WO2024257876A1 - 液体酵素製剤 - Google Patents

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WO2024257876A1
WO2024257876A1 PCT/JP2024/021776 JP2024021776W WO2024257876A1 WO 2024257876 A1 WO2024257876 A1 WO 2024257876A1 JP 2024021776 W JP2024021776 W JP 2024021776W WO 2024257876 A1 WO2024257876 A1 WO 2024257876A1
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liquid enzyme
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protein
protease
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寛之 谷内
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Amano Enzyme Inc
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Amano Enzyme Inc
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    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)

Definitions

  • the present invention relates to a liquid enzyme preparation. More specifically, the present invention relates to a liquid enzyme preparation containing protein deamidase, which has excellent activity stability of protein deamidase.
  • protein glutaminase derived from Chryseobacterium gleum JCM2410 strain and protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum 9670 strain are known as enzymes that deamidate the ⁇ -amide and ⁇ -amide groups of glutamine and asparagine residues in proteins. Enzyme preparations of such protein deamidating enzymes are currently only available commercially in powder form.
  • Patent Document 2 proposes a liquid enzyme preparation that contains at least one milk protein cross-linking and/or modification enzyme in a polyol-water suspension containing 25% to 100% (w/w) polyol and having a pH value in the range of 4.4 to 5.1.
  • Patent Document 2 finds that transglutaminase is less stable at pH 5.2, and based on this finding, it discloses that the stability of a transglutaminase preparation in a glycerol-water suspension at pH 4.4 to 4.8 and a transglutaminase preparation in a sorbitol-water suspension at pH 4.6 is improved, and also discloses a tyrosinase preparation in a glycerol-water suspension at pH 4.6 and a protein glutaminase preparation in a glycerol-water suspension at pH 4.6.
  • Patent Document 3 also describes that a useful protein composition, such as a stable interferon, can be produced by bubbling an asphyxiant gas such as nitrogen into a useful protein composition that contains a useful protein, a solvent, and a compound having a thiol structure, to reduce the dissolved oxygen concentration to 3 mg/L or less.
  • an asphyxiant gas such as nitrogen
  • Patent Document 2 examines the stability of liquid enzyme preparations of transglutaminase preparations, but only discloses the formulation of liquid enzyme preparations of protein deamidase, and does not fully examine the stability of this enzyme.
  • Patent Document 3 examines the antiviral activity of an aqueous preparation containing canine interferon- ⁇ , but does not even mention liquid enzyme preparations of protein deamidase, and naturally does not examine them at all.
  • some enzyme preparations are composed of a combination of multiple types of enzymes, but no examination is conducted on the stability of protein deamidase in liquid enzyme preparations that contain protein deamidase together with other enzymes.
  • the object of the present invention is to provide a liquid enzyme preparation that contains protein deamidase together with other enzymes and has excellent activity stability of protein deamidase.
  • a liquid enzyme preparation containing protein deamidase has excellent stability of activity of protein deamidase even when it contains a protease.
  • the present inventors have found that in a liquid enzyme preparation containing protein deamidase and protease, the activity stability of protein deamidase is further improved when the preparation is stored in a container whose internal space is replaced with an inert gas, when the upper limit of the protease content is limited to a predetermined amount, and/or when sorbitol is added in the presence of a predetermined amount or more of protease, and that excellent activity stability of protein deamidase is obtained even when citrate is added in the presence of a predetermined amount or more of protease.
  • the present invention was completed based on these findings. That is, the present invention includes the following inventions:
  • Item 1 A liquid enzyme preparation comprising (A) a protein deamidase and (B) a protease.
  • Item 2. The liquid enzyme preparation according to Item 1, wherein the liquid enzyme preparation is contained in a container whose internal space is replaced with an inert gas.
  • Item 3. The liquid enzyme preparation according to Item 1 or 2, further comprising (C) sorbitol.
  • Item 4. The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 3, further comprising (D) a citrate salt.
  • Item 5. The liquid enzyme preparation according to Item 3, wherein the content of the component (C) is 30 w/v % or more.
  • Item 6. The liquid enzyme preparation according to Item 3 or 4, wherein the content of the component (D) is 1 w/v % or more.
  • Item 8. The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 7, which has a pH of 8.2 or less.
  • Item 9. The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 8, wherein the content of the component (A) is 0.1 to 10,000 U/ml.
  • Item 10. The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 9, wherein the component (A) is a protein deamidase derived from Chryseobacterium proteolyticum.
  • Item 11 The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 10, wherein the content of the component (B) is 0.01 to 2,000 U/mL.
  • Item 13 The liquid enzyme preparation according to Item 12, wherein the bacterial protease is a protease derived from the genus Chryseobacterium.
  • Item 14 The liquid enzyme preparation according to Item 12, wherein the bacterial protease is a protease derived from the genus Bacillus and/or Geobacillus.
  • Item 15 The liquid enzyme preparation according to any one of Items 1 to 14, wherein the content of the component (B) per 100 U of the component (A) is 0.002 to 400 U.
  • the present invention provides a liquid enzyme preparation with excellent activity stability of protein deamidase.
  • 1 shows the relationship between the amount of protease added (addition activity) to a liquid enzyme preparation containing protein deamidase and the remaining activity of protein deamidase in the liquid enzyme preparation.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention is characterized by containing (A) protein deamidase (hereinafter also referred to as “component (A)”) and (B) protease (hereinafter also referred to as “component (B)”).
  • component (A) protein deamidase
  • component (B) protease
  • the liquid enzyme preparation of the present invention will be described in detail below.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention may contain (C) sorbitol (hereinafter also referred to as “component (C)”) and/or (D) citrate (hereinafter also referred to as “component (D)”).
  • the liquid enzyme preparation of the present invention contains protein deamidase as component (A).
  • Protein deamidase is an enzyme that exhibits the action of decomposing amide group-containing side chains of proteins without cleavage of peptide bonds and cross-linking of proteins, and its type, origin, etc. are not particularly limited. In addition, as long as the above action is the main activity, it may further have the action of decomposing amide group-containing side chains of proteins with cleavage of peptide bonds and cross-linking of proteins.
  • protein deamidase examples include enzymes that deamidate glutamine residues in proteins and convert them to glutamic acid (e.g., protein glutaminase) and enzymes that deamidate asparagine residues in proteins and convert them to aspartic acid (e.g., protein asparaginase). More specific examples of protein deamidating enzymes include those of the genus Chryseobacterium, Flavobacterium, Empedobacter, Sphingobacterium, Aureobacterium, etc., which are disclosed in JP2000-50887A, JP2001-218590A, and WO2006/075772A1.
  • protein deamidase examples include a protein deamidase derived from the genus Luteimicrobium, Agromyces, Microbacterium, or Leifsonia disclosed in WO2015/133590; and a commercially available protein glutaminase derived from the genus Chryseobacterium. These protein deamidases may be used alone or in combination of two or more kinds.
  • protein deamidating enzymes derived from the genus Chryseobacterium are preferred, protein glutaminases derived from the genus Chryseobacterium are more preferred, and protein glutaminase derived from the species Chryseobacterium proteolyticum is even more preferred.
  • Protein deamidase can be prepared from the culture medium of the microorganism from which the protein deamidase is derived. Specific preparation methods include a method of recovering protein deamidase from the culture medium or cells of the microorganism. For example, when a protein deamidase-secreting microorganism is used, the cells can be recovered from the culture medium in advance by filtration, centrifugation, or the like as necessary, and the enzyme can be separated and/or purified. When a protein deamidase-nonsecreting microorganism is used, the cells can be recovered from the culture medium in advance by pressure treatment, ultrasonic treatment, or the like to expose the enzyme, and the enzyme can be separated and/or purified.
  • a known protein separation and/or purification method can be used without any particular limitation, and examples of the method include centrifugation, UF concentration, salting out, and various chromatography methods using ion exchange resins, etc.
  • the content of component (A) in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 to 10,000 U/mL, 1 to 5,000 U/mL, 10 to 3,000 U/mL, or 50 to 2,000 U/mL, preferably 100 to 1,500 U/mL, more preferably 200 to 1,000 U/mL, even more preferably 300 to 900 U/mL or 350 to 700 U/mL, and even more preferably 400 to 600 U/mL.
  • the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of ammonia per minute using benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine (Z-Gln-Gly) as a substrate is defined as 1 unit (1 U).
  • the liquid enzyme preparation of the present invention contains a protease as component (B).
  • the protease is not particularly limited in terms of origin, and examples thereof include bacterial proteases.
  • Bacterial proteases include proteases derived from the genera Chryseobacterium, Bacillus, and Geobacillus.
  • protease derived from the genus Chryseobacterium is not particularly limited as long as it can achieve the desired effects of the present invention.
  • Specific examples of proteases derived from the genus Chryseobacterium include Chryseobacterium nematophagum, Chryseobacterium cucumeris, Chryseobacterium lactis, Chryseobacterium rhizoplane, Chrys
  • the proteases include those derived from Eobacterium joostei, Chryseobacterium shigense, Chryseobacterium proteolyticum, Chryseobacterium gleum, and Chryseobacterium soil.
  • proteases derived from the genus Chryseobacterium may be used alone or in combination of two or more types.
  • proteases derived from the genus Chryseobacterium proteases derived from the species Chryseobacterium proteolyticum are preferred from the viewpoint of further enhancing the activity stabilizing effect of protein deamidase.
  • the protease derived from the genus Chryseobacterium can be prepared by known methods. For example, it can be easily prepared by culturing bacteria of the genus Chryseobacterium and isolating the protease using known means, or by using genetic recombination technology.
  • proteases derived from the genus Bacillus include Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus intermedius, and Bacillus lentus.
  • proteases that can be used include proteases derived from Geobacillus s, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, and Bacillus thermoproteolyticus, and proteases derived from these Geobacillus species.
  • the above-mentioned proteases may be used alone or in combination of two or more kinds.
  • proteases derived from the genus Bacillus from the viewpoint of further enhancing the activity stabilizing effect of protein deamidase, proteases derived from Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, and these proteases derived from the genus Geobacillus are preferred.
  • the content of component (B) in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, but examples of the content include 0.01 to 10,000 U/mL or 0.01 to 5,000 U/mL.
  • the content of component (B) in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 0.01 to 3,500 U/mL, more preferably 0.01 to 3,000 U/mL or 0.01 to 2,500 U/mL, and even more preferably 0.01 to 2,000 U/mL, 0.01 to 1,800 U/mL, 0.01 to 1,650 U/mL, 0.01 to 1,500 U/mL, 0.01 to 1,400 U/mL, 0.01 to 1,300 U/mL, 0.01 to 1,200 U/mL, 0.01 to 1,100 U/mL, 0.01 to 1,000 U/mL, 0.01 to 900 U/mL, 0.01 to 800 U/mL, 0.01 up to 700 U/mL, 0.01 to 600 U/mL, 0.01 to 500 U/mL, 0.01 to 400 U/mL, 0.01 to 300 U/mL, 0.01 to 200 U/mL, or 0.01 to 150 U/mL, more preferably 0.01 to
  • the content of component (B) in the liquid enzyme preparation of the present invention is 0.1 to 2,000 U/mL, 0.5 to 2,000 U/mL, 1 to 2,000 U/mL, 5 to 2,000 U/mL, 10 to 2,000 U/mL, 15 to 2,000 U/mL, 20 to 2,000 U/mL, 30 to 2,000 U/mL, 40 to 400 U/mL, 50 to 600 U/mL, 60 to 800 U/mL, 70 to 800 U/mL, 80 to 900 U/mL, 90 to 1000 U/mL, 100 to 12000 U/mL, 120 to 1400 U/mL, 140 to 1600 U/mL, 160 to 1800 U/mL, 180 to 2000 U/mL, 180 to 2000 U/mL, 190 to 2000 U/mL, 200 to 2000 U/mL, 200 to 2000 U/mL, 300 to 3000 U/mL, 300 to 4000 U/mL, 400 to
  • the content of component (B) in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 100 to 2,000 U/mL, 150 to 2,000 U/mL, 200 to 2,000 U/mL, 250 to 2,000 U/mL, or 300 to 2,000 U/mL.
  • component (B) per 100 U of component (A) in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, but examples include 0.002 to 2,000 U or 0.002 to 1,000 U.
  • the content of component (B) per 100 U of component (A) in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 0.002 to 700 U, more preferably 0.002 to 600 U or 0.002 to 500 U, and even more preferably 0.002 to 400 U, 0.002 to 360 U, 0.002 to 330 U, 0.002 to 300 U, 0.002 to 280 U, 0.002 to 260 U, 0.002 to 240 U, 0.002 to 220 U, 0.002 to 200 U, 0.002 to 180 U, 0.002 to 160 U, 0.002 to 140 U, 0.002 to 120 U, 0.002 to 100 U, 0.002 to 80 U, 0.002 to 60 U, 0.002 to 40 U, or 0.002 to 30 U, more preferably 0.002 to 20 U, 0.002 to 16 U, 0.002 to 15 U, 0.002 to 14 U, 0.002 to 13 U, 0.002 to 8 U, 0.002
  • the content of component (B) per 100 U of component (A) in the liquid enzyme preparation of the present invention may be 0.02-400 U, 0.1-400 U, 0.2-400 U, 1-400 U, 2-400 U, 3-400 U, 4-400 U, 6-400 U, 8-400 U, 10-400 U, 12-400 U, 14-400 U, 16-400 U, 18-400 U, 20-400 U, 30-400 U, 40-400 U, 50-400 U, or 60-400 U.
  • the content of component (B) per 100 U of component (A) in the liquid enzyme preparation of the present invention is preferably 20 to 400 U, 30 to 400 U, 40 to 400 U, 50 to 400 U, or 60 to 400 U.
  • Protease activity is measured by the Folin method using casein as a substrate.
  • protease activity is measured by carrying out an enzyme reaction using casein as a substrate at a pH that is set according to the optimal pH of the protease being measured in a standard manner, and the amount of enzyme that causes an increase in the Folin test solution color substance equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute is defined as 1 unit (1 U).
  • the liquid enzyme preparation of the present invention may contain sorbitol as component (C). There are no particular limitations on the circumstances in which component (C) may be blended into the liquid enzyme preparation of the present invention.
  • the (C) component is particularly preferred when the content of the (B) component in the liquid enzyme preparation of the present invention is 100-2,000 U/mL, 150-2,000 U/mL, 200-2,000 U/mL, 250-2,000 U/mL, or 300-2,000 U/mL, or when the content of the (B) component per 100 U of the (A) component is 20-400 U, 30-400 U, 40-400 U, 50-400 U, or 60-400 U, in that it can further improve the stability of the liquid enzyme preparation.
  • the content of component (C) in the liquid enzyme preparation of the present invention may be, for example, 10 w/v% or more, or 15 w/v% or more, preferably 20 w/v% or more, or 25 w/v% or more, more preferably 30 w/v% or more, even more preferably 35 w/v% or more, and even more preferably 38 w/v% or more.
  • the upper limit of the above content range of component (C) is not particularly limited, and may be, for example, 80 w/v% or less, 75 w/v% or less, 65 w/v% or less, 55 w/v% or less, 50 w/v% or less, 45 w/v% or less, or 42 w/v% or less.
  • Specific ranges for the content of component (C) include, for example, 10-80 w/v%, or 15-75 w/v%, preferably 20-65 w/v%, or 25-55 w/v%, more preferably 30-50 w/v%, even more preferably 35-45 w/v%, and even more preferably 38-42 w/v%.
  • the content of the (C) component per 1 U of the (A) component in the liquid enzyme preparation of the present invention may be, for example, 0.15 mg or more, 0.2 mg or more, 0.3 mg or more, 0.4 mg or more, or 0.45 mg or more, preferably 0.5 mg or more, or 0.6 mg or more, and more preferably 0.75 mg or more.
  • the upper limit of the above content range of the (C) component per 1 U of the (A) component in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, 1.2 mg or less, 1.1 mg or less, 1 mg or less, 0.85 mg or less, or 0.83 mg or less.
  • the specific range of the content of the (C) component per 1 U of the (A) component may be, for example, 0.15 to 1.2 mg, 0.2 to 1.1 mg, 0.3 to 1 mg, 0.4 to 1 mg, or 0.45 to 1 mg, preferably 0.5 to 0.85 mg, or 0.6 to 0.85 mg, and more preferably 0.75 to 0.83 mg.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention may contain a citrate as component (D).
  • a citrate as component (D).
  • Specific examples of the citrate preferably include alkali metal salts such as potassium salts and sodium salts, more preferably sodium salts.
  • component (D) may be incorporated into the liquid enzyme preparation of the present invention.
  • Component (D) can be used as a pH buffer. While component (D) suppresses pH fluctuations, it tends to reduce the stability of the liquid enzyme preparation of the present invention.
  • the content of component (B) in the liquid enzyme preparation of the present invention is 80 to 2,000 U/mL, 90 to 2,000 U/mL, 100 to 2,000 U/mL, 150 to 2,000 U/mL, 200 to 2,000 U/mL, 250 to 2,000 U/mL, or 300 to 2,000 U/mL, or that the content of component (B) per 100 U of component (A) is 16 to 400 U, 18 to 400 U, 20 to 400 U, 30 to 400 U, 40 to 400 U, 50 to 400 U, or 60 to 400 U, in terms of suppressing a decrease in the stability of the liquid enzyme preparation.
  • the content of the (D) component in the liquid enzyme preparation of the present invention may be, for example, 0.5 w/v% or more, preferably 0.8 w/v% or more, more preferably 1 w/v% or more, and even more preferably 1.5 w/v% or more, 2 w/v% or more, 2.5 w/v% or more, or 2.8 w/v% or more.
  • the upper limit of the above content range of the (D) component is not particularly limited, and may be, for example, 20 w/v% or less, 18 w/v% or less, 16 w/v% or less, 13 w/v% or less, 11 w/v% or less, 9 w/v% or less, 7 w/v% or less, 5 w/v% or less, 4 w/v% or less, or 3.5 w/v% or less.
  • Specific ranges for the content of component (D) include, for example, 0.5 to 20 w/v%, or 0.5 to 18 w/v%, preferably 0.8 to 16 w/v%, or 0.8 to 13 w/v%, more preferably 1 to 11 w/v%, or 1 to 9 w/v%, and even more preferably 1.5 to 7 w/v%, 2 to 5 w/v%, 2.5 to 4 w/v%, or 2.8 to 3.5 w/v%.
  • the content of the (D) component per 1 U of the (A) component in the liquid enzyme preparation of the present invention is, for example, 0.0075 mg or more, preferably 0.012 mg or more, more preferably 0.02 mg or more, and even more preferably 0.025 mg or more, 0.03 mg or more, 0.035 mg or more, 0.04 mg or more, 0.045 mg or more, or 0.05 mg or more.
  • the upper limit of the above content range of the (D) component per 1 U of the (A) component in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include 0.3 mg or less, 0.27 mg or less, 0.24 mg or less, 0.2 mg or less, 0.16 mg or less, 0.14 mg or less, 0.1 mg or less, 0.09 mg or less, 0.08 mg or less, or 0.07 mg or less.
  • Specific ranges for the content of component (D) per 1 U of component (A) include 0.0075 to 0.3 mg, preferably 0.012 to 0.27 mg, more preferably 0.02 to 0.24 mg, and even more preferably 0.025 to 0.2 mg, 0.03 to 0.16 mg, 0.035 to 0.14 mg, 0.04 to 0.1 mg, 0.045 to 0.09 mg, 0.045 to 0.08 mg, or 0.05 to 0.07 mg.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention contains water as a base, in addition to the above-mentioned components (A) and (B), and the components (C) and/or (D) which are blended as necessary. Furthermore, the liquid enzyme preparation of the present invention may or may not contain other components, in addition to the components (A), (B), and water, and the components (C) and/or (D) which are blended as necessary, to the extent that they do not affect the effects of the present invention. Examples of such other components include enzymes other than the components (A) and (B), and additives other than the components (C) and (D).
  • enzymes include, for example, amylase ( ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase), glucosidase ( ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase), galactosidase ( ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase), peptidase (leucine peptidase, aminopeptidase), lipase, esterase, cellulase, phosphatase (acid phosphatase, alkaline phosphatase), nuclease, deaminase, oxidase, dehydrogenase, glutaminase, pectinase, catalase, dextranase, transglutaminase, pullulanase, etc. These other enzymes may be contained alone or in combination of multiple types.
  • additives include buffers, suspending agents, and physiological saline.
  • buffers include phosphate buffers and acetate buffers. These other additives may be included alone or in combination.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention is a liquid enzyme composition.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can be prepared by adding predetermined amounts of protein deamidase, protease, and predetermined additives and other components to be blended as necessary to water, and further sterilizing the mixture as necessary.
  • the pH (referring to the pH at 25°C; the same applies below) of the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 5.5 or higher, preferably 5.8 or higher.
  • the upper limit of the above pH range of the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but is preferably 8.2 or lower, more preferably 7.5 or lower, even more preferably 7 or lower, and even more preferably 6.5 or lower.
  • Specific pH ranges include, for example, 5.5 to 8.2, preferably 5.5 to 7.5, more preferably 5.8 to 7, and even more preferably 5.8 to 6.5.
  • the amount of dissolved oxygen contained in the liquid enzyme preparation of the present invention is not particularly limited.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention has excellent activity stability of protein deamidating enzyme, even if the amount of dissolved oxygen contained in the liquid enzyme preparation is not actively reduced, an activity stabilization effect can be effectively obtained.
  • suitable examples of the amount of dissolved oxygen in the liquid enzyme preparation include more than 3 mg/L, preferably more than 4 mg/L, more preferably 4.5 mg/L or more, and even more preferably 5 mg/L or more.
  • the upper limit of the range of the amount of dissolved oxygen in the liquid enzyme preparation is not particularly limited, but examples include 8 mg/L or less, preferably 7 mg/L or less, more preferably 6 mg/L or less, and even more preferably 5.5 mg/L or less. Specific examples of the range of the amount of dissolved oxygen include more than 3 mg/L and 8 mg/L or less, preferably more than 4 mg/L and 7 mg/L or less, more preferably 4.5 to 6 mg/L, and even more preferably 5 to 5.5 mg/L. Note that the liquid enzyme preparation of the present invention does not exclude the case where the amount of dissolved oxygen is 3 mg/L or less.
  • liquid enzyme preparation of the present invention is appropriately contained in a container capable of containing a liquid.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention is contained in a container whose internal space is replaced with an inert gas.
  • the inert gas is not particularly limited, and examples thereof include nitrogen gas and rare gases (helium gas, argon gas, etc.).
  • the method for replacing the internal space of the container with an inert gas is not particularly limited, and examples thereof include a method in which a gaseous inert gas or a liquid inert gas is directly added to the container.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can improve the activity stability of protein deamidating enzyme by being stored in a container whose internal space is replaced with an inert gas, even without bubbling an inert gas into the liquid enzyme preparation. For this reason, in a preferred embodiment of the liquid enzyme preparation of the present invention, an inert gas is not bubbled. Note that when the liquid enzyme preparation of the present invention is stored in a container whose internal space is replaced with an inert gas, a form in which an inert gas is bubbled is not excluded.
  • the oxygen concentration in the container i.e., in the gas phase in the container
  • the oxygen concentration in the container can be, for example, 5 v/v% or less, preferably 3 v/v% or less, more preferably 2 v/v% or less, 1.5 v/v% or less, 1.3 v/v% or less, or 1 v/v% or less.
  • the oxygen concentration range in the container is not particularly limited in its lower limit, but can be, for example, 0.01 v/v% or more, 0.05 v/v% or more, 0.1 v/v% or more, 0.4 v/v% or more, 0.6 v/v% or more, 0.8 v/v% or more, or 1 v/v% or more.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can be used for any application that utilizes at least protein deamidase activity.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can be used for the purpose of protein modification.
  • the specific mode of protein modification is not particularly limited, and may be any that utilizes changes in protein properties brought about by deamidation of ⁇ -amide groups and ⁇ -amide groups in glutamine residues and asparagine residues of the protein to generate carboxyl groups.
  • protein modification include increased solubility of the protein, increased water dispersibility, improved emulsifying power, and improved emulsion stability.
  • the liquid enzyme preparation of the present invention can be widely used in the food industry. Specifically, it can be used in applications such as improving the solubility, dispersibility, emulsifying property, etc. of animal proteins and/or vegetable proteins in a weakly acidic condition environment that is the pH range of normal foods (for example, applications for producing acidic beverages such as coffee whitener, juice, dressings, mayonnaise, and cream); increasing the solubility and dispersibility of poorly soluble vegetable proteins (for example, applications for producing tempura flour using wheat gluten); modifying dough in bread and confectionery (for example, applications for producing crackers, biscuits, cookies, pizza or pie crusts); and detecting allergens in allergenic proteins in foods.
  • a weakly acidic condition environment that is the pH range of normal foods
  • applications for producing acidic beverages such as coffee whitener, juice, dressings, mayonnaise, and cream
  • increasing the solubility and dispersibility of poorly soluble vegetable proteins for example, applications for producing tempura flour using wheat gluten
  • modifying dough in bread and confectionery for
  • HAP hydrolyzed animal protein
  • HVP hydrolyzed vegetable protein
  • miso and soy sauce etc.
  • liquid enzyme preparation of the present invention can be used for any application that utilizes both protein deamidase activity and protease activity.
  • Protein deamidase Insoluble components such as contaminating polymers were removed from the culture solution of Chryseobacterium proteolyticum, a protein deamidase (protein glutaminase) producing strain, and the product was purified by ion exchange chromatography. Protein deamidase activity was measured by the following method.
  • 0.1 mL of the sample solution containing protein deamidase was added to 1 mL of 0.2 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 mM Z-Gln-Gly, and the mixture was left at 37°C for 10 minutes, after which 1 mL of 0.4 M TCA solution was added to stop the reaction.
  • 1 mL of 0.4 M TCA solution was added to 1 mL of 0.2 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 mM Z-Gln-Gly, and 0.1 mL of the sample solution containing protein deamidase was added and the mixture was left at 37°C for 10 minutes.
  • the amount of ammonia produced in the reaction solution was measured using an Ammonia Test Wako (Fujifilm Wako Pure Chemicals).
  • the ammonia concentration in the reaction solution was calculated from a calibration curve showing the relationship between ammonia concentration and absorbance (630 nm) created using an ammonia standard solution (ammonium chloride).
  • the activity of protein deamidating enzyme was calculated from the following formula, with 1 unit (1U) being the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute.
  • the reaction solution volume is 2.1
  • the enzyme solution volume is 0.1
  • Df is the dilution ratio of the enzyme solution.
  • 17.03 is the molecular weight of ammonia.
  • proteases used in the following test examples are as follows. ⁇ Protease derived from Chryseobacterium genus: Protease derived from Chryseobacterium proteolyticum ⁇ Protease derived from Bacillus licheniformis ⁇ Protease derived from Bacillus amyloliquefaciens
  • protease activity was measured by the following method. 5 mL of 0.6% (w/v) casein solution (0.05 mol/L sodium hydrogen phosphate, pH 8.0) was heated at 37°C for 10 minutes, and then 1 mL of a sample solution containing protease was added and immediately shaken. After leaving this solution at 37°C for 10 minutes, 5 mL of trichloroacetic acid test solution (containing 1.8% (w/v) trichloroacetic acid, 1.8% (w/v) sodium acetate and 0.33 mol/L acetic acid) was added and shaken, and the solution was left at 37°C for 30 minutes again and filtered.
  • casein solution 0.05 mol/L sodium hydrogen phosphate, pH 8.0
  • tyrosine standard stock solution 0.2mol/L hydrochloric acid 1mL, 2mL, 3mL and 4mL were measured, and 0.2mol/L hydrochloric acid test solution was added to each to make 100mL. 2mL of each solution was measured, 5mL of 0.55mol/L sodium carbonate test solution and 1mL of Folin test solution (1 ⁇ 3) were added, and the mixture was immediately shaken and left at 37°C for 30 minutes. For these solutions, 2mL of 0.2mol/L hydrochloric acid test solution was measured and the solution obtained by the same operation as above was used as a control, and the absorbances A1, A2, A3 and A4 at a wavelength of 660nm were measured.
  • the absorbances A1, A2, A3 and A4 were plotted on the vertical axis and the amount of tyrosine ( ⁇ g) in 2mL of each solution was plotted on the horizontal axis, and a calibration curve was created to determine the amount of tyrosine ( ⁇ g) relative to the absorbance difference of 1.
  • the amount of enzyme that causes an increase in the color substance of Folin's test solution equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute was defined as 1 unit (1 U).
  • Protein glutaminase (PG, component (A)) purified by ion exchange chromatography was mixed with protease (component (B)), sorbitol (component (C)) or citric acid (component (D)) in the amounts shown in Tables 1 to 3.
  • the pH was adjusted to 6.0 (25°C) using 80% acetic acid or 6N aqueous sodium hydroxide solution as a pH adjuster to prepare a liquid enzyme preparation having a PG concentration as shown in Tables 1 to 3.
  • the prepared liquid enzyme preparation was placed in a container, and nitrogen was injected from a nitrogen cylinder into the gas phase of the storage container (the space above the liquid phase consisting of the liquid enzyme preparation), and the container was repeatedly put in and taken out 20 times to almost completely replace the oxygen in the container with nitrogen (i.e., the oxygen in the gas phase was replaced with nitrogen without bubbling nitrogen into the liquid enzyme preparation), and the container was sealed to obtain a liquid enzyme preparation in a container.
  • Example 1 and Example 6, between Example 2 and Example 7, between Example 3 and Example 8, between Example 4 and Example 9, between Example 5 and Example 10, and between Example 18 and Example 24 show that when the amount of component (B) is relatively small, the residual activity tends to decrease by adding component (C); however, comparisons between Example 19 and Example 21 and between Example 20 and Example 25 show that when the amount of component (B) is relatively large (specifically, when the amount of component (B) is approximately 100 U/mL or more (approximately 20 U or more of component (B) per 100 U of component (A))), the residual activity improves by adding component (C).
  • Example 21 Compared Example 21 with Example 24, and Example 22 with Example 26, it was found that the incorporation of component (D) tended to slightly decrease the residual activity, but because the stability of the liquid enzyme preparation to which component (C) was added was high when the amount of component (B) was relatively large, the decrease in residual activity could be suppressed even when component (D) was added, and high stability was effectively achieved.
  • the activity stabilization effect of protein deamidase shown in Tables 1 to 3 was also excellent in that it was improved compared to the case where the oxygen in the container was not replaced with nitrogen. Such an excellent stabilization effect was obtained even when the amount of dissolved oxygen in the liquid enzyme preparation shown in Tables 1 to 3 exceeded 3 mg/L (specifically, more than 3 mg/L and 8 mg/L or less), which is shown in Patent Document 3 to decrease the stability of useful proteins. Therefore, it was completely unexpected that such a stabilization effect could be obtained simply by replacing the internal space with an inert gas regardless of the amount of dissolved oxygen in the liquid enzyme preparation.

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Abstract

本発明は、タンパク質脱アミド酵素を他の酵素とともに含む液体酵素製剤であって、活性安定性に優れたタンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤を提供する。　タンパク質脱アミド酵素と、プロテアーゼとを含む液体酵素製剤は、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性に優れる。

Description

液体酵素製剤
　本発明は、液体酵素製剤に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性に優れた、タンパク質脱アミド酵素を含む液体酵素製剤に関する。
　タンパク質中のグルタミン残基及びアスパラギン残基のγ－アミド基及びβ－アミド基を脱アミド化する酵素として、特許文献１等に記載されているように、クリセオバクテリウム・グレウムＪＣＭ２４１０株由来のプロテイングルタミナーゼ及びクリセオバクテリウム・プロテオリティカム９６７０株由来のプロテイングルタミナーゼが知られている。このようなタンパク質脱アミド酵素の酵素製剤製品は、現在、粉末形態で市販されているのみである。
　酵素製剤に関しては、一般的に、ダスティング及びハンドリングの点を考慮すると、粉末形態よりも液体形態の方が望ましい。このため、酵素製剤を液状形態で製剤化する技術が、種々の酵素について検討されている。例えば、特許文献２には、２５％～１００％（ｗ／ｗ）のポリオールを含み、４．４～５．１の範囲内のｐＨ値を有するポリオール－水懸濁液に少なくとも１種の乳タンパク質架橋及び／又は修飾酵素を含むことを特徴とする液体酵素製剤が提案されている。具体的には、特許文献２では、ｐＨ５．２におけるトランスグルタミナーゼの安定性が低いことを見出し、この知見に基づいて、ｐＨ４．４～４．８のグリセロール－水懸濁液中のトランスグルタミナーゼ製剤、ｐＨ４．６のソルビトール－水懸濁液中のトランスグルタミナーゼ製剤の安定性が向上していることを開示するとともに、これに付随して、ｐＨ４．６のグリセロール－水懸濁液中のチロシナーゼ製剤及びｐＨ４．６のグリセロール－水懸濁液中のタンパク質グルタミナーゼ製剤も開示している。
　また、特許文献３には、有用タンパク質、溶媒、チオール構造を有する化合物を含む有用タンパク質組成物において、窒素等の窒息性ガスをバブリングさせることで溶存酸素濃度が３ｍｇ／Ｌ以下とすることにより、安定なインターフェロンなどの有用タンパク質組成物を製造することができることが記載されている。
国際公開第２０１０／０２９６８５号 国際公開第２０１３／０６４７３６号 特開２０１３－０４９６５０号公報
　特許文献２には、トランスグルタミナーゼ製剤の液体酵素製剤については安定性が検討されている一方で、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤については製剤処方の開示のみにとどまり、この酵素の安定性について十分な検討はなされていない。また、特許文献３には、イヌインターフェロン－γを含む水性製剤についてはその抗ウイルス活性が検討されている一方で、タンパク質脱アミド酵素の液体酵素製剤については言及すらなく、当然に何らの検討もされていない。また、酵素製剤には、複数種の酵素が組み合わされて組成されるものがあるが、タンパク質脱アミド酵素を他の酵素とともに含む液体酵素製剤についての、タンパク質脱アミド酵素の安定性についての検討もなされていない。
　そこで本発明の目的は、タンパク質脱アミド酵素を他の酵素とともに含む液体酵素製剤であって、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性に優れた液体酵素製剤を提供することにある。
　本発明者は、鋭意検討の結果、タンパク質脱アミド酵素を含む液体酵素製剤が、プロテアーゼを含んでいても、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性に優れることを見出した。
　さらに、本発明者は、タンパク質脱アミド酵素及びプロテアーゼを含む液体酵素製剤において、内部空間が不活性ガスで置換された容器に収容する場合、プロテアーゼ含有量の上限を所定量に制限する場合、及び／又は所定量以上のプロテアーゼ共存下でソルビトールを配合する場合に、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性が一層向上すること、並びに、所定量以上のプロテアーゼ共存下でクエン酸塩を配合した場合でもタンパク質脱アミド酵素の優れた活性安定性が得られることを見出した。
　本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明は、以下に掲げる発明を含む。
項１．　（Ａ）タンパク質脱アミド酵素と、（Ｂ）プロテアーゼとを含む、液体酵素製剤。
項２．　前記液体酵素製剤が、内部空間が不活性ガスで置換された容器に収容されている、項１に記載の液体酵素製剤。
項３．　さらに（Ｃ）ソルビトールを含む、項１又は２に記載の液体酵素製剤。
項４．　さらに（Ｄ）クエン酸塩を含む、項１～３のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項５．　前記（Ｃ）成分の含有量が３０ｗ／ｖ％以上である、項３に記載の液体酵素製剤。
項６．　前記（Ｄ）成分の含有量が１ｗ／ｖ％以上である、項３又は４に記載の液体酵素製剤。
項７．　ｐＨ５．５以上である、項１～６のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項８．　ｐＨ８．２以下である、項１～７のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項９．　前記（Ａ）成分の含量が０．１～１０,０００Ｕ／ｍｌである、項１～８のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項１０．　前記（Ａ）成分がクリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来のタンパク質脱アミド酵素である、項１～９のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項１１．　前記（Ｂ）成分の含量が０.０１～２，０００Ｕ／ｍＬである、項１～１０のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項１２．　前記（Ｂ）成分が、細菌由来プロテアーゼである、項１～１１のいずれかに記載の液体酵素製剤。
項１３．　前記細菌由来プロテアーゼが、クリセオバクテリウム属由来のプロテアーゼである、項１２に記載の液体酵素製剤。
項１４．　前記細菌由来プロテアーゼが、バチルス属及び／又はジオバチルス属由来のプロテアーゼである、項１２に記載の液体酵素製剤。
項１５．　前記（Ａ）成分１００Ｕ当たりの前記（Ｂ）成分の含有量が、０．００２～４００Ｕである、項１～１４のいずれかに記載の液体酵素製剤。
　本発明によれば、タンパク質脱アミド酵素の活性安定性に優れた液体酵素製剤が提供される。
タンパク質脱アミド酵素を含む液体酵素製剤へのプロテアーゼ添加量（添加活性）と、当該液体酵素製剤のタンパク質脱アミド酵素の残存活性との関係を示す。
［１．液体酵素製剤]
　本発明の液体酵素製剤は、（Ａ）タンパク質脱アミド酵素（以下において、「（Ａ）成分」とも記載する。）と、（Ｂ）プロテアーゼ（以下において、「（Ｂ）成分」とも記載する。）とを含むことを特徴とする。以下、本発明の液体酵素製剤について詳述する。さらに、本発明の液体酵素製剤は、（Ｃ）ソルビトール（以下において、「（Ｃ）成分」とも記載する。）及び／又は（Ｄ）クエン酸塩（以下において、「（Ｄ）成分」とも記載する。）を含むことができる。
［１－１．（Ａ）タンパク質脱アミド酵素］
　本発明の液体酵素製剤は、（Ａ）成分としてタンパク質脱アミド酵素を含む。タンパク質脱アミド酵素は、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わないタンパク質のアミド基含有側鎖を分解する作用を示す酵素であって、その種類及び由来等は特に限定されない。また、上記作用が主活性である限り、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴うタンパク質のアミド基含有側鎖を分解する作用をさらに有していても良い。タンパク質脱アミド酵素の例として、タンパク質中のグルタミン残基を脱アミド化し、グルタミン酸に変換する酵素（例えばプロテイングルタミナーゼ）、及びタンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化し、アスパラギン酸に変換する酵素（例えばプロテインアスパラギナーゼ）が挙げられる。タンパク質脱アミド酵素のより具体的な例としては、ＪＰ２０００－５０８８７Ａ、ＪＰ２００１－２１８５９０Ａ、ＷＯ２００６／０７５７７２Ａ１に開示された、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属由来のタンパク質脱アミド酵素；ＷＯ２０１５／１３３５９０に開示された、ルテイミクロビウム（Ｌｕｔｅｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はレイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属由来のタンパク質脱アミド酵素；及びクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼの市販品が挙げられる。これらのタンパク質脱アミド酵素は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　これらのタンパク質脱アミド酵素の中でも、より一層活性安定性に優れた液体酵素製剤とする観点から、好ましくはクリセオバクテリウム属由来のタンパク質脱アミド酵素、より好ましくはクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼ、さらに好ましくはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム種由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素は、上記のタンパク質脱アミド酵素の由来元となる微生物の培養液より調製することができる。具体的な調製方法としては、上記の微生物の培養液又は菌体よりタンパク質脱アミド酵素を回収する方法が挙げられる。例えば、タンパク質脱アミド酵素分泌型微生物を用いる場合は、培養液から、必要に応じて予めろ過、遠心処理等によって菌体を回収した後、酵素を分離及び／又は精製することができる。また、タンパク質脱アミド酵素非分泌型微生物を用いる場合は、必要に応じて予め培養液から菌体を回収した後、菌体を加圧処理、超音波処理等によって破砕して酵素を露出させた後、酵素を分離及び／又は精製することができる。酵素の分離及び／又は精製法としては、公知のタンパク質分離及び／又は精製法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分の含有量としては特に限定されないが、例えば０．１～１０，０００Ｕ／ｍＬ、１～５，０００Ｕ／ｍＬ、１０～３，０００Ｕ／ｍＬ、又は５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１００～１，５００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは２００～１，０００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは３００～９００Ｕ／ｍＬ、又は３５０～７００Ｕ／ｍＬ、一層好ましくは４００～６００Ｕ／ｍＬが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素の活性については、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ）を基質とし、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを遊離する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
［１－２．（Ｂ）プロテアーゼ］
　本発明の液体酵素製剤は、（Ｂ）成分としてプロテアーゼを含む。本発明において、プロテアーゼは、その由来において特に限定されるものではないが、例えば、細菌由来プロテアーゼが挙げられる。
　細菌由来プロテアーゼとしては、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に由来するプロテアーゼが挙げられる。
　クリセオバクテリウム属由来プロテアーゼは、本発明の所望の効果を得られるものであれば特に限定されない。クリセオバクテリウム属由来プロテアーゼの具体例としては、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｅｍａｔｏｐｈａｇｕｍ 、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｉｓ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｊｏｏｓｔｅｉ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｉｇｅｎｓｅ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｅｕｍ、及びＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｏｉｌ 等に由来するプロテアーゼが挙げられる。これらのクリセオバクテリウム属由来プロテアーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのクリセオバクテリウム属由来プロテアーゼの中でも、タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果をより一層高める観点から、好ましくはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム種由来プロテアーゼが挙げられる。
　クリセオバクテリウム属由来プロテアーゼは、公知の方法により調製することができる。一例として、クリセオバクテリウム属細菌を培養し、プロテアーゼを公知の手段を用いて分離する方法、及び遺伝子組み換え技術を用いる方法等によって容易に調製することができる。
　バチルス属（又はジオバチルス属）由来プロテアーゼの具体例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・クラウジー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・インターミディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、及びこれらのジオバチルス属由来のプロテアーゼが挙げられる。本発明において、上記のプロテアーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのバチルス属（又はジオバチルス属）由来プロテアーゼの中でも、タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果をより一層高める観点から、好ましくはバチルス・リケニフォルミス由来プロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来プロテアーゼ及びこれらのジオバチルス属由来のプロテアーゼが挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤における（Ｂ）成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、例えば０．０１～１０，０００Ｕ／ｍＬ又は０．０１～５，０００Ｕ／ｍＬが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果をより一層高める観点から、本発明の液体酵素製剤における（Ｂ）成分の含有量としては、好ましくは、０．０１～３，５００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．０１～３，０００Ｕ／ｍＬ、又は０．０１～２，５００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．０１～２，０００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，８００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，６５０Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，５００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，４００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，３００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，２００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，１００Ｕ／ｍＬ、０．０１～１，０００Ｕ／ｍＬ、０．０１～９００Ｕ／ｍＬ、０．０１～８００Ｕ／ｍＬ、０．０１～７００Ｕ／ｍＬ、０．０１～６００Ｕ／ｍＬ、０．０１～５００Ｕ／ｍＬ、０．０１～４００Ｕ／ｍＬ、０．０１～３００Ｕ／ｍＬ、０．０１～２００Ｕ／ｍＬ、又は０．０１～１５０Ｕ／ｍＬ、一層好ましくは、０．０１～１００Ｕ／ｍＬ、０．０１～８０Ｕ／ｍＬ、０．０１～７５Ｕ／ｍＬ、０．０１～７０Ｕ／ｍＬ、０．０１～６５Ｕ／ｍＬ、０．０１～４０Ｕ／ｍＬ、０．０１～２０Ｕ／ｍＬ、０．０１～１０Ｕ／ｍＬ、又は０．０１～５Ｕ／ｍＬ（プロテアーゼがバチルス属（又はジオバチルス属）由来プロテアーゼの場合、より一層好ましくは、０．０１～２０Ｕ／ｍＬ、０．０１～１０Ｕ／ｍＬ、又は０．０１～５Ｕ／ｍＬ）が挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果を効果的に得る観点から、本発明の液体酵素製剤における（Ｂ）成分の含有量としては、０．１～２，０００Ｕ／ｍＬ、０．５～２，０００Ｕ／ｍＬ、１～２，０００Ｕ／ｍＬ、５～２，０００Ｕ／ｍＬ、１０～２，０００Ｕ／ｍＬ、１５～２，０００Ｕ／ｍＬ、２０～２，０００Ｕ／ｍＬ、３０～２，０００Ｕ／ｍＬ、４０～２，０００Ｕ／ｍＬ、５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、６０～２，０００Ｕ／ｍＬ、７０～２，０００Ｕ／ｍＬ、８０～２，０００Ｕ／ｍＬ、９０～２，０００Ｕ／ｍＬ、１００～２，０００Ｕ／ｍＬ、１５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、２００～２，０００Ｕ／ｍＬ、２５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、又は３００～２，０００Ｕ／ｍＬであってもよい。
　さらに、（Ｃ）成分を配合することによりタンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤における（Ｂ）成分の含有量としては、好ましくは、１００～２，０００Ｕ／ｍＬ、１５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、２００～２，０００Ｕ／ｍＬ、２５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、又は３００～２，０００Ｕ／ｍＬが挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１００Ｕ当たりの（Ｂ）成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、例えば０．００２～２，０００Ｕ又は０．００２～１，０００Ｕが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果をより一層高める観点から、本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１００Ｕ当たりの（Ｂ）成分の含有量としては、好ましくは、０．００２～７００Ｕ、より好ましくは０．００２～６００Ｕ、又は０．００２～５００Ｕ、さらに好ましくは、０．００２～４００Ｕ、０．００２～３６０Ｕ、０．００２～３３０Ｕ、０．００２～３００Ｕ、０．００２～２８０Ｕ、０．００２～２６０Ｕ、０．００２～２４０Ｕ、０．００２～２２０Ｕ、０．００２～２００Ｕ、０．００２～１８０Ｕ、０．００２～１６０Ｕ、０．００２～１４０Ｕ、０．００２～１２０Ｕ、０．００２～１００Ｕ、０．００２～８０Ｕ、０．００２～６０Ｕ、０．００２～４０Ｕ、又は０．００２～３０Ｕ、一層好ましくは、０．００２～２０Ｕ、０．００２～１６Ｕ、０．００２～１５Ｕ、０．００２～１４Ｕ、０．００２～１３Ｕ、０．００２～８Ｕ、０．００２～４Ｕ、０．００２～２Ｕ、又は０．００２～１Ｕ（プロテアーゼがバチルス属（又はジオバチルス属）由来プロテアーゼの場合、より一層好ましくは、０．００２～４Ｕ、０．００２～２Ｕ、又は０．００２～１Ｕ）が挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果を効果的に得る観点から、本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１００Ｕ当たりの（Ｂ）成分の含有量としては、０．０２～４００Ｕ、０．１～４００Ｕ、０．２～４００Ｕ、１～４００Ｕ、２～４００Ｕ、３～４００Ｕ、４～４００Ｕ、６～４００Ｕ、８～４００Ｕ、１０～４００Ｕ、１２～４００Ｕ、１４～４００Ｕ、１６～４００Ｕ、１８～４００Ｕ、２０～４００Ｕ、３０～４００Ｕ、４０～４００Ｕ、５０～４００Ｕ、又は６０～４００Ｕであってもよい。
　さらに、（Ｃ）成分を配合することによりタンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果を高める観点から、本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１００Ｕ当たりの（Ｂ）成分の含有量としては、好ましくは、２０～４００Ｕ、３０～４００Ｕ、４０～４００Ｕ、５０～４００Ｕ、又は６０～４００Ｕが挙げられる。
　プロテアーゼの活性については、カゼインを基質とし、フォリン法により測定されるものとする。すなわち、プロテアーゼの活性は、カゼインを基質として常法により測定対象プロテアーゼの至適ｐＨに応じて設定されるｐＨで酵素反応を行い、１分間にチロシン１μｇに相当するフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
［１－３．（Ｃ）ソルビトール］
　本発明の液体酵素製剤は、（Ｃ）成分としてソルビトールを含むことができる。本発明の液体酵素製剤において、（Ｃ）成分を配合してよい場合としては特に制限はない。
　（Ｃ）成分は、特に、本発明の液体酵素製剤における（Ｂ）成分の含有量が、１００～２，０００Ｕ／ｍＬ、１５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、２００～２，０００Ｕ／ｍＬ、２５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、又は３００～２，０００Ｕ／ｍＬである場合、若しくは、（Ａ）成分１００Ｕ当たりの（Ｂ）成分の含有量が、２０～４００Ｕ、３０～４００Ｕ、４０～４００Ｕ、５０～４００Ｕ、又は６０～４００Ｕである場合に、液体酵素製剤の安定性をより一層向上できる点で好ましい。
　本発明の液体酵素製剤における（Ｃ）成分の含有量としては、例えば、１０ｗ／ｖ％以上、又は１５ｗ／ｖ％以上、好ましくは２０ｗ／ｖ％以上、又は２５ｗ／ｖ％以上、より好ましくは３０ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは３５ｗ／ｖ％以上、一層好ましくは３８ｗ／ｖ％以上が挙げられる。この場合、（Ｃ）成分の上記含有量範囲の上限としても特に限定されないが、例えば８０ｗ／ｖ％以下、７５ｗ／ｖ％以下、６５ｗ／ｖ％以下、５５ｗ／ｖ％以下、５０ｗ／ｖ％以下、４５ｗ／ｖ％以下、又は４２ｗ／ｖ％以下が挙げられる。（Ｃ）成分の含有量の具体的な範囲としては、例えば１０～８０ｗ／ｖ％、又は１５～７５ｗ／ｖ％、好ましくは２０～６５ｗ／ｖ％、又は２５～５５ｗ／ｖ％、より好ましくは３０～５０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは３５～４５ｗ／ｖ％、一層好ましくは３８～４２ｗ／ｖ％が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１Ｕ当たりの（Ｃ）成分の含有量としては、例えば０．１５ｍｇ以上、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上、０．４ｍｇ以上、又は０．４５ｍｇ以上、好ましくは０．５ｍｇ以上、又は０．６ｍｇ以上、より好ましくは０．７５ｍｇ以上が挙げられる。また、本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１Ｕ当たりの（Ｃ）成分の上記含有量範囲の上限としても特に限定されないが、例えば１．２ｍｇ以下、１．１ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．８５ｍｇ以下、又は０．８３ｍｇ以下が挙げられる。（Ａ）成分１Ｕ当たりの（Ｃ）成分の含有量の具体的な範囲としては、例えば０．１５～１．２ｍｇ、０．２～１．１ｍｇ、０．３～１ｍｇ、０．４～１ｍｇ、又は０．４５～１ｍｇ、好ましくは０．５～０．８５ｍｇ、又は０．６～０．８５ｍｇ、より好ましくは０．７５～０．８３ｍｇが挙げられる。
［１－４．（Ｄ）クエン酸塩］
　本発明の液体酵素製剤は、（Ｄ）成分としてクエン酸塩を含むことができる。クエン酸塩の具体例としては、好ましくは、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられ、より好ましくはナトリウム塩が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤において、（Ｄ）成分を配合してよい場合としては特に制限はない。（Ｄ）成分は、ｐＨ緩衝剤として用いることができる。（Ｄ）成分は、ｐＨ変動を抑制する一方で、本発明の液体酵素製剤の安定性を低下させる傾向にある。しかしながら、特に、本発明の液体酵素製剤における（Ｂ）成分の含有量が、８０～２，０００Ｕ／ｍＬ、９０～２，０００Ｕ／ｍＬ、１００～２，０００Ｕ／ｍＬ、１５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、２００～２，０００Ｕ／ｍＬ、２５０～２，０００Ｕ／ｍＬ、又は３００～２，０００Ｕ／ｍＬである場合、若しくは、（Ａ）成分１００Ｕ当たりの（Ｂ）成分の含有量が、１６～４００Ｕ、１８～４００Ｕ、２０～４００Ｕ、３０～４００Ｕ、４０～４００Ｕ、５０～４００Ｕ、又は６０～４００Ｕである場合に、液体酵素製剤の安定性の低下を抑制できる点で好ましい。
　本発明の液体酵素製剤における（Ｄ）成分の含有量としては、例えば、０．５ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．８ｗ／ｖ％以上、より好ましくは１ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは１．５ｗ／ｖ％以上、２ｗ／ｖ％以上、２．５ｗ／ｖ％以上、又は２．８ｗ／ｖ％以上が挙げられる。この場合、（Ｄ）成分の上記含有量範囲の上限としても特に限定されないが、例えば２０ｗ／ｖ％以下、１８ｗ／ｖ％以下、１６ｗ／ｖ％以下、１３ｗ／ｖ％以下、１１ｗ／ｖ％以下、９ｗ／ｖ％以下、７ｗ／ｖ％以下、５ｗ／ｖ％以下、４ｗ／ｖ％以下、又は３．５ｗ／ｖ％以下が挙げられる。（Ｄ）成分の含有量の具体的な範囲としては、例えば０．５～２０ｗ／ｖ％、又は０．５～１８ｗ／ｖ％、好ましくは０．８～１６ｗ／ｖ％、又は０．８～１３ｗ／ｖ％、より好ましくは１～１１ｗ／ｖ％、又は１～９ｗ／ｖ％、さらに好ましくは１．５～７ｗ／ｖ％、２～５ｗ／ｖ％、２．５～４ｗ／ｖ％、又は２．８～３．５ｗ／ｖ％が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１Ｕ当たりの（Ｄ）成分の含有量としては、例えば、０．００７５ｍｇ以上、好ましくは０．０１２ｍｇ以上、より好ましくは０．０２ｍｇ以上、さらに好ましくは０．０２５ｍｇ以上、０．０３ｍｇ以上、０．０３５ｍｇ以上、０．０４ｍｇ以上、０．０４５ｍｇ以上、又は０．０５ｍｇ以上が挙げられる。本発明の液体酵素製剤における（Ａ）成分１Ｕ当たりの（Ｄ）成分の上記含有量範囲の上限としても特に限定されないが、例えば０．３ｍｇ以下、０．２７ｍｇ以下、０．２４ｍｇ以下、０．２ｍｇ以下、０．１６ｍｇ以下、０．１４ｍｇ以下、０．１ｍｇ以下、０．０９ｍｇ以下、０．０８ｍｇ以下、又は０．０７ｍｇ以下が挙げられる。（Ａ）成分１Ｕ当たりの（Ｄ）成分の含有量の具体的な範囲としては、０．００７５～０．３ｍｇ、好ましくは０．０１２～０．２７ｍｇ、より好ましくは０．０２～０．２４ｍｇ、さらに好ましくは０．０２５～０．２ｍｇ、０．０３～０．１６ｍｇ、０．０３５～０．１４ｍｇ、０．０４～０．１ｍｇ、０．０４５～０．０９ｍｇ、０．０４５～０．０８ｍｇ、又は０．０５～０．０７ｍｇが挙げられる。
［１－５．他の成分］
　本発明の液体酵素製剤は、上記の（Ａ）成分及び（Ｂ）成分、並びに必要に応じて配合される（Ｃ）成分及び／又は（Ｄ）成分以外に、基剤としての水を含む。さらに、本発明の液体酵素製剤は、（Ａ）成分、（Ｂ）成分及び水、並びに必要に応じて配合される（Ｃ）成分及び／又は（Ｄ）成分以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。当該他の成分としては、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分以外の他の酵素、（Ｃ）成分及び（Ｄ）成分以外の他の添加剤等が挙げられる。
　他の酵素としては、例えば、アミラーゼ（α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　他の添加剤としては、緩衝剤、懸濁剤、生理食塩水等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤が挙げられる。これらの他の添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
［１－６．製剤形態等］
　本発明の液体酵素製剤は液体状の酵素組成物である。本発明の液体酵素製剤は、水に対して、タンパク質脱アミド酵素とプロテアーゼ、及び所定の添加剤と、必要に応じ配合される他の成分とを所定量添加し、さらに必要に応じて滅菌することによって調製することができる。
　本発明の液体酵素製剤のｐＨ（２５℃でのｐＨを指す。以下において同様である。）については特に限定されないが、例えば５．５以上、好ましくは５．８以上が挙げられる。本発明の液体酵素製剤の上記ｐＨ範囲の上限としては特に限定されないが、好ましくは８．２以下、より好ましくは７．５以下、さらに好ましくは７以下、一層好ましくは６．５以下が挙げられる。ｐＨの具体的な範囲としては、例えば５．５～８．２、好ましくは５．５～７．５、より好ましくは５．８～７、さらに好ましくは５．８～６．５が挙げられる。
［１－７．溶存酸素量］
　本発明の液体酵素製剤に含まれる溶存酸素量については特に限定されない。特に、本発明の液体酵素製剤についてはタンパク質脱アミド酵素の活性安定性に優れているため、液体酵素製剤に含まれる溶存酸素量が積極的に低減させられていなくても、効果的に活性安定化効果を得ることができる。このような観点から、液体酵素製剤中の溶存酸素量の好適な例としては、３ｍｇ／Ｌ超、好ましくは４ｍｇ／Ｌ超、さらに好ましくは４．５ｍｇ／Ｌ以上、一層好ましくは５ｍｇ／Ｌ以上が挙げられる。液体酵素製剤中の上記溶存酸素量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば８ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは７ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ以下、一層好ましくは５．５ｍｇ／Ｌ以下が挙げられる。溶存酸素量の具体的な範囲としては、３ｍｇ／Ｌ超８ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは４ｍｇ／Ｌ超７ｍｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４．５～６ｍｇ／Ｌ、一層好ましくは５～５．５ｍｇ／Ｌが挙げられる。なお、本発明の液体酵素製剤は、溶存酸素量が３ｍｇ／Ｌ以下である場合を排除するものではない。
［１－８．容器への収容］
　本発明の液体酵素製剤は、適宜、液体を収容可能な容器に収容される。
　好ましくは、本発明の液体酵素製剤は、内部空間が不活性ガスで置換された容器に収容される。不活性ガスとしては特に限定されず、例えば、窒素ガス及び希ガス（ヘリウムガス、アルゴンガス等）が挙げられる。容器の内部空間を不活性ガスで置換する方法については特に限定されず、例えば、気体状の不活性ガス又は液体状の不活性ガスを容器内に直接添加する方法が挙げられる。
　本発明の液体酵素製剤は、液体酵素製剤中に不活性ガスをバブリングさせなくとも、内部空間が不活性ガスで置換された容器に収容されることでタンパク質脱アミド酵素の活性安定性を向上できる。このため、本発明の液体酵素製剤の好適な態様においては、不活性ガスをバブリングさせない。なお、本発明の液体酵素製剤を、内部空間が不活性ガスで置換された容器に収容する場合、不活性ガスをバブリングさせる形態が排除されるものではない。
　上記の容器に収容された本発明の液体酵素製剤において、容器中の（つまり、容器中の気相における）酸素濃度としては、たとえば５ｖ／ｖ％以下、好ましくは３ｖ／ｖ％以下、より好ましくは２ｖ／ｖ％以下、１．５ｖ／ｖ％以下、１．３ｖ／ｖ％以下、又は１ｖ／ｖ％以下が挙げられる。当該容器中の上記酸素濃度範囲は、その下限において特に限定されないが、例えば０．０１ｖ／ｖ％以上、０．０５ｖ／ｖ％以上、０．１ｖ／ｖ％以上、０．４ｖ／ｖ％以上、０．６ｖ／ｖ％以上、０．８ｖ／ｖ％以上、又は１ｖ／ｖ％以上が挙げられる。
［１－９．用途］
　本発明の液体酵素製剤の用途としては、少なくともタンパク質脱アミド酵素活性を利用する任意の用途に利用することができる。例えば、本発明の液体酵素製剤は、タンパク質の改質を目的として用いることができる。タンパク質の改質の具体的な態様としては特に限定されず、タンパク質のグルタミン残基及びアスパラギン残基のγ－アミド基及びβ－アミド基の脱アミド化によりカルボキシル基が生じることでもたらされるタンパク質の特性変化を利用するものであればよい。具体的には、タンパク質の改質としては、タンパク質の可溶性の増大、水分散性の増大、乳化力の向上、及び乳化安定性の向上等が挙げられる。
　従って、本発明の液体酵素製剤は、食品分野において広く用いることができる。具体的には、通常の食品のｐＨ範囲である弱酸性条件環境において動物性タンパク質及び／又は植物性タンパク質の可溶性、分散性、乳化性などを向上させる用途（例えば、コーヒー・ホワイトナー、ジュースなどの酸性飲料、ドレッシング、マヨネーズ、クリームの製造用途）；植物性難溶解性蛋白質の可溶性、分散性の増大化（例えば、小麦グルテンを用いた天ぷら粉等の製造用途）；製パン・製菓におけるドウの改質用途（例えば、クラッカー、ビスケット、クッキー、ピザや或いはパイのクラストの製造用途）；食品中のアレルギー性蛋白質におけるアレルゲンの除去又は低減化用途（例えば、小麦アレルギー患者用の食品の製造用途）；蛋白質のミネラル感受性を低下させ、蛋白質及びミネラルを含む液体中の可溶性ミネラル含量を高め、ミネラルの人体への吸収性を高める用途（例えば、高ミネラル（例えばカルシウム）含有飲料、ミネラル（例えばカルシウム）の吸収促進剤の製造用途）；苦みを低下させる用途、及び／又はグルタミン酸含有量を増強させる用途（例えば、アミノ酸系調味料（動物性蛋白質の加水分解物（ＨＡＰ）、植物性蛋白質の加水分解物（ＨＶＰ））、味噌・醤油の製造用途）等が挙げられる。
　さらに、本発明の液体酵素製剤の用途としては、タンパク質脱アミド酵素活性とプロテアーゼ活性との両方を利用する任意の用途に利用することもできる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［（Ａ）タンパク質脱アミド酵素］
　タンパク質脱アミド酵素（プロテイングルタミナーゼ）生産株であるクリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ）種の培養液から夾雑高分子等の不溶成分を除去し、イオン交換クロマトグラフィーにて精製した。タンパク質脱アミド酵素活性は、以下の方法で測定した。
　３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬにタンパク質脱アミド酵素を含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃で１０分間放置した後、０．４Ｍ　ＴＣＡ溶液を１ｍＬ加えて反応を停止した。ブランクとして、３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬに０．４Ｍ　ＴＣＡ溶液を１ｍＬ加え、さらにタンパク質脱アミド酵素を含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃で１０分間放置した。
　前記で得られた溶液についてアンモニアテストワコー（富士フイルム和光純薬）を用い、反応液中に生じたアンモニア量の測定を行った。アンモニア標準液（塩化アンモニウム）を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（６３０ｎｍ）との関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求めた。
　タンパク質脱アミド酵素の活性を、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とし、以下の式から算出した。式中、反応液量は２．１、酵素溶液量は０．１、Ｄｆは酵素溶液の希釈倍率である。また、１７．０３はアンモニアの分子量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
［（Ｂ）プロテアーゼ］
　以下の試験例において用いたプロテアーゼは、以下の通りである。
　・クリセオバクテリウム属由来プロテアーゼ：Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテアーゼ
　・Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来プロテアーゼ
　・Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来プロテアーゼ
　プロテアーゼ活性は、以下の方法で測定した。
　０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０）５ｍＬを、３７℃で１０分間加温した後、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを加え、直ちに振り混ぜた。この液を３７℃で１０分間放置した後、トリクロロ酢酸試液（１．８％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、１．８％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含む）５ｍＬを加えて振り混ぜ、再び３７℃で３０分間放置し、ろ過した。初めのろ液３ｍＬを除き、次のろ液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加え、よく振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。この液（酵素反応液）につき、水を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度ＡＴを測定した。
　別に、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを量り、トリクロロ酢酸試液（１．８％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、１．８％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含む）５ｍＬを加えて振り混ぜた後、０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、直ちに振り混ぜ、３７℃で３０分間放置したことを除いて上述の酵素反応液と同様に操作した液（ブランク）について、吸光度ＡＢを測定した。
　１ｍｇ／ｍＬチロシン標準原液（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸）１ｍＬ，２ｍＬ，３ｍＬ及び４ｍＬを量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加え、１００ｍＬとした。それぞれの液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加え、直ちに振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。これらの液につき、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液２ｍＬを量り上記と同様に操作して得た液を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を測定した。縦軸に吸光度Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を、横軸にそれぞれの液２ｍＬ中のチロシン量（μｇ）をとり、検量線を作成し、吸光度差１に対するチロシン量（μｇ）を求めた。
　１分間にチロシン１μｇに相当するフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
［試験例１］
　イオン交換クロマトグラフィー精製したプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ、（Ａ）成分）に、プロテアーゼ（（Ｂ）成分）、ソルビトール（（Ｃ）成分）又はクエン酸（（Ｄ）成分）を、表１から表３に記載の量で添加し混合した。８０％酢酸又は６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ調整剤として用いてｐＨを６．０（２５℃）に調整し、ＰＧの濃度が表１から表３中の通りである液体酵素製剤を調製した。調製した液体酵素製剤を容器に入れ、窒素ボンベより窒素を保存容器の気相（液体酵素製剤からなる液相の上の空間）に注入し、２０回出し入れを繰り返し、容器内の酸素を窒素にほぼ完全に置換（つまり、液体酵素製剤中に窒素をバブリングさせずに、気相の酸素を窒素に置換）して密閉し、容器入り液体酵素製剤を得た。
　このようにして得られた容器入り液体酵素製剤を４０℃で１か月間放置した。放置前におけるタンパク質脱アミド酵素活性値を１００％とした場合の、放置後におけるタンパク質脱アミド酵素活性値の相対値（％）を、残存活性として算出した。結果を表１から表３に示す。また、ブレンドしたプロテアーゼ添加活性とタンパク質脱アミド酵素活性の残存活性との相関関係を表したものを図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表１～３に示される通り、実施例１～２７と比較例２～６との対比から、（Ｂ）成分の配合量を２，０００Ｕ／ｍＬ程度以下（（Ａ）成分１００Ｕに対し（Ｂ）成分の配合量を４００Ｕ程度以下）とすることで、タンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果を高めることができた。
　また、実施例１と実施例６の対比、実施例２と実施例７の対比、実施例３と実施例８の対比、実施例４と実施例９の対比、実施例５と実施例１０の対比、実施例１８と実施例２４との対比から、（Ｂ）成分の配合量が比較的少ない場合は、（Ｃ）成分を追配合することで残存活性は下がる傾向にあるが、実施例１９と実施例２１との対比、実施例２０と実施例２５との対比から、（Ｂ）成分の配合量が比較的多い場合（具体的には、（Ｂ）成分の配合量を１００Ｕ／ｍＬ程度以上（（Ａ）成分１００Ｕに対し（Ｂ）成分の配合量を２０Ｕ程度以上）である場合）、（Ｃ）成分を追配合することで残存活性が向上した。なお、実施例２１と実施例２４との対比、実施例２２と実施例２６との対比から、（Ｄ）成分を配合すると若干残存活性が落ちる傾向にあるが、（Ｂ）成分の配合量が比較的多い場合に（Ｃ）成分が追配合された液体酵素製剤の安定性が高いため、（Ｄ）成分が配合されても残存活性の低下を抑制することができ、効果的に高い安定性が得られていた。
　なお、表１～３に示すタンパク質脱アミド酵素の活性安定化効果は、容器内の酸素を窒素に置換しなかった場合に比べて向上している点でも優れていた。このような優れた安定化効果は、表１～３に示す液体酵素製剤中の溶存酸素量が、特許文献３で有用タンパク質の安定性が低下することが示されている３ｍｇ／Ｌを超えている場合（具体的には、３ｍｇ／Ｌ超８ｍｇ／Ｌ以下）であっても得られたため、液体酵素製剤中の溶存酸素量に関わらず内部空間を不活性ガスで置換するだけでこのような安定化効果が得られるのは、全く想定外であった。

Claims (15)

  1. 　（Ａ）タンパク質脱アミド酵素と、（Ｂ）プロテアーゼとを含む、液体酵素製剤。
  2. 　前記液体酵素製剤が、内部空間が不活性ガスで置換された容器に収容されている、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  3. 　さらに（Ｃ）ソルビトールを含む、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  4. 　さらに（Ｄ）クエン酸塩を含む、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  5. 　前記（Ｃ）成分の含有量が３０ｗ／ｖ％以上である、請求項３に記載の液体酵素製剤。
  6. 　前記（Ｄ）成分の含有量が１ｗ／ｖ％以上である、請求項４に記載の液体酵素製剤。
  7. 　ｐＨ５．５以上である、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  8. 　ｐＨ８．２以下である、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  9. 　前記（Ａ）成分の含量が０．１～１０,０００Ｕ／ｍｌである、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  10. 　前記（Ａ）成分がクリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来のタンパク質脱アミド酵素である、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  11. 　前記（Ｂ）成分の含量が０.０１～２，０００Ｕ／ｍＬである、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  12. 　前記（Ｂ）成分が、細菌由来プロテアーゼである、請求項１に記載の液体酵素製剤。
  13. 　前記細菌由来プロテアーゼが、クリセオバクテリウム属由来のプロテアーゼである、請求項１２に記載の液体酵素製剤。
  14. 　前記細菌由来プロテアーゼが、バチルス属及び／又はジオバチルス属由来のプロテアーゼである、請求項１２に記載の液体酵素製剤。
  15. 　前記（Ａ）成分１００Ｕ当たりの前記（Ｂ）成分の含有量が、０．００２～４００Ｕである、請求項１に記載の液体酵素製剤。
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