WO2025009480A1 - 麦芽発酵液の製造方法 - Google Patents

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WO2025009480A1
WO2025009480A1 PCT/JP2024/023580 JP2024023580W WO2025009480A1 WO 2025009480 A1 WO2025009480 A1 WO 2025009480A1 JP 2024023580 W JP2024023580 W JP 2024023580W WO 2025009480 A1 WO2025009480 A1 WO 2025009480A1
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fermentation
malt
liquid
concentration
producing
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聡史 前田
美穂 三好
由香 池田
朋子 ▲高▼橋
浩一 指原
慧三 楠
嘉▲こう▼ 叢
智正 神田
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Asahi Group Holdings Ltd
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Asahi Group Holdings Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C7/00—Preparation of wort

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fermented liquid using a saccharified product of malt as a fermentation raw material, which has a low ethanol concentration and a reduced wort odor, and a method for producing a beverage containing the fermented liquid produced by the production method as an ingredient.
  • yeasts in fermented alcoholic beverages the various aroma components produced during fermentation depend on the type of yeast used in fermentation.
  • yeast most widely used in brewing beer and wine is the Saccharomyces genus, but in recent years, yeasts other than Saccharomyces have been used to produce beers with flavors different from those of conventional beers.
  • a method for producing beer with a high content of isoamyl acetate (IAAT) and ethyl acetate by fermenting wort under aerobic conditions using yeast of the Pichia genus, such as Pichia kluyveri (Patent Document 1).
  • a method for producing a fermented beverage with an alcohol concentration of less than 1% by volume by inoculating a mixture of wort and whey with Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces fragilis and fermenting the mixture (Patent Document 2).
  • Saccharomycodes ludwigii which has low ethanol production ability, has been used as a yeast for producing non-alcoholic beer (Non-Patent Document 1).
  • mutant strains of Kluyveromyces lactis with a phenotype that cannot grow when respiration is inhibited (RAG - phenotype) produce less ethanol on YPD medium than wild-type strains (Non-Patent Document 2). It has also been reported that mutant strains with RAG - phenotypes can be selected by subjecting wild-type strains of Kluyveromyces lactis to mutation treatment and using poor growth in a medium containing antimycin A, a respiration inhibitor, as an indicator (Non-Patent Document 3).
  • the present invention aims to provide a method for producing a malt fermentation liquid having a low ethanol concentration and little wort odor remaining due to poor fermentation, a method for producing a fermented malt beverage using the malt fermentation liquid produced by said production method, and a fermented malt beverage produced by said production method.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems, and as a result have found that by fermenting a fermentation raw material liquid containing a saccharified product of malt using RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, fermentation is carried out sufficiently while ethanol production is greatly suppressed, making it possible to produce a malt fermentation liquid having a sufficiently low ethanol concentration and little unpleasant odor derived from wort, thereby completing the present invention.
  • the method for producing a fermented malt liquid, the method for producing a fermented malt beverage, and the fermented malt beverage according to the present invention are as follows.
  • the method for producing a malt fermentation liquor, wherein the malt fermentation liquor has an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per Brix 5.0 mass%.
  • [2] The method for producing a malt fermentation liquor according to [1], wherein the malt fermentation liquor has a methional concentration of 3.0 ppb or less per Brix 5.0 mass%.
  • [3] The method for producing a malt fermentation liquid according to [1] or [2], wherein the methional concentration of the malt fermentation liquid is 15% by mass or less of the methional concentration of the fermentation raw material liquid.
  • [4] The method for producing a malt fermentation liquor according to any one of [1] to [3] above, wherein the bacterial concentration in the malt fermentation liquor at the end of fermentation is 3.0 x 10 6 cells/mL or more.
  • [8] The method for producing a malt fermentation liquid according to any one of [1] to [7], wherein the fermentation is carried out at 1° C. or higher.
  • a method for producing a malt fermentation liquid comprising producing a malt fermentation liquid by any one of the methods for producing a malt fermentation liquid according to [1] to [10] above, and then producing a fermented malt beverage using the resulting malt fermentation liquid as a raw material.
  • the method for producing a malt fermentation liquor according to the present invention fermentation is carried out using RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, which has an extremely low ethanol production ability and can sufficiently remove unpleasant odors derived from wort. Therefore, the method for producing a malt fermentation liquor according to the present invention can provide a malt fermentation liquor having a low ethanol concentration and a sufficiently low unpleasant odor derived from wort. Furthermore, by using the malt fermentation liquor, a malt fermented beverage having a low ethanol concentration and a suppressed wort odor can be provided.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the dissolved oxygen concentration over time in pure water incubated at 18° C. under normal pressure under various oxygen-supplying conditions in Reference Example 1.
  • X 1 to X 2 (are real numbers satisfying X 1 ⁇ X 2 )" means a numerical range of "not less than X 1 and not more than X 2 ".
  • ppb and ppm mean “ppb by mass” and “ppm by mass”, respectively.
  • the term "RAG - (Resistance to Antimycin A on Glucose - ) phenotype” means a trait of sensitivity to a respiratory inhibitor in the presence of glucose, i.e., a trait of being inhibited in growth in the presence of glucose and a respiratory inhibitor.
  • the respiratory inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that has an effect of inhibiting any of the oxidative phosphorylation reactions in mitochondria.
  • the respiratory inhibitor examples include electron transport inhibitors such as antimycin A (CAS RN: 1397-94-0), rotenone (CAS RN: 83-79-4), and thenoyltrifluoroacetone (CAS RN: 326-91-0), and ATP synthase inhibitors such as oligomycin A (CAS RN: 579-13-5).
  • electron transport inhibitors such as antimycin A (CAS RN: 1397-94-0), rotenone (CAS RN: 83-79-4), and thenoyltrifluoroacetone (CAS RN: 326-91-0)
  • ATP synthase inhibitors such as oligomycin A (CAS RN: 579-13-5).
  • RAG - phenotype Kluyveromyces lactis means a Kluyveromyces lactis strain that is sensitive to a respiratory inhibitor, i.e., a strain whose normal growth is inhibited in the presence of a respiratory inhibitor. Wild-type Kluyveromyces lactis can grow without problems in the presence of glucose or a respiratory inhibitor, but some mutant strains are of the RAG - phenotype. Whether Kluyveromyces lactis is of the RAG - phenotype or not can be identified, for example, by culturing it in a culture medium containing glucose as a carbon source and a culture medium containing a respiratory inhibitor in addition to glucose. Kluyveromyces lactis that can grow in a culture medium containing glucose but cannot grow in a culture medium containing a respiratory inhibitor is identified as Kluyveromyces lactis of the RAG - phenotype.
  • the genotype of the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis used in the present invention is not particularly limited as long as it has sensitivity to a respiratory inhibitor in the presence of glucose.
  • Examples of the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis include, among Kluyveromyces lactis, functionally defective mutants of the RAG1 gene that encodes the glucose transporter protein RAG1.
  • Kluyveromyces lactis that does not have a RAG - phenotype can be subjected to a mutation treatment such as a drug treatment using EMS (Ethyl Methanesulfonate) or ultraviolet light irradiation, and from the obtained mutants, a mutant that cannot be cultured in a culture medium containing a respiratory inhibitor but can be cultured in a culture medium not containing a respiratory inhibitor can be obtained.
  • EMS Ethyl Methanesulfonate
  • ultraviolet light irradiation ultraviolet light irradiation
  • the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis can be a respiration inhibitor-sensitive strain appropriately selected from strains of Kluyveromyces lactis available from strain preservation organizations such as the National Biotechnology Center (NBRC) of the National Institute of Technology and Evaluation and the National Collection of Yeast Cultures (NCYC) or from distributors.
  • NBRC National Biotechnology Center
  • NCYC National Collection of Yeast Cultures
  • the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis to be inoculated into the fermentation raw material liquid may be one type or two or more types.
  • the fermentation raw material liquid may be inoculated with a combination of RAG - phenotype Kluyveromyces lactis and other yeasts to the extent that the effects of the present invention are not impaired.
  • the method for producing a malt fermentation liquor according to the present invention comprises a step of inoculating a fermentation raw material liquid containing a saccharified product of malt with yeast and fermenting the liquid to prepare a malt fermentation liquor, and is characterized in that RAG - phenotype Kluyveromyces lactis is used as the yeast.
  • RAG - phenotype Kluyveromyces lactis has a sufficient ability to produce aroma components through fermentation but a low ability to produce ethanol through fermentation. Therefore, by fermenting the fermentation raw material liquid with RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, it is possible to produce a malt fermentation liquor that contains various aroma components through fermentation but has a sufficiently reduced ethanol concentration.
  • the method for producing malt fermentation liquor according to the present invention can produce a malt fermentation liquor having an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per 5.0 mass% Brix.
  • the ethanol concentration of the malt fermentation liquor produced by the present invention per 5.0 mass% Brix is not particularly limited as long as it is less than 0.05 v/v%, but is preferably 0.025 v/v% or less, more preferably 0.010 v/v% or less, even more preferably 0.008 v/v% or less, and even more preferably 0.005 v/v% or less.
  • the lower limit of the ethanol concentration per 5.0 mass% Brix of the malt fermentation liquor produced by the present invention is not particularly limited, and can be, for example, 0.001 v/v% or more, or may be 0.002 v/v% or more.
  • the methional concentration per Brix 5.0 mass% of the malt fermentation liquid produced by the present invention is not particularly limited as long as it is 3.0 ppb or less, but is preferably 1.0 ppb or less.
  • the lower limit of the methional concentration per Brix 5.0 mass% of the malt fermentation liquid produced by the present invention is not particularly limited, and can be, for example, 0.10 ppb or more, or may be 0.20 ppb or more.
  • the ethanol concentration of malt fermentation liquid or beverages can be measured by, for example, an enzymatic method that measures the amount of NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) generated using ADH (alcohol dehydrogenase) and AlDH (aldehyde dehydrogenase) by spectroscopy, an enzymatic method using the multifunctional biosensor BF-5 (manufactured by Oji Measurement Instruments), a distillation-density (specific gravity) method, a gas chromatography (GC) analysis method, an oxidation method (oxidation-reduction titration method), etc.
  • NADH reduced nicotinamide adenine dinucleotide
  • AlDH aldehyde dehydrogenase
  • a malt fermentation liquor having an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per Brix 5.0 mass% and a methional concentration of 3.0 ppb or less per Brix 5.0 mass% can be produced.
  • Methional is an aroma component that causes wort odor and decreases as fermentation progresses.
  • a methional concentration of 3.0 ppb or less per Brix 5.0 mass% means that fermentation has progressed and the wort odor has been sufficiently reduced. That is, according to the present invention, a malt fermentation liquor in which both the ethanol concentration and the methional concentration are sufficiently reduced can be produced.
  • the methional concentration of a malt fermentation liquid or beverage can be determined, for example, from the peak area of a chromatograph obtained by GC (gas chromatography) analysis, GC-MS analysis (gas chromatography-mass spectrometry), or solid-phase microextraction (SPME)-GC-MS/MS analysis (gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry).
  • the method for quantifying the concentration from the peak area is not particularly limited, but examples include the area percentage method, the internal standard method, the standard addition method, and the absolute calibration curve method.
  • the concentration can be determined by the method described in the examples below.
  • the methional concentration of the malt fermentation liquor can be sufficiently reduced below the methional concentration of the fermentation raw material liquor by fermentation using RAG - phenotype Kluyveromyces lactis.
  • the methional concentration of the malt fermentation liquor can be reduced to preferably 15% by mass or less, more preferably 10% by mass or less, and even more preferably 5% by mass or less of the methional concentration of the fermentation raw material liquor.
  • the method for producing a malt fermentation liquor according to the present invention can provide a malt fermentation liquor that is low in ethanol but also has a low methional concentration and a highly palatable malt fermentation liquor with a suppressed wort odor.
  • the fermentation raw material liquid to be inoculated with RAG - phenotype Kluyveromyces lactis and fermented is not particularly limited as long as it contains a saccharified product of malt and contains a carbon source or nitrogen source that can be assimilated by RAG - phenotype Kluyveromyces lactis.
  • it may consist of only a saccharified product of malt, or it may contain a carbon source or nitrogen source other than a saccharified product of malt.
  • malt saccharification product refers to the product that has been saccharified using various enzymes from sugars in malt.
  • the enzymes used in the saccharification process may be enzymes that are naturally contained in malt, or may be enzymes derived from sources other than malt.
  • a saccharification product can be obtained using amylase derived from malt.
  • a saccharification enzyme derived from a source other than malt may be further added, and enzymes other than saccharification enzymes, such as proteolytic enzymes, may be used in combination.
  • wort or malt extract can be used as the malt saccharification product.
  • Malt extract is concentrated wort, and its main component is malt sugar.
  • Malt extract can be mixed with carbonated water as it is to make a beverage, or it can be used as an ingredient in food and beverage products.
  • Wort can be concentrated by conventional methods. Concentration under reduced pressure is preferred because it minimizes the effect on the components in the wort, but it can also be concentrated by heating to remove the solvent.
  • Wort is prepared by preparing a mixture containing malt and raw water, heating it, and saccharifying the starch in the malt. It is preferable to use malt powder obtained by crushing the malt.
  • the crushing of malt can be carried out by a conventional method.
  • the crushed malt may be subjected to a conventional treatment before or after the crushing. Such treatment may include, for example, root removal.
  • the mixture containing malt and raw water may contain a fermentation raw material other than malt.
  • the fermentation raw material may be a grain raw material or a carbohydrate raw material.
  • grain raw materials other than malt include wheat and barley, rice, corn, soybeans, and other beans, and potatoes.
  • the grain raw material can also be used as ground grain, grain syrup, grain extract, and the like.
  • Ground grain may be corn starch, corn grits, and the like, which have been subjected to a typical process before or after grinding. Examples of the typical process include removal of proteins, husks, and germs, and dehydration.
  • carbohydrate raw materials include sugars such as liquid sugar.
  • the wort may be used as it is as a fermentation raw material liquid, but it is preferable to carry out a boiling treatment before inoculating the yeast.
  • This boiling treatment allows sterilization and makes fermentation safer.
  • the filtration treatment is not particularly limited, and can be appropriately selected from solid-liquid separation treatments that are commonly carried out in the manufacturing process of foods and beverages, such as diatomaceous earth filtration and filter filtration.
  • a malt extract to which warm water has been added can be used and boiled. The boiling method and conditions can be determined appropriately.
  • a malt fermentation liquid with the desired flavor can be produced.
  • hops By performing the boiling process in the presence of hops, the flavor and aroma components of the hops can be efficiently extracted.
  • the amount of hops to be added, the manner of addition (for example, adding in several batches), and the boiling conditions can be determined as appropriate.
  • dregs such as proteins that have formed due to precipitation from the boiled wort before inoculating the yeast.
  • Any solid-liquid separation process can be used to remove the dregs, but typically a tank called a whirlpool is used to remove the sediment.
  • the temperature of the boiled wort during this process should be 15°C or higher, and is generally around 50-80°C.
  • the clear wort (filtrate) after removing the dregs is cooled to an appropriate fermentation temperature using a plate cooler or similar. This wort after removing the dregs becomes the fermentation raw material liquid.
  • the Brix of the fermentation raw material liquid into which the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis is inoculated is preferably 4% to 20%, more preferably 8% to 18%, and even more preferably 12% to 16%.
  • the pH of the fermentation raw material liquid into which the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis is inoculated is preferably 3.0 to 6.0, and more preferably 3.5 to 5.5.
  • the Brix value of the fermentation raw material liquid can be measured by standard methods using a measuring device such as a refractometer (RX-5000 ⁇ , manufactured by Atago Co., Ltd.).
  • the cooled fermentation raw material liquid is inoculated with RAG - phenotype Kluyveromyces lactis to carry out fermentation.
  • the cooled fermentation raw material liquid may be subjected to fermentation as it is, or may be subjected to fermentation after being adjusted to a desired extract concentration.
  • the amount of RAG - phenotype Kluyveromyces lactis added to the fermentation raw material liquid is not particularly limited.
  • the amount of RAG - phenotype Kluyveromyces lactis inoculated into the fermentation raw material liquid is preferably an amount that results in a bacterial concentration of the malt fermentation liquid at the start of fermentation of 2.0 x 10 4 cells/mL or more, more preferably an amount that results in a bacterial concentration of 2.0 x 10 4 to 2.0 x 10 7 cells/mL.
  • the bacterial concentration of the malt fermentation liquor at the end of fermentation is preferably 3.0 x 10 6 cells/mL or more, and more preferably 3.0 x 10 6 to 1.4 x 10 8 cells/mL.
  • the conditions for fermentation performed by inoculating RAG - phenotype Kluyveromyces lactis are not particularly limited.
  • the fermentation temperature may be 1° C. or higher, and for example, is preferably 1 to 35° C., which is a temperature range in which yeast can generally survive, more preferably 1 to 28° C., even more preferably 1 to 25° C., and even more preferably 1 to 20° C.
  • fermentation may be performed at a constant temperature from the start of fermentation to the end of fermentation, or the fermentation temperature may be appropriately changed.
  • the fermentation time can be appropriately determined in consideration of the fermentation temperature and the desired product quality, etc., but is preferably 4 hours or more because it is expected that unpleasant odors derived from wort such as methional can be sufficiently reduced.
  • the fermentation time is preferably 4 to 168 hours, more preferably 4 to 96 hours, and even more preferably 4 to 72 hours.
  • the time when the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis in the fermentation liquor reaches a target bacterial concentration can also be regarded as the end of fermentation.
  • the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis may be in a growth phase, or may be fermented in a state where it is barely growing. For example, at 1° C., RAG - phenotype Kluyveromyces lactis grows only slightly, but by inoculating a sufficient amount of RAG - phenotype Kluyveromyces lactis into the fermentation raw material liquid, a malt fermentation liquid having a desired low ethanol concentration and low unpleasant odor can be obtained.
  • anaerobic environment refers to a condition where a certain oxygen supply condition is maintained, but the amount of oxygen supplied is less than the amount of oxygen consumed by the growth of the bacteria, and as a result, the dissolved oxygen concentration in the liquid becomes zero, rather than a completely anaerobic condition.
  • a completely anaerobic environment refers to an environment where no new oxygen is supplied, that is, “under conditions where no oxygen is supplied.”
  • a completely anaerobic environment can be achieved by supplying oxygen-free gas, such as nitrogen gas or carbon dioxide gas, to a fermentation tank.
  • fermentation can be performed under a constant oxygen-supplying condition while maintaining an anaerobic environment, thereby allowing the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis to grow to 3.0 ⁇ 10 6 cells/mL or more, preferably 3.0 ⁇ 10 6 to 1.4 ⁇ 10 8 cells/mL, at the end of fermentation, and a malt fermentation liquid with a desired low ethanol concentration and low unpleasant odor can be obtained.
  • the fermentation raw material liquid when the number of inoculated cells in the fermentation raw material liquid is 3 ⁇ 10 6 cells/mL or more, fermentation may be performed under an anaerobic environment, and even when fermentation is performed under a completely anaerobic environment, the fermentation time can be adjusted to obtain a malt fermentation liquid with a desired low ethanol concentration and low unpleasant odor.
  • the fermentation raw material liquid with a cell count of RAG - phenotype Kluyveromyces lactis of 3 x 10 cells/mL or more and fermenting the liquid at 1 to 35°C, preferably 1 to 28°C, more preferably 8 to 28°C, and even more preferably 12 to 24°C for 24 hours or more, it is possible to obtain a malt fermentation liquid with the desired low ethanol concentration and low unpleasant odor, even when fermented in a completely anaerobic environment.
  • RAG - phenotype Kluyveromyces lactis When RAG - phenotype Kluyveromyces lactis is fermented in an anaerobic environment, it is preferable to carry out the fermentation under oxygen-adding conditions such that the time required to increase the dissolved oxygen concentration in pure water from 6 ppm to 8 ppm at 18° C. and normal pressure is more than 0 hours and not more than 5 hours, for example, 15 minutes to 5 hours, so that the oxygen concentration can be adjusted within an appropriate range. Fermentation under the oxygen-adding conditions can be carried out by fermenting the fermentation liquid while stirring it in a fermentation tank filled with an oxygen-containing gas such as air, rather than directly mixing oxygen into the fermentation liquid.
  • an oxygen-containing gas such as air
  • the oxygen-adding conditions can be achieved by stirring the fermentation liquid while supplying air to the empty space in the fermentation tank, or by pressurizing the fermentation tank at 0.026 MPa and supplying air at 10 NL/h per 1 kL of fermentation liquid.
  • the above-mentioned oxygen-imparting conditions can be achieved, for example, by stirring the fermentation liquid with a pump, by putting 400 mL of wort into a 500 mL Erlenmeyer flask and stirring at 60 rpm using a shaking culture device, or by putting 400 mL of wort into a 500 mL jar fermenter with a 0.2 ⁇ m filter attached to the exhaust port and rotating the stirring blade at 50 rpm without actively supplying air.
  • the above-mentioned oxygen-imparting conditions can also be achieved by leaving the fermentation liquid stationary in a fermentation vessel with a wide gas-liquid contact surface.
  • the malt fermentation liquid obtained in the present invention can be used as it is as a raw material for food and beverages.
  • the food and beverages produced using the malt fermentation liquid as a raw material There are no particular limitations on the food and beverages produced using the malt fermentation liquid as a raw material.
  • beverages are preferred, malt fermented beverages are more preferred, and malt fermented beer-like sparkling beverages are even more preferred.
  • the term "fermented malt beverage” refers to a beverage produced by using malt or a processed malt product as a raw material and undergoing a fermentation process with yeast.
  • the fermented malt beverage may be an alcoholic beverage, or may be a so-called non-alcoholic beverage or low-alcohol beverage having an ethanol concentration of less than 1.0 v/v%.
  • the fermented malt beverage produced by using the malt fermentation liquid obtained in the present invention as a raw material has an ethanol concentration of less than 0.05 v/v%, preferably 0.025 v/v% or less, more preferably 0.01 v/v% or less, even more preferably 0.008 v/v% or less, and even more preferably 0.005 v/v% or less.
  • beer-like sparkling beverage refers to a sparkling beverage that has a flavor, taste, and texture equivalent to or similar to that of beer, and has a beer-like flavor (a flavor that is pronounced of beer).
  • malt-fermented beer-like sparkling beverages include beer and happoshu (low-malt beer) made from malt.
  • liqueurs obtained by mixing malt fermentation liquid with an ethanol-containing distilled liquid are also possible.
  • the ethanol-containing distilled liquid is a solution containing ethanol obtained by a distillation operation, and may be, for example, raw material alcohol (ethanol), or distilled alcohol (spirits) such as whiskey, brandy, vodka, rum, tequila, gin, and shochu.
  • ethanol raw material alcohol
  • spirits distilled alcohol
  • the obtained malt fermentation liquid can be subjected to solid-liquid separation to remove yeast and the like, thereby obtaining a fermented malt beverage.
  • the solid-liquid separation can be performed by any method capable of removing yeast and the like, such as centrifugation, diatomaceous earth filtration, and filter filtration using a filter with an average pore size of about 0.4 to 0.5 ⁇ m, and these treatments can be combined.
  • hops, hop extract, flavorings, and the like can be added to the obtained malt fermentation liquid to adjust the flavor of the fermented malt beverage.
  • the flavor can be adjusted before or after the solid-liquid separation.
  • the malt fermentation liquid after the solid-liquid separation can be stored and aged under low-temperature conditions of about 0°C. In order to produce a fermented malt beverage, further treatments such as pH adjustment and heating can be performed according to conventional methods.
  • the obtained malt fermentation liquid can be appropriately diluted to produce a malt fermented beverage having an extract concentration within a desired range.
  • the solution used for dilution is not particularly limited, but examples include water or carbonated water.
  • the dilution ratio is not particularly limited, and can be, for example, 2-10 times, more preferably 2-6 times, and even more preferably 2-4 times.
  • a malt fermented beverage can be produced by diluting the original wort extract concentration to within a desired range, for example, 3-7% by mass.
  • the process of diluting the malt fermentation liquid may be performed after the fermentation process is completed, or after the yeast and the like are removed, or it may be performed on the malt fermentation liquid after maturation.
  • the original wort extract concentration of malt fermentation liquid or malt fermented beverage can be measured according to the method stipulated in the analytical method published by the Brewing Society of Japan ("8.5 Extract-related Measurement Methods” in "BCOJ Beer Analysis Methods (2013 Revised Edition) (edited by the International Technical Committee (Analysis Committee) of the Brewers Association of Japan)). Specifically, it can be measured from the alcohol concentration and true extract concentration.
  • the true extract concentration of malt fermentation liquid or malt fermented beverage can be measured according to the method specified in "8.4.3 Alcolyzer Method” of "BCOJ Beer Analysis Methods (2013 revised edition)” (edited by the International Technical Committee (Analysis Committee) of the Brewers Association of Japan).
  • the ethanol concentration of the malt fermented beverage obtained using the malt fermentation liquid obtained in the present invention as a raw material is not particularly limited.
  • a malt fermented beverage with a low ethanol concentration and reduced wort odor can be produced.
  • a fermented malt beverage having an ethanol concentration of 0.05 v/v% or less per 5.0 mass% Brix is preferred, a fermented malt beer-like sparkling beverage having an ethanol concentration of 0.05 v/v% or less and a methional concentration of 3.0 ppb or less per 5.0 mass% Brix is more preferred, a fermented malt beer-like sparkling beverage having an ethanol concentration of 0.01 v/v% or less and a methional concentration of 3.0 ppb or less per 5.0 mass% Brix is even more preferred, and a fermented malt beer-like sparkling beverage having an ethanol concentration of 0.01 v/v% or less and a methional concentration of 1.0 ppb or less per 5.0 mass% Brix is even more preferred.
  • the ethanol concentration in the malt fermentation liquid or beverage was measured by the following method.
  • the sample was diluted with distilled water to an ethanol concentration of 0.5 to 2.0 v/v%, and the solution was measured using a multifunctional biosensor (BF-5, manufactured by Oji Instruments Co., Ltd.)
  • the ethanol concentration (v/v%) in the sample was determined by multiplying the measured value by the dilution rate.
  • the multifunctional biosensor is a device that electrochemically detects hydrogen peroxide ( H2O2 ) produced by oxidation with alcohol oxidase, and can measure the total concentration of methanol and ethanol. Since yeast does not synthesize methanol, malt fermentation liquor contains only trace amounts of methanol that are within the margin of error. Therefore, the measurement value obtained by the multifunctional biosensor is the measurement value of the amount of ethanol in the malt fermentation liquor sample.
  • H2O2 hydrogen peroxide
  • this multifunctional biosensor was used to measure the ethanol concentration of a solution diluted with the sample so that the alcohol concentration was 0.01 to 0.04 v/v%, using a highly sensitive measurement method that uses a sodium azide-free buffer solution (SL04-0015, Oji Instruments and Measurement Co., Ltd.).
  • SPME solid-phase microextraction
  • PFBOA o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) hydroxylamine.HCl
  • a SPME fiber (PDMS/DVB: 65 ⁇ m, 1 cm, 57327-U 24 gauge StableFlex, SPELCO) was exposed to the headspace of the vial containing the PFBOA solution at 50°C for 10 minutes.
  • the SPME fiber that captured the PFBOA was exposed to the headspace of a vial containing 10 g of sample and 50 ⁇ L of Methional-d3 dissolved in ethanol to a concentration of 5 mg/L at 50°C for 60 minutes.
  • the derivatized methional was analyzed under the following GC-MS/MS conditions.
  • GC-MS/MS Apparatus: GC-MS/MS (7890A/7000C, Agilent) equipped with a multifunction autosampler MPS2 system (Gerstel) Column: HP-5MS UI 30 m x 0.25 mm x 0.25 ⁇ m (Agilent) Carrier gas: helium Flow rate: 1 mL/min Heating conditions: 80°C (5 min) ⁇ 15°C/min ⁇ 150°C ⁇ 5°C/min ⁇ 220°C ⁇ 50°C/min ⁇ 300°C (5 min) Injection method: splitless purge flow: 50 mL/min, 1 min Injection port temperature: 250° C.
  • ⁇ Preparation of worts A and D> Worts A and D were produced using a 200 L scale brewing facility. First, 40 kg of ground malt and starchy auxiliary materials as fermentation raw materials and 160 L of raw water were charged into the brewing tank. Next, the mixture in the brewing tank was heated and saccharified in a conventional manner, and the resulting saccharified liquid was filtered. Hops were added to the resulting filtrate, which was then boiled. The boiled filtrate was transferred to a settling tank to separate and remove the precipitate, after which the pH was adjusted with phosphoric acid and cooled to obtain worts A and D. The analytical values of the resulting worts A and D were as shown in Table 2.
  • Oxygenation condition 1 400 mL of pure water was placed in a 500 mL Erlenmeyer flask and stirred at 60 rpm in a shaking incubator.
  • Oxygenation condition 2 400 mL of pure water was placed in a 500 mL jar fermenter, and with a 0.2 ⁇ m filter attached to the exhaust port, air was not actively supplied and the mixture was stirred by rotating the stirring blade at 50 rpm.
  • Oxygenation condition 3 100 L of pure water was placed in a 200 L fermentation tank, pressurized to 0.026 MPa, and air was supplied at a rate of 0.67 NL/min per 100 L of pure water.
  • Oxygenation condition 4 400 mL of pure water was placed in a 500 mL jar fermenter, a 0.2 ⁇ m filter was attached to the exhaust port, and nitrogen gas was blown in while the stirring blades were rotated at 50 rpm (completely anaerobic conditions).
  • Example 1 Wort was fermented in flasks using various yeasts, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermented liquid were examined.
  • Kluyveromyces lactis NBRC648 strain has a RAG ⁇ phenotype
  • Kluyveromyces lactis NBRC1267 strain and Kluyveromyces lactis NBRC1090TS strain do not have the RAG ⁇ phenotype and are capable of growing even in the presence of a respiratory inhibitor.
  • Wort A was used as the fermentation raw material liquid.
  • each yeast was pre-cultured overnight in wort diluted with water to a Brix of 5% by mass, washed once with water, and then added to 400 mL of wort (Brix 12.0%) in a 500 mL Erlenmeyer flask so that the initial number of yeast cells was 1.0 x 10 6 per mL of wort.
  • the wort inoculated with yeast was shake-cultured at an incubator speed of 60 rpm and normal pressure of 18 ° C., and fermented for 3 days. Thereafter, the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified.
  • ethanol (% ABV) indicates the ethanol concentration (v/v%) of the fermentation broth at the end of fermentation
  • ethanol/Brix 5% equivalent (% ABV) indicates the ethanol concentration (v/v%) per Brix 5.0 mass% of the fermentation broth at the end of fermentation
  • methional (ppb) indicates the methional concentration (ppb) of the fermentation broth at the end of fermentation
  • methional/Brix 5% equivalent (ppb) indicates the methional concentration (ppb) per Brix 5.0 mass% of the fermentation broth at the end of fermentation.
  • Methods concentration (ppb) indicates the methional concentration (ppb) of the fermentation raw material liquid (wort before inoculation)
  • Methodhional/Brix 5% equivalent (ppb) indicates the methional concentration (ppb) per Brix 5.0% by mass of the fermentation raw material liquid.
  • Methodhional reduction rate (%) indicates the reduction rate of the methional concentration from the fermentation raw material liquid (100% - [Methional concentration (ppb) per Brix 5.0% by mass of the fermentation liquid at the end of fermentation] / [Methional concentration (ppb) per Brix 5.0% by mass of the fermentation raw material liquid] x 100%).
  • yeasts produced fermentation broths with low ethanol concentrations, similar to Saccharomyces ludwigii, which is commercially used to produce non-alcoholic beer.
  • Kluyveromyces lactis NBRC648, Lipomyces starchii NBRC10381TS, Lipomyces lipofus NBRC1288TS, Yarrowia lipolytica NBRC717, and Rhodotorula gluntis NBRC1125TS had extremely low ethanol concentrations of less than 0.05 v/v% per Brix 5.0%.
  • the fermentation broths fermented with Kluyveromyces lactis NBRC648 and Lipomyces lipofus NBRC1288TS had methional reduction rates of 80% or more, and fermentation was carried out sufficiently.
  • the evaluation items were (a) the strength of the wort odor, and (b) the deliciousness. (a) was evaluated by aroma, and (b) by taste.
  • Each evaluation sample was 20 mL, and the order of evaluation was randomized so that it was different for each panelist.
  • the results of the sensory evaluation are shown in Table 5.
  • the diluted fermentation liquids of Kluyveromyces lactis NBRC648 strain, Kluyveromyces lactis NBRC1267 strain, Kluyveromyces lactis NBRC1090TS strain, Lipomyces lipofus NBRC1288TS strain, and Rhodotorula gluntis NBRC1125TS strain which had low methional concentrations (ppb) per 5.0 mass% Brix of the fermentation raw material liquid, had a weak wort odor and were highly rated for their deliciousness.
  • the diluted solution of the fermented liquid fermented with Kluyveromyces lactis NBRC648 strain had a high palatability rating of 5 or more, similar to the diluted solution of the fermented liquid fermented with Saccharomycodes ludwigii, and had a very low ethanol concentration of 0.004 v/v% per Brix 5.0 mass%, making it a mild, refreshing, easy-to-drink beer-like sparkling beverage.
  • Example 2 Wort was fermented in flasks using various RAG - phenotypes of Kluyveromyces lactis, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation broth were examined.
  • KL NBRC648 was suspended in pure water to a concentration of 1 x 10 8 cells/mL to obtain a suspension. 100 ⁇ L of the suspension was inoculated onto a parafluorophenylalanine-containing agar medium (0.67% Yeast Nitrogen Base with Amino Acids, 2% Glucose, 1.0 mg/mL parafluorophenylalanine, 2% agar) and cultured at 25°C for 4 days. From the colonies that appeared on the agar medium, strains that produced a large amount of aroma component ( ⁇ -phenethyl alcohol) were selected.
  • a parafluorophenylalanine-containing agar medium 0.67% Yeast Nitrogen Base with Amino Acids, 2% Glucose, 1.0 mg/mL parafluorophenylalanine, 2% agar
  • KL NBRC1267 strain was treated with 0.3% ethyl methanesulfonate at 30°C for 60 minutes to give a viable cell rate of 38%.
  • the treated cells were inoculated onto YPD agar medium so that about 100 colonies grew, and replica plating was performed onto antimycin A-containing agar medium (0.5% yeast extract, 1% peptone, 5% glucose, 5 ⁇ M antimycin A, 2% agar). Strains that could grow on YPD agar medium but could not grow on antimycin A-containing agar medium were selected.
  • ⁇ 400mL scale test> In the same manner as in Example 1, the pre-cultured yeast was inoculated into the wort so that the initial cell count was 1.0 x 106 per 1 mL of wort, and the wort was fermented by shaking culture at 18°C and normal pressure for 3 days. The cell concentration (achieved cell count), ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 7.
  • the fermentation broths obtained from all of the breeding strains had an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per 5.0 mass% Brix, and the methional concentration was reduced by 85 mass% or more compared to wort A. Furthermore, the methional concentration was 3 ppb or less per 5.0 mass% Brix.
  • Example 3 Worts with different compositions and Brix were fermented using RAG - phenotype Kluyveromyces lactis as fermentation raw material liquids, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquids were examined.
  • Kluyveromyces lactis NBRC648 strain was used as the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis.
  • Example 1 The same procedure as in Example 1 was followed except that the wort A was replaced with the Brix wort shown in Table 8.
  • the pre-cultured yeast was inoculated into the wort so that the initial cell count was 1.0 x 106 per mL of wort, and fermented by shaking culture at 18°C and normal pressure for 3 days.
  • the bacterial concentration (achieved cell count), ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 8.
  • the ethanol concentration per Brix 5.0 mass% was less than 0.05 v/v%, and the methional concentration was reduced by 85 mass% or more compared to the wort before yeast inoculation. Furthermore, a malt fermentation liquid with a methional concentration of 3 ppb or less per Brix 5.0 mass% was produced.
  • the resulting malt fermentation liquid had an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per Brix 5.0 mass%, and the methional concentration was reduced by 85 mass% or more compared to the wort before yeast inoculation, and furthermore, the methional concentration per Brix 5.0 mass% was 3 ppb or less.
  • Example 4 The number of RAG - phenotype Kluyveromyces lactis bacteria inoculated into the fermentation raw material liquid and the number of bacteria reached were varied, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquid were examined.
  • Kluyveromyces lactis NBRC648 strain was used as the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, and wort A was used as the fermentation raw material liquid.
  • Example 10 The same procedure as in Example 1 was followed except that the culture time, culture scale, and initial cell count were as shown in Table 10.
  • the precultured yeast was inoculated into the wort in an Erlenmeyer flask so that the initial cell count was 1.0 x 10 6 cells per mL of wort, and fermented by shaking culture at an incubator speed of 60 rpm and at normal pressure of 18°C.
  • the bacterial concentration (achieved cell count), ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 10.
  • the column with the culture time of 0 days shows the measurement results of the fermentation raw material liquid (wort) before inoculation with yeast.
  • the reduction rate of methional was 60% or less, and fermentation was insufficient.
  • the ethanol concentration per Brix 5.0 mass% was more than 0.05 v / v %, and the amount of ethanol produced was large.
  • the ethanol concentration per Brix 5.0 mass% was 0.05 v / v % or less and the methional reduction rate was 90% or more, and a good malt fermentation liquid with low alcohol and low methional was obtained.
  • Example 5 The fermentation raw material liquid was inoculated with RAG - phenotype Kluyveromyces lactis and the fermentation time was changed, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquid were examined.
  • Kluyveromyces lactis NBRC648 strain was used as the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, and wort A was used as the fermentation raw material liquid.
  • Example 11 In a 200 mL Erlenmeyer flask, 160 mL of wort was placed, and the number of days of culture and the initial number of bacteria were set as shown in Table 11. The same procedure as in Example 1 was followed, except that the pre-cultured yeast was inoculated into the wort placed in an Erlenmeyer flask so that the initial number of bacteria was 1.0 x 10 6 per mL of wort, and fermented by shaking culture at an incubator speed of 60 rpm and normal pressure of 18 ° C. The bacterial concentration (achieved number of bacteria), ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 11.
  • the column with a culture time of 0 hours shows the measurement results of the fermentation raw material liquid (wort) before inoculation with yeast.
  • the longer the culture time the higher the methional reduction rate.
  • the contact time between yeast and wort was 4 hours or more, a malt fermentation liquid was obtained in which the ethanol concentration per Brix 5.0 mass% was less than 0.05 v/v%, methional was reduced by 85 mass% or more compared to the wort (fermentation raw material liquid), and the methional concentration per Brix 5.0 mass% was 3 ppb or less.
  • Example 6 The fermentation raw material liquid was inoculated with RAG - phenotype Kluyveromyces lactis and fermented under different oxygen supply conditions, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquid were examined.
  • Kluyveromyces lactis NBRC648 strain was used as the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis
  • wort A was used as the fermentation raw material liquid.
  • Fermentation under oxygenation condition 2 400 mL of wort was put into a 500 mL jar fermenter, and yeast was inoculated so that the initial number of bacteria was 2.0 ⁇ 10 5 per mL of wort. Then, a 0.2 ⁇ m diameter filter was attached to the exhaust port to allow air to enter and exit without actively supplying air, and the stirring blade was rotated at 50 rpm to stir the mixture, and the mixture was fermented at 18 ° C. and normal pressure for 1 day. The yeast pre-cultured was inoculated into the wort and fermented in the same manner as in Example 1. The bacterial concentration (number of bacteria reached), ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 12.
  • Fermentation under oxygenation condition 4 (Reference Example 1) 400 mL of wort was put into a 500 mL jar fermenter, and yeast was inoculated so that the initial number of bacteria was 2.0 ⁇ 10 5 per mL of wort. Then, a 0.2 ⁇ m diameter filter was attached to the exhaust port, and the stirring blade was rotated at 50 rpm to stir the mixture, and fermented at 18 ° C. and normal pressure for 1 day. The yeast pre-cultured was inoculated into the wort and fermented in the same manner as in (1). The bacterial concentration (number of bacteria reached), ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 12.
  • the column with "oxygenation condition” "2" shows the results when fermentation was performed in a state where air was not actively supplied but air was allowed to flow in and out (oxygenation condition 2 in Reference Example 1)
  • the column with "4" shows the results when fermentation was performed in a state where nitrogen gas was blown in (oxygenation condition 4 in Reference Example 1).
  • oxygenation condition 2 which is an anaerobic environment
  • a malt fermentation liquid was obtained in which the ethanol concentration per Brix 5.0 mass% was less than 0.05 v/v%, methional was reduced by 85 mass% or more compared to the wort (fermentation raw material liquid), and the methional concentration per Brix 5.0 mass% was 3 ppb or less.
  • the methional reduction rate was only about 30%, and the fermentation was insufficient.
  • Example 7 The fermentation temperature was varied during inoculation of the fermentation raw material liquid with RAG - phenotype Kluyveromyces lactis and fermentation was carried out, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquid were examined. Wort A was used as the fermentation raw material liquid.
  • the methional reduction rate can be made 90% or more, and a malt fermentation liquid having an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per Brix 5.0 mass% and an ethanol concentration of less than 0.05 v/v% per Brix 5.0 mass% can be prepared.
  • Example 8 The fermentation temperature was 1° C., and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the obtained fermentation liquid were examined. Wort A was used as the fermentation raw material liquid.
  • yeasts Kluyveromyces lactis NBRC648 strain and Kluyveromyces lactis R33 strain, which are RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, and Saccharomyces ludwigii NBRC798TS strain were used.
  • Example 15 240 mL of wort was placed in a 300 mL Erlenmeyer flask, and the pre-cultured yeast was inoculated into the wort in the same manner as in Example 1, except that the fermentation temperature, yeast species, and initial cell count were as shown in Table 15. Fermentation was carried out by shaking culture at an incubator speed of 60 rpm at 18°C and normal pressure. The cell concentration (achieved cell count), ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquid were quantified. The results are shown in Table 15.
  • each of the fermented liquids obtained was diluted 2.56 times to prepare a liquid (fermented malt beer-like sparkling beverage), and the taste was evaluated by five experienced panelists. The results are shown in Table 16.
  • the fermentation liquid obtained using any of the yeasts had a methional reduction rate of 85% or more, and was sufficiently fermented.
  • the fermentation liquid obtained using the RAG - phenotype Kluyveromyces lactis Kluyveromyces lactis NBRC648 strain and Kluyveromyces lactis R33 strain had a low ethanol production amount and was mild, but refreshing, light, and easy to drink compared to the fermentation liquid obtained using the Saccharomyces ludwigii NBRC798TS strain (Table 16).
  • Example 9 Fermentation was carried out on a pilot scale using RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, and the bacterial concentration, ethanol concentration, and methional concentration of the resulting fermentation liquid were examined.
  • Wort D was used as the fermentation raw material liquid.
  • yeast Kluyveromyces lactis NBRC648 strain and Kluyveromyces lactis R86 strain, which are RAG - phenotype Kluyveromyces lactis, were used.

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Abstract

本発明は、エタノール濃度が低く、かつ麦汁由来の不快臭が充分に少ない麦芽発酵液の製造方法、及び当該製造方法で得られた麦芽発酵液から麦芽発酵飲料を提供する。本発明は、麦芽の糖化物を含む発酵原料液に酵母を接種して発酵させて、麦芽発酵液を調製する工程を有し、前記酵母が、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであり、前記麦芽発酵液が、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満である、麦芽発酵液の製造方法、及び、前記の麦芽発酵液の製造方法により麦芽発酵液を製造した後、得られた麦芽発酵液を原料として、麦芽発酵飲料を製造する、麦芽発酵飲料の製造方法である。

Description

麦芽発酵液の製造方法
　本発明は、麦芽の糖化物を発酵原料とし、エタノール濃度が低く、かつ麦汁臭が抑えられた発酵液の製造方法、及び当該製造方法により製造された発酵液を原料として含む飲料の製造方法に関する。
　本願は、２０２３年７月４日に、日本に出願された特願２０２３－１０９９８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、アルコール飲料では、消費者の嗜好の多様化にともない、多種多様の商品が上市されている。例えば、より飲み易いことから、アルコール濃度が比較的低いアルコール飲料の需要も高まっている。一方で、発酵アルコール飲料の場合には、発酵によって、エタノールに加えて様々な香気成分が酵母により産生され、飲料の香味に寄与している。
　発酵アルコール飲料において、発酵の際に産生される各種の香気成分は、発酵に使用される酵母の種類に依存する。例えば、ビールやワインの醸造で最も広く利用されている酵母は、サッカロミセス属（Saccharomyces）であるが、近年、サッカロミセス属以外の酵母を使用することにより、従来のビール等とは異なる香味のビール等を製造することも行われている。
　例えば、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）等のピキア（Pichia）属の酵母を用いて麦汁を好気条件下で発酵させることにより、酢酸イソアミル（IAAT）や酢酸エチルの含有量の多いビールを製造する方法が知られている（特許文献１）。また、麦汁とホエーの混合物に、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）とクルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces flagilis）を接種させて発酵させることにより、アルコール濃度１容量％未満の発酵飲料を製造する方法が知られている（特許文献２）。さらに、低アルコールビールの製造には、エタノール産生能が低いサッカロマイコーデス・ルドウィギイ（Saccharomycodes ludwigii）が、ノンアルコールビール製造用酵母として使用されてきた（非特許文献１）。
　一方で、酵母のエタノール産生量が低い変異体も幾つか報告されている。例えば、クルイベロミセス・ラクチスにおいては、呼吸が阻害されると増殖できなくなる表現型（ＲＡＧ－表現型）を持つ変異株は、ＹＰＤ培地上で、野生株よりもエタノール産生量が低いことが報告されている（非特許文献２）。また、クルイベロミセス・ラクチスの野生株に変異処理を行い、呼吸阻害剤であるアンチマイシンＡを含有させた培地における生育不良を指標として、ＲＡＧ－表現型を持つ変異株を選抜できることも報告されている（非特許文献３）。
国際公開第２０１４／２０２５６４号 特開昭６０－０９４０７７号公報
Bellut, et al., Journal of the American Society of Brewing Chemists, 2019, DOI: 10.1080/03610470.2019.1569452 Wesolowski-Louvel, et al., Molecular and General Genetics, 1992, vol.233(1-2), p.89-96. Wesolowski-Louvel, et al., Yeast, 1992, vol.8, p.711-719.
　発酵アルコール飲料の製造において、エタノール濃度を低く抑えるために発酵度を抑えると、香気成分の含有量も低下したり、発酵不良により麦汁由来の不快臭が残存する場合もある。
　本発明は、エタノール濃度が低く、かつ発酵不良により残存した麦汁臭が少ない麦芽発酵液の製造方法、当該製造方法により製造された麦芽発酵液を用いて麦芽発酵飲料を製造する方法、及び当該製造方法により製造された麦芽発酵飲料を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、麦芽の糖化物を含む発酵原料液の発酵を、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いて行うことにより、発酵は十分に行われるが、エタノール産生が非常に抑えられ、エタノール濃度が充分に低く、かつ麦汁由来の不快臭も少ない麦芽発酵液が製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法、麦芽発酵飲料の製造方法、及び麦芽発酵飲料は、下記の通りである。
［１］　麦芽の糖化物を含む発酵原料液に酵母を接種して発酵させて、麦芽発酵液を調製する工程を有し、
　前記酵母が、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであり、
　前記麦芽発酵液が、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満である、麦芽発酵液の製造方法。
［２］　前記麦芽発酵液が、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下である、前記［１］の麦芽発酵液の製造方法。
［３］　前記麦芽発酵液のメチオナール濃度が、前記発酵原料液のメチオナール濃度の１５質量％以下である、前記［１］又は［２］の麦芽発酵液の製造方法。
［４］　発酵終了時の前記麦芽発酵液の菌濃度が、３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、前記［１］～［３］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［５］　発酵開始時の前記麦芽発酵液の菌濃度が、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、前記［１］～［４］のいずれかの製造方法。
［６］　前記発酵を、酸素付与条件下で行い、
　前記酸素付与条件が、１８℃常圧において、純水の溶存酸素濃度を６．０ｐｐｍから８．０ｐｐｍに上昇させるために要する時間が０時間超５時間以下である条件である前記［１］～［５］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［７］　前記発酵を、酸素付与のない条件下で行う、前記［１］～［５］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［８］　前記発酵を、１℃以上で行う、前記［１］～［７］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［９］　前記発酵を、４時間以上行う、前記［１］～［８］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［１０］　前記発酵を、２４時間以上行う、前記［１］～［８］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［１１］　前記［１］～［１０］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法により麦芽発酵液を製造した後、得られた麦芽発酵液を原料として、麦芽発酵飲料を製造する、麦芽発酵飲料の製造方法。
［１２］　前記麦芽発酵液を希釈する工程を有する、前記［１１］の麦芽発酵飲料の製造方法。
［１３］　原麦汁エキスが３～７質量％である麦芽発酵飲料を製造する、前記［１１］又は［１２］の麦芽発酵飲料の製造方法。
［１４］　前記麦芽発酵飲料がビール様発泡性飲料である、前記［１１］～［１３］のいずれかの麦芽発酵飲料の製造方法。
［１５］　Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下である、麦芽発酵飲料。
［１６］　ビール様発泡性飲料である、前記［１５］の麦芽発酵飲料。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法では、エタノール産生能が非常に低く、麦汁由来の不快臭は十分に除去できるＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いて発酵させる。このため、本発明に係る麦芽発酵液の製造方法により、エタノール濃度が低く、かつ麦汁由来の不快臭が充分に少ない麦芽発酵液を提供できる。また、当該麦芽発酵液を用いることで、エタノール濃度が低く、かつ麦汁臭が抑えられた麦芽発酵飲料を提供できる。
参考例１において、１８℃常圧で、各酸素付与条件下でインキュベートした純水の溶存酸素濃度を経時的に測定した結果を示した図である。
　本発明及び本願明細書において、「Ｘ１～Ｘ２（は、Ｘ１＜Ｘ２を満たす実数である）」は、「Ｘ１以上Ｘ２以下」の数値範囲を意味する。
　本発明及び本願明細書において、「ｐｐｂ」及び「ｐｐｍ」は、それぞれ、「質量ｐｐｂ」及び「質量ｐｐｍ」を意味する。
　本発明及び本願明細書において、「ＲＡＧ－（Resistance to Antimycin A on Glucose　-）表現型」とは、グルコース存在下の呼吸阻害剤感受性の形質、すなわち、グルコース及び呼吸阻害剤の存在下では増殖阻害を受ける形質を有することを意味する。当該呼吸阻害剤としては、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化反応のいずれかの反応を阻害する作用を有する物質であれば、特に限定されるものではない。例えば、アンチマイシンＡ（ＣＡＳ ＲＮ：１３９７－９４－０）、ロテノン（ＣＡＳ ＲＮ：８３－７９－４）、テノイルトリフルオロアセトン（ＣＡＳ ＲＮ：３２６－９１－０）等の電子伝達阻害剤や、オリゴマイシンＡ（ＣＡＳ ＲＮ：５７９－１３－５）等のＡＴＰ合成酵素阻害剤等が挙げられる。
　本発明及び本願明細書において、「ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチス」とは、クルイベロミセス・ラクチスのうち、呼吸阻害剤感受性株、すなわち、呼吸阻害剤存在下では正常な増殖が阻害される株を意味する。野生型のクルイベロミセス・ラクチスは、グルコース存在下では、呼吸阻害剤存在下でも問題なく増殖できるが、一部の変異株は、ＲＡＧ－表現型である。クルイベロミセス・ラクチスがＲＡＧ－表現型か否かの識別は、例えば、炭素源としてグルコースを含有する培養培地と、グルコースに加えて呼吸阻害剤を含有させた呼吸阻害剤含有培養培地とで培養することにより実施できる。グルコースを含有する培養培地では増殖でき、呼吸阻害剤含有培養培地では増殖できないクルイベロミセス・ラクチスが、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであると識別される。
　本発明において用いられるＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとしては、グルコース存在下で呼吸阻害剤感受性を有していれば、その遺伝子型は特に限定されるものではない。ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとしては、例えば、クルイベロミセス・ラクチスのうち、グルコーストランスポータータンパク質であるＲＡＧ１をコードするＲＡＧ１遺伝子の機能欠損変異体が挙げられる。また、ＲＡＧ－表現型ではないクルイベロミセス・ラクチスに対して、例えば、ＥＭＳ（Ethyl Methanesulfonate）等を用いた薬剤処理、又は紫外線照射処理等の変異処理を施し、得られた変異体から、呼吸阻害剤含有培養培地では培養できず、呼吸阻害剤不含培養培地では培養可能な変異体を選抜することによっても、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを得られる。その他、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）、National Collection of Yeast Cultures（ＮＣＹＣ）等の菌株保存機関や販売元から入手可能なクルイベロミセス・ラクチスの株の中から、呼吸阻害剤感受性株を適宜選択して用いることができる。本発明において、発酵原料液に接種するＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスは、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。また、本発明の効果を損なわない限度において、発酵原料液には、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとその他の酵母を併用して接種してもよい。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法は、麦芽の糖化物を含む発酵原料液に、酵母を接種して発酵させて、麦芽発酵液を調製する工程を有する方法であり、当該酵母として、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いることを特徴とする。ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスは、発酵による香気成分の産生能力は十分であるが、発酵によるエタノール産生能力は低い。このため、発酵原料液をＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスで発酵させることにより、発酵により様々な香気成分が含まれているが、エタノール濃度は十分に抑えられた麦芽発酵液を製造することができる。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法により、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満の麦芽発酵液を製造できる。本発明により製造される麦芽発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度としては、０．０５ｖ／ｖ％未満であれば特に限定されるものではないが、０．０２５ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、０．０１０ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．００８ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましく、０．００５ｖ／ｖ％以下であることがよりさらに好ましい。本発明により製造される麦芽発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度の下限値は、特に限定されるものではなく、例えば、０．００１ｖ／ｖ％以上とすることができ、０．００２ｖ／ｖ％以上であってもよい。また、本発明により製造される麦芽発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりメチオナール濃度としては、３．０ｐｐｂ以下であれば特に限定されるものではないが、１．０ｐｐｂ以下であることが好ましい。本発明により製造される麦芽発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度の下限値は、特に限定されるものではなく、例えば、０．１０ｐｐｂ以上とすることができ、０．２０ｐｐｂ以上であってもよい。
　本発明及び本願明細書において、麦芽発酵液や飲料のエタノール濃度は、例えば、ＡＤＨ（alcohol dehydrogenase）及びＡｌＤＨ（aldehyde dehydrogenase）を用いて生成されたＮＡＤＨ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide）量を分光法により計測する酵素法、多機能バイオセンサＢＦ－５（王子計測機器製）を用いた酵素法、蒸留－密度（比重）法、ガスクロマトグラフ（ＧＣ：Gas Chromatography）分析法、酸化法（酸化還元滴定法）等により測定することができる。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法においては、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いた発酵により、麦芽発酵液のエタノール産生を抑えられるだけではなく、麦汁由来の不快臭の残存も抑制できる。例えば、麦汁に由来する不快臭の一つに、メチオナールがある。本発明に係る麦芽発酵液の製造方法においては、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、かつＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下の麦芽発酵液を製造できる。メチオナールは、麦汁臭の原因香気成分であり、発酵が進むにつれて低減する。Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下であることは、発酵が進み、麦汁臭が充分に低減されていることを意味する。すなわち、本発明により、エタノール濃度とメチオナール濃度の両方が充分に低減された麦芽発酵液が製造できる。
　本発明及び本願明細書において、麦芽発酵液や飲料のメチオナール濃度は、例えば、ＧＣ（ガスクロマトフラフ）分析やＧＣ－ＭＳ分析（ガスクロマトグラフ質量分析）、固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）－ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ分析（ガスクロマトグラフ－トリプル４重極質量分析）により得られたクロマトグラフのピーク面積から求めることができる。ピーク面積からの定量方法は、特に限定されるものではないが、例えば、面積百分率法、内部標準法、標準添加法、及び絶対検量線法が挙げられる。具体的には、下記実施例に記載の方法により求めることができる。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法においては、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いた発酵により、麦芽発酵液のメチオナール濃度を、発酵原料液のメチオナール濃度よりも十分に低減させることもできる。本発明においては、麦芽発酵液のメチオナール濃度は、発酵原料液のメチオナール濃度の好ましくは１５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、さらに好ましく５質量％以下にまで低減させることもできる。すなわち、本発明に係る麦芽発酵液の製造方法により、低エタノールであるが、メチオナール濃度も低く、麦汁臭が抑えられた嗜好性の高い麦芽発酵液が得られる。
　本発明において、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種して発酵させる発酵原料液は、麦芽の糖化物を含むものであり、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスが資化可能な炭素源又は窒素源を含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、麦芽の糖化物のみからなるものであってもよく、麦芽の糖化物以外の炭素源又は窒素源を含むものであってもよい。
　本発明及び本願明細書において、「麦芽の糖化物」とは、麦芽中の糖類を、各種酵素で糖化処理したものである。糖化処理に使用する酵素は、麦芽に本来含まれている酵素であってもよく、麦芽以外に由来する酵素であってもよい。例えば、麦芽又はその粉砕物に水を加えて、５０～６０℃で保持することにより、麦芽由来のアミラーゼによって糖化物が得られる。この際に、麦芽以外に由来する糖化酵素をさらに添加してもよく、タンパク質分解酵素等の糖化酵素以外の酵素を併用してもよい。
　本発明において、麦芽の糖化物としては、例えば、麦汁や麦芽エキスを用いることができる。麦芽エキスは、麦汁を濃縮したものであり、麦芽糖を主成分とする。麦芽エキスは、そのまま炭酸水でわって飲料としたり、飲食品の原材料として使用されている。麦汁の濃縮は、常法により行うことができる。麦汁中の成分への影響が抑えられるため、減圧濃縮が好ましいが、加熱して溶媒を除去して濃縮することもできる。
　麦汁は、麦芽と原料水とを含む混合物を調製して加温し、麦芽の澱粉質を糖化させて調製する。麦芽は、粉砕処理して得られる麦芽粉砕物として用いることが好ましい。麦芽の粉砕処理は、常法により行うことができる。麦芽粉砕物は、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。当該処理としては、例えば、除根等が挙げられる。
　麦芽と原料水を含む混合物には、麦芽以外の発酵原料を含んでいてもよい。当該発酵原料は、穀物原料であってもよく、糖質原料であってもよい。麦芽以外の穀物原料としては、例えば、大麦や小麦等の麦類、米、トウモロコシ、大豆等の豆類、イモ類等が挙げられる。穀物原料は、穀物粉砕物、穀物シロップ、穀物エキス等として用いることもできる。穀物粉砕物としては、コーンスターチ、コーングリッツ等のように、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。当該通常なされる処理としては、例えば、タンパク質・穀皮・胚芽の除去、脱水等が挙げられる。糖質原料としては、例えば、液糖等の糖類が挙げられる。
　麦汁は、このまま発酵原料液として用いてもよいが、酵母を接種させる前に、煮沸処理を行うことが好ましい。当該煮沸処理により、殺菌でき、より安全に発酵を行うことができる。煮沸処理を行う場合、煮沸処理前に、濾過等により不溶性の固形分を除去しておくことが好ましい。当該濾過処理は、特に限定されるものではなく、珪藻土濾過、フィルター濾過等の飲食品の製造工程で一般的に行われている固液分離処理の中から適宜選択して用いることができる。また、この糖液の濾液に替わりに、麦芽エキスに温水を加えたものを用い、これを煮沸してもよい。煮沸方法及びその条件は、適宜決定することができる。
　煮沸処理前又は煮沸処理中に、香草等を適宜添加することにより、所望の香味を有する麦芽発酵液を製造することができる。特にホップは、煮沸処理前又は煮沸処理中に添加することが好ましい。ホップの存在下で煮沸処理することにより、ホップの風味・香気成分を効率よく煮出することができる。ホップの添加量、添加態様（例えば数回に分けて添加するなど）及び煮沸条件は、適宜決定することができる。
　煮沸された麦汁は、酵母を接種させる前に、沈殿により生じたタンパク質等の粕を除去することが好ましい。粕の除去は、いずれの固液分離処理で行ってもよいが、一般的には、ワールプールと呼ばれる槽を用いて沈殿物を除去する。この際の煮汁の温度は、１５℃以上であればよく、一般的には５０～８０℃程度で行われる。粕を除去した後の清澄な麦汁（濾液）は、プレートクーラー等により適切な発酵温度まで冷却する。この粕を除去した後の麦汁が、発酵原料液となる。
　本発明において、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種する発酵原料液のＢｒｉｘは、４％～２０％であるものが好ましく、８％～１８％であるものがより好ましく、１２％～１６％であるものがさらに好ましい。また、本発明において、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種する発酵原料液のｐＨは、３．０～６．０が好ましく、３．５～５．５がより好ましい。
　なお、本発明及び本願明細書において、発酵原料液のＢｒｉｘ値は、屈折計（ＲＸ－５０００α、アタゴ社製）等の測定装置を用いて、常法により測定することができる。
　冷却した発酵原料液にＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種して、発酵を行う。冷却した発酵原料液は、そのまま発酵に供してもよく、所望のエキス濃度に調整した後に発酵に供してもよい。発酵原料液に添加するＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスの量は、特に限定されるものではない。麦汁臭の十分な除去の点から、発酵原料液に接種させるＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスの量は、発酵開始時の前記麦芽発酵液の菌濃度が２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上となる量であることが好ましく、２．０×１０４～２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量であることがより好ましい。
　ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスの発酵終了時の到達菌数が多くなりすぎると、産生されるエタノール量が多くなりすぎるおそれがある。一方で、発酵終了時の到達菌数が少なすぎると、発酵が不十分となりやすく、メチオナール等の麦汁由来の不快臭を充分に低減させることが困難な場合がある。目的の低エタノール濃度かつ低不快臭の麦芽発酵液が得られやすい点から、発酵終了時における麦芽発酵液の菌濃度は、３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが好ましく、３．０×１０６～１．４×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがより好ましい。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法において、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種して行う発酵の条件は、特に限定されるものではない。発酵温度としては、１℃以上であればよく、例えば、一般的に酵母が生存可能な温度域である１～３５℃であることが好ましく、１～２８℃であることがより好ましく、１～２５℃であることがさらに好ましく、１～２０℃であることがよりさらに好ましい。また、発酵開始から発酵終了時まで、一定の温度で発酵させてもよく、発酵温度を適宜変動させてもよい。発酵時間は、発酵温度と所望の製品品質等を考慮して適宜決定することができるが、メチオナール等の麦汁由来の不快臭の充分な低減が期待できることから、４時間以上が好ましい。なかでも、発酵時間としては、４～１６８時間が好ましく、４～９６時間がより好ましく４～７２時間がさらに好ましい。また、発酵液中のＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスが目的の菌濃度に達した時点を、発酵終了時とすることもできる。
　ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスによる発酵では、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスが増殖期にあってもよく、ほとんど増殖しない状態で発酵させてもよい。例えば、１℃ではＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスはごくわずかしか増殖しないが、発酵原料液に十分量のＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種させることにより、目的の低エタノール濃度かつ低不快臭の麦芽発酵液が得られる。一方で、発酵原料液への接種量が少ない場合でも、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスが増殖する環境下で発酵させることにより、目的の低エタノール濃度かつ低不快臭の麦芽発酵液が得られる。
　ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを十分に増殖させるためには、完全嫌気的環境下よりも、嫌気的環境下で発酵させることが好ましい。ここで「嫌気的環境下」とは、完全な嫌気的条件ではなく、一定の酸素付与条件を維持しているが、供給酸素量が菌体増殖に伴う酸素消費量を下回り、結果的に液中の溶存酸素濃度がゼロとなる条件である。また、「完全嫌気的環境下」とは、新たに酸素供給がない環境下、すなわち、「酸素付与のない条件下」を意味する。完全嫌気的環境は、発酵タンクへ供給する気体を、窒素ガスや二酸化炭素ガス等の酸素を含有してないガスで行うことにより達成できる。
　例えば、発酵原料液への植菌数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ未満とする場合には、一定の酸素付与条件で嫌気的環境を維持して発酵させることにより、発酵終了時には３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、好ましくは３．０×１０６～１．４×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬにまでＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを増殖させることができ、目的の低エタノール濃度かつ低不快臭の麦芽発酵液が得られる。一方で、発酵原料液への植菌数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の場合には、嫌気的環境下で発酵させてもよく、完全嫌気的環境下で発酵させた場合でも、発酵時間を調整することで目的の低エタノール濃度かつ低不快臭の麦芽発酵液を得ることができる。例えば、発酵原料液へのＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスの植菌数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、１～３５℃、好ましくは１～２８℃、より好ましくは８～２８℃、さらに好ましくは１２～２４℃で、２４時間以上発酵させることにより、完全嫌気的環境下で発酵させた場合でも、目的の低エタノール濃度かつ低不快臭の麦芽発酵液を得ることができる。
　ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを嫌気的環境下で発酵させる場合には、酸素濃度が適切な範囲内に調節できるよう、１８℃常圧において純水の溶存酸素濃度を６ｐｐｍから８ｐｐｍに上昇させるために要する時間が０時間超５時間以下、例えば、１５分間以上５時間以下となるような酸素付与条件下で行うことが好ましい。当該酸素付与条件下での発酵は、発酵液に直接酸素を混入させるのではなく、空気のような酸素を含有する気体が充填された発酵タンク内で発酵液を撹拌しながら発酵させることにより実施できる。具体的には、発酵タンクで発酵を行う場合には、発酵タンク内の空寸に空気を供給している状態で発酵液を撹拌したり、発酵タンクに０．０２６ＭＰａで加圧して、１ｋＬ発酵液あたりに空気を１０ＮＬ／ｈで供給することにより、前記酸素付与条件を達成できる。また、実験室レベルの低容量の発酵容器内で発酵を行う場合には、例えば、ポンプで発酵液を撹拌したり、５００ｍＬ容三角フラスコに４００ｍＬの麦汁をいれ、振盪培養器を用いて６０ｒｐｍで撹拌したり、５００ｍＬ容のジャーファーメンターに４００ｍＬの麦汁をいれ、排気口に０．２μｍ口径フィルターを取り付けた状態で積極的な空気供給はせず、撹拌羽を５０ｒｐｍで回転させて撹拌することによって、前記酸素付与条件を達成できる。その他、気液接触面の広い発酵容器で静置することによっても、前記酸素付与条件を達成できる。
　本発明において得られた麦芽発酵液は、そのまま飲食品の原料とすることができる。当該麦芽発酵液を原料として製造される飲食品は、特に限定されるものではない。本発明において得られた麦芽発酵液を原料として製造される飲食品としては、飲料が好ましく、麦芽発酵飲料がより好ましく、麦芽発酵ビール様発泡性飲料がさらに好ましい。
　なお、本発明及び本願明細書において、「麦芽発酵飲料」とは、麦芽又はその加工品を原料として用い、酵母による発酵工程を経て製造される飲料を意味する。麦芽発酵飲料としては、アルコール飲料であってもよく、エタノール濃度が１．０ｖ／ｖ％未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよい。本発明において得られた麦芽発酵液を原料として製造される麦芽発酵飲料としては、エタノール濃度が、０．０５ｖ／ｖ％未満、好ましくは０．０２５ｖ／ｖ％以下、より好ましくは０．０１ｖ／ｖ％以下、さらに好ましくは０．００８ｖ／ｖ％以下、よりさらに好ましくは０．００５ｖ／ｖ％以下であることが好ましい。
　麦芽発酵飲料としては、例えば、ビール様発泡性飲料が挙げられる。本発明及び本願明細書において、「ビール様発泡性飲料」とは、ビールと同等の又はそれと似た風味・味覚及びテクスチャーを有し、ビールらしさ（香味上ビールを想起させる呈味）を有する発泡性飲料を意味する。麦芽発酵ビール様発泡性飲料としては、具体的には、ビール、麦芽を原料とする発泡酒等が挙げられる。その他、麦芽発酵液を、エタノール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類であってもよい。エタノール含有蒸留液とは、蒸留操作により得られたエタノールを含有する溶液であり、例えば、原料用アルコール（エタノール）であってもよく、ウィスキー、ブランデー、ウオッカ、ラム、テキーラ、ジン、焼酎等の蒸留酒（スピリッツ）等を用いることができる。
　例えば、得られた麦芽発酵液を固液分離処理することにより、酵母等を除去して、麦芽発酵飲料を得ることができる。当該固液分離処理は、酵母等を除去可能な方法であればよく、例えば、遠心分離処理、珪藻土濾過処理、平均孔径が０．４～０．５μｍ程度のフィルターによるフィルター濾過処理等が挙げられ、これらの処理を組み合わせてもよい。また、得られた麦芽発酵液にホップ、ホップエキス、香料等を添加し、発酵麦芽飲料の香味を調整してもよい。香味の調整は、固液分離処理前に行ってもよく、固液分離処理後に行ってもよい。また、固液分離処理後の麦芽発酵液を、０℃程度の低温条件下で貯蔵して熟成させてもよい。麦芽発酵飲料を製造するために、さらに、例えば、ｐＨ調整処理や加熱処理等を常法に従って行ってもよい。
　得られた麦芽発酵液を、適宜希釈することにより、エキス濃度等が所望の範囲内である麦芽発酵飲料を製造することもできる。希釈に用いられる溶液は、特に限定されるものではないが、例えば、水又は炭酸水等が挙げられる。希釈倍率は特に限定されるものではなく、例えば、２～１０倍に希釈することができ、２～６倍希釈がより好ましく、２～４倍希釈がさらに好ましい。また、原麦汁エキス濃度が所望の範囲内、例えば３～７質量％になるように希釈して、麦芽発酵飲料を製造することもできる。麦芽発酵液を希釈する工程は、発酵工程終了後に行ってもよく、酵母等を除去した後に行ってもよく、熟成後の麦芽発酵液に対して行ってもよい。
　麦芽発酵液や麦芽発酵飲料の原麦汁エキス濃度は、日本醸造協会が発行している分析法で規定されている方法（「ＢＣＯＪビール分析法（２０１３改訂版）（ビール酒造組合国際技術委員会(分析委員会)編集）」の「８．５　エキス関係測定法」）に従って測定することができる。具体的には、アルコール濃度と真正エキス濃度から測定することができる。
　麦芽発酵液や麦芽発酵飲料の真正エキス濃度は、「ＢＣＯＪビール分析法（２０１３改訂版）（ビール酒造組合国際技術委員会(分析委員会)編集）」の「８．４．３アルコライザー法」に規定されている方法に従って測定することができる。
　本発明において得られた麦芽発酵液を原料として得られる麦芽発酵飲料のエタノール濃度は、特に限定されるものではない。本発明において得られた麦芽発酵液を原料とすることにより、エタノール濃度が低く、麦汁臭が抑えられた麦芽発酵飲料を製造できる。当該麦芽発酵飲料としては、例えば、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％以下である麦芽発酵飲料が好ましく、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％以下かつメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下である麦芽発酵ビール様発泡性飲料がより好ましく、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０１ｖ／ｖ％以下かつメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下である麦芽発酵ビール様発泡性飲料がさらに好ましく、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０１ｖ／ｖ％以下かつメチオナール濃度が１．０ｐｐｂ以下である麦芽発酵ビール様発泡性飲料がよりさらに好ましい。
　次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
＜エタノール濃度測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、麦芽発酵液又は飲料中のエタノール濃度は、下記の方法により測定した。
　蒸留水を用いてエタノール濃度が０．５～２．０ｖ／ｖ％になるようにサンプルを希釈した溶液を、多機能バイオセンサ（ＢＦ－５、王子機器計測社製）により測定した。得られた測定値に希釈倍率を乗じた値を、サンプル中のエタノール濃度（ｖ／ｖ％）とした。
　なお、当該多機能バイオセンサは、アルコールオキシダーゼによる酸化によって生じた過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を電気化学的に検出する装置であり、メタノールとエタノールの合計濃度が測定できる。酵母はメタノールを生合成しないことなどから、麦芽発酵液には、メタノールは、誤差範囲といえる程度の微量しか含まれていない。このため、当該多機能バイオセンサによる測定値は、麦芽発酵液サンプルのエタノール量の測定値である。
　エタノール濃度が０．５ｖ／ｖ％未満のサンプルの場合には、この多機能バイオセンサを使用して、アルコール濃度が０．０１～０．０４ｖ／ｖ％となるようにサンプルを希釈した溶液に対して、アジ化ナトリウム非含有の緩衝液（ＳＬ０４－００１５、王子機器計測社製）を用いた高感度測定法により、エタノール濃度の測定を行った。
＜メチオナールの分析＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料のメチオナールの濃度は、ＧＣ－ＭＳ分析法により定量した。分析に使用したＭＲＭトランジションを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　具体的には、固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）－ＧＣ－ＭＳ／ＭＳにより、以下の要領で測定した。１０ｍＬのヘキサン洗浄水が入ったバイアルに、６ｇ／Ｌに調製したｏ－（２，３，４，５，６－ｐｅｎｔａｆｌｕｏｌｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ・ＨＣｌ（ＰＦＢＯＡ）を１００μＬ入れ、これを誘導体化試薬とした。ＳＰＭＥファイバー（ＰＤＭＳ／ＤＶＢ：６５μｍ、１ｃｍ、５７３２７－Ｕ　２４ｇａｕｇｅ　ＳｔａｂｌｅＦｌｅｘ、ＳＰＥＬＣＯ社製）を、ＰＦＢＯＡ溶液が入ったバイアルのヘッドスペースに、５０℃で１０分間、露出させた。続いて、１０ｇの試料と、５ｍｇ／Ｌになるようエタノールに溶解したＭｅｔｈｉｏｎａｌ－ｄ３が５０μＬ入ったバイアルのヘッドスペースに、ＰＦＢＯＡを捕集したＳＰＭＥファイバーを５０℃で６０分間露出させた。誘導体化したメチオナールは、以下のＧＣ－ＭＳ／ＭＳ条件で分析した。
＜ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ条件＞
装置：多機能オートサンプラＭＰＳ２システム（Ｇｅｒｓｔｅｌ社製）が搭載されたＧＣ－ＭＳ／ＭＳ（７８９０Ａ／７０００Ｃ　Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
カラム：ＨＰ－５ＭＳ　ＵＩ　３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
キャリアガス：ヘリウム
流量：１ｍＬ／分
昇温条件：８０℃（５分間）→１５℃／分→１５０℃→５℃／分→２２０℃→５０℃／分→３００℃（５分間）
注入法：スプリットレス
パージフロー：５０ｍＬ／分、１分間
注入口温度：２５０℃
圧力：９．３８２５ｐｓｉ
トランスファーライン：３２０℃
イオン化：電子イオン化法（７０ｅＶ）
イオン源温度：２５０℃
四重極温度：１５０℃
Ｈｅクエンチガス流量：２．２５ｍＬ／分
Ｎ２コリジョンガス流量：１．５ｍＬ／分
ＭＲＭトランジション：（表１参照）
＜Ｂｒｉｘ測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料のＢｒｉｘは、デジタル屈折計（ＲＸ－５０００α、アタゴ社製）を用いて測定した。
＜ｐＨ測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料のｐＨは、ｐＨ計測機（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ－ｐＨ－３３、Ｈｏｒｉｂａ社製）により測定した。
＜麦汁Ａ及びＤの調製＞
　麦汁Ａ及びＤは、２００Ｌスケールの仕込設備を用いて製造した。まず、仕込槽に、発酵原料となる粉砕麦芽及びデンプン質副原料を４０ｋｇと原料水を１６０Ｌとを投入した。次いで、当該仕込槽内の混合物を常法に従って加温して糖化させた後、得られた糖化液を濾過した。得られた濾液にホップを添加した後、煮沸した。煮沸後の濾液を沈降槽に移して沈殿物を分離除去した後、ｐＨをリン酸で調整し、冷却して麦汁Ａ及びＤを得た。得られた麦汁Ａ及びＤの分析値は、表２の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜麦汁Ｂ及びＣの調製＞
　表３に記載の市販の麦芽エキスを水で希釈、混合し、それぞれ表３に記載のＢｒｉｘ及びｐＨの麦汁Ｂ又は麦汁Ｃとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［参考例１］
　１８℃、大気圧で、純水を下記の酸素付与条件でインキュベートし、溶存酸素濃度を測定した。
酸素付与条件１：５００ｍＬ容の三角フラスコに４００ｍＬの純水をいれ、振盪培養器で６０ｒｐｍで撹拌する。
酸素付与条件２：５００ｍＬ容のジャーファーメンターに４００ｍＬの純水をいれ、排気口に０．２μｍ口径フィルターを取り付けた状態で積極的な空気供給はせず、撹拌羽を５０ｒｐｍで回転させて撹拌する。
酸素付与条件３：２００Ｌ容の発酵タンクに１００Ｌの純水を入れ、て０．０２６ＭＰａで加圧して、１００Ｌ純水あたり空気を０．６７ＮＬ／分で供給する。
酸素付与条件４：５００ｍＬ容のジャーファーメンターに４００ｍＬの純水をいれ、排気口に０．２μｍ口径フィルターを取り付けて窒素ガスを吹き込む状態で、撹拌羽を５０ｒｐｍで回転させて撹拌する（完全嫌気的条件）。
　各条件で溶存酸素濃度を経時的に測定した結果を図１に示す。この結果、酸素付与条件１～３では、１８℃常圧において、純水の溶存酸素濃度を６．０ｐｐｍから８．０ｐｐｍに上昇させるために要する時間は、０時間超５時間以下であった。一方で、酸素付与条件４では、酸素供給がないため、当該純水の溶存酸素濃度は０ｐｐｍに保持されていた。
［実施例１］
　様々な酵母を用いて麦汁をフラスコ内で発酵させ、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。
＜酵母＞
　クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ１２６７株、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ１０９０ＴＳ株、リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）ＮＢＲＣ１０３８１ＴＳ株、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）ＮＢＲＣ１２８８ＴＳ株、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）ＮＢＲＣ７１７株、ロドトルラ・グルンティス（Rhodotorula gluntis）ＮＢＲＣ１１２５ＴＳ株、サッカロマイコーデス・ルドウィギイＮＢＲＣ７９８ＴＳ株、及びトルラスポラ・デルブリュッキ（Torulaspora delbrueckii）ＮＢＲＣ９５５ＴＳ株を用いた。株名の末尾に「ＴＳ」とある株は、タイプストレイン株である。
　使用した３株のクルイベロミセス・ラクチスのうち、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株はＲＡＧ－表現型であり、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ１２６７株、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ１０９０ＴＳ株はＲＡＧ－表現型を持たず、呼吸阻害剤存在下でも増殖可能である。
＜４００ｍＬスケール試験＞
　発酵原料液として、麦汁Ａを用いた。まず、Ｂｒｉｘ５質量％となるよう水で希釈した麦汁で一晩前培養した各酵母を、１度水で洗浄した後、５００ｍＬ容の三角フラスコに入れた麦汁（Ｂｒｉｘ１２．０％）各４００ｍＬに、酵母の初発菌数が麦汁１ｍＬあたり１．０×１０６個となるよう添加した。次いで、酵母を接種した麦汁を、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍ、１８℃常圧にて振盪培養を行い、３日間発酵させた。その後、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。
　なお、５００ｍＬ容の三角フラスコに純水４００ｍＬを入れて、１８℃常圧において、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした場合、当該純水の溶存酸素濃度が６．０ｐｐｍから８．０ｐｐｍに上昇するのに要する時間は１３５分間であった。
　発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度の定量結果を表４に示す。表中、「ＫＬ」はクルイベロミセス・ラクチス、「ＬＳ」はリポマイセス・スターキー、「ＬＬ」はリポマイセス・リポファ、「ＹＬ」はヤロウィア・リポリティカ、「ＲＧ」はロドトルラ・グルンティス、「ＳＬ」はサッカロマイコーデス・ルドウィギイ、及び「ＴＢ」はトルラスポラ・デルブリュッキをそれぞれ示す。また、「到達菌数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）」は発酵終了時の発酵液の菌濃度を、「エタノール（％ＡＢＶ）」は発酵終了時の発酵液のエタノール濃度（ｖ／ｖ％）を、「エタノール/Ｂｒｉｘ５％相当（％ＡＢＶ）」は発酵終了時の発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度（ｖ／ｖ％）を、「メチオナール（ｐｐｂ）」は発酵終了時の発酵液のメチオナール濃度（ｐｐｂ）を、「メチオナール/Ｂｒｉｘ５％相当（ｐｐｂ）」は発酵終了時の発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度（ｐｐｂ）を、それぞれ示す。ただし、「植菌無し」欄では、「メチオナール濃度（ｐｐｂ）」は発酵原料液（植菌前の麦汁）のメチオナール濃度（ｐｐｂ）を、「メチオナール/Ｂｒｉｘ５％相当（ｐｐｂ）」は発酵原料液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度（ｐｐｂ）を、それぞれ示す。また、「メチオナール低減率（％）」は、発酵原料液からのメチオナール濃度の低減率（１００％－［発酵終了時の発酵液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度（ｐｐｂ）］／［発酵原料液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度（ｐｐｂ）］×１００％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、いずれの酵母でも、ノンアルコールビールの製造に商業利用されているサッカロマイコーデス・ルドウィギイと同様にエタノール濃度の低い発酵液が得られたが、特に、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株、リポマイセス・スターキーＮＢＲＣ１０３８１ＴＳ株、リポマイセス・リポファＮＢＲＣ１２８８ＴＳ株、ヤロウィア・リポリティカＮＢＲＣ７１７株、ロドトルラ・グルンティスＮＢＲＣ１１２５ＴＳ株は、Ｂｒｉｘ５．０％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満と非常に低かった。これらのうち、特に、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株、及びリポマイセス・リポファＮＢＲＣ１２８８ＴＳ株で発酵させた発酵液では、メチオナール低減率が８０％以上であり、発酵も十分に行われていた。
　３株のクルイベロミセス・ラクチスで発酵させた発酵液は、いずれもメチオナール低減率が９０%以上であり、発酵は十分になされていたが、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度（ｖ／ｖ％）を０．０５ｖ／ｖ％以下にまで低減できたのは、Ｒａｇ－表現型であるクルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株のみであった。
＜官能評価＞
　官能評価は、各発酵液を２．５６倍希釈した液（発酵麦芽ビール様発泡性飲料）を評価試料として、熟練のパネリスト５名により、１点から７点のＳＤ法(semantic differential method)（Frey, The SAGE Encyclopedia of Educational Research, Measurement, and Evaluation, "Semantic Differential Scaling" , 2018, p. 1504-1507）を用いて行った。評価項目は、（ａ）麦汁臭の強さ、及び（ｂ）おいしさとした。（ａ）については香りで、（ｂ）については味で評価を行った。評価試料はそれぞれ２０ｍＬとし、評価する順番はパネリストによって異なるようランダム化した。
　（ａ）については、１点に水、７点に麦汁Ａを標品として使用して評価した。
　（ｂ）については、麦汁Ａをコントロール（３点）として、採点を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　官能評価の評価結果を表５に示す。発酵原料液のＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度（ｐｐｂ）が低かったクルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ１２６７株、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ１０９０ＴＳ株、リポマイセス・リポファＮＢＲＣ１２８８ＴＳ株、及びロドトルラ・グルンティスＮＢＲＣ１１２５ＴＳ株の発酵液の希釈液は、麦汁臭が弱く、おいしさの評価も高かった。特に、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株で発酵させた発酵液の希釈液は、サッカロマイコーデス・ルドウィギイで発酵させた発酵液の希釈液と同様に、おいしさの評点が５以上と高く、かつ、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．００４ｖ／ｖ％と非常に低く、マイルドですっきりとした飲みやすいビール様発泡性飲料であった。
［実施例２］
　様々なＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いて麦汁をフラスコ内で発酵させ、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。
＜酵母＞
　ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとしては、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株及び／又はＮＢＲＣ１２６７株から育種した、表６に記載の株を用いた。表中、「ＫＬ」は「Kluyveromyces lactis」の略である。
＜ＫＬ　Ｎｏ．８６の取得＞
　麦汁９０ｍＬを１００ｍＬ容三角フラスコに入れ、ＮＢＲＣ６４８株（前培養菌体）を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ植菌し、１８℃で６０ｒｐｍロータリーにて２日間の培養を５回繰り返した。得られた菌体をＹＭ寒天培地に塗抹し、アネロパック・微好気（三菱ガス化学社製）とともに密閉容器に入れ、２５℃で５日間培養した。寒天培地上に生じたコロニーのうち、生育が早いコロニーを選抜した。
＜ＫＬ　Ｐ１３及びＫＬ　Ｐ１５の取得＞
　純水にＫＬ　ＮＢＲＣ６４８を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁し、懸濁液を得た。パラフルオロフェニルアラニン含有寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ/ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、２％ Ｇｌｕｃｏse、１．０ ｍｇ/ｍＬ パラフルオロフェニルアラニン、２％ ａｇａｒ）に懸濁液１００μＬを植菌し、２５℃で４日間培養した。寒天培地上に生じたコロニーのうち、香気成分（βフェネチルアルコール）の産生量が多い株を選抜した。
＜ＫＬ　６４８×１２６７－２Ｃ、ＫＬ　６４８×１２６７－４Ａ、ＫＬ　６４８×１２６７－５Ｂの取得＞
　ＮＢＲＣ６４８株とＲＡＧ－表現型を持たないＫＬ　ＮＢＲＣ１２６７株を接合して得られた胞子のうち、ＲＡＧ－表現型をもつ株を選抜した。
＜ＫＬ　１２６７－Ｒ６、ＫＬ　１２６７－Ｒ３３の取得＞
　ＫＬ　ＮＢＲＣ１２６７株を０．３％エチルメタンスルホン酸で３０℃、６０分間処理し、生菌率が３８％になるようにした。処理した菌体を１００個程度のコロニーが生えるようにＹＰＤ寒天培地に植菌し、アンチマイシンＡ含有寒天培地（０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ｐｅｐｔｏｎｅ、５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、５μＭ アンチマイシンＡ、２％ ａｇａｒ）にレプリカプレーティングを行った。ＹＰＤ寒天培地では生育可能で、アンチマイシンＡ含有寒天培地では生育できない株を選抜した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜４００ｍＬスケール試験＞
　実施例１と同様にして、前培養した酵母を初発菌数が麦汁１ｍＬあたり１．０×１０６個となるよう麦汁に接種し、１８℃常圧にて３日間振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　全ての育種株から得られた発酵液は、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、麦汁Ａと比較して、メチオナール濃度が８５質量％以上低減されており、さらに、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下であった。これらの結果から、ＲＡＧ－表現型を有するクルイベロミセス・ラクチスであれば、低アルコール濃度かつ低メチオナール濃度の麦芽発酵液が調製できることが確認された。
［実施例３］
　組成やＢｒｉｘが異なる麦汁を発酵原料液としてＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いて発酵させ、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとして、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株を用いた。
（１）
　麦汁Ａに代えて、表８に記載のＢｒｉｘの麦汁を用いた以外は、実施例１と同様にして、前培養した酵母を初発菌数が麦汁１ｍＬあたり１．０×１０６個となるよう麦汁に接種し、１８℃常圧にて３日間振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　麦汁Ｂと麦汁Ｃのいずれを用いた場合でも、麦汁Ａを用いた場合と同様に、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、酵母接種前の麦汁と比較して、メチオナール濃度が８５質量％以上低減されており、さらに、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下の麦芽発酵液が調製できた。
（２）
　麦汁Ａに代えて、麦汁Ｂを表９に記載のＢｒｉｘに調製した麦汁を用いた以外は、前記（１）と同様にして、前培養した酵母を麦汁に酵母菌数が麦汁１ｍＬあたり１．０×１０６個となるよう接種し、１８℃常圧にて３日間振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　発酵原料液のＢｒｉｘ値にかかわらず、得られた麦芽発酵液は、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、酵母接種前の麦汁と比較して、メチオナール濃度が８５質量％以上低減されており、さらに、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下であった。
［実施例４］
　発酵原料液に接種させるＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスの菌数や到達菌数を変えて、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとして、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株を用い、発酵原料液として麦汁Ａを使用した。
　培養時間、培養スケール、及び初発菌数を表１０に記載の通りとした以外は、実施例１と同様にして、前培養した酵母を、初発菌数が麦汁１ｍＬあたり１．０×１０６個となるように、三角フラスコに入れた麦汁に接種し、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍ、１８℃常圧にて振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１０に示す。
　表中、「培養スケール」のうち、「１６０／２００ｍＬ」及び「１６０／５００ｍＬ」は、それぞれ、２００ｍＬ容の三角フラスコ又は５００ｍＬ容の三角フラスコに、１６０ｍＬの麦汁を入れ、当該麦汁に酵母を接種させたことを示す。
　なお、５００ｍＬ容の三角フラスコに純水１６０ｍＬを入れて、１８℃常圧において、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした場合、当該純水の溶存酸素濃度が６．０ｐｐｍから８．０ｐｐｍに上昇するのに要する時間は１時間であった。また、２００ｍＬ容の三角フラスコに純水１６０ｍＬを入れて、１８℃常圧において、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした場合、当該純水の溶存酸素濃度が６．０ｐｐｍから８．０ｐｐｍに上昇するのに要する時間は１６０分間であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０中、培養時間が０日間の欄が、酵母を植菌する前の発酵原料液（麦汁）の測定結果を示す。表１０に示すように、到達菌数が３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ未満であった発酵液では、メチオナールの低減率が６０％以下であり、発酵が不十分であった。一方で、到達菌数が１．４×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ超であった発酵液では、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％超であり、エタノール産生量が多かった。到達菌数が３．０×１０６～１．４×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった発酵液では、初発菌数や発酵日数にかかわらず、いずれもＢｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％以下、かつメチオナール低減率９０％以上であり、低アルコールかつ低メチオナールの良好な麦芽発酵液が得られた。
［実施例５］
　発酵原料液にＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種して発酵時間を変えて、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとして、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株を用い、発酵原料液として麦汁Ａを使用した。
　２００ｍＬ容の三角フラスコに１６０ｍＬの麦汁を入れて、培養日数及び初発菌数を表１１に記載の通りとした以外は、実施例１と同様にして、前培養した酵母を、初発菌数が麦汁１ｍＬあたり１．０×１０６個となるように三角フラスコに入れた麦汁に接種し、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍ、１８℃常圧にて振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１中、培養時間が０時間の欄が、酵母を植菌する前の発酵原料液（麦汁）の測定結果を示す。表１１に示すように、培養時間が長くなるほど、メチオナール低減率は高くなっていた。酵母と麦汁の接触時間が４時間以上の場合に、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、かつ、麦汁（発酵原料液）と比較して、メチオナールが８５質量％以上低減されており、かつＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下である麦芽発酵液が得られた。
［実施例６］
　発酵原料液にＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種して発酵させる際の酸素付与条件を変えて、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとして、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株を用い、発酵原料液として麦汁Ａを使用した。
（１）酸素付与条件２（参考例１）での発酵
　５００ｍＬ容のジャーファーメンターに４００ｍＬの麦汁をいれ、酵母を初発菌数が麦汁１ｍＬあたり２．０×１０５個となるように接種させた後、排気口に０．２μｍ口径フィルターを取り付けて積極的な空気供給はしないが空気の出入りは可能にしてある状態で、撹拌羽を５０ｒｐｍで回転させて撹拌して、１８℃常圧で１日間発酵させた以外は、実施例１と同様にして、前培養した酵母を麦汁に接種し、発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１２に示す。
（２）酸素付与条件４（参考例１）での発酵
　５００ｍＬ容のジャーファーメンターに４００ｍＬの麦汁をいれ、酵母を初発菌数が麦汁１ｍＬあたり２．０×１０５個となるように接種させた後、排気口に０．２μｍ口径フィルターを取り付けて窒素ガスを吹き込む状態で、撹拌羽を５０ｒｐｍで回転させて撹拌して、１８℃常圧で１日間発酵させた以外は、前記（１）と同様にして、前培養した酵母を麦汁に接種し、発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２中、「酸素付与条件」が「２」の欄は、積極的な空気供給はしないが空気の出入りは可能にしてある状態（参考例１の酸素付与条件２）で発酵させた場合の結果であり、「４」の欄は、窒素ガスを吹き込む状態（参考例１の酸素付与条件４）で発酵させた場合の結果である。嫌気的環境である酸素付与条件２での発酵では、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、かつ、麦汁（発酵原料液）と比較して、メチオナールが８５質量％以上低減されており、かつＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下である麦芽発酵液が得られた。一方で、完全嫌気的環境である酸素付与条件４での発酵では、メチオナール低減率が３０％程度しかなく、発酵が不十分であった。
　次いで、初発菌数を表１３に記載の量とした以外は、前記（２）と同様にして、酸素付与条件４で発酵を行った。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３に示すように、植菌数（初発菌数）が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを上回る場合には、完全嫌気的環境での発酵であっても、到達菌数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを上回り、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、かつ、麦汁（発酵原料液）と比較して、メチオナールが８５質量％以上低減されており、かつＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下である麦芽発酵液が得られた。これらの結果から、発酵中に酵母の増殖が抑えられている完全嫌気的環境であっても、初発菌数が充分に多い場合には、目的の低アルコール濃度かつ低メチオナール濃度の麦芽発酵液が得られることがわかった。
［実施例７］
　発酵原料液にＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを接種して発酵させる際の発酵温度を変えて、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。発酵原料液として麦汁Ａを使用した。
　ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスとして、クルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株を用い、２００ｍＬ容の三角フラスコに１６０ｍＬの麦汁を入れて、発酵温度及び初発菌数を表１４に記載の通りとした以外は、実施例１と同様にして、前培養した酵母を麦汁に接種し、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍ、１８℃常圧にて振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１４に示すように、発酵温度が低く、発酵期間中に酵母はほとんど増殖しない場合であっても、到達菌数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを上回る場合には、メチオナール低減率を９０％以上とすることができ、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、かつＢｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満である麦芽発酵液が調製できた。
［実施例８］
　発酵温度１℃として、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。発酵原料液として麦汁Ａを使用した。酵母としては、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであるクルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株及びクルイベロミセス・ラクチスＲ３３株と、サッカロマイコーデス・ルドウィギイＮＢＲＣ７９８ＴＳ株とを用いた。
　３００ｍＬ容の三角フラスコに２４０ｍＬの麦汁を入れて、発酵温度、酵母の菌種、及び初発菌数を表１５に記載の通りとした以外は、実施例１と同様にして、前培養した酵母を麦汁に接種し、インキュベーターの回転数を６０ｒｐｍ、１８℃常圧にて振盪培養を行って発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１５に示す。
　また、得られた各発酵液を２．５６倍希釈した液（発酵麦芽ビール様発泡性飲料）を調製し、熟練のパネリスト５名により、その呈味を評価した。結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１５に示すように、いずれの酵母を用いて得られた発酵液でも、メチオナール低減率は８５％以上であり、十分に発酵されていた。特に、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであるクルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株及びクルイベロミセス・ラクチスＲ３３株を用いて得られた発酵液では、エタノール産生量も低く、サッカロマイコーデス・ルドウィギイＮＢＲＣ７９８ＴＳ株を用いて得られた発酵液と比較して、マイルドだが、すっきりして軽快であり、飲みやすいという特徴を有していた（表１６）。
［実施例９］
　パイロットスケールでＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いて発酵させ、得られた発酵液の菌濃度、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を調べた。発酵原料液として麦汁Ｄを使用した。酵母としては、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであるクルイベロミセス・ラクチスＮＢＲＣ６４８株及びクルイベロミセス・ラクチスＲ８６株を用いた。
＜発酵タンク発酵＞
　２００Ｌ容の発酵タンクに、麦汁Ｄ（Ｂｒｉｘ９．０％）１００Ｌを入れ、当該発酵タンクに、初発菌数が表１７に記載の量となるように酵母を添加した。次いで、発酵タンクを０．０２６ＭＰａで加圧して、１００Ｌ発酵液あたりに空気を０．６７ＮＬ／分で供給した条件（参考例１における酸素付与条件３）下で、１８℃、３日間発酵させた。得られた発酵液の菌濃度（到達菌数）、エタノール濃度、及びメチオナール濃度を定量した。その結果を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１７に示すように、パイロットスケールであっても、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスを用いて適切な酸素付与条件下で発酵させることにより、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、かつ、麦汁（発酵原料液）と比較して、メチオナールが８５質量％以上低減されており、かつＢｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３ｐｐｂ以下である麦芽発酵液が得られることが確認された。

Claims (16)

  1. 　麦芽の糖化物を含む発酵原料液に酵母を接種して発酵させて、麦芽発酵液を調製する工程を有し、
    　前記酵母が、ＲＡＧ－表現型クルイベロミセス・ラクチスであり、
    　前記麦芽発酵液が、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満である、麦芽発酵液の製造方法。
  2. 　前記麦芽発酵液が、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下である、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  3. 　前記麦芽発酵液のメチオナール濃度が、前記発酵原料液のメチオナール濃度の１５質量％以下である、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  4. 　発酵終了時の前記麦芽発酵液の菌濃度が、３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  5. 　発酵開始時の前記麦芽発酵液の菌濃度が、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  6. 　前記発酵を、酸素付与条件下で行い、
    　前記酸素付与条件が、１８℃常圧において、純水の溶存酸素濃度を６．０ｐｐｍから８．０ｐｐｍに上昇させるために要する時間が０時間超５時間以下である条件である、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  7. 　前記発酵を、酸素付与のない条件下で行う、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  8. 　前記発酵を、１℃以上で行う、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  9. 　前記発酵を、４時間以上行う、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  10. 　前記発酵を、２４時間以上行う、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の麦芽発酵液の製造方法により麦芽発酵液を製造した後、得られた麦芽発酵液を原料として、麦芽発酵飲料を製造する、麦芽発酵飲料の製造方法。
  12. 　前記麦芽発酵液を希釈する工程を有する、請求項１１に記載の麦芽発酵飲料の製造方法。
  13. 　原麦汁エキスが３～７質量％である麦芽発酵飲料を製造する、請求項１１に記載の麦芽発酵飲料の製造方法。
  14. 　前記麦芽発酵飲料がビール様発泡性飲料である、請求項１１に記載の麦芽発酵飲料の製造方法。
  15. 　Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのエタノール濃度が０．０５ｖ／ｖ％未満であり、Ｂｒｉｘ５．０質量％あたりのメチオナール濃度が３．０ｐｐｂ以下である、麦芽発酵飲料。
  16. 　ビール様発泡性飲料である、請求項１５に記載の麦芽発酵飲料。
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