が高く、高活性であることが明らかとなった。
（５）ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｖ６６Ｘ（ＸはＶ以外のすべてのアミノ酸）発現株の造成
　変異体はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ（タカラバイオ社）による変異導入システムを使用した。具体的には、実施例１（１）で造成したｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２プラスミドを鋳型とし、下記表の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、環状二本鎖を得た。この環状二本鎖を用いて、配列番号１４０～１５８で表されるアミノ酸配列からなるＦｍｆｕｃＴ２＿Ｖ６６Ｘをコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を造成し、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｖ６６Ｘを得た。
　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｖ６６Ｘを得た。
　（６）ＦｍｆｕｃＴ２とＦｍｆｕｃＴ２＿Ｖ６６Ｘ発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産比較
　実施例１（１）と実施例３（５）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｖ６６Ｘを１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍＭの５糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、１０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、実施例１（２）と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を下記表に示した。ＦｍｆｕｃＴ２のＮａｔｉｖｅ配列が最も活性が高かったことから、ＦｍｆｕｃＴ２の６６番目のアミノ酸はＶが最適であることが明らかとなった。
［実施例４］７糖非硫酸化コンドロイチンに対する活性評価
　実施例１（１）と実施例３（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．７５ｍＭの７糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で４８時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。分析結果を下記表に示した。下記表より、ＦｍｆｕｃＴ２、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＬｂｆｕｃＴ５のすべてで７糖非硫酸化コンドロイチンをフコシル化することが確認できた。１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量はＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄが最も高く、３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量はＬｂｆｕｃＴ５が最も高かった。
［実施例５］９糖非硫酸化コンドロイチンに対する活性評価
　実施例１（１）と実施例３（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．３７５ｍＭの９糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で４８時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。分析結果を下記表に示した。下記表より、ＦｍｆｕｃＴ２、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＬｂｆｕｃＴ５のすべてで９糖非硫酸化コンドロイチンをフコシル化することが確認できた。１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量はＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄが最も高く、３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体の生産量はＬｂｆｕｃＴ５が最も高かった。
［実施例６］１１糖非硫酸化コンドロイチンに対する活性評価
　実施例１（１）と実施例３（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．１２５ｍＭの１１糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で４８時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。分析結果を下記表に示した。下記表より、ＦｍｆｕｃＴ２、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＬｂｆｕｃＴ５のすべてで１１糖非硫酸化コンドロイチンをフコシル化することができ、１０糖を超えるような多糖も基質とすることが確認できた。また、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄが１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体、３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体のすべてで生産量が最も高かった。
［実施例７］ナマコ由来ｆｕｃＴの活性評価
（１）ナマコ由来ｆｕｃＴ発現株の造成
　Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を鋳型とし、配列番号１２４及び１２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、断片２を得た。配列番号１９、２０及び１２６で表されるアミノ酸配列からなるｆｕｃＴをそれぞれコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。下記表の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、下記表の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。下記表に記載の人工合成遺伝子はそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列をユーロフィンジェノミクス社の人工合成遺伝子サービスにて大腸菌に最適化して合成した。プライマー１３０及び１３２はｆｕｃＴ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端に、実施例１（１）のｐＥＴ２８ａ断片１の３’末端から１５残基の塩基配列を付加したものである。プライマー１３１及び１３３はｆｕｃＴ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補な塩基配列の５’末端に、実施例１（１）のｐＥＴ２８ａ断片１の５’末端から１５残基と相補な塩基配列を付加したものである。プライマー１３４はｆｕｃＴ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端に、ｐＥＴ２８ａ断片２の３’末端から１５残基の塩基配列を付加したものである。プライマー１３５はｆｕｃＴ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補な塩基配列の５’末端に、ｐＥＴ２８ａ断片２の５’末端から１５残基と相補な塩基配列を付加したものである。
　該ＰＣＲによって得られた増幅産物とｐＥＴ２８ａ断片１とＡｊｆｕｃＴ２及びＡｊｆｕｃＴ７、ｐＥＴ２８ａ断片２とＡｊｆｕｃＴ１５をそれぞれＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて５０℃で１５分間反応させ、発現ベクターｐＥＴ２８ａと連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ２、ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ７、ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ１５を得た。
　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ７、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ１５を得た。
（２）ナマコ由来ｆｕｃＴ発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産
　（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ７、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＡｊｆｕｃＴ１５及び実施例１（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａを１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で３０分間の膜処理を行った。
　１００　ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍＭの５糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、１０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、分析画分を［分析例］に記載の方法で分析した。分析結果を下記表に示した。下記表より、（１）で造成した３種のナマコ由来ｆｕｃＴ発現菌株を用いた静止菌体反応において、ＡｊｆｕｃＴ７及びＡｊｆｕｃＴ１５にてｆｕｃＴを導入していない空ベクターと比較して多量のフコシル化コンドロイチンの生産が確認できた。
［実施例８］Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＡＳ２Ｍ－Ｂｉｎ００２由来フコース転移酵素（ＥｓｆｕｃＴ）の活性評価
（１）ＥｓｆｕｃＴ発現株の造成
　Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を鋳型とし、配列番号２３および２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、断片１を得た。配列番号１９７で表されるアミノ酸配列からなるＥｓｆｕｃＴをコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。表１７の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表１７の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。表１７に記載の人工合成遺伝子はそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列をユーロフィンジェノミクス社の人工合成遺伝子サービスにて大腸菌に最適化して合成した。プライマー（配列番号１９９）はｆｕｃＴ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端に、ｐＥＴ２８ａ断片１の３’末端から１５残基の塩基配列を付加したものである。プライマー（配列番号２００）はｆｕｃＴ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補な塩基配列の５’末端に、ｐＥＴ２８ａ断片１の５’末端から１５残基と相補な塩基配列を付加したものである。
　該ＰＣＲによって得られた増幅産物とｐＥＴ２８ａ断片１をそれぞれＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて５０℃で１５分間反応させ、発現ベクターｐＥＴ２８ａと連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＥｓｆｕｃＴを得た。
　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＥｓｆｕｃＴを得た。
（２）ＥｓｆｕｃＴ発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産
　（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＥｓｆｕｃＴを１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．７５ｍＭの７糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で４８時間反応を行った。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心分離し、上清の反応生成物をＬＣ－ＭＳ法により分析した。ＬＣ－ＭＳによる分析は、分離カラムにＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＮ－５０　４Ｄ，　５μｍ　４．６×１５０ｍｍ（Ｒｅｓｏｎａｃ社製）を用い、カラム温度は６０℃とした。ＬＣの溶離液としてＡ液に２５ｍＭ　ギ酸アンモニウム／Ｈ２Ｏ、Ｂ液にアセトニトリルを用い、０．５ｍＬ／分の流動速度で行った。Ａ液とＢ液の混合比は０～５分は１０：９０から２８：７２の勾配、５～１１分は２８：７２から３８：６２の勾配、１１～２１分は３８：６２の一定で、２１～２３分は３８：６２から１０：９０の勾配、２３～３０分は１０：９０の一定に変化させた。ＭＳによる検出はネガティブモードで行い、７糖非硫酸化コンドロイチンの検出は６７８．３＞５７６．７５ｍ／ｚ、７糖非硫酸化コンドロイチンにフコースが１個付加したフコシル化コンドロイチン（以下１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体）の検出は７５１．５ｍ／ｚ、７糖非硫酸化コンドロイチンにフコースが２個付加したフコシル化コンドロイチン（以下２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体）の検出は８２４．５ｍ／ｚ、７糖非硫酸化コンドロイチンにフコースが３個付加したフコシル化コンドロイチン（以下３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体）の検出は８９７．５ｍ／ｚで行った。分析結果を表１８に示す。表１８に記載の通り、ＥｓｆｕｃＴは１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体及び、２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体を生産することが示された。
［実施例９］シャペロン蛋白質によるＬｂｆｕｃＴ５の活性向上検討
（１）ＬｂｆｕｃＴ５発現株へのシャペロンプラスミドの導入
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５をシャペロンプラスミドｐＧ－ＫＪＥ８、ｐＧｒｏ７（ともにタカラバイオ社）でそれぞれ形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧ－ＫＪＥ８、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７を得た。
（２）ＬｂｆｕｃＴ５とシャペロン蛋白質の共発現株を用いた静止菌体反応によるフコシル化コンドロイチン生産
　（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧ－ＫＪＥ８を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、０．５ｇ／ＬのＬ－アラビノース、５ｎｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。また、（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、０．５ｇ／ＬのＬ－アラビノースを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。さらに、比較対象として、シャペロン蛋白質を導入していないＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１７５ｍＭの７糖非硫酸化コンドロイチン（ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心分離し、上清の反応生成物をＬＣ－ＭＳ法により分析した。ＬＣ－ＭＳによる分析は、分離カラムにＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＮ－５０　４Ｄ，　５μｍ　４．６×１５０ｍｍ（Ｒｅｓｏｎａｃ社製）を用い、カラム温度は６０℃とした。ＬＣの溶離液としてＡ液に２５　ｍＭ　ギ酸アンモニウム／Ｈ２Ｏ、Ｂ液にアセトニトリルを用い、０．５ｍＬ／分の流動速度で行った。Ａ液とＢ液の混合比は０～５分は１０：９０から２８：７２の勾配、５～１１分は２８：７２から３８：６２の勾配、１１～２１分は３８：６２の一定で、２１～２３分は３８：６２から１０：９０の勾配、２３～３０分は１０：９０の一定に変化させた。ＭＳによる検出はネガティブモードで行い、７糖非硫酸化コンドロイチンの検出は６７８．３＞５７６．７５ｍ／ｚ、７糖非硫酸化コンドロイチンにフコースが１個付加したフコシル化コンドロイチン（以下１×Ｆｕｃｏｓｅ付加体）の検出は７５１．５ｍ／ｚ、７糖非硫酸化コンドロイチンにフコースが２個付加したフコシル化コンドロイチン（以下２×Ｆｕｃｏｓｅ付加体）の検出は８２４．５ｍ／ｚで行った。分析結果を表１９に示す。表１９より、ＬｂｆｕｃＴ５はｐＧ－ＫＪＥ８及びｐＧｒｏ７を用い、シャペロン蛋白質であるｇｒｏＥＳ，ｇｒｏＥＬと共発現させることで、活性が向上することが明らかとなった。
［実施例１０］複数分子量（５，７，９，１１，１３，１５糖）を含有する非硫酸化コンドロイチン（以下ＣＳ－０　ＭＩＸ）に対する活性評価
　実施例９（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、０．５ｇ／ＬのＬ－アラビノースを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。また、１１糖でも活性がみられているＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｇ／Ｌ　ＣＳ－０　ＭＩＸ、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心分離し、上清の反応生成物をＬＣ－ＭＳ法により分析した。ＬＣ－ＭＳによる分析は、分離カラムにＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＮ－５０　４Ｄ，　５μｍ　４．６×１５０ｍｍ（Ｒｅｓｏｎａｃ社製）を用い、カラム温度は６０℃とした。ＬＣの溶離液としてＡ液に２５　ｍＭ　ギ酸アンモニウム／Ｈ２Ｏ、Ｂ液にアセトニトリルを用い、０．５ｍＬ／分の流動速度で行った。Ａ液とＢ液の混合比は０～５分は１０：９０から２８：７２の勾配、５～１１分は２８：７２から３８：６２の勾配、１１～２３分は３８：６２の一定で、２３～２５分は３８：６２から５０：５０の勾配、２５～３５分は５０：５０の一定で、３５～３６分は５０：５０から１０：９０の勾配、３６～４０分は１０：９０の一定に変化させた。ＭＳによる検出はネガティブモードで行い、表２０のｍ／ｚで行った。分析結果を表２１に示す。表２１より、ＬｂｆｕｃＴ５はシャペロン蛋白質と共発現させることで、５糖、７糖、９糖、１１糖、１３糖、１５糖を基質とした場合においても活性が向上することが明らかとなった。表２１より、低分子基質ではＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄの活性が高く、高分子基質ではＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７の活性が高いことが明らかとなった。また、ＦｍｆｕｃＴ２＿Ｐ１３Ｄは９糖以上で３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体を生産できなかったが、ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７は１５糖でも３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体を生産できたことから、フコースを複数個付加する活性が非常に高いことも明らかとなった。
　なお、実施例５，６において、９糖、１１糖の非硫酸化コンドロイチンを基質として４８時間反応させることで３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体が検出されたが、実施例１０では反応時間が４８時間の半分である２４時間と短いため、３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体は検出されなかった。実施例５，６と同等の条件で反応させることで、３×Ｆｕｃｏｓｅ付加体は検出される。
［実施例１１］ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７の反応至適ｐＨ評価
　実施例９（１）で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、０．５ｇ／ＬのＬ－アラビノースを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。
　１００ｇ／Ｌの各湿菌体、５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７、７．５、８）、５ｇ／Ｌ　ＣＳ－０　ＭＩＸ、２０ｍＭのＧＤＰ－Ｆｕｃｏｓｅ、１０ｍＭの塩化マグネシウムからなる０．２ｍＬの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、３７℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。緩衝液はＢｉｓ－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を使用した。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心分離し、上清の反応生成物をＬＣ－ＭＳ法により分析した。ＬＣ－ＭＳによる分析は、分離カラムにＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＮ－５０　４Ｄ，　５μｍ　４．６×１５０ｍｍ（Ｒｅｓｏｎａｃ社製）を用い、カラム温度は６０℃とした。ＬＣの溶離液としてＡ液に２５ｍＭ　ギ酸アンモニウム／Ｈ２Ｏ、Ｂ液にアセトニトリルを用い、０．５ｍＬ／分の流動速度で行った。Ａ液とＢ液の混合比は０～５分は１０：９０から２８：７２の勾配、５～１１分は２８：７２から３８：６２の勾配、１１～２３分は３８：６２の一定で、２３～２５分は３８：６２から５０：５０の勾配、２５～３５分は５０：５０の一定で、３５～３６分は５０：５０から１０：９０の勾配、３６～４０分は１０：９０の一定に変化させた。ＭＳによる検出はネガティブモードで行い、実施例１０の表２０のｍ／ｚで行った。分析結果を表２２に示す。表２２より、ＬｂｆｕｃＴ５＋ｐＧｒｏ７は５、７、９、１１、１３、１５糖のすべての非硫酸化コンドロイチン基質に対して、ｐＨ７、ｐＨ７．５、ｐＨ８のどの条件においても活性を有し、中でもｐＨ７．５での活性が最も高いことが明らかとなった。

Claims (14)

  1. 　下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つの蛋白質を用い、基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
    ［１］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
    ［２］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
    ［３］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
  2. 　前記基質に対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の蛋白質であって、前記アミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、［４］～［１０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、蛋白質を用い、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法。
    ［４］　配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基である
    ［５］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である
    ［６］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である
    ［７］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である
    ［８］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
    ［９］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
    ［１０］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基である
  3. 　基質に対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記［１１］～［１６］からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を導入した蛋白質を用い、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
    ［１１］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン酸残基へ置換
    ［１２］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基へ置換
    ［１３］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をグルタミン酸残基へ置換
    ［１４］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
    ［１５］　配列番号４の５０位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
    ［１６］　配列番号４の８４位のアミノ酸残基をグリシン残基へ置換
  4. 　Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来であって、基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を用い、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、方法。
  5. 　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、前記グルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸であり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチン又はフコシル化コンドロイチン硫酸である、又は、
    　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチンである、
    請求項１～４に記載のフコシル化多糖を製造する方法。
  6. 　以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子改変微生物。
    （Ａ）基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を有し、前記基質からフコシル化多糖を生産する、遺伝子改変微生物であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、遺伝子改変微生物。
    （Ｂ）基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を有する、遺伝子改変微生物であって、前記基質が、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンである、遺伝子改変微生物。
  7. 　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質が、下記［１］～［３］で表される蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１つで表される、請求項６に記載の遺伝子改変微生物。
    ［１］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
    ［２］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列において、１～３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
    ［３］　配列番号１～２２及び１９７からなる群より選ばれる１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質
  8. 　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質であって、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、［４］～［１０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、蛋白質を有する、請求項６に記載の遺伝子改変微生物。
    ［４］　配列番号４の６６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基である
    ［５］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基である
    ［６］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である
    ［７］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である
    ［８］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
    ［９］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン残基である
    ［１０］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基である
  9. 　前記基質に対してフコース転移活性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記［１１］～［１６］からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を導入した蛋白質を有する、請求項６に記載の遺伝子改変微生物。
    ［１１］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン酸残基へ置換
    ［１２］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基へ置換
    ［１３］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をグルタミン酸残基へ置換
    ［１４］　配列番号４の１３位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
    ［１５］　配列番号４の５０位のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
    ［１６］　配列番号４の８４位のアミノ酸残基をグリシン残基へ置換
  10. 　前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質が、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ由来である、請求項６に記載の遺伝子改変微生物。
  11. 　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、前記グルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸であり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチン又はフコシル化コンドロイチン硫酸である、又は、
    　前記グルクロン酸含有グリコサミノグリカンがコンドロイチンであり、かつ、前記フコシル化多糖がフコシル化コンドロイチンである、
    請求項６～１０に記載の遺伝子改変微生物。
  12. 　請求項６～１１のいずれかに記載の遺伝子改変微生物の培養物又は前記培養物の処理物であって、前記基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質を含む、酵素調製物。
  13. 　請求項６～１１のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を用いた、前記基質からフコシル化多糖を製造する方法。
  14. 　基質に対してフコース転移活性を有する蛋白質であって、
    　前記基質は、グルクロン酸含有グリコサミノグリカン又はグルクロン酸含有硫酸化グリコサミノグリカンであり、
    　配列番号４で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列とアライメントした際に、下記［１］～［６］からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異を導入した蛋白質。
    ［１］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸残基へ置換
    ［２］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基へ置換
    ［３］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミン酸残基へ置換
    ［４］　配列番号４の１３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
    ［５］　配列番号４の５０位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン残基へ置換
    ［６］　配列番号４の８４位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシン残基へ置換
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