WO2025159488A1 - 질병 진단을 위한 펩타이드 기반 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

질병 진단을 위한 펩타이드 기반 프로브 및 이의 용도

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WO2025159488A1
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disease
biomarker
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정종평
박윤정
이주연
조범수
윤국진
이동우
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Seoul National University R&DB Foundation
Nibec Co Ltd
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    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a fusion peptide of a cell-penetrating peptide and a physiologically active peptide labeled with a fluorophore and a quencher, and a use thereof, and more specifically, to a probe designed to additionally bind a fluorophore and a quencher to both ends of a chemically bonded cell-penetrating peptide and a physiologically active peptide so that fluorescence is not emitted by the quencher until reaching a target, and fluorescence is detected when the physiologically active peptide binds to a target biomarker, and a diagnostic composition and a diagnostic method comprising the same.
  • Noninvasive and simultaneous imaging and therapy have been attempted with some success in the treatment of cancer and inflammatory diseases (Kim EM, et al., Nucl Med Biol 2009;36:371-8).
  • Most of these imaging approaches have previously relied on targeting specific enzyme activities, primarily expressed on substrates conjugated to activatable probes (Akhatib B, et al., J Biol Chem 2013;288:19280-7).
  • MMP matrix metalloproteinase
  • NIRF near-infrared fluorescent
  • peptide ligands the most potent of which typically bind to receptors with nanomolar dissociation, which is advantageous for determining specificity (Ehrlich A, et al., Biochem Pharmacol 2013;86:1263-71).
  • Ubiquitination is a natural proteasome degradation reaction that balances the removal of aged or abnormal proteins, but dysfunction or overactivity of ubiquitination leads to inflammation and disease states.
  • ubiquitin proteasome system UPS
  • ubiquitin ligation is mediated by a cascade of enzymes E1-E2-E3 (Tian M, Xie Q. J Integr Plant Biol 2013;55:54-63).
  • E1-E2-E3 a cascade of enzymes E1-E2-E3 (Tian M, Xie Q. J Integr Plant Biol 2013;55:54-63).
  • E1-E2-E3 a cascade of enzymes E1-E2-E3
  • E3 ligase The final linkage of the ubiquitin C-terminus to the target occurs by E3 ligase (Schulman BA, Harper JW. Nat Rev Mol Cell Biol 2009;10: 319-31). Most studies have targeted E3 ligases as key molecules in many diseases associated with the UPS (Wang Z, et al., Neoplasia 2013;15:1028-35).
  • the two main classes of E3 ligases are RING and HECT type E3s, with C2-WW-HECT E3s being the most studied.
  • This subfamily of E3s typically consists of an N-terminal C2 domain, two to four WW domains, a domain for substrate interaction, and a C-terminal HECT domain to maintain E3 activity.
  • Smurf-1 an example of an E3 ubiquitin ligase
  • E3 ubiquitin ligase is a HECT class ubiquitin ligase that specifically binds Smad proteins and promotes their degradation by the proteasome, and is a frequent marker in inflammatory diseases (Sangadala S, et al., J Biol Chem 2006;281:17212-9).
  • Smads particularly Smad 1/5/8, are also associated with osteogenesis.
  • Smurf overexpression is significantly elevated in most inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis, periodontitis, osteoporosis, other bone resorption diseases, and cancer. It is clear that bone formation is impaired in these inflammatory diseases due to degradation of Smad proteins.
  • LMP-1 LIM mineralization protein-1
  • Smads by binding to E3 ligases in cells and tissues overexpressing Smurf-1.
  • LIM mineralization protein (LMP)-1 is a recently identified intracellular protein that has been shown to stimulate osteoblast differentiation and generate mineralized nodules in rat calvarial osteoblasts in vitro (Boden SD, et al., Endocrinology 1998;139:5125-34). Although the exact mechanism or key domain of LMP-1's osteogenic action is unknown, LMP-1 has been shown to bind strongly to Smurf-1 (Sangadala S, et al., Proteins 2007;68:690-701).
  • a specific domain sequence of LMP-1 could be produced by peptide synthesis and mimic the full activity of LMP-1, while also strongly binding to the inflammatory marker Smurf.
  • the resulting peptide must satisfy three essential requirements: (i) retain the same chemical and physical properties as LMP-1, (ii) have a well-defined Smurf-1 binding strength (i.e., greater than the binding strength between Smurf-1 and Smad), and (iii) the sequence must be delivered intracellularly and be fluorescently labeled to monitor Smurf-1 localization and binding.
  • Target binding can be detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET) imaging if it alters the peptide conformation. This involves conjugating a fluorescent dye and its quencher to each end of the peptide.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a peptide probe is coupled to a sequence together with BHQ-1 and a fluorescent dye, and exhibits fluorescent inactivity until it reaches Smurf-1, and then, upon binding between Smurf-1 and a Smurf1-binding peptide (SBP) sequence, it switches to activity as the distance between the fluorophore and the quencher increases, thereby compensating for interference. Consequently, the peptide motif, called a peptide probe, has been confirmed to provide a convenient, rapid, specific, and sensitive means of monitoring analytes and reporting the presence of a specific target substrate, thereby completing the present invention.
  • SBP Smurf1-binding peptide
  • the purpose of the present invention is to provide a probe in which a fusion peptide in which a cell-penetrating peptide and a physiologically active peptide are combined is labeled with a fluorescent substance and a quencher to rapidly diagnose a disease in a non-invasive manner.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing an inflammatory disease including the probe.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing an inflammatory disease including the above probe and a method for providing information for diagnosing an inflammatory disease.
  • the present invention provides a probe for detecting a biomarker in which a fluorophore and a quencher are combined with a fusion peptide in which a cell-penetrating peptide and a physiologically active peptide are combined.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing an inflammatory disease comprising the probe.
  • the present invention also provides a method for diagnosing an inflammatory disease and a method for providing information for diagnosis, including a step of treating a sample separated from a subject with the probe.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the concept of real-time molecular imaging using a ubiquitin proteasome system (UPS)-based peptide probe and its application to diagnosis and therapy.
  • UPS ubiquitin proteasome system
  • Figure 2 is a schematic diagram of peptide design and production using (A) F-moc solid-phase peptide synthesis, (B) the results of Smurf-1 binding evaluation of SBP and hBCPP-SBP containing WW domain interaction sites using slot blot analysis, (C) sensorgrams confirming the interactions between SBP and Smurf-1, (D) hBCPP-SBP and Smurf-1, (E) human recombinant protein Smad 1 and Smurf-1, and (F) hBCPP and Smurf-1, at 1000, 4000, 6000, and 8000 nM from the top of each graph, and (G) the SPR analysis results for the specific binding of each peptide to immobilized Smurf-1 at 1 ⁇ M.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing (A) the fluorescence imaging of fluorescently labeled peptides (light emission, left panel), BHQ-1-conjugated fluorescently labeled peptides (middle panel), and re-fluorescent peptides using Smurf-1 protein due to conformational changes upon binding to target markers (light re-emission, right panel), (B) the results of treating Smurf-1-overexpressing hMSCs with various doses of fluorescently quenched peptides (fluorescence images were detected with LAS3000 at 488 nm), and (C) the fluorescence intensity was quantified by a fluorimeter. Data are presented as mean ⁇ standard error of the mean (* p -value ⁇ 0.05, *** p- value ⁇ 0.01).
  • the present invention relates to a peptide probe that can be more usefully applied in the diagnosis of diseases including inflammation, based on an intracellular delivery technique that allows a non-permeable bioactive substance such as a peptide or drug bound thereto to penetrate into cells using a cell-penetrating peptide.
  • a non-permeable bioactive substance such as a peptide or drug to be introduced is treated in vivo and in vitro so that it can be quickly and safely penetrated into cells, that is, introduced directly into cells without the endocytosis process, which is a conventional cellular uptake method, by chemically bonding a cell-penetrating peptide, and a peptide probe labeled with a fluorescent substance and a quencher is manufactured by labeling this fusion peptide, and only when the physiologically active peptide binds to the biomarker after the probe is penetrated into the target cell by the cell-penetrating peptide, does the quencher and the fluorescent substance become distant and only then does light shine, thereby facilitating molecular diagnosis even at low concentrations, and thus it was confirmed to be useful for the diagnosis of diseases expressing target biomarkers.
  • the present invention relates, from one aspect, to a probe for detecting a biomarker in which a fluorophore and a quencher are combined with a fusion peptide in which a cell-penetrating peptide and a physiologically active peptide are combined.
  • the "probe” is a peptide or protein-based probe for confirming the presence or absence of a specific biomarker, has cell-penetrating functionality by a cell-penetrating peptide, includes a physiologically active peptide that specifically binds to a specific biomarker, and is characterized in that a fluorescent substance and a quencher are combined within a distance at which the fluorescent substance can be quenched by binding to the quencher.
  • the “biomarker” is molecular information based on a single molecule or a pattern of molecules derived from DNA, RNA, metabolites, proteins, and protein fragments, and is an indicator that can detect changes in the body caused by the influence of genetic or epigenetic changes in a living organism.
  • cell-penetrating peptide is used interchangeably with “cell-penetrating domain” and “protein transport domain (PTD)”, and refers to a permeable peptide or the like that can permeate a peptide, drug, or drug-containing particle into the cytoplasm or nucleus of a cell.
  • PTD protein transport domain
  • the cell-penetrating peptide may be characterized by being composed of a sequence of 5 to 15 amino acids and having a content ratio of at least one amino acid selected from the group consisting of arginine (R), lysine (K) and histidine (H) of 40 to 70%, but is not limited thereto.
  • the cell-penetrating peptide may be characterized by including at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12:
  • H4S (SEQ ID NO: 1: SSRKKNPNCRRH), H4Q (SEQ ID NO: 2: QRARKKNKNCRRH), HBD-3P (SEQ ID NO: 3: CSTRGRKCCRRKK), H2 (SEQ ID NO: 4: HKREKRQAKHKQRKR), H3 (SEQ ID NO: 5: KSKNKKKQRKGPHRK), H3B (SEQ ID NO: 6: KPRPGRKDRRKK), H4-1 (SEQ ID NO: 7: RRRRAKRSPKHHS), H6 (SEQ ID NO: 8: SRRRQQSRNR), H8 (SEQ ID NO: 9: RAVRPLRRRQPKKS), H4C (SEQ ID NO: 10: CSSRKKNPNCRRH), H5C (SEQ ID NO: 11: CSSRKKNKNCPRRH), and H6C (SEQ ID NO: 12: CSSRKKNPNCPRRH).
  • H4Q is a peptide derived from human bone morphogenetic protein (BMP)-4
  • HBD-3P is a peptide derived from human beta defensin
  • H2 is derived from human bone morphogenetic protein (BMP)-2
  • H3 and H3B are derived from human bone morphogenetic protein (BMP)-3
  • H4-1 is a peptide derived from human bone morphogenetic protein (BMP)-4 with some modification
  • H6 is derived from human bone morphogenetic protein (BMP)-6
  • H8 is a peptide derived from human bone morphogenetic protein (BMP)-8.
  • amino acids constituting the above cell-penetrating peptide can be in L-form or D-form considering stability in the body.
  • the cell-penetrating peptide may be any peptide or peptide analogue other than the aforementioned peptide, as long as it can penetrate the cell membrane.
  • a fusion peptide of the cell-penetrating peptide and the physiologically active peptide according to the present invention may be prepared using existing non-human cell-penetrating functional domains, such as TAT and arginine-derived peptides.
  • human-derived peptides are listed to impart biocompatibility, and this does not mean that they cannot be applied to existing viral or non-human-derived peptides.
  • biologically active peptide is used interchangeably with “biologically active protein”, “biologically active domain”, “biomarker conjugate”, “biomarker binding sequence”, etc., and may be a peptide including an amino acid sequence that specifically binds to a specific biomarker and has anti-inflammatory functionality, antimicrobial functionality, anticancer functionality, tissue regeneration functionality, or bone regeneration induction functionality.
  • the physiologically active peptide may be characterized by including at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 16:
  • Sequence number 13 GAPPPADSAP
  • sequence number 14 PPGY
  • sequence number 15 PAY
  • sequence number 16 anti care peptide: TRGRKCCRRKK
  • a fusion peptide of a cell-penetrating peptide and a physiologically active peptide can be manufactured by chemical synthesis using a peptide synthesis device, and a bone differentiation-inducing sequence or a physiologically active domain is sequentially chemically synthesized at the C-terminal end of a protein transport domain (PTD) having cell-penetrating functionality, so that a fusion peptide can be manufactured by synthesizing in the order of 'N terminus-protein transport domain-physiologically active domain-C terminus' or 'N terminus-physiologically active domain-protein transport domain-C terminus'.
  • the physiologically active domain is mainly used to have the function of binding to a biomarker of a disease.
  • the body can be characterized by being able to play a role in correcting abnormal pathologies caused by deficiency or excessive secretion of substances involved in functional regulation in the body, as a substance that regulates genetic expression and physiological functions in vitro or in vivo , as well as pharmacologically active functions, such as osteogenic differentiation induction, and can be made into L-type or D-type considering stability in the body.
  • the fusion peptide can be applied to cell and in vivo biomarker detection and disease diagnosis by covalently bonding with a fluorophore and a quencher.
  • the fluorophore or quencher can be covalently bonded to the N-terminal or C-terminal portion of the fusion peptide, and preferably, a cysteine can be additionally attached to the terminal portion of a cell-penetrating peptide or a physiologically active peptide to form a covalent bond.
  • a complex of the fusion peptide with a fluorophore and a quencher can be formed by inducing chemical bonding using a cross-linking agent.
  • the cell-penetrating peptide has a free amino group at the N-terminus, making it easy to form a complex using the cross-linking agent.
  • Crosslinking agents that can be used in the present invention include 1,4-bis-maleimidobutane (BMB), 1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol (BM[PEO]4), 1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC), succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]] (SMCC) and its sulfonated salt (sulfo-SMCC), succinimidyl Examples thereof include, but are not limited to, succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate (SPDP) and its sulfonated salt (sulfo-SPDP), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) and its sulfonated salt (sulf
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the fluorescent dye is selected from the group consisting of fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, Oregon green, Alexa Fluor, FAM, JOE, ROX, HEX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, cyanine series dyes and thiadicarbocyanine, but is not limited thereto, and the quencher is selected from the group consisting of Dabcyl, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, Blackberry Quencher, Black Hole Quencher, It may be characterized by being selected from the group consisting of BHQ), Qxl, Iowa black FQ, Iowa black RQ and IRDye QC-1.
  • the fluorescent agent may be FITC
  • the quencher may be BHQ-1, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing an inflammatory disease comprising the above-described probe for detecting a biomarker.
  • the “diagnosis” means accurately identifying the condition of a subject with respect to a specific disease or condition, and the contents thereof include the name of the disease, etiology, pathological type, severity, detailed aspects of the condition, and presence or absence of complications.
  • the condition of a subject with respect to a specific disease or condition is used in a broad sense, including not only susceptibility to a specific disease or condition, determination of the disease the subject is currently suffering from, but also confirmation of the characteristics of the disease, such as prognosis of the subject, identification of the disease condition, determination of the stage of the disease, or prediction of the sensitivity and responsiveness of cancer to treatment, obtaining a basis for appropriate treatment according to the patient’s disease and condition, such as confirming the condition of the subject to confirm the therapeutic effect of a specific drug, and further including prediction and confirmation of recurrence in a subject who has been cured from a specific disease or condition.
  • the inflammatory disease may be characterized by being selected from the group consisting of bone disease, fibrosis, periodontitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, biomaterial transplant inflammatory response, asthma, dermatitis, psoriasis, and cancer, but is not limited thereto.
  • the bone disease may be characterized by being selected from the group consisting of osteoporosis, osteoarthritis, osteitis, osteogenesis imperfecta, hypercalcemia, osteomalacia, Paget's disease, bone loss due to cancer, and osteonecrosis, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a kit for diagnosing an inflammatory disease comprising the above-mentioned probe for detecting a biomarker.
  • the present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease and a method for providing information for diagnosis, which comprises a step of treating a sample separated from a subject with a probe for detecting a biomarker.
  • a fusion peptide containing GAPPPADSAP (SEQ ID NO: 13) as a bone differentiation-inducing sequence derived from LMP1 and H4S (SSRKKNPNCRRH: SEQ ID NO: 1) as a PTD in order from the N-terminus was synthesized by F-moc solid-phase chemical synthesis using a peptide synthesizer (Fig. 1).
  • the peptide was synthesized using Rink resin (0.075 mmol/g, 100-200 mesh, 1% DVB crosslinking) conjugated with Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl) as a blocking group.
  • the synthesis was confirmed using the ninhydrin test method. After the test and the synthesis was completed, the resin was dried with THF or DCM, and then TFA cleavage cocktail was added at a ratio of 20 ml per 1 g of resin, shaken for 3 hours, and then filtered to separate the resin and the cocktail containing the dissolved peptide. The filtered solution was removed using a rotary evaporator, and then cold ether was added or an excessive amount of cold ether was added directly to the TFA cocktail solution containing the dissolved peptide to crystallize the peptide into a solid phase, which was then centrifuged. At this time, the TFA cocktail was completely removed through several washes with ether and centrifugation processes. The peptide thus obtained was dissolved in distilled water and lyophilized.
  • Fusion peptide NH 2 -GAPPPADSAP-SSRKKNPNCRRH-C-COONH 2 (SEQ ID NO: 17)
  • the synthesized peptide sequence was cleaved from the resin, washed, lyophilized, and then separated and purified by liquid chromatography. The molecular weight of the purified peptide was confirmed using MALDI analysis.
  • the above peptide was synthesized using a peptide synthesis device using the F-moc solid-phase chemical synthesis method.
  • the above peptide was synthesized using a peptide synthesis device using the F-moc solid-phase chemical synthesis method.
  • Example 2 Confirmation of binding affinity between fusion peptide and inflammatory marker Smurf1.
  • human-derived Smurf1 protein which acts as a ligand in this experiment, was purchased from Origene (Rockville, MD, USA). 100 mg/ml of the protein was bound to the gold-coated side of a CM5 chip (BIACORE AB, Sweden) with amino groups bonded to the surface using an EDC/NHS kit (BIACORE AB, Sweden) (the above experimental method may also use ‘Immobilization’ built into the BIACORE T100 (BIACORE AB, Sweden) software used by the present inventors).
  • a method called ‘pH scouting’ was performed to find a suitable pH condition under which the protein can bind to the amino group of the CM5 chip, and one pH condition was found.
  • the experimental method of ‘pH scouting’ may also use the one built into the BIACORE T100 (BIACORE AB, Sweden) software used by the present inventors.
  • the analytes (the fusion peptide synthesized in Example 1, the cell-penetrating peptide of Comparative Example 1 to be used as a negative control, and the inflammatory marker binding sequence of Comparative Example 2 to be used as a positive control) are each flowed at 10 mM over the CM5 chip and the binding strength is measured (the above experimental method may also be used with the ‘Binding analysis’ built into the BIACORE T100 (BIACORE AB, Sweden) software used by the present inventors).
  • This can be said to be a result showing that the fusion peptide has a sequence that induces osteogenic differentiation and that the physiologically active sequence (a portion that can exhibit functionality by binding to Smurf1 in vivo) was not significantly damaged during the synthesis process.
  • Smurf1 an inflammatory factor that interferes with tissue maintenance and regeneration, strongly binds to its counterpart, SMAD, and then initiates ubiquitination, which degrades the protein, irreversibly hindering cell regeneration.
  • SMAD a sulfonylcholine
  • the inventors determined that the more overexpressed Smurf1, the more severe the inflammatory disease.
  • the apparent dissociation constant of Smad-1 a molecule known to strongly bind to Smurf-1 upon ubiquitination, is 298 nM (Table 1).
  • Example 3 Simultaneous imaging using fusion peptide probes in cells overexpressing Smurf-1.
  • the fusion peptide was further modified with an activatable fluorescent dye.
  • BHQ-1 can quench the fluorescence of fluorescein isothiocyanate (FITC) with higher efficiency.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the fluorescence of the two peptides was inactive due to the close proximity of BHQ to the fluorescent dye.
  • fluorescence activation was observed after Smurf-1 treatment, which was attributed to the sequestration of BHQ by the binding of Smurf-1 and SBP (Fig. 3A).
  • the fluorescence intensity was proportional to the Smurf-1 concentration, indicating that the peptide probe of the present invention is useful for measuring inflammatory diseases (Figs. 3B and 3C). This is likely a result of a structural change in the peptide caused by the relatively large molecule Smurf-1.
  • FRET analysis was performed on human osteosarcoma (HOS) cells, which are Smurf-1-positive cells, and mouse fibroblasts (NIH3T3) cells, which are Smurf-1-negative cells (Fig. 3). HOS cells treated with the quenched hBCPP-SBP probe restored the fluorescence signal, but NIH3T3 cells did not.
  • the diagnostic method according to the present invention can identify diseases, such as inflammation, relatively quickly and non-invasively compared to conventional staining-based histological disease diagnosis, making it useful for diagnosing various inflammatory diseases and monitoring inflammatory responses associated with transplantation during in vivo transplantation. Furthermore, it can be applied clinically without requiring multiple steps and can be mass-produced, making it useful for the development of diagnostic drug delivery systems and therapeutic technologies.

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Abstract

본 발명은 세포투과성 펩타이드-질환 바이오마커 결합기능성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드에 추가적으로 형광체(fluorescence dye)-소광체(quencher)가 결합된 프로브(probe)에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 비투과성 질환 감응성 중요 도메인을 세포 내로 직접 도입시킴으로써 표적 세포에 투과하여 표적물질에 결합시 형광을 발광할 수 있어 진단을 용이하게 함과 동시에 치료도 기할 수 있도록 유도한 세포투과성 펩타이드-생리활성 펩타이드 분자 프로브에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 염색기반 조직학적 질환 진단 대비 비침습적이면서도 신속하게 질환, 예컨데 염증상황을 확인할 수 있어 다양한 염증성 질환의 진단이나 생체내 이식시 이식과 관련된 염증반응의 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 여러 단계를 거치지 않고 임상에 적용할 수 있고 대량 생산이 가능하여 이를 이용한 진단용 약물 전달 시스템 및 치료기술의 발전에 유용하다.

Description

질병 진단을 위한 펩타이드 기반 프로브 및 이의 용도
본 발명은 형광체 및 소광체가 표지된 세포투과성 펩타이드-생리활성 펩타이드의 융합 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 화학적으로 결합시킨 세포투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드의 양 말단에 형광체 및 소광체를 추가로 결합시켜, 표적에 도달하기 전까지는 소광체에 의해 형광을 내지 않고, 생리활성 펩타이드가 표적 바이오마커에 결합하면 형광이 검출되도록 설계한 프로브 및 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단방법에 관한 것이다.
비침습적 동시 영상화(noninvasive and simultaneous imaging) 및 치료가 시도되어 암 및 염증성 질환을 포함한 치료에 어느 정도 성공을 거두었다(Kim EM, et al., Nucl Med Biol 2009;36:371-8). 이러한 이미징의 대부분은 이전에 활성화 가능한 프로브(probe)에 접합된 기질에 대한 표적에서 주로 발현되는 특정 효소 활성에 의존해왔다(Akhatib B, et al., J Biol Chem 2013;288:19280-7). 예를 들어, 류마티스 관절염의 경우 매트릭스 금속단백분해효소(Matrix Metallo-protease, MMP)-3-특이적 기질 변형 폴리머가 근적외선 형광(NIRF) 프로브로 연구되어 시도된 바 있다(Ryu JH, et al., Arthritis Rheum 2011;63:3824-32). 문제는 이 마커가 고농도로 존재하게 될 중기 이후 악화되어야 정확성이 인정되었고, 해당 프로브는 단일 MMP에 대해 특이적이지 않았다. 이보다는 단백질-단백질 결합을 기반으로 프로브를 설계하는 것이 조기 검출에 더 유리할 수 있다. 한 분자와 다른 분자의 이러한 특정한 결합은 널리 알려져 있는 생물학의 현상이며 이를 기반으로 한 많은 진단, 치료기술이 도출되어 왔다. 합성 프로브 사이의 안정적인 공유결합 형성 분자와 표적 단백질의 특정 부위는 의생명과학에서 많은 잠재적 응용 분야를 가지고 있다(Marquez BV, et al., Bioconjug Chem 2012;16:1080-9). 더 흥미로운 사례 중에는 펩타이드 리간드가 있는데 가장 강한 것은 일반적으로 나노 몰 해리로 수용체에 결합 하여 특이성을 확인하는 데 유리하다(Ehrlich A, et al., Biochem Pharmacol 2013;86: 1263-71).
본 발명자들은 E3 유비퀴틴 효소 시스템을 단백질 결합 표적으로 적용했다. 유비퀴틴화는 노화된 단백질이나 비정상적인 단백질 제거 과정의 균형을 맞추기 위한 천연 프로테아좀 분해 반응인데, 유비퀴틴화의 기능 장애 또는 과잉 작용이 있는 경우 염증이나 질병 상태로 이어진다. 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(UPS)에서 유비퀴틴의 결찰은 E1-E2-E3 효소의 연쇄 작용에 의해 매개된다(Tian M, Xie Q. J Integr Plant Biol 2013;55:54-63). 유비퀴틴은 E1에 의해 활성화되고, 그 후 유비퀴틴 C 말단과 E1의 시스테인 사이에 형성된 티오에스테르 결합이 활성 유비퀴틴으로 전달된다. 유비퀴틴 C 말단과 표적의 최종 결합은 E3-리가제에 의해 발생한다(Schulman BA, Harper JW. Nat Rev Mol Cell Biol 2009;10: 319-31). 대부분의 연구는 UPS와 관련된 많은 질병의 핵심 분자로서 E3-리가제를 표적으로 삼고있다(Wang Z, et al., Neoplasia 2013;15:1028-35). E3-리가제의 두 가지 주요 클래스는 RING 및 HECT 유형 E3이며 C2-WW-HECT E3가 가장 많이 연구되었다. E3의 하위 계열은 일반적으로 N 말단 C2 도메인, 2~4개의 WW로 구성된다. 기질 상호작용을 위한 도메인과 E3 활성을 유지하기 위한 C 말단 HECT 도메인 E3-유비퀴틴 리가제의 예인 Smurf-1은 Smad 단백질에 특이적으로 결합하여 프로테오솜에 의한 Smad 분해를 촉진하는 HECT 클래스 유비퀴틴 리가제로, 염증성 질환에서 빈발하는 마커이다(Sangadala S, et al., J Biol Chem 2006;281:17212-9). Smads, 특히 Smad 1/5/8은 골형성과도 관련이 있다. 류마티스 관절염, 치주염, 골다공증, 기타 뼈 흡수 질환, 암 등 대부분의 염증성 질환에서 Smurf의 과발현은 상당하다. 이러한 염증성 질환에서는 Smad 단백질의 분해로 인해 골형성이 불량하다는 것이 분명하다. E3-유비퀴틴의 역할은 표적 단백질에 대한 특이적 결합에 기초하여 프로테오솜 분해를 유도한다. 본 발명자들은 Smurf-1이 과발현된 세포와 조직에서 E3 리가아제를 결합시켜 Smads의 프로테오솜 분해를 차단하는 치료 도구로 펩타이드 모티프를 설계했다. LIM 광물화 단백질(LMP)-1은 최근 확인된 세포내 단백질로 조골세포 분화를 자극하고 시험관 내 쥐 두개골 조골세포에서 광물화된 결절을 생성하는 것으로 나타났다(Boden SD, et al., Endocrinology 1998;139:5125-34). LMP-1의 골형성 작용의 정확한 메커니즘이나 핵심 영역은 알려져 있지 않지만, LMP-1은 Smurf-1에 강하게 결합하는 것으로 나타났다(Sangadala S, et al., Proteins 2007;68:690-701).
본 발명자들은 LMP-1의 특정 도메인 서열이 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있고 LMP-1의 전체 활성을 모방할 수 있다는 가설을 세웠고, 또한 염증성 마커인 Smurf에 강하게 결합할 것이라는 가설을 세웠다. 생성된 펩타이드는 세 가지 필수 요구 사항을 충족해야 한다: (i) LMP-1과 동일한 화학적, 물리적 특성을 유지할 것, (ii) 잘 정의된 Smurf-1 결합 강도(즉, Smurf-1과 Smad 사이의 결합 강도보다 커야 함)를 가질 것, (iii) 해당 서열은 세포 내로 전달되어야 하며 Smurf-1의 세포 내 국소화 및 결합이 모니터링 될 수 있는 형광을 표지할 것. 표적 결합이 펩타이드 형태를 변경할 수 있는 경우 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 영상을 통해 검출할 수 있다. 즉, 형광염료와 그 소광염료가 펩타이드의 각 말단에 결합되어 있는 경우이다. 형광은 없지만 형태 변화로 두 염료의 거리가 확장될 수 있다. 본 발명에 따르면, 펩타이드 프로브는 BHQ-1 및 형광 염료와 함께 시퀀스에 결합되어 Smurf-1에 도달할 때까지 형광 불활성을 나타내다가 Smurf-1과 Smurf1 결합 펩타이드(SBP) 시퀀스 사이의 결합 후, 형광체와 소광체의 거리가 멀어지면서 활성으로 전환되어 간섭을 보상하였다. 결과적으로, 펩타이드 프로브라고 불리는 펩타이드 모티프는 분석물을 모니터링하고 특정 표적 기질의 존재를 보고하는 편리하고 신속하며 구체적이고 민감한 수단을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 비침습적으로 신속하게 질환을 진단하기 위해, 세포투과성 펩타이드 및 생리활성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드에 형광체 및 소광체를 표지한 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 포함한 염증성 질환 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브를 포함한 염증성 질환 진단방법, 염증성 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포투과성 펩타이드 및 생리활성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드에 형광체 및 소광체가 결합된 바이오마커 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 대상에서 분리된 시료에 상기 프로브를 처리하는 단계를 포함하는 염증성 질환 진단방법 및 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
도 1은 유비퀴틴 프로테오솜 시스템(UPS) 기반 펩타이드 프로브에 의한 실시간 분자 이미징 및 이의 진단 및 치료로의 적용 개념에 대한 모식도이다.
도 2는 (A) F-moc 고체상 펩타이드 합성을 이용한 펩타이드 설계 및 제작의 모식도이고, (B) 슬롯 블롯 분석을 사용하여 WW 도메인 상호작용 부위를 포함하는 SBP, hBCPP-SBP의 Smurf-1 결합 평가 결과이며, (C) SBP와 Smurf-1, (D) hBCPP-SBP와 Smurf-1, (E) 인간 재조합 단백질 Smad 1와 Smurf-1, 및 (F) hBCPP와 Smurf-1간의 상호작용을 확인한 센서그램으로, 각 그래프의 위에서부터 1000, 4000, 6000 및 8000nM이며, (G) 1μM의 각 펩타이드와 고정화된 Smurf-1의 특이적 결합에 대한 SPR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 (A) 타겟 마커에 결합함에 따라 구조 변화에 의한 형광 표지된 펩타이드(빛 방출, 왼쪽 패널), BHQ-1 접합 형광 표지 펩타이드(중간 패널) 및 Smurf-1 단백질을 사용한 재형광 펩타이드의 형광 이미징(빛 재방출, 오른쪽 패널) 모식도이며, (B) 형광 소광 펩타이드를 Smurf-1 과발현 hMSC에 다양한 용량으로 처리한 결과이고(형광 이미지는 488nm에서 LAS3000으로 검출), (C) 형광 강도는 형광계로 정량화하였다. 데이터 표시: 평균 ± 평균의 표준 오차(* p-값 < 0.05, *** p-값 < 0.01).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 세포투과성 펩타이드를 이용하여 이와 결합된 펩타이드나 약물 등 비투과성 생리활성물질을 세포 내로 투과할 수 있도록 하는 세포 내 전달기법을 바탕으로, 염증을 포함한 질환의 진단에 있어서 보다 유용하게 적용할 수 있는 펩타이드 프로브에 관한 것이다.
도입시키고자 하는 펩타이드나 약물 등 비투과성 생리활성물질을 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 처리하여 세포 내로 빠르고 안전하게 투과되도록, 즉, 기존 세포 내 흡수방법인 엔도사이토시스(endocytosis) 과정 없이 직접 세포 내로 도입할 수 있도록 세포투과성 펩타이드를 화학적으로 결합시키고, 이 융합 펩타이드에 형광체 및 소광체를 표지한 펩타이드 프로브를 제조하고, 상기 프로브가 세포투과성 펩타이드에 의해 표적 세포에 투과된 후 생리활성 펩타이드가 바이오마커에 결합할 때만 소광체와 형광체가 거리가 멀어져 비로소 발광함으로써 저농도에서도 분자진단을 용이하게 할 수 있으므로, 표적 바이오마커를 발현하는 질환 등에 대한 진단에 유용함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 세포투과성 펩타이드 및 생리활성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드에 형광체 및 소광체가 결합된 바이오마커 검출용 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 "프로브"는 특정 바이오마커의 존재 유무를 확인하기 위한 펩타이드 또는 단백질 기반 프로브로서, 세포투과성 펩타이드에 의한 세포투과기능성을 가지며, 특정 바이오마커에 특이적으로 결합하는 생리활성 펩타이드를 포함하고, 형광체가 소광체의 결합에 의해 소광될 수 있는 거리 내에 형광체 및 소광체가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 “바이오마커”는 DNA, RNA, 대사 물질, 단백질 및 단백질 조각(protein fragments) 등에서 유래된 단일 분자 또는 분자들의 패턴을 근거로 한 분자적 정보로서, 생명체 내에서 유전적 또는 후생 유전적 변화의 영향으로 유발된 신체의 변화를 감지할 수 있도록 하는 지표이다.
본 명세서에서, 상기 “세포투과성 펩타이드”는 “세포투과성 도메인”, “단백질 수송 도메인(PTD)”과 상호 교환적으로 사용되며, 펩타이드, 약물 또는 약물함유입자를 세포의 세포질이나 핵 안으로 투과시킬 수 있는 투과기능성 펩타이드 등을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당, 다당류 또는 나노입자 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고, 이들 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 5~15개의 아미노산 서열로 구성되고, 아르기닌(R), 라이신(K) 및 히스티딘(H)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 함량비가 40~70%인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
H4S(서열번호 1: SSRKKNPNCRRH), H4Q(서열번호 2: QRARKKNKNCRRH), HBD-3P(서열번호 3: CSTRGRKCCRRKK), H2(서열번호 4: HKREKRQAKHKQRKR), H3(서열번호 5: KSKNKKKQRKGPHRK), H3B(서열번호 6: KPRPGRKDRRKK), H4-1(서열번호 7: RRRRAKRSPKHHS), H6(서열번호 8: SRRRQQSRNR), H8(서열번호 9: RAVRPLRRRQPKKS), H4C(서열번호 10: CSSRKKNPNCRRH), H5C(서열번호 11: CSSRKKNKNCPRRH) 및 H6C(서열번호 12: CSSRKKNPNCPRRH).
H4Q는 인간 골형성단백질(human BMP)-4 유래의 펩타이드이고, HBD-3P는 인간 유래 베타 디펜신(Human beta defensin)에서 유래한 펩타이드이며, H2는 인간 골형성단백질(human BMP)-2 유래, H3 및H3B는 인간 골형성단백질(human BMP)-3 유래, H4-1은 인간 골형성단백질(human BMP)-4 유래의 펩타이드를 일부 변형(modify)한 것이고, H6는 인간 골형성단백질(human BMP)-6 유래, H8은 인간 골형성단백질(human BMP)-8 유래의 펩타이드이다.
상기 세포투과성 펩타이드를 구성하는 아미노산은 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 세포막을 투과할 수 있다면 전술한 펩타이드 이외의 다른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체도 사용할 수 있다. 또한 이와 유사하게 기존의 비인간 유래 세포투과기능성 도메인, 예를 들어 TAT, 아르기닌 유래 펩타이드를 사용하여서도 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드-생리활성 펩타이드의 융합 펩타이드를 만들 수 있다. 다만 본 발명에서는 생체친화성을 부여하기 위해 인간유래의 펩타이드로 나열한 것이지 이것이 기존의 바이러스성, 비인간 유래 펩타이드에는 적용될 수 없음을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 "생리활성 펩타이드"는 “생리활성 단백질”, “생리활성 도메인”, “바이오마커 결합체”, “바이오마커 결합 서열” 등과 상호 교환적으로 사용되며, 특정 바이오마커에 특이적으로 결합하고, 항염기능성, 항미생물기능성, 항암기능성, 조직재생기능성 또는 골재생 유도성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드는 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
골분화, 골재생 유도서열인 서열번호 13(GAPPPADSAP), 서열번호 14(PPGY), 서열번호 15(PPAY) 및 항염기능성 서열인 서열번호 16(anti care peptide: TRGRKCCRRKK).
본 발명에 있어서, 세포투과성 펩타이드 및 생리활성 펩타이드의 융합 펩타이드는 화학적 합성으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 제조할 수 있으며, 세포 내 투과기능성을 가지는 단백질 수송 도메인(PTD)의 C 말단부에 골분화 유도 서열 또는 생리활성 도메인을 순차적으로 화학합성 되도록 하여, 'N 말단-단백질 수송 도메인-생리활성 도메인-C 말단'의 순서 또는 'N 말단-생리활성 도메인-단백질 수송도메인-C 말단의 순서'로 합성하여 융합 펩타이드를 제조할 수 있다. 생리활성 도메인은 질환의 바이오마커와 결합하는 작용을 하는 것이 주로 사용된다. 또한 약리활성 기능, 예컨데 골분화유도 작용뿐만 아니라 세포 내(In vitro) 혹은 생체 내(In vivo)에서 유전표현과 생리기능을 조정하는 물질로서 생체 내에서 기능 조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 바로잡아 주는 역할을 할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 형광체 및 소광체와 공유결합함으로써, 세포 및 생체 내 바이오마커 검출 및 질환 진단에 적용될 수 있으며, 이 때, 융합 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단부 등에 형광체 또는 소광체가 공유결합될 수 있으며, 바람직하게는 세포투과성 펩타이드 또는 생리활성 펩타이드의 말단부에 시스테인을 부가적으로 부착하여 공유결합될 수 있다.
또한, 상기 융합 펩타이드와 형광체 및 소광체의 복합체는 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시켜 만들 수 있다. 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시킬 경우, 세포투과성 펩타이드의 N 말단에 자유 아미노기를 지니고 있어 가교제에 의한 복합체 형성이 용이하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 가교제는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bis- maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl)butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히 형광염료 자체만을 표지하는 것은 비특이적인 형광발현에 의해 정확한 진단을 기하기 어려우므로, 생리활성도메인이 질환의 마커 단백질과 결합했을 때에만 형광을 내도록 설계하는 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 기법에 필수적인 소광체의 적용이 필수적이다.
본 발명에 있어서, 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 형광체(fluorescence dye)는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군에서 선택되며, 상기 소광체(quencher)는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher, BHQ), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 형광체는 FITC, 상기 소광체는 BHQ-1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 바이오마커 검출용 프로브를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 “진단(diagnosis)”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 상태를 정확하게 파악하는 것을 의미하며, 그 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다. 예를 들어, 특정 질병 또는 질환에 대한 대상의 상태는 특정 질병 또는 질환에 대한 감수성(susceptibility), 현재 대상이 앓고 있는 질환의 판정뿐만 아니라, 대상의 예후(prognosis), 질병 상태의 동정, 질병의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 감수성 및 반응성에 대한 예측과 같은 질환의 특성에 대한 확인, 특정 약물의 치료 효과를 확인하기 위해 대상의 상태를 확인하는 것과 같이 환자의 질병 및 상태에 따른 적절한 처치의 근거를 얻는 것, 나아가 특정 질병 또는 질환으로부터 완치된 대상에서의 재발여부의 예측 및 확인을 포함하는 광의의 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 골 질환, 섬유증, 치주염, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 생체재료 이식 염증반응, 천식, 피부염, 건선 및 암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골관절염, 골염, 골형성 부전증, 고칼슘혈증, 골연화증, 파젯병, 암에 의한 골 소실 및 골 괴사증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 바이오마커 검출용 프로브를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 대상에서 분리된 시료에 바이오마커 검출용 프로브를 처리하는 단계를 포함하는 염증성 질환 진단방법 및 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 발명의 관점에서, 설명되지 않은 용어의 정의 및 구현예들은 별도로 기재되지 않는 한 상기 염증성 질환 진단용 조성물의 관점에 기재된 것과 동일한 특징을 공유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 융합 펩타이드의 합성
N 말단으로부터 순서대로 LMP1에서 유래된 골분화 유도서열로서 GAPPPADSAP(서열번호 13), PTD로서 H4S(SSRKKNPNCRRH: 서열번호 1)를 함유는 융합 펩타이드를 펩타이드 합성장치를 이용하여 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다(도 1). 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9- Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink resin(0.075mmol/g, 100 ~ 200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50㎎의 Rink resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M amino acid 용액(용매: DMF), 1.0M DIPEA(용매: DMF&NMP), 0.5M HBTU(용매: DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 NMP로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다.
합성의 확인은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 resin은 THF나 DCM으로 건조시킨 후 TFA cleavage cocktail을 resin 1g당 20ml의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 후 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail 용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리했다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결건조하였다.
융합 펩타이드: NH2-GAPPPADSAP-SSRKKNPNCRRH-C-COONH2 (서열번호 17)
합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척과정을 거쳐 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리, 정제되었다. 정제된 펩타이드는 MALDI분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.
비교예 1: PTD로서 H4S(SSRKKNPNCRRH: 서열번호 1)
펩타이드 합성장치를 이용하여 상기 펩타이드를 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다.
비교예 2: LMP1으로부터 유래된 염증성 마커 결합 서열(GAPPPADSAP: 서열번호 13)
펩타이드 합성장치를 이용하여 상기 펩타이드를 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다.
실시예 2: 융합 펩타이드와 염증마커 Smurf1의 결합력 확인
실시예 1의 방법으로 합성된 융합 펩타이드와 Smurf1의 결합력을 화학적인 방법으로 확인하기 위해, 본 실험에서 리간드로 작용하는 인간유래 Smurf1 단백질을 Origene사(Rockville, MD, USA)에서 구매하였다. 상기 단백질 100mg/ml을 EDC/NHS kit(BIACORE AB, Sweden)를 이용하여 아미노기가 표면에 결합되어 있는 CM5 chip(BIACORE AB, Sweden)의 금으로 코팅된 면에 결합시켰다(상기 실험 방법은 본 발명자들이 사용한 BIACORE T100(BIACORE AB, Sweden) 소프트웨어에 내장되어 있는 ‘Immobilization'을 사용해도 무관하다). 이 때, 단백질이 CM5 chip의 아미노기와 결합할 수 있는 적합한 pH 조건을 찾기 위해 'pH scouting'이라 불리는 방법을 실시하여 하나의 pH 조건을 찾는다. 'pH scouting'의 실험 방법은 본 발명자들이 사용한 BIACORE T100(BIACORE AB, Sweden) 소프트웨어에 내장되어 있는 것을 사용해도 무관하다. 이와 같은 방법으로 도출된 pH 조건에서 리간드를 결합시킨 후에 분석물질(실시예 1에서 합성된 융합 펩타이드, 음성 대조군으로 사용하기 위한 비교예 1의 세포투과성 펩타이드 및 양성 대조군으로 사용하기 위한 비교예 2의 염증성 마커 결합 서열)을 각각 10mM씩 CM5 chip 위로 흘려주면서 결합력을 측정한다(상기 실험 방법은 본 발명자들이 사용한 BIACORE T100(BIACORE AB, Sweden) 소프트웨어에 내장되어 있는 ‘Binding analysis'를 사용해도 무관하다).
그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, Smurf1 단백질 서열 내 WW 도메인과 결합하는 부분이며, 골분화능을 가진 비교예 2는 Smurf1에 대한 결합력이 750RU(Resonance Unit; 결합력 측정 단위)를 나타내었고, 융합 펩타이드는 600RU, 음성대조군으로 사용된 비교예 1의 세포투과성 펩타이드는 100RU을 나타내었다(도 2B 내지 도 2G). 이는 융합 펩타이드가 골분화 유도 서열을 가지고 있으며 합성되는 과정에서 생리활성서열(생체 내에서 Smurf1과 결합하여 기능성을 나타낼 수 있는 부분)에 유의적인 손상이 가해지지 않았음을 보여주는 결과라 할 수 있다.
골관절염이나 다른 염증성 질환의 경우 조직의 유지나 재생을 방해하는 염증성 인자로서 Smurf1은 카운터 단백질인 SMAD와 강력하게 결합하여 결합한 후 해당 단백질을 분해하는 유비퀴틴화를 진행시켜 비가역적으로 세포의 재생을 방해한다. 본 발명자는 이러한 Smurf1이 과발현되어 있을수록 염증성 질환의 상태가 위중할 것으로 판단하였다.
LMP-1 유래 Smurf1결합 펩타이드(SBP), 세포투과성 SBP 융합 펩타이드(hBCPP-SBP) 및 세포투과 펩타이드(hBCPP)에 대한 겉보기 결합 상수(KA)는 1.036E로 계산되었다. +7(M-1), 1.237E+7(M-1) 및 4.129E+5(M-1). 따라서, 겉보기 해리상수(KD =1/KA)는 SBP, hBCPP-SBP 및 hBCPP에 대해 각각 96.6nM, 80.8nM 및 2422nM이었다. 대조적으로, 유비퀴틴화 처리에서 Smurf-1과 강력하게 결합하는 것으로 알려진 분자인 Smad-1의 겉보기 해리 상수는 298nM이다(표 1).
따라서, 결합 상수로부터 Smad-1보다 SBP와 Smurf-1 사이에 더 강력한 상호작용이 있다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서 LMP-1은 Smurf-1에 결합하기 위해 Smad1/5/8과 경쟁하여 유비퀴틴화의 표적화를 억제할 수 있다. 이러한 상대적으로 높은 친화력은 Smurf-1 상호작용이 생물학적 중요성을 가질 가능성을 높였다. 이러한 결과는 위의 결합 분석과 일치하며, 본 연구에서 확인된 hBCPP-SBP가 Smurf-1을 억제하기 위한 LMP의 중요한 도메인이고 발명자에 의해 인간 유래 세포투과 펩타이드(hBCPP)를 추가하여 추가로 활성화된다는 것을 보여준다.
또한, 이러한 기능은 세포투과 기능성 표적결합 펩타이드 프로브에 의한 유비퀴틴화가 조절될 수 있음도 제시하여 치료제로서의 가능성도 확인시켜 준다. 도 2에 나타난 바와 같이, Smurf1는 SMAD를 강하게 결합시켜, 유비퀴틴화함으로서 프로테아좀 분해를 유도하는데, Smurf1과 펩타이드 프로브가 결합함으로써 해당 분해과정이 저해되어 SMAD의 분해가 중지되는 것을 확인하였다.
실시예 3: Smurf-1이 과발현된 세포내에서의 융합 펩타이드 프로브에 의한 동시 영상화
FRET라고 불리는 소광 전략에 의해 생리활성 펩타이드(SBP) 서열과 Smurf-1 사이의 결합 상호작용을 조사하기 위해 융합 펩타이드를 활성화 가능한 형광 염료로 추가로 변형하였다. BHQ-1은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)의 형광을 더 높은 효율로 소멸시킬 수 있다. 본 연구에서는 두 개의 펩타이드(hBCPP와 SBP)의 형광이 형광염료와 BHQ가 가까워 불활성이었으나, Smurf-1 처리 후에는 형광활성이 나타났는데, 이는 BHQ가 Smurf-1과 SBP와의 결합에 의해 격리되었기 때문이다(도 3A). 형광 강도는 Smurf-1 농도에 비례하며, 이는 본 발명의 펩타이드 프로브가 염증 질환을 측정하는 데 유용하다는 것을 나타낸다(도 3B 및 도 3C). 이는 상대적으로 거대 분자인 스머프-1(Smurf-1)에 의한 펩타이드의 구조적 변화의 결과일 가능성이 높다. 다음 결과를 시험관 내에서 조사하기 위해 Smurf-1 발현 양성 세포인 인간 골육종(HOS)과 Smurf-1 발현 음성 세포인 마우스 섬유아세포(NIH3T3)에 대해 FRET 분석을 수행했다(도 3). 소광된(quenching, 퀜칭) hBCPP-SBP 프로브 처리된 HOS 세포는 형광 신호를 복원했지만 NIH3T3 세포에서는 그렇지 않았다. 한편, HOS와 NIH3T3 모두 세포투과 기능성 펩타이드가 연결되지 않은 채로는, 즉 표적결합 펩타이드 SBP 처리 세포는 SBP가 세포막 자체를 침투할 수 없기 때문에 형광을 나타내지 않았다. 또한 세포투과 기능성 펩타이드인 hBCPP는 Smurf-1과 결합하지 않기 때문에 이 펩타이드로 처리된 세포에서는 형광 신호의 회복이 관찰되지 않았다.
본 발명에 따른 진단법은 기존의 염색기반 조직학적 질환 진단 대비 비침습적이면서도 비교적 신속하게 질환, 예컨데 염증상황을 확인할 수 있어 다양한 염증성 질환의 진단이나 생체내 이식시 이식과 관련된 염증반응의 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 여러 단계를 거치지 않고 임상에 적용할 수 있고 대량 생산이 가능하여 이를 이용한 진단용 약물 전달 시스템 및 치료기술의 발전에 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (8)

  1. 세포투과성 펩타이드 및 생리활성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드에 형광체 및 소광체가 결합된 바이오마커 검출용 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 5~15개의 아미노산 서열로 구성되고, 아르기닌(R), 라이신(K) 및 히스티딘(H)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 함량비가 40~70%인 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출용 프로브.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출용 프로브.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드는 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출용 프로브.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오마커 검출용 프로브를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염증성 질환은 골 질환, 섬유증, 치주염, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 생체재료 이식 염증반응, 천식, 피부염, 건선 및 암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골관절염, 골염, 골형성 부전증, 고칼슘혈증, 골연화증, 파젯병, 암에 의한 골 소실 및 골 괴사증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오마커 검출용 프로브를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120026408A (ko) * 2010-09-09 2012-03-19 서울대학교산학협력단 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도
KR20120079299A (ko) * 2011-01-04 2012-07-12 한국과학기술연구원 Ａｔｇ4Ｂ 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서
WO2014056813A1 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell penetrating peptides which bind irf5
KR20180100523A (ko) * 2016-08-09 2018-09-11 주식회사 시선테라퓨틱스 세포투과성이 향상된 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120026408A (ko) * 2010-09-09 2012-03-19 서울대학교산학협력단 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도
KR20120079299A (ko) * 2011-01-04 2012-07-12 한국과학기술연구원 Ａｔｇ4Ｂ 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서
WO2014056813A1 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell penetrating peptides which bind irf5
KR20180100523A (ko) * 2016-08-09 2018-09-11 주식회사 시선테라퓨틱스 세포투과성이 향상된 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOARO ANDREIA, AGEITOS LUCíA, TORRES MARCELO, BARTOLONI FERNANDO HEERING, DE LA FUENTE-NUNEZ CESAR: "Light-Emitting Probes for Labeling Peptides", CELL REPORTS PHYSICAL SCIENCE, vol. 1, no. 12, 1 December 2020 (2020-12-01), pages 100257, XP093337840, ISSN: 2666-3864, DOI: 10.1016/j.xcrp.2020.100257 *
SUH JIN SOOK; LEE JUE YEON; LEE GENE; CHUNG CHONG PYOUNG; PARK YOON JEONG: "Simultaneous imaging and restoration of cell function using cell permeable peptide probe", BIOMATERIALS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 35, no. 24, 13 May 2014 (2014-05-13), AMSTERDAM, NL , pages 6287 - 6298, XP029030466, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2014.04.045 *

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