WO2025150751A1 - Nk 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포 및 이의 용도 - Google Patents

Nk 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포 및 이의 용도

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WO2025150751A1
WO2025150751A1 PCT/KR2024/021499 KR2024021499W WO2025150751A1 WO 2025150751 A1 WO2025150751 A1 WO 2025150751A1 KR 2024021499 W KR2024021499 W KR 2024021499W WO 2025150751 A1 WO2025150751 A1 WO 2025150751A1
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cell
culture
membrane
hla
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김현영
김진호
조유정
이미정
한병우
강진모
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Sungkyunkwan University
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Sungkyunkwan University
Samsung Life Public Welfare Foundation
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to culture auxiliary cells for activation and expansion of NK cells and their uses.
  • Natural killer cells are one of the cytotoxic lymphocytes that are important in innate immunity, and they mainly react to virus-infected cells or cancer cells. This response is influenced by signals generated by the interaction of various activating receptors and inhibitory receptors of NK cells with ligands of target cells.
  • Normal cells have ligands (e.g., MHC) for the inhibitory receptors of NK cells, which transmit inhibitory signals, thereby activating the defense mechanism against NK cells.
  • infected cells or abnormal cells have ligands for the activating receptors of NK cells, which transmit activation signals, and when the activation signals are strengthened by stimuli such as cytokines, the balance with the inhibitory signals is broken, and the NK cell attack begins.
  • NK cells secrete perforin to create holes in the cell membranes of infected cells or cancer cells, and release granzymes to activate apoptosis signals in cells, thereby inducing cell death.
  • NK cells which have the ability to directly recognize and destroy cancer cells, are currently undergoing various studies and clinical trials as one of the recent anticancer treatment strategies.
  • adaptive NK cells that respond to stimuli such as tumors or infections and remember the characteristics of conventional NK cells have recently begun to receive attention.
  • Adaptive NK cells show similar characteristics to memory cells, such as increased expression of NKG2C activating receptors after HCMV infection and long-term survival. Research is being conducted to apply these adaptive NK cells to anticancer treatment to complement the limitations of conventional NK cells.
  • the purpose of the present invention is to provide culture auxiliary cells for activating and amplifying NK cells.
  • the present invention aims to provide a composition for activating and amplifying NK cells including the above-mentioned culture auxiliary cells.
  • the antibody includes not only a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, but also a functional fragment of an antibody molecule.
  • the functional fragment of the antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and may be Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, etc.
  • the culture auxiliary cells may express human leukocyte antigen E (HLA-E) and membrane-bound anti-CD16 antibody (mbCD16).
  • HLA-E human leukocyte antigen E
  • mbCD16 membrane-bound anti-CD16 antibody
  • the culture auxiliary cells may express human leukocyte antigen E (HLA-E), membrane-bound interleukin-12 (mbIL-12), and membrane-bound interleukin-18 (mbIL-18).
  • HLA-E human leukocyte antigen E
  • mbIL-12 membrane-bound interleukin-12
  • mbIL-18 membrane-bound interleukin-18
  • the culture auxiliary cells may express human leukocyte antigen E (HLA-E), membrane-bound anti-CD16 antibody (mbCD16), membrane-bound interleukin-12 (mbIL-12), and membrane-bound interleukin-18 (mbIL-18).
  • HLA-E human leukocyte antigen E
  • mbCD16 membrane-bound anti-CD16 antibody
  • mbIL-12 membrane-bound interleukin-12
  • mbIL-18 membrane-bound interleukin-18
  • One aspect of the present invention provides a composition for activating and amplifying NK cells, including the culture auxiliary cells.
  • the NK cells in the present invention include NK cells without additional modification derived from any tissue source, and may include mature NK cells as well as NK progenitor cells.
  • the NK cells are activated in response to interferon or macrophage-derived cytokines, and contain two types of surface receptors that control the cytotoxic activity of the cells, which are labeled as activating receptors and inhibitory receptors.
  • the NK cells can be generated from hematopoietic cells, for example, hematopoietic stem or progenitor cells, from any source, for example, placental tissue, placental perfusate, umbilical cord blood, placental blood, peripheral blood, spleen, liver, and the like.
  • the cytokine of the present disclosure may be a naturally occurring cytokine or may be a mutated version of a naturally occurring cytokine.
  • Naturally occurring herein may also be referred to as wild type, and includes allelic variants.
  • the "mutated version of a naturally occurring cytokine” or “mutation” refers to specific mutations made to a naturally occurring sequence so as to alter the function, activity, and/or specificity of the cytokine. In one embodiment, the mutations may enhance or decrease the function, activity, and/or specificity of the cytokine.
  • the mutations may include deletions or additions of one or more amino acid residues of the cytokine.
  • the above cytokine may be at least one selected from the group consisting of BMP (Bone morphogenetic protein) family, CCL (Cheomkine ligands) family, CMTM (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member) family, CXCL (C-X-C motif ligand ligand) family, GDF (Growth/differentiation factor) family, growth hormone, IFN family, IL family, TNF family, GPI (glycophosphatidylinositol), SLUPR-1 (Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 1), SLUPR-2 (Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 2), and combinations thereof.
  • the composition may further comprise interleukin or a mutant thereof as a cytokine.
  • helper CD4 T lymphocytes as well as monocytes, macrophages, and endothelial cells, and can promote the development and differentiation of T and B lymphocytes and hematopoietic cells.
  • the interleukin may further include, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 and IL-36.
  • One aspect of the present invention provides a method for activating and amplifying NK cells, comprising the step of contacting NK cells with a composition for activating and amplifying NK cells comprising the cultured auxiliary cells or the cultured auxiliary cells.
  • the above sample may be a biological sample derived from an individual, for example, a mammal including a human.
  • the biological sample may be isolated from the individual, and may be, for example, but not limited to, blood, whole blood, serum, plasma, lymph, urine, feces, tissue, cells, organs, bone marrow, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or a combination thereof.
  • the NK cells may be derived from PBMCs, and the cultured feeder cells may be separately treated to inactivate proliferation.
  • the NK cells that have been co-cultured according to the present invention may be activated.
  • the activated NK cells may refer to cells in which cytotoxicity or the inherent immune-regulatory ability of NK cells is activated compared to parent cells, for example, hematopoietic cells, or NK progenitor cells.
  • the activated NK cells or the population enriched in activated NK cells can be assessed by detecting at least one or more functionally relevant markers, for example, CD16, CD57, CD69, CD94, CD161, CD158a, CD158b, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1,2B4, KIR (e.g., KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1) and the NKG2 family of activating receptors (e.g., NKG2A, NKG2C, NKG2D).
  • KIR e.g., KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1
  • NKG2 family of activating receptors e.g., NKG2A, NKG2C, NKG2D
  • the method for activating and amplifying NK cells according to the present invention may further include a step of recovering activated NK cells after the step of contacting the NK cells with cultured auxiliary cells or a composition for activating and amplifying NK cells containing the cultured auxiliary cells.
  • the recovery of the above NK cells may be performed using any cell recovery method known in the art without limitation.
  • One aspect of the present invention provides a method for examining the activity of NK cells, comprising the steps of: i) contacting NK cells with the culture auxiliary cells or the composition to activate NK cells; and ii) analyzing the degree of activation of the activated NK cells.
  • one aspect of the present invention provides a method for providing information for diagnosing an NK cell-related disease, comprising the steps of: i) activating NK cells by contacting the culture auxiliary cells or the composition to the NK cells; and ii) analyzing the degree of activation of the activated NK cells.
  • step i) above overlaps with the method for activating and amplifying NK cells described above, and the specific details of the culture auxiliary cells and composition are as described above.
  • the NK cells of step i) may exist together with other blood cells or lymphocytes, and may be stimulated after being separated from a blood sample, if necessary.
  • the separation step may be performed after stimulation, and in order to use only NK cells as lymphocytes, the stimulation may be performed after the separation step.
  • the degree of purification of the separated NK cells and the composition of the sample may vary to the extent necessary for the experiment, and are not particularly limited as known in the art.
  • the NK cells may be used as they are purified from the sample, if necessary, or may be used after being proliferated to secure conditions or cell amounts suitable for the experiment.
  • the step of isolating the NK cells may not be essential when using a combination of factors specific to NK cells in the method of the present invention.
  • the above step ii) is a process of measuring the degree of NK cell activation according to a method known in the art and comparing it with a normal control group.
  • the above degranulation activity may mean, for example, inducing lysis of target cells by secretion of perforin or granzyme, and this can be analyzed using FACS.
  • a method can be used in which CD107a expression, which is proportional to degranulation, is measured using a fluorochrome-conjugated antibody after stimulating PBMCs isolated from whole blood samples or pure isolated NK cells.
  • the cytotoxic activity can be measured, for example, by incubating a culture containing target cells capable of activating NK cells labeled with a europium fluorescent dye, and then measuring the amount of fluorescent dye released through target cell lysis using a microplate reader.
  • the cytokine secreted by the above NK cell stimulation may be at least one selected from the group consisting of IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , MIP1- ⁇ , MIP-1 ⁇ , PANTES, IL-8, and IL-10.
  • the analysis of the expression of the immune activator of the NK cell as described above can be performed using FACS, intracellular cytokine staining, ELISA, etc. Specifically, a method can be used in which the surface of the NK cell is stained using a specific antibody conjugated to fluorochrome, the cells are permeabilized, and the cytokines, etc. are stained with another specific immune activator (e.g., IFN- ⁇ ) antibody conjugated to fluorochrome to measure the expression of the immune activator in the NK cell.
  • another specific immune activator e.g., IFN- ⁇
  • step ii) the degree of activation of the activated NK cells may be compared with that of normal NK cells.
  • normal NK cells when normal NK cells are stimulated with the above-mentioned cultured feeder cells under conditions equivalent to those of the experimental group as a control group, if the activation phenomenon shown in the normal NK cells is significantly higher in the experimental group, or does not appear or the degree is significantly lower, it is judged as abnormal.
  • pathological signs of diseases related to abnormal NK cells, viral infection, the presence of cancer cells, and specific cancers can be judged, and the prognosis for the above diseases can be predicted.
  • the "normal NK cell” refers to an NK cell possessed by or derived from an individual who does not have a disease, and the individual who does not have the disease does not have at least a physical, genetic, or external condition known to affect NK cell activity.
  • the NK cell-related disease is one showing abnormal NK cell activity, and may be, for example, a hypersensitive immune disease, an autoimmune disease, an immune rejection reaction, an immunodeficiency disease, a histiocytosis, cancer, type 2 diabetes, a parasitic infection disease, and a viral disease.
  • the hypersensitive immune disease may be at least one selected from asthma and sinusitis, or the autoimmune disease may be at least one selected from lupus, multiple sclerosis, type 1 diabetes, and rheumatoid arthritis, or the histiocytosis may be at least one selected from HLH, XLP1, and XLP2.
  • Hemophagocytic lymphohistiocytosis may include group II Langerhans cell histiocytosis, erythrophagocytic lymphohistiocytosis (familial, sporadic), infection-associated hemophagocytic syndrome, virus-associated hemophagocytic syndrome, histiocytosis with massive lymphadenopathy, or reticulohistiocytosis.
  • the "cancer” may include a tumor, a hematological cancer or a solid cancer, which impairs the synergistic activity of NK cells of the subject or does not cause the synergistic activity of NK cells as target cells under certain conditions.
  • the cancer may be selected from the group consisting of lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, small intestine cancer, pancreatic cancer, melanoma, breast cancer, oral cancer, brain cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, cervical cancer, sarcoma, prostate cancer, urethral cancer, bladder cancer, testicular cancer, hematological cancer, lymphoma, skin cancer, psoriasis and fibroadenoma.
  • the cancer can be pancreatic cancer or B cell lymphoma.
  • the viral disease can be hepatitis B.
  • the immunodeficiency disease can be DiGeorge syndrome or Chediak-Higashi syndrome.
  • Information on the disease related to the above NK cell activity can be determined as an abnormal NK cell if no activation of the NK cells of the experimental group is detected compared to normal NK cells, or can be determined as the target cell being related to a specific disease if the NK cells that have lost activity for a specific receptor abnormally or do not cause activity for a target cell.
  • NK cells NK cells, cell therapy agents, pharmaceutical compositions, uses of NK cells, and methods for treating diseases
  • One aspect of the present invention provides NK cells manufactured by a method for activating and amplifying the NK cells.
  • one aspect of the present invention provides a cell therapy agent comprising the NK cell as an effective ingredient.
  • one aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising the NK cell as an effective ingredient.
  • one aspect of the present invention provides a use of said NK cells for the manufacture of a medicament.
  • one aspect of the present invention provides a disease treatment method for preventing or treating cancer or an infectious disease, comprising a step of administering the NK cells to a subject.
  • the NK cells may comprise NK cells or a population thereof.
  • Disease as used herein may mean a pathological condition, particularly cancer, an infectious disease, an inflammatory disease, a metabolic disease, an autoimmune disorder, a degenerative disease, a disease involving apoptosis, and graft rejection.
  • treatment refers to or includes the alleviation, inhibition of progression, or prevention of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof
  • active ingredient or “pharmaceutically effective amount” may mean any amount of the composition used in the course of practicing the invention provided herein that is sufficient to alleviate, inhibit progression, or prevent a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof.
  • administering may refer to placement of a composition according to one embodiment into a subject by a method or route that results in at least partial localization of the composition to a desired site.
  • Administration may be by any suitable route that delivers at least a portion of the cells or cellular components of the composition according to one embodiment to a desired location in a viable subject.
  • the survival period of the cells after administration to a subject may be as short as several hours, for example 24 hours, to several days, or as long as several years.
  • isolated cell as used in the present invention, such as “isolated immune cell”, means a cell that is substantially separated from the tissue from which the cell originates, such as a hematopoietic cell.
  • the method of administering the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may be administered parenterally, such as intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, by inhalation, or topical application, or may be administered orally, depending on the intended method.
  • the dosage may vary depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity.
  • the daily dosage refers to the amount of a therapeutic substance according to one aspect that is sufficient to treat the alleviated disease state by being administered to a subject requiring treatment.
  • the effective amount of a therapeutic substance varies depending on a specific compound, a disease state and its severity, and a subject requiring treatment, and this can be routinely determined by a person skilled in the art.
  • the dosage of the composition according to one aspect to a human body may vary depending on the patient's age, body weight, sex, administration form, health condition, and disease severity.
  • the dosage of the composition according to one aspect to a human body may vary depending on the patient's age, body weight, sex, administration form, health condition, and disease severity.
  • an adult patient weighing 70 kg for example, about 1,000 to 10,000 cells/time, 1,000 to 100,000 cells/time, 1,000 to 1,000,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000, 1,000 to 100,000,000 cells/time, 1,000 to 1,000,000,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000,000 cells/time, can be divided into administration once or several times a day at regular intervals, or can be administered multiple times at regular intervals.
  • subject means a subject requiring treatment of a disease, and more specifically, means a mammal such as a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, or cow.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive may include sterile water, saline solution, a conventional buffer (such as phosphoric acid, citric acid, or other organic acids), a stabilizer, a salt, an antioxidant (such as ascorbic acid), a surfactant, a suspending agent, an isotonic agent, or a preservative.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may include sterile water, saline solution, a conventional buffer (such as phosphoric acid, citric acid, or other organic acids), a stabilizer, a salt, an antioxidant (such as ascorbic acid), a surfactant, a suspending agent, an isotonic agent, or a preservative.
  • an organic substance such as a biopolymer, an inorganic substance such as hydroxyapatite, specifically, a collagen matrix, a polylactic acid polymer or copolymer, a polyethylene glycol polymer or copoly
  • the pharmaceutical composition may appropriately contain, depending on the administration method or formulation, a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an anti-adsorption agent, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, a soothing agent, a buffer, a reducing agent, an antioxidant, etc., if necessary.
  • a suspending agent e.g., a solubilizing agent, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an anti-adsorption agent, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, a soothing agent, a buffer, a reducing agent, an antioxidant, etc.
  • the pharmaceutical composition according to one specific example may be manufactured in a unit dose form or may be manufactured by introducing it into a multi-dose container by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of a powder, granules, tablets, or capsules.
  • the NK cell culture auxiliary cell stimulates NK cells by expressing at least one of mbCD16, mbIL-12 and mbIL-18 together with HLA-E, thereby increasing the activation and expansion of NK cells, and such NK cells can be used as a cell therapeutic agent and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or infectious diseases.
  • Figure 1 shows the HLA-E expression levels of K562 (K562-HLA-E) expressing HLA-E, K562 (K562-HLA-E UL40F) expressing HLA-E and UL40F, and K562 (K562-HLA-E UL40I) expressing HLA-E and UL40I as culture auxiliary cells according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the expression levels of mbCD16-1 or mbCD16-2 of K562 (K562-HLA-E-mbCD16-1) expressing HLA-E and mbCD16-1, and K562 (K562-HLA-E-mbCD16-2) expressing HLA-E and mbCD16-2, as culture auxiliary cells according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows the expression levels of mbCD16-1 or mbCD16-2 of K562 (K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1) expressing HLA-E and mbCD16-1, and K562 (K562-HLA-E UL40F-mbCD16-2) expressing HLA-E and mbCD16-2, as culture auxiliary cells according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows the expression levels of mbCD16-1 or mbCD16-2 of K562 (K562-HLA-E UL40I-mbCD16-1) expressing HLA-E and mbCD16-1, and K562 (K562-HLA-E UL40I-mbCD16-2) expressing HLA-E and mbCD16-2, as culture auxiliary cells according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the expression levels of mbIL-12 and mbIL-18 of K562 (K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1-mbIL12/18) expressing HLA-E, mbCD16-1, mbIL-12 and mbIL-18 as a culture auxiliary cell according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the level of gNK expression co-cultured with cultured auxiliary cells according to one embodiment of the present invention, with A and B using PBMCs from different donors.
  • Figure 7 shows the cell killing ability of gNK co-cultured with culture auxiliary cells according to one embodiment of the present invention.
  • K562 human myelogenous leukemia cell line
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS (heat-inactivated) (Gibco), 100 U/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Invitrogen) at 37°C in a humidified 5% CO 2 cell incubator.
  • K562 was then used to produce feeder cells.
  • K562 expressing HLA-E was produced, and the CMV peptide UL40F or UL40I was additionally expressed to promote the amplification of NK cells.
  • human HLA-E gene (SEQ ID NO: 1), UL40F (SEQ ID NO: 2), or UL40I (SEQ ID NO: 3) was cloned into the lentiviral vector pCDH-CMV-EF1-GFP to produce recombinant lentivirus vectors Vector_HLA-E (SEQ ID NO: 4), Vector_HLA-E-UL40F (SEQ ID NO: 5), and Vector_HLA-E-UL40I (SEQ ID NO: 6). Then, each of the constructed vectors was transfected into 293FT cells together with the packaging vector using lipofectamin3000 (Invitrogen) for virus production.
  • lipofectamin3000 Invitrogen
  • the medium was replaced with fresh medium, and the cells were cultured for 48 hours, and then the medium containing the virus was collected.
  • the recovered medium was centrifuged at 500 ⁇ g for 10 minutes, and only the pure medium containing the virus was separated using a 0.45 ⁇ m filter to produce HLA-E, HLA-E + UL40F, or HLA-E + UL40I expressing lentivirus.
  • 1 mL of each lentivirus was dissolved in 9 mL of medium containing K562, and the mixture was added together with polybrene (8 ⁇ g/ml), and cell culture was performed for 48 hours. Thereafter, infected cells were selected using flow cytometry (fluorescence-activated cell sorting, FACS).
  • NK cells and gNK were stained.
  • the purity of NK cells and gNK was confirmed by the expression of CD3-CD56+ and CD56+FcR ⁇ -/CD3-CD56+, respectively.
  • Fixation/Permeabilization Kit (BD, 554714) was used. After treating the cells with 100 ul of 1X Perm/Wash buffer containing 1 ul of Fc ⁇ RI ( ⁇ subunit-FITC) (Merck, FCABS400F), staining was performed in the dark at 4°C for 30 minutes. After washing with 1X Perm/Wash buffer, the supernatant was removed by centrifugation. After adding 200 ul of 1X Perm/Wash buffer to the cells, flow cytometry analysis was performed.
  • K562 expressing HLA-E was named 'K562-HLA-E'
  • K562 expressing UL40F or UL440I together with HLA-E was named 'K562-HLA-E UL40F' and 'K562-HLA-E UL40I', respectively.
  • lipofectamin3000 Invitrogen
  • the medium was replaced with fresh medium, and the cells were cultured for 48 hours, and then the medium containing the virus was collected.
  • the recovered medium was centrifuged at 500 xg for 10 minutes, and only the pure medium containing the virus was separated using a 0.45 ⁇ m filter to produce mbCD16-1 or mbCD16-2 expressing lentivirus.
  • 1 mL of each lentivirus was dissolved in 9 mL of the medium containing K562-HLA-E, K562-HLA-E UL40F, or K562-HLA-E UL40I produced in Example 1-1, and the mixture was added together with polybrene (8 ⁇ g/ml), and cell culture was performed for 48 hours.
  • K562 expressing HLA-E and mbCD16-1 were named 'K562-HLA-E-mbCD16-1', 'K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1', and 'K562-HLA-E UL40I-mbCD16-1'
  • K562 expressing HLA-E and mbCD16-2 were named 'K562-HLA-E-mbCD16-2', 'K562-HLA-E UL40F-mbCD16-2', and 'K562-HLA-E UL40I-mbCD16-2'.
  • gNK cells have reduced expression of receptors for cytokines IL-12 or IL-18, which may weaken their responsiveness to IL-12 or IL-18 during NK cell amplification. Therefore, in order to provide cytokine stimulation to supplement memory function during the amplification step, cultured feeder cells expressing membrane-bound forms of IL-12 and IL-18 (mbIL-12/18) together with HLA-E and mbCD16 were produced.
  • mbIL-12 (SEQ ID NO: 11) and mbIL-18 (SEQ ID NO: 12) were cloned into the lentiviral vector pCDH-CMV-EF1-GFP to produce a recombinant lentivirus vector, Vector_mbIL12/18 (SEQ ID NO: 13). Then, for virus production, the constructed vectors were transfected into 293FT cells together with the packaging vector using lipofectamin3000 (Invitrogen). After a period of time, the medium was replaced with fresh medium, and the cells were cultured for 48 hours. Then, the medium containing the viruses was collected.
  • the collected medium was centrifuged at 500 ⁇ g for 10 minutes, and only the pure medium containing the viruses was separated using a 0.45 ⁇ m filter to produce mbIL-12 and mbIL-18 expressing lentiviruses. Thereafter, 1 mL of the lentivirus was dissolved in 9 mL of the medium containing K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1 produced in Example 1-2, and the solution was added together with polybrene (8 ⁇ g/ml), and cell culture was performed for 48 hours. Thereafter, infected cells were selected using flow cytometry, and the expression of mbIL-12 and mbIL-18 in the selected cells was confirmed using RT-qPCR (Quantitative reverse transcription PCR) (Fig.
  • the cultured feeder cells were lysed to extract mRNA.
  • 1 mg of the extracted mRNA 1 mg was synthesized, and mbIL-12 and mbIL-18 were amplified using this as a template.
  • PCR was performed at 60°C for 30 cycles using the primers in Table 1 below.
  • Primer name Primer sequence (5'-3') Sequence number mbIL18_F GAA TGA CCA AGT TCT CTT CAT TGA CCA AG 14 mbIL18_R GTT CTC ACA GGA GAG AGT TGA AAT TTT CTC 15 mbIL12_F GAT GCC GTT CAC AAG CTC AAG 16 mbIL12_R GAA CGC AGA ATG TCA GGG AGA AGT AG 17
  • PBMCs Human peripheral blood mononuclear cells

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Abstract

본 발명은 NK 세포의 활성화 및 증폭을 위한 배양보조세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 NK 세포의 배양보조세포는 HLA-E와 함께 mbCD16, mbIL-12 및 mbIL-18 중 하나 이상을 발현함으로써 NK 세포를 자극하여 NK 세포의 활성화 및 증폭을 증대시키며, 이러한 NK 세포는 세포 치료제 및 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있다.

Description

NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포 및 이의 용도
본 발명은 NK 세포의 활성화 및 증폭을 위한 배양보조세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
NK 세포(Natural killer cell)는 선천적 면역에 중요한 세포독성 림프구 중 하나로, 주로 바이러스 감염된 세포나 암세포에 반응한다. 이러한 반응은 NK 세포의 다양한 활성화 수용체(activating receptor)와 억제성 수용체(inhibitory receptor)가 대상 세포가 가진 리간드(ligand)와의 상호작용에 의한 시그널(signal)에 의해 좌우된다. 정상 세포는 NK 세포의 억제성 수용체에 대한 리간드 (예컨대, MHC)를 가지고 있어 억제 시그널을 전달하므로 NK 세포에 대한 방어 메커니즘이 작동된다. 반면 감염된 세포나 비정상적인 세포에는 NK 세포의 활성화 수용체에 대한 리간드가 존재하여 활성 시그널이 전달되고, 사이토카인 등의 자극에 의해 활성 시그널이 강화되어 억제 시그널과의 균형이 깨지면서 NK 세포의 공격이 시작된다. NK 세포는 퍼포린(perforin)을 분비해 감염 세포나 암세포의 세포막에 구멍을 내고, 그랜자임(granzyme)을 방출하여 세포들의 세포자멸(apoptosis) 신호를 활성화시켜 세포의 죽음을 유도한다.
이와 같이 암세포를 직접 인식하고 파괴하는 능력을 가진 NK 세포는 최근 항암 치료 전략 중 하나로 다양한 연구와 임상시험이 진행되고 있다. 특히, 최근에는 일반적인 NK 세포(conventional NK cell)의 특성뿐만 아니라 종양이나 감염과 같은 자극에 반응하여 기억하는 적응형 NK 세포(adaptive NK cell)가 주목을 받기 시작하였다. 적응형 NK 세포는 HCMV 감염 후 NKG2C 활성 수용체의 발현이 증가되며, 장기간 생존하는 등 기억 세포와 유사한 특성을 보여주고 있다. 이러한 적응형 NK 세포를 활용하여 일반 NK 세포의 한계점을 보완하고자 항암 치료에 적용하는 연구가 진행되고 있다.
적응형 NK 세포의 임상적 의의가 강조되고 있지만, 특히 이 세포들의 증폭력을 보여주는 연구 (Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 9426)가 있음에도, 적응형 NK의 특징인 FcεRIγ 감소 및 ADCC 효능 증가 면에서 아직 부족한 상태이다. 따라서 적응형 NK 세포를 항암 치료에 효과적으로 사용하기 위해서는 adaptive 특성을 최대한 활용할 수 있도록 적응형 NK 세포의 충분한 세포 양을 확보하는데 중점을 두는 선택적 증폭 기술을 개발하는 것이 필요하다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국 등록특허공보 제10-1525199호
미국 등록특허공보 제10,995,317호
본 발명은 NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배양보조세포를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배양보조세포 또는 조성물을 이용한 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배양보조세포 또는 조성물을 이용한 NK 세포의 활성도 검사 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배양보조세포 또는 조성물을 이용한 NK 세포 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법으로 제조된 NK 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포를 이용한 암 또는 감염성 질환의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포
본 발명의 일 양상은 인간 백혈구 항원 E(human leukocyte antigen E); 및 막 결합성 항-CD16 항체(membrane bound anti-CD16 antibody), 막 결합성 인터루킨-12(membrane bound interleukin-12) 및 막 결합성 인터루킨-18(membrane bound interleukin-18)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포를 제공한다.
본 발명에 사용된 "배양보조세포(feeder cell)"는 유사분열을 하지 못하지만 대사활성이 있기 때문에 여러 대사물질을 생산하여 목적 세포의 증식을 돕는 세포를 의미하며, 분열 비활성화를 위해 미토마이신 C(mitomycin C)를 처리하거나 X선, γ선 등 방사선을 조사하여 사용된다. 본 발명에서의 배양보조세포는 NK 세포의 활성화 및 증폭을 위한 것으로, 당업계에 공지된 동물 유래 세포라면 제한 없이 사용 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 K562, RPMI8866, ARH77, EBV_LCL, 721.221 및 HFWT로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일반적으로, NK 세포 증식에 사용되는 대표적인 영양보조세포인 K562 세포주는 NK 세포의 증식을 위해 사용될 뿐이므로 K562 세포주 자체가 증식해서는 안 된다. 따라서, NK 세포와 배양하기 전, 상기 K562 세포주에 강력한 방사선 (예를 들어, 50 ~ 100 Gy)의 조사를 통한 전처리를 수행하여 상기 K562 세포주 자체는 전혀 증식하지 않고, NK 세포의 증식만을 돕도록 한다. 한편, NK 세포의 효율적인 증식을 위해서는 IL-2, IL-15 등과 같은 대부분의 사이토카인이 NK 세포에 지속적으로 노출되어야 한다. 따라서, 암 세포주 기반 영양보조세포에 IL-2 및/또는 IL-15 등과 같은 사이토카인을 발현하도록 유전적으로 조작하는 경우, 방사선 조사 등으로 전처리한 암 세포주 자체가 배양 과정에서 장시간 생존할 수 없는 바 NK 세포의 선택적 증식 효율이 떨어진다는 문제점이 있다. 그러나, 본 발명에 따른 NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포는 인간 백혈구 항원을 발현하도록 유전적으로 조작함으로써 NK 세포를 선택적이고, 보다 효율적으로 획득할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NK 세포는 적응형 NK 세포인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "NK 세포 또는 자연살해세포(natural killer cell)"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. NK 세포에서는 CD16 (FcγRIII)이 특이한 표면 단백질이며, CD56도 주된 표면 단백질이다. 하지만 T 세포에서 발현되는 CD3는 결여되어 있다.
본 명세서에서 사용된 "적응형 NK 세포(adaptive NK cell)"는 면역학적 기억(immunological memory)을 형성할 수 있는 특수화된 NK 세포로서, 적응면역체계에 관여한다. 또한, 상기 적응형 NK 세포는 항원 특이성을 가지고 있지 않으며, NK 세포들 중 체내에서 보다 오래 생존하고, 항체의존세포매개 세포독성작용(Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 등이 더 강한 세포 아형(subgroup)이다. 일례로, 상기 NK 세포 또는 적응형 NK 세포는 NKG2C+ NK 세포, FcεRγ- NK 세포 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 "인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)"은 사람의 유핵세포 표면에 발현되는 세포막 당단백 분자로, T 림프구에 항원을 제시하여 침입한 항원에 대하여 적응면역(adaptive immune)을 유발시키고 또한 NK 세포에 의한 사멸작용으로부터 정상세포를 보호한다. 상기 HLA로는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 등일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 인간 백혈구 항원 E(human leukocyte antigen E) 또는 HLA-E는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 HLA-E는 서열번호 1의 핵산 서열 또는 그의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포는 유전자 조작을 통해 세포막에서 HLA-E와 함께 막 결합성 항-CD16 항체, 막 결합성 IL-12 및 막 결합성 IL-18 중 하나 이상을 발현하는, 유전적으로 조작된 세포 또는 세포주이다. 여기서 "유전자 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"이란 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 의미한다.
구체적으로, 상기 배양보조세포는 HLA-E; 및 막 결합성 항-CD16 항체, 막 결합성 IL-12 및 막 결합성 IL-18로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 암호화하는 외인성 유전자(exogenous gene)를 포함하는 것일 수 있다. 여기서 "외인성(exogenous)"은 언급된 분자(referenced molecule) 또는 언급된 활성(referenced activity)이 숙주세포로 도입된 것을 의미한다. 상기 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산(encoding nucleic acid)의 숙주 유전물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원(source)은 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성(homologous) 또는 이질성(heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 반대로, "내인성(endogenous)"은 상기 숙주세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 상기 "이질성(heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고, 상기 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성(heterologous) 또는 동질성(homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 HLA-E; 및 막 결합성 항-CD16 항체, 막 결합성 IL-12 및 막 결합성 IL-18로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 HLA-E; 및 막 결합성 항-CD16 항체, 막 결합성 IL-12 및 막 결합성 IL-18로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 벡터(vector)는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 숙주세포 내에서 안정적으로 상기 목적 단백질 또는 이들의 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선별 마커(selection marker)를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 백시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 목적 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 발명에서 사용된 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또한, 본 발명에서 사용된 "막 결합성 항-CD16 항체(membrane bound anti-CD16 antibody, mbCD16)"은 세포막에 결합된 항-CD16 항체를 의미하는 것으로, 세포 외로 분비되는 항-CD16 항체와 구분되는 의미일 수 있다.
본 발명이 일 구체예에 따르면, 상기 막 결합성 항-CD16 항체는 단클론항체, 다클론항체, 재조합 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 항-CD16 항체는 항원, 즉 CD16과 특이적으로 결합하여 반응성을 갖는 구조 및 기능을 갖는 항체 또는 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 여기서 "항체(antibody)"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서는 각 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론항체, 다클론항체, 전체 길이의 사슬 구조를 가진 항체(전장 항체, full-length antibody) 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 여기서 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
본 발명에 따른 막 결합성 항-CD16 항체는 하나의 항원결정기(antigenic determinant 또는 epitope)에만 결합하는 단일 친화력을 가진 단클론항체인 것이 바람직하다.
상기 막 결합성 항-CD16 항체는 단클론항체 클론으로 eBioCB16 (CB16), 3G8, B73.1, MEM-154 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단클론항체는 CB16, 3G8, B73.1 및 MEM-154로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
이러한 단클론항체들은 각자 결합하는 항원결정기가 일부 중복되거나 서로 상이할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "막 결합성 인터루킨(membrane bound interleukin, mbIL)"은 세포막에 결합된 인터루킨을 의미하는 것으로, 세포 외로 분비되는 인터루킨과 구분되는 의미일 수 있다. mbIL-12는 서열번호 11의 핵산 서열 또는 그의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다. mbIL-18은 서열번호 12의 핵산 서열 또는 그의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 인간 백혈구 항원 E(HLA-E) 및 막 결합성 항-CD16 항체(mbCD16)를 발현하는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 인간 백혈구 항원 E(HLA-E), 막 결합성 인터루킨-12(mbIL-12) 및 막 결합성 인터루킨-18(mbIL-18)을 발현하는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 인간 백혈구 항원 E(HLA-E), 막 결합성 항-CD16 항체(mbCD16), 막 결합성 인터루킨-12(mbIL-12) 및 막 결합성 인터루킨-18(mbIL-18)을 발현하는 것일 수 있다.
NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물
본 발명의 일 양상은 상기 배양보조세포를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물을 제공한다.
상기 배양보조세포의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물은 HLA-E와 함께 막 결합성 항-CD16 항체, 막 결합성 IL-12 및 막 결합성 IL-18로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 배양보조세포를 포함함으로써 NK 세포의 증폭 및/또는 활성화를 유도할 수 있어 NK 세포의 배양, 분리, 또는 증식 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서의 NK 세포는 임의의 조직 공급원(source)으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 NK 세포를 포함하고, 성숙한 NK 세포뿐 아니라 NK 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 NK 세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 활성화 수용체 및 억제성 수용체로 표지되는 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다. 상기 NK 세포는 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 NK 세포의 활성화를 위한 사이토카인을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "사이토카인(cytokine)"은 세포 신호전달의 역할을 하는 단백질 (5 ~ 20 kDa)을 의미하며, 세포에 의해 방출되고 사이토카인을 방출하는 세포들 및/또는 다른 세포들의 거동에 영향을 준다. 상기 사이토카인은 기능적으로 분류할 수 있으며, 그 예로는 인터루킨(interleukin, IL), 림포카인(limphokine), 모노카인(monokine), 케모카인(chemokine), 인터페론(interferon, IFN), 조혈인자(hematopoietic factor), 세포증식인자(growth factor), 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 슈퍼패밀리, 아디포카인(adipokine) 및 신경영양인자(neurotrophic factor) 등이 있다. 상기 사이토카인은 면역세포들, 가령, 대식세포, B 림프구들, T 림프구들, 비만세포 및 단핵구, 내피세포, 섬유모세포 및 간질세포들을 비롯한 광범위한 세포들에 의해 생성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사이토카인은 하나 이상의 유형의 세포에 의해 생성될 수 있다. 상기 사이토카인은 수용체들을 통해 작용하며 면역계에서 특히 중요하고, 체액성 및 세포계 면역 반응들 사이의 균형을 조절하며, 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성(responsiveness)을 조절한다.
본 명세서의 사이토카인은 자연 발생 사이토카인일 수 있거나 또는 자연 발생 사이토카인의 돌연변이 버전일 수 있다. 여기서 "자연 발생"은 또한 야생형으로도 지칭될 수 있으며, 대립유전자 변종들을 포함한다. 상기 "자연 발생 사이토카인의 돌연변이된 버전" 또는 "돌연변이"는 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 변화시키기 위하여 자연 발생 서열에 대해 이루어진 특정 돌연변이들을 지칭한다. 일례로, 돌연변이들은 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 향상시키거나 감소시킬 수 있다. 돌연변이는 사이토카인의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
상기 사이토카인은 BMP(Bone morphogenetic protein) 패밀리, CCL(Cheomkine ligands) 패밀리, CMTM(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member) 패밀리, CXCL(C-X-C motif ligand ligand) 패밀리, GDF(Growth/differentiation factor) 패밀리, 성장 호르몬, IFN 패밀리, IL 패밀리, TNF 패밀리, GPI(glycophosphatidylinositol), SLUPR-1(Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 1), SLUPR-2(Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 사이토카인으로서 인터루킨 또는 이의 돌연변이를 더 포함하는 것일 수 있다.
다수의 인터루킨들은 보조 CD4 T 림프구들뿐만 아니라 단핵구, 대식세포, 및 내피 세포에 의해 합성되며, T 및 B 림프구들 및 조혈세포들의 발달 및 분화를 촉진시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 인터루킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
NK 세포의 활성화 및 증폭 방법
본 발명의 일 양상은 NK 세포에 상기 배양보조세포 또는 상기 배양보조세포를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법을 제공한다.
상기 배양보조세포 및 상기 배양보조세포를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법에서는 개체로부터 NK 세포를 포함하는 시료를 얻은 후 NK 세포 또는 이들의 집단(population)과 상기 배양보조세포 또는 상기 조성물에 포함된 배양보조세포를 혼합 배양 (공배양)하여 NK 세포의 서브 집단(subpopulation)을 자극, 활성화 또는 증폭(expanding)시키는 과정이다.
상기 시료는 개체, 예를 들면, 인간을 포함한 포유류 등으로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있으며, 예를 들어 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NK 세포는 혈액 시료에서 분리된 것일 수 있으며, 일례로 전혈인 것일 수 있다.
상기 전혈은 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 정제된 NK 세포, 일차성 휴지기의 세포(primary resting cell) (즉, 혈액에서 바로 분리한) 등을 포함한다.
본 발명에서 사용된 "NK 세포의 자극"은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 NK 세포의 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 증가시키거나, 활성화된 NK 세포가 생성, 증가, 증폭 또는 증식되는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단계는 NK 세포와 배양보조세포를 공배양하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 NK 세포는 PBMC에서 유래된 것일 수 있으며, 배양보조세포는 분열 증식의 비활성화를 위해 별도의 처리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양보조세포는 50 Gy 내지 300 Gy로 방사선 조사된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 공배양은 1 X 106의 NK 세포 당 0.1 내지 10 X 106의 배양보조세포를 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 공배양은 사이토카인의 존재 하에서 수행되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 사이토카인은 인터루킨 또는 이의 돌연변이일 수 있으며, 인터루킨으로서 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
일례로, 공배양에 첨가되는 사이토카인은 IL-2 및 IL-15일 수 있다. 상세하게는, 상기 공배양은 IL-2의 존재 하에서 배양하면서, IL-15을 배양 배지에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 IL-2는 1 내지 500 U/mL, 1 내지 400 U/mL, 1 내지 300 U/mL, 1 내지 200 U/mL, 1 내지 100 U/mL, 1 내지 50 U/mL, 또는 5 내지 30 U/mL의 농도로 사용될 수 있다. 상기 IL-15는 1 내지 50 ng/mL, 1 내지 40 ng/mL, 1 내지 30 ng/mL, 1 내지 20 ng/mL, 또는 1 내지 10 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 공배양은 2일 내지 30일 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 공배양이 완료된 NK 세포는 활성화된 상태일 수 있다. 활성화된 NK 세포는 모세포, 예를 들면, 조혈 세포, 또는 NK 전구세포에 비해 세포 독성, 또는 NK 세포의 본연의 면역 조절능이 활성화된 세포를 의미할 수 있다. 상기 활성화된 NK 세포 또는 활성화된 NK 세포가 풍부한(enriched) 집단은 적어도 하나 이상의 기능적으로 관련된 마커, 예를 들어 CD16, CD57, CD69, CD94, CD161, CD158a, CD158b, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1,2B4, KIR (예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1) 및 활성화 수용체의 NKG2 패밀리 (예를 들어, NKG2A, NKG2C, NKG2D)를 검출함으로써 평가될 수 있다.
본 발명에 따른 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법은 상기 NK 세포에 배양보조세포 또는 상기 배양보조세포를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물을 접촉시키는 단계 이후, 활성화된 NK 세포를 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 NK 세포의 회수는 당업계에 공지된 세포 회수 방법을 제한 없이 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
NK 세포의 활성도 검사 방법, 및 NK 세포 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법
본 발명의 일 양상은 i) NK 세포에 상기 배양보조세포 또는 상기 조성물을 접촉시켜 NK 세포를 활성화시키는 단계; 및 ii) 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 분석하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 i) NK 세포에 상기 배양보조세포 또는 상기 조성물을 접촉시켜 NK 세포를 활성화시키는 단계; 및 ii) 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 분석하는 단계를 포함하는 NK 세포 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 i) 단계에 대한 설명은 전술한 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법과 중복되며, 상기 배양보조세포 및 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 NK 세포의 활성도 검사 방법에서, 상기 i) 단계의 NK 세포는 다른 혈구 또는 림프구와 함께 존재할 수 있으며, 필요에 따라 혈액 시료로부터 분리되는 단계를 거친 후 자극될 수 있다. 예를 들면, NK 세포가 다른 혈구 또는 림프구와 함께 존재하는 경우에는 자극 후 분리 단계가 이루어질 수 있고, 림프구로서 NK 세포만을 사용하기 위해서는 분리 단계가 이루어진 후 자극이 이루어질 수 있다. 분리된 NK 세포의 정제도 및 그 시료의 구성은 실험에 필요한 정도로 다양할 수 있으며, 당업계에 공지된 바에 따라 특별히 제한되지 않는다. NK 세포는 필요에 따라 시료에서 정제된 그대로를 사용할 수 있고, 실험에 적합한 조건 또는 세포량을 확보하기 위하여 증식시킨 후 사용할 수 있다.
그러나, 특정 인자의 조합의 경우에는 NK 세포에 특이적이므로, 본 발명의 방법에서 상기 NK 세포에 특이적인 인자의 조합을 이용하는 경우에는 상기 NK 세포를 분리하는 단계는 필수적이지 않을 수 있다.
상기 ii) 단계는 당업계에 공지된 방법에 따라 NK 세포의 활성화 정도를 측정하여 정상 대조군과 비교하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ii) 단계의 NK 세포의 활성화 정도는 탈과립화(degranulation) 활성, 세포독성(cytotoxicity) 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 측정되는 것일 수 있다.
상기 탈과립화 활성은 예를 들어, 퍼포린(perforin) 또는 그랜자임(granzyme) 분비로 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 의미할 수 있고, 이를 FACS를 이용해 분석할 수 있다. 구체적으로, 전혈 시료에서 분리한 PBMC 혹은 순수 분리된 NK 세포를 자극한 후 탈과립화와 비례하는 CD107a 발현을 플루오로크롬-접합된 항체를 이용하여 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 세포독성 활성은 예를 들어, 유로피움(europium) 형광 염료로 표지된 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 표적 세포를 포함하는 배양물과 배양한 후 표적 세포 용해를 통해 배출된 형광 염료의 양을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 NK 세포 자극에 의해 분비된 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, TNF-β, MIP1-α, MIP-1β, PANTES, IL-8 및 IL-10로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기와 같은 NK 세포의 면역활성인자 발현 분석은 FACS, 세포 내 시토킨 염색 또는 ELISA 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 구체적으로 플루오로크롬-접합된 특정 항체를 이용하여 NK 세포 표면을 염색한 후 세포를 투과성화(permeabilization)하고 플로오로크롬-접합된 다른 특정 면역활성인자 (예를 들어, IFN-γ) 항체로 상기 사이토카인 등을 염색하여 NK 세포 내의 면역활성인자의 발현을 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ii) 단계에서는 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 정상 NK 세포와 비교하는 것일 수 있다.
구체적으로, 정상적인 NK 세포를 대조군으로 실험군과 동등한 조건에서 상기 언급된 배양보조세포로 자극하였을 때, 정상적인 NK 세포에서 나타나는 활성화 현상이 실험군에서 현저하게 높거나, 나타나지 않거나 그 정도가 현저하게 적은 경우 비정상으로 판단한다. 이러한 비교에 의하여 비정상적인 NK 세포와 관련한 질환의 병리학적 징후, 바이러스 감염, 암 세포의 존재, 및 특정 암을 판단하고 상기 질병들에 대해 예후를 예측할 수 있다. 상기 "정상 NK 세포"는 질병을 갖지 않는 개체가 갖는 또는 그러한 개체로부터 유래된 NK 세포를 말하며, 상기 질병을 갖지 않는 개체는 적어도 NK 세포 활성에 영향을 미치는 것이라 알려진 신체적, 유전적, 또는 외래적 조건을 갖지 않는다.
본 발명의 NK 세포 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법에서, 상기 NK 세포 관련 질환은 비정상적인 NK 세포의 활성도를 보이는 것으로서, 예를 들어, 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역거부반응, 면역결핍질환, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 질환일 수 있다. 상기 과민성 면역질환은 천식 및 축농증 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 상기 자가면역질환은 루푸스, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병 및 류마티스 관절염 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 또는 상기 조직구증은 HLH, XLP1, 및 XLP2에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 혈구탐식성 림프조직구증(HLH)은 제 2군 랑게르한스 세포 조직구증, 적혈구탐식성 림프조직구증식증 (가족성, 산발성), 감염연관성 혈구탐식증후군, 바이러스연관성 혈구탐식증후군, 거대한 림프절병증을 동반한 조직구증, 또는 망상조직구증의 의미를 포함할 수 있다. 상기 "암"은 종양, 혈액암 또는 고형암을 포함하는 의미로서 개체의 NK 세포의 시너지 활성을 손상시키거나 또는 특정 조건에서 표적 세포로서 NK 세포의 시너지 활성을 일으키지 않는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 췌장암 또는 B 세포 림프종(B cell lymphoma)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 면역결핍질환은 디조지증후군(DiGeorge synderome) 또는 체디악히가시증후군(Chedial-Higashi syndrome)일 수 있다.
상기 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보는 정상 NK 세포 대비 실험군 NK 세포의 활성화가 검출되지 않는 경우 비정상적인 NK 세포로 판단할 수 있고, 또는 특정 수용체에 대해 활성을 상실한 NK 세포가 표적 세포에 대해 비정상적으로 활성을 일으키거나 일으키지 않는 경우 상기 표적 세포가 특정한 질병과 관련이 있음을 판단할 수 있다.
NK 세포, 세포치료제, 약학적 조성물, NK 세포의 용도, 및 질환 치료 방법
본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법으로 제조된 NK 세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포를 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NK 세포를 개체 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NK 세포는 NK 세포 또는 이들의 집단을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "질환"은 하나의 병리적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역성 장애, 퇴행성 질환, 세포사멸 관련 질환 및 이식편 거부를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 또는 그를 포함하며, "유효 성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증 상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "분리된 세포", 예컨대, "분리된 면역세포" 등은 세포가 기원하는 조직, 예컨대, 조혈 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다.
일 구체예에 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000 ~ 10,000 세포/회, 1,000 ~ 100,000 세포/회, 1,000 ~ 1000,000 세포/회, 1,000 ~ 10,000,000, 1,000 ~ 100,000,000 세포/회, 1,000 ~ 1,000,000,000 세포/회, 1,000 ~ 10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "개체"는 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제 (인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제 (아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는 면역세포, 면역세포, 또는 그의 활성을 증가시키는 물질은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활 성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 NK 세포의 배양보조세포는 HLA-E와 함께 mbCD16, mbIL-12 및 mbIL-18 중 하나 이상을 발현함으로써 NK 세포를 자극하여 NK 세포의 활성화 및 증폭을 증대시키며, 이러한 NK 세포는 세포 치료제 및 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포로서 HLA-E를 발현하는 K562 (K562-HLA-E), HLA-E 및 UL40F를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40F), 그리고 HLA-E 및 UL40I를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40I)의 HLA-E 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포로서 HLA-E 및 mbCD16-1를 발현하는 K562 (K562-HLA-E-mbCD16-1), 그리고 HLA-E 및 mbCD16-2를 발현하는 K562 (K562-HLA-E-mbCD16-2)의 mbCD16-1 또는 mbCD16-2 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포로서 HLA-E 및 mbCD16-1를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1), 그리고 HLA-E 및 mbCD16-2를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40F-mbCD16-2)의 mbCD16-1 또는 mbCD16-2 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포로서 HLA-E 및 mbCD16-1를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40I-mbCD16-1), 그리고 HLA-E 및 mbCD16-2를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40I-mbCD16-2)의 mbCD16-1 또는 mbCD16-2 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포로서 HLA-E, mbCD16-1, mbIL-12 및 mbIL-18를 발현하는 K562 (K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1-mbIL12/18)의 mbIL-12 및 mbIL-18 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포와 공배양된 gNK 발현 수준을 나타낸 것으로, A와 B는 서로 다른 기증자의 PBMC를 사용한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양보조세포와 공배양된 gNK의 세포 사멸능을 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 배양보조세포 제작
K562 (인간 골수성 백혈병 세포주, human myelogenous leukemia cell line)는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 수득하였다. 상기 세포는 가습된 5% CO2 세포배양기에서 37℃에서 10% FBS (heat-inactivated) (Gibco), 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL (Invitrogen)가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 이후 K562를 사용하여 배양보조세포를 제작하였다.
1-1. HLA-E 발현 배양보조세포 제작
HLA-E를 발현하는 K562를 제작하였으며, NK 세포의 증폭을 촉진시키기 위해 CMV peptide인 UL40F 또는 UL40I를 추가로 발현시켰다.
먼저, 인간 유래 HLA-E 유전자 (서열번호 1), UL40F (서열번호 2) 또는 UL40I (서열번호 3)를 렌티바이러스 벡터인 pCDH-CMV-EF1-GFP에 클로닝하여 재조합 렌티바이러스 생산용 벡터 Vector_HLA-E (서열번호 4), Vector_HLA-E-UL40F (서열번호 5) 및 Vector_HLA-E-UL40I (서열번호 6)를 제작하였다. 이후, 바이러스 생산을 위해 상기 제작된 각각의 벡터를 293FT 세포에 패키징 벡터와 함께 lipofectamin3000 (Invitrogen)을 이용하여 형질주입 시켰다. 시간이 지난 뒤, 새로운 배지로 교환하여 48 시간 동안 세포를 배양 한 후, 바이러스가 함유된 배지를 회수하였다. 회수된 배지는 500 xg에서 10 분간 원심분리하고, 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 바이러스가 함유된 순수한 배지만을 분리하여 HLA-E, HLA-E + UL40F 또는 HLA-E + UL40I 발현 렌티바이러스를 생산하였다. 이후, K562를 포함하는 배지 9 mL에 상기 각각의 렌티바이러스 1 mL를 녹여 폴리브렌(polybrene) (8 ㎍/ml)과 함께 첨가하여, 48 시간 동안 세포 배양을 진행하였다. 이후, 유세포분석(fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 이용하여 감염된 세포를 선별하였다.
유세포분석을 위하여 세포 표면 단백질 및 세포내 단백질을 염색하였다. NK 세포 및 gNK는 각각 CD3-CD56+ 및 CD56+FcRγ-/CD3-CD56+의 발현으로 순도를 확인하였다.
먼저 세포 표면 단백질 염색에서는 약 1 X 106의 세포를 96웰-U bottom 플레이트에 옮겨, 원심분리하여 세포만 남기고 상측액을 제거하였다. 100 ul의 FACS 버퍼 (1% FBS in PBS)에 분석하고자 하는 표면 단백질의 항체를 각 1 ul씩 추가하였다: CD3 (APC-Cy7) (Invitrogen, 47-0036-42), CD56 (PE-Cy7) (Invitrogen, 25-0567-42), CD57 (APC) (Biolegend, 359610) 및 NKG2C (BV421) (BD, 748169). 각 항체를 포함한 FACS 버퍼 100 ul를 세포가 들어있는 96웰 플레이트에 처리한 후 4℃의 어두운 곳에서 15분간 염색하였다. FACS 버퍼로 세척 후, 원심분리하여 세포만 남기고 상층액을 제거하였다.
세포내 단백질 염색에서는 Fixation/Permeabilization Kit (BD, 554714)를 사용하였다. 1 ul의 FcεRI (γ subunit-FITC) (Merck, FCABS400F)를 포함한 100 ul의 1X Perm/Wash 버퍼를 세포에 처리한 후 30분간 4℃의 어두운 곳에서 염색하였다. 1X Perm/Wash 버퍼로 세척한 후 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 200 ul의 1X Perm/Wash 버퍼를 세포에 넣어준 후 유세포분석을 진행하였다.
배양보조세포는 GFP, RFP 등의 리포터 유전자를 발현하여 별도로 염색을 진행하지 않았다.
그 결과, 도 1을 참고하면, 선별된 세포 중 HLA-E를 발현하는 K562는 'K562-HLA-E'로, HLA-E와 함께 UL40F 또는 UL440I를 발현하는 K562는 각각 'K562-HLA-E UL40F' 및 'K562-HLA-E UL40I'라고 명명하였다.
1-2. HLA-E 및 mbCD16 발현 배양보조세포 제작
CD16은 NK 세포 중 FcεRIγ가 결여된 gNK 세포의 선택적 증폭을 촉진하는 핵심 인자(key factor)로, HLA-E와 함께 막 결합 형태의 항-CD16 항체 (mbCD16-1 또는 mbCD16-2)를 발현하는 배양보조세포를 제작하였다.
먼저, 항-CD16 항체의 단일클론항체 3G8 클론인 mbCD16-1 (서열번호 7) 또는 mbCD16-2 (서열번호 8)을 렌티바이러스 벡터인 pCDH-CMV-EF1-RFP에 클로닝하여 재조합 렌티바이러스 생산용 벡터 Vector_mbCD16-1 (서열번호 9) 및 Vector_mbCD16-2 (서열번호 10)를 제작하였다. 이후, 바이러스 생산을 위해 상기 제작된 각각의 벡터를 293FT 세포에 패키징 벡터와 함께 lipofectamin3000 (Invitrogen)을 이용하여 형질주입 시켰다. 시간이 지난 뒤, 새로운 배지로 교환하여 48 시간 동안 세포를 배양 한 후, 바이러스가 함유된 배지를 회수하였다. 회수된 배지는 500 xg에서 10 분간 원심분리하고, 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 바이러스가 함유된 순수한 배지만을 분리하여 mbCD16-1 또는 mbCD16-2 발현 렌티바이러스를 생산하였다. 이후, 실시예 1-1에서 제작된 K562-HLA-E, K562-HLA-E UL40F 또는 K562-HLA-E UL40I를 포함하는 배지 9 mL에 상기 각각의 렌티바이러스 1 mL를 녹여 폴리브렌(polybrene) (8 ㎍/ml)과 함께 첨가하여, 48 시간 동안 세포 배양을 진행하였다. 이후, 유세포분석을 이용하여 감염된 세포를 선별하였다. 도 2 내지 4를 참고하면, 선별된 세포 중 HLA-E 및 mbCD16-1를 발현하는 K562는 'K562-HLA-E-mbCD16-1', 'K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1' 및 'K562-HLA-E UL40I-mbCD16-1'로, HLA-E 및 mbCD16-2를 발현하는 K562는 'K562-HLA-E-mbCD16-2', 'K562-HLA-E UL40F-mbCD16-2', 'K562-HLA-E UL40I-mbCD16-2'라고 명명하였다.
1-3. HLA-E, mbCD16, mbIL-12 및 mbIL-18 발현 배양보조세포 제작
gNK 세포는 사이토카인 IL-12 또는 IL-18의 수용체 발현이 저하되어 있어, NK 세포 증폭 시 IL-12 또는 IL-18에 대한 반응성이 약화될 수 있다. 따라서 증폭 단계에서 기억 기능을 보완할 수 있도록 사이토카인 자극을 주기 위하여, HLA-E, mbCD16와 함께 막 결합 형태의 IL-12 및 IL-18 (mbIL-12/18)를 발현하는 배양보조세포를 제작하였다.
먼저, mbIL-12 (서열번호 11) 및 mbIL-18 (서열번호 12)을 렌티바이러스 벡터인 pCDH-CMV-EF1-GFP에 클로닝하여 재조합 렌티바이러스 생산용 벡터 Vector_mbIL12/18 (서열번호 13)를 제작하였다. 이후, 바이러스 생산을 위해 상기 제작된 벡터를 293FT 세포에 패키징 벡터와 함께 lipofectamin3000 (Invitrogen)을 이용하여 형질주입 시켰다. 시간이 지난 뒤, 새로운 배지로 교환하여 48 시간 동안 세포를 배양 한 후, 바이러스가 함유된 배지를 회수하였다. 회수된 배지는 500 xg에서 10 분간 원심분리하고, 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 바이러스가 함유된 순수한 배지만을 분리하여 mbIL-12 및 mbIL-18 발현 렌티바이러스를 생산하였다. 이후, 실시예 1-2에서 제작된 K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1를 포함하는 배지 9 mL에 상기 렌티바이러스 1 mL를 녹여 폴리브렌(polybrene) (8 ㎍/ml)과 함께 첨가하여, 48 시간 동안 세포 배양을 진행하였다. 이후, 유세포분석을 이용하여 감염된 세포를 선별하였고, RT-qPCR(Quantitative reverse transcription PCR)을 이용하여 선별된 세포에서 mbIL-12 및 mbIL-18의 발현을 확인하였다 (도 5). 선별된 세포 중 HLA-E, mbCD16-1, mbIL-12 및 mbIL-18를 발현하는 K562는 'K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1-mbIL12/18'라고 명명하였다.
PCR을 위하여 배양보조세포를 용해하여 mRNA를 추출하였다. 추출된 1 mg의 mRNA를 이용해 1 mg의 cDNA 합성하였고, 이를 주형(template)으로 하여 mbIL-12 및 mbIL-18을 증폭하였다. PCR에서는 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 60℃의 온도에서 30회에서 수행하였다.
프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
mbIL18_F GAA TGA CCA AGT TCT CTT CAT TGA CCA AG 14
mbIL18_R GTT CTC ACA GGA GAG AGT TGA AAT TTT CTC 15
mbIL12_F GAT GCC GTT CAC AAG CTC AAG 16
mbIL12_R GAA CGC AGA ATG TCA GGG AGA AGT AG 17
실시예 2. 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 특성
건강한 성인 기증자로부터 Ficoll-Hypaque (d = 1.077, Lymphoprep TM [0076]; Axis-Shield, Oslo, Norwa y)를 이용하여 말초혈액 단핵구(human peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리한 후, PBS로 2회 세척하였다. 실시예 1의 배양보조세포는 각각 100 Gy 감마선을 조사하여 준비하였다.
배양보조세포와 PBMC의 공배양을 위하여 24-웰 플레이트에 실시예 1의 배양보조세포 (2.55 x 105 cells/well) 및 PBMC (5 x 105 cells/well)를 IL-2 10 U/mL, IL-12 10 U/mL 및 IL-18 100 ng/mL가 포함된 RPMI 1640 배지 (10% FBS, 페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 ㎍/mL 및 L-글루타민 4 mmol/L 함유)에서 배양하였다. 막 결합성 IL-12 및 IL-18을 발현하는 배양보조세포의 공배양에서는 IL-2 및 IL-18을 첨가하지 않았다. 7일 및 14일에 재-자극을 위하여 감마선을 조사한 배양보조세포를 추가하였다. 배지는 IL-2 200 U/mL 및 IL-15 5 ng/mL가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 2 ~ 3일마다 교체하면서 21일까지 배양하였다. 배양 7일, 14일 및 21일 차에 유세포분석을 이용하여 증폭된 NK 세포의 표현형 특성을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 배양보조세포에서 HLA-E를 발현하는 경우에는 HLA-E를 발현하지 않는 경우에 비해 증폭된 NK 세포 중 gNK 세포의 발현 수준이 높고, mbCD16-1/2를 추가로 발현할수록 gNK 세포의 발현 수준이 증가하였다. 특히 HLA-E, mbCD16-1 및 mbIL-12/18를 모두 발현하는 배양보조세포와 공배양된 경우에는 gNK 세포의 발현 수준이 가장 높았다.
실시예 3. 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 ADCC 평가
gNK는 FcεRIγ가 결여되어 있어, conventional NK 세포에 비해 세포독성이 낮다. 하지만 gNK가 항-CD16 항체와 결합하면 CD16의 신호가 강해지기 때문에 ADCC 기능은 향상되는 것을 특징으로 한다. 따라서 실시예 1의 배양보조세포 K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1-mbIL12/18에 의해 증폭된 gNK의 ADCC를 평가하기 위하여 세포 사멸능을 분석하였다.
먼저 Raji 세포는 FACS 버퍼에서 0.5　μM의 CFSE로 37℃에서 10분간 염색한 후 RPMI 배지로 2번 세척하였다. CFSE로 염색된 Raji 세포는 10 ug/mL 리툭시맙(rituximab)으로 상온에서 3분간 코팅되었다. 배양 14일차의 gNK 세포와 Raji 세포는 E:T 비율 (2:1, 1:1, 0.5:1)로 96웰 U-bottom 플레이트에에 혼합되었다. 플레이트는 400 xg에서 3분간 원심분리한 후 5% CO2 세포배양기에서 4시간 동안 배양되었다. 배양 후, 세포를 1　mg/mL propidium iodide로 염색한 후 유세포분석을 이용하여 세포 사멸능을 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 배양보조세포 K562-HLA-E UL40F-mbCD16-1-mbIL12/18와의 공배양 14일차에 확보된 gNK는 림프종(lymphoma) 세포주 Raji에 대한 세포 사멸능을 나타내며, 공배양 시 CD20을 표적하는 항체 리툭시맙(rituximab)을 추가한 경우에는 gNK의 ADCC가 보다 증가하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (21)

  1. 인간 백혈구 항원 E(human leukocyte antigen E); 및
    막 결합성 항-CD16 항체(membrane bound anti-CD16 antibody), 막 결합성 인터루킨-12(membrane bound interleukin-12) 및 막 결합성 인터루킨-18(membrane bound interleukin-18)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 배양보조세포.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양보조세포는 K562, RPMI8866, ARH77, EBV_LCL, 721.221 및 HFWT 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 배양보조세포.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 막 결합성 항-CD16 항체는 단클론항체, 다클론항체, 재조합 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 배양보조세포.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 단클론항체는 CB16, 3G8, B73.1 및 MEM-154로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 배양보조세포.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양보조세포는 인간 백혈구 항원 E, 막 결합성 항-CD16 항체, 막 결합성 인터루킨-12 및 막 결합성 인터루킨-18을 발현하는 것인 배양보조세포.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 배양보조세포를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭용 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 조성물은 사이토카인을 더 포함하는 것인 조성물.
  8. NK 세포에 청구항 1의 배양보조세포 또는 청구항 6의 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 NK 세포는 혈액 시료에서 분리된 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 단계는 NK 세포와 배양보조세포를 공배양하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 배양보조세포는 50 Gy 내지 300 Gy로 방사선 조사된 것인 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 공배양은 1 X 106의 NK 세포 당 0.1 내지 10 X 106의 배양보조세포를 배양하는 것인 방법.
  13. 청구항 10에 있어서,
    상기 공배양은 사이토카인의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 방법.
  15. i) NK 세포에 청구항 1의 배양보조세포 또는 청구항 6의 조성물을 접촉시켜 NK 세포를 활성화시키는 단계; 및
    ii) 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 분석하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 ii) 단계의 NK 세포의 활성화 정도는 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 측정되는 것인 방법.
  17. i) NK 세포에 청구항 1의 배양보조세포 또는 청구항 6의 조성물을 접촉시켜 NK 세포를 활성화시키는 단계; 및
    ii) 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 분석하는 단계를 포함하는 NK 세포 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 ii) 단계의 NK 세포의 활성화 정도는 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 측정되는 것인 방법.
  19. 청구항 8의 NK 세포의 활성화 및 증폭 방법으로 제조된 NK 세포.
  20. 청구항 19의 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제.
  21. 청구항 19의 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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