WO2024071918A1 - 고배율의 세포 확대 분석을 위한 세포 필름, 이의 제조용 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

고배율의 세포 확대 분석을 위한 세포 필름, 이의 제조용 조성물 및 제조 방법 Download PDF

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WO2024071918A1
WO2024071918A1 PCT/KR2023/014689 KR2023014689W WO2024071918A1 WO 2024071918 A1 WO2024071918 A1 WO 2024071918A1 KR 2023014689 W KR2023014689 W KR 2023014689W WO 2024071918 A1 WO2024071918 A1 WO 2024071918A1
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WO
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human
cell
mouse
cells
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PCT/KR2023/014689
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Inventor
우지원
박정윤
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연세대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention is a technique related to the preparation of cell samples for observing cells at higher magnifications at limited microscope magnification, hydrogelating cells, and hydrogelling cells that can be magnified at least 5 to 5.5 times and up to 22 to 24 times. This is a technology related to film manufacturing methods.
  • the present invention was derived from the following research.
  • the MAP (magnified analysis of proteome) technique is a technique that magnifies tissues and cells up to 4 times. It is achieved by culturing cells on an 8 mm round coverslip and then applying a MAP solution to produce a hydrogel.
  • the result which was 4 times larger in dH 2 O, was a convex lens-shaped hydrogel, making it difficult to fix the hydrogel for imaging analysis, and the hydrogel thickness was over 3 mm, making it quite large in volume.
  • eMAP epitope-preserving magnified analysis of proteome
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for producing cell films containing acrylamide, bis-acrylamide, sodium acrylate, and TEMED dissolved in distilled water.
  • Another object of the present invention is a cell film manufacturing method comprising applying a first solution and a second solution to cells to proceed with a coagulation reaction, wherein the first solution is acrylamide and bis-acrylamide dissolved in distilled water. , sodium acrylate, and TEMED, and the second solution is 5 to 20% APS dissolved in distilled water.
  • Another object of the present invention is to provide a cell film prepared by the cell film production method described above.
  • the present invention also includes the steps of (a) culturing the cell film in a first solution; (b) applying a third solution to the cell film cultured in step (a) to cause a coagulation reaction, wherein the first solution is acrylamide or bis-acryl dissolved in distilled water. It provides a cell expansion method, which is a composition containing amide, sodium acrylate, and TEMED, and the third solution is 0.5 to 2% APS dissolved in distilled water.
  • the present invention relates to the production of a cell film that can be used for cell imaging by optimizing the hydrogel composition and changing the basic base solution to distilled water (dH 2 O).
  • dH 2 O distilled water
  • a thin hydrogel cell film capable of enlarging 5 times the thickness of 0.17 mm was produced using coverslips with a thickness of 0.17 mm (FIG. 2).
  • the incubation and coagulation process using a dH 2 O-based hydrogelation solution (hereinafter referred to as “film” solution) and 1% APS (coagulant solution-2) was performed a total of 5 times to sequentially increase the size by up to approximately 22 times.
  • hydrogel cell films can be selectively produced for various cell lines, stem cell plaques, human derivatives, bacteria, etc., and can be used as hydrogel cell films for ultra-high resolution imaging analysis.
  • the present invention provides a composition for producing cell films containing acrylamide, bis-acrylamide, sodium acrylate, and TEMED dissolved in distilled water.
  • cell film refers to a hydrogelated fixed cell sample for performing high-resolution imaging analysis of cells under a microscope by enlarging/expanding the cells 4- to 22-fold.
  • Hydrogel “cell film” has liquid absorbent properties and has the property of expanding cell shape and intracellular organelles through repeated culture and coagulation reactions in the composition for producing cell film.
  • the reliance on only the lens magnification of existing microscopes can be overcome by increasing the magnification by enlarging the observed sample, and the structure of cells can be observed as high-resolution images.
  • it can be produced as a thin cell film targeting various cells and microorganisms such as cells, bacteria, mold, and yeast, and has the advantage of being convenient to store and very easy to use.
  • “cell film” is used with the same meaning as “hydrogel cell film.”
  • Acrylamide and bis-acrylamide in the composition are components that hydrogel by forming a cross-linking structure, and sodium acrylate has the property of absorbing moisture and expanding.
  • the composition of the present invention is a composition for use in imaging analysis by dissolving each component in distilled water rather than PBS.
  • the magnification when each component was dissolved in PBS and distilled water was compared, and in this case, the distilled water It was confirmed that the magnification was significantly higher when a hydrogel composition dissolved in was used ( Figure 1 and Table 2).
  • a hydrogel composition dissolved in was used ( Figure 1 and Table 2).
  • 4-fold magnification is possible in PBS, but when using the dH 2 O-based composition using the present invention, it was confirmed that 5-5.5-fold magnification is possible in 0-round, and the culture and coagulation reaction It was confirmed that up to 22-fold cell expansion was possible when sequentially performing up to 5 round cycles.
  • Excipients acceptable in the compositions for preparing cell films of the present invention include any and all solvents, dispersion media, diluents, or other liquid vehicles, dispersion or suspension aids, surface active agents, isotonic agents, thickeners or emulsifiers, preservatives, suitable for the purpose of the particular processing type, Includes solid binders, lubricants, etc.
  • Exemplary preservatives included in compositions for preparing cell films may include antioxidants, chelating agents, antimicrobial preservatives, antifungal preservatives, alcohol preservatives, acidic preservatives, and other preservatives.
  • Exemplary antioxidants include alpha tocopherol, ascorbic acid, ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, monothioglycerol, potassium metabisulfite, propionic acid, propyl gallate, sodium ascorbate, bisulfite. Including, but not limited to, sodium sulfate, sodium metabisulfite, and sodium sulfite.
  • Exemplary chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid monohydrate, disodium edetate, disodium edetate, edetic acid, fumaric acid, malic acid, phosphoric acid, sodium edetate, tartaric acid, and trisodium edetate. .
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • citric acid monohydrate disodium edetate
  • disodium edetate disodium edetate
  • edetic acid fumaric acid, malic acid
  • phosphoric acid sodium edetate
  • tartaric acid tartaric acid
  • trisodium edetate trisodium edetate.
  • Exemplary antimicrobial preservatives include benzalkonium chloride, benzethonium chloride, benzyl alcohol, bronopol, cetrimide, cetylpyridinium chloride, chlorhexidine, chlorobutanol, chlorocresol, chloroxylenol, cresol, ethyl alcohol, glycerin, Includes, but is not limited to, hexetidine, imidurea, phenol, phenoxyethanol, phenylethyl alcohol, phenylmercuric nitrate, propylene glycol, and thimerosal.
  • Exemplary antifungal preservatives include, but are not limited to, butyl paraben, methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, benzoic acid, hydroxybenzoic acid, potassium benzoate, potassium sorbate, sodium benzoate, sodium propionate, and sorbic acid.
  • Exemplary alcohol preservatives include, but are not limited to, ethanol, polyethylene glycol, phenol, phenolic compounds, bisphenol, chlorobutanol, hydroxybenzoate, and phenylethyl alcohol.
  • Exemplary acidic preservatives include, but are not limited to, vitamin A, vitamin C, vitamin E, beta-carotene, citric acid, acetic acid, dehydroacetic acid, ascorbic acid, sorbic acid, and phytic acid.
  • preservatives include tocopherol, tocopherol acetate, deteroxyme mesylate, cetrimide, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluende (BHT), ethylenediamine, sodium lauryl sulfate (SLS), Sodium Lauryl Ether Sulfate (SLES), Sodium Bisulfite, Sodium Metabisulfite, Potassium Sulfite, Potassium Metabisulfite, Glydant Plus, Fenonib, Methylparaben, Low Mol 115, Germaben II, Neolon, Katon, and E Including, but not limited to, Uxil.
  • Exemplary buffering agents include citrate buffer solution, acetate buffer solution, phosphate buffer solution, ammonium chloride, calcium carbonate, calcium chloride, calcium citrate, calcium gluvionate, calcium gluceptate, calcium gluconate, D-gluconic acid, glycero.
  • Exemplary lubricants include magnesium stearate, calcium stearate, stearic acid, silica, talc, malt, glyceryl behanate, hydrogenated vegetable oil, polyethylene glycol, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, leucine, magnesium lauryl sulfate, sodium. Including, but not limited to, lauryl sulfate, and combinations thereof.
  • the concentration of acrylamide is 20 to 40% (w/v), the concentration of bisacrylamide is 0.01 to 0.1% (v/v), and the concentration of sodium acrylate is 5 to 20% (w/v). ), the concentration of TEMED may be 0.5 to 0.8 % (v/v). More preferably, the concentration of acrylamide may be 30%, the concentration of bisacrylamide may be 0.02%, the concentration of sodium acrylate may be 10%, and the concentration of TEMED may be 0.65%. If it is outside the above range, cell expansion may not occur as desired (see Figure 1).
  • the cells that can be used to produce the cell film of the present invention may be cells derived from any one species selected from the group consisting of animals, protozoa, crustaceans, reptiles, plants, insect-derived cells, bacteria, yeast, and mold. .
  • the animal may be a mouse, rat, opossum, quail, hamster, rabbit, dog, pig, guinea pig, sheep, cow, cat, mink, duck, chicken, etc., but is not limited thereto.
  • the cells include skin, blood, bone, bone marrow, embryo, macrophage, lung, blood vessel, brain, heart, pancreas, testis, ovary, muscle, cartilage, liver, spleen, cervix, breast, neuroblastoma, large intestine, pituitary gland, It may be a cell derived from any one type selected from the group consisting of cornea, retina, pancreas, melanoma, ductal gland, bladder, mucus, prostate, astrocyte, glial cell, peritoneum, adipocyte, and thymus, but is not limited thereto. No.
  • the cells are adherent cells, suspension cells, adipose stem cells, induced pluripotent stem cells, cells induced and differentiated from stem cells, 293T, HeLa, fibroblasts, viruses and bacteria. It may be, but is not limited to, an infected cell.
  • the adherent cells are primarily cell cultured skin fibroblasts, embryonic fibroblasts, HEK293T cells (human embryonic kidney cells), A549 lung carcinoma cells, and Hela cervical cancer. It may be the cells listed in Table 1 below, including cervix adenocarcinoma cells, Raw 264.7 macrophages, U87 glioblastoma cells, etc., but is not limited thereto.
  • the floating cells may be the cells listed in Table 1 below, including HL-60 peripheral blood acute promyelocytic leukemia cells, U-937 pleural effusion histiocytic lymphoma cells, etc. Not limited.
  • the cells may be one or more types selected from Table 1 below, but are not limited thereto.
  • the composition may additionally include sodium azide.
  • Hydrogel cell films are divided into short-term storage and long-term storage depending on the storage period, and long-term storage may additionally contain 0.01% sodium azide, which has preservative properties.
  • the present invention also provides a method for producing a cell film comprising the step of applying a first solution and a second solution to cells to proceed with a coagulation reaction, wherein the first solution is acrylamide, bis-acrylamide, and sodium dissolved in distilled water.
  • a method of producing a cell film is provided, wherein the composition includes acrylate and TEMED, and the second solution is 5 to 20% APS dissolved in distilled water.
  • first solution is used in the same meaning as “film solution” in this specification
  • second solution may be used in the same meaning as “coagulant solution-1” in the embodiment, and the first When mixed with a “film solution” as a solution, a poly-hydrogelation reaction can proceed through a chemical reaction.
  • the specific cell film production method is the same as the flow chart shown in FIGS. 2A and 2B.
  • the concentration of acrylamide is 20 to 40% (w/v), and bisacrylamide is 0.01%. to 0.1% (v/v), the concentration of sodium acrylate may be 5 to 20% (w/v), and the concentration of TEMED may be 0.5 to 0.8% (v/v). More preferably, the concentration of acrylamide may be 30%, the concentration of bisacrylamide may be 0.02%, the concentration of sodium acrylate may be 10%, and the concentration of TEMED may be 0.65%. If it is outside the above range, cell expansion may not occur as desired (see Figure 1).
  • Cells that can be used in the cell film production method may be cells derived from any one species selected from the group consisting of animals, protozoa, crustaceans, reptiles, plants, insect-derived cells, bacteria, yeast, and mold.
  • the cells may be derived from any one or more species selected from Table 1 of the specification.
  • possible cells are the same as described above in the composition for producing cell film, so description is omitted.
  • Sodium azide may be additionally included in the first solution used in the cell film manufacturing method. Since this is the same as described above in the composition for producing cell film, the description is omitted.
  • Cell films made with film solution for short-term and long-term storage can be easily stored at room temperature by sealing them in a plastic zipper bag, and hydrogel cell films of cells stained with fluorescent antibodies and dyes can be stored using a light-blocking plastic zipper bag. .
  • the coagulation reaction may be performed for 5 to 60 minutes, preferably for 10 to 40 minutes, and more preferably for 15 to 30 minutes.
  • the step of sealing the coagulated cell film with parafilm may be further included.
  • the cell film manufactured in this way can be used one-time by users who need cell enlargement imaging analysis without a cumbersome cell culture process, and storage of the cell film is also easy.
  • the present invention provides a cell film produced by the cell film production method.
  • the present invention also includes the steps of (a) culturing the above-described cell film in a first solution; and
  • step (b) applying a third solution to the cell film cultured in step (a) to proceed with a coagulation reaction;
  • a cell expansion method comprising, wherein the first solution is a composition containing acrylamide, bis-acrylamide, sodium acrylate, and TEMED dissolved in distilled water, and the third solution is 0.5 to 2% APS dissolved in distilled water. , a cell expansion method is provided.
  • the cell expansion method refers to a method of expanding cells by additionally hydrogelating and re-solidifying the cell film prepared by the above-described method in a film solution or coagulation solution, and the specific process is as shown in FIG. 4.
  • the "third solution” may be used in the same sense as “coagulation solution-2" in the embodiment, and when mixed with the first solution, "film solution", a poly-hydrogelation reaction can proceed through a chemical reaction. there is.
  • the acrylamide concentration of the first solution in step (a) is 30 to 40%, the bisacrylamide concentration is 0.01 to 0.1%, the sodium acrylate concentration is 5 to 20%, and the TEMED concentration is 0.5. It may be from 0.8%. More preferably, the concentration of acrylamide may be 30%, the concentration of bisacrylamide may be 0.02%, the concentration of sodium acrylate may be 10%, and the concentration of TEMED may be 0.65%.
  • the culturing in step (a) may be carried out at 2°C to 10°C for 4 to 12 hours, preferably for 5 to 8 hours, and can be appropriately adjusted by a person skilled in the art. .
  • the coagulation reaction in step (b) may be performed for 5 to 60 minutes, and preferably for 5 to 30 minutes.
  • steps (a) to (b) may be repeated 1 to 3 times. It may further include culturing the cell film prepared by repeating steps (a) to (b) 1 to 3 times in the first solution at 2°C to 10°C for 6 to 24 hours.
  • step (c) culturing the cell film coagulated in step (b) in PBS; and (d) culturing the cell film cultured in step (c) in distilled water.
  • the concentration of PBS may be 0.05 to 0.2M, preferably 0.1M.
  • step (c) or step (d) may further include processing an antibody or staining material for fluorescence imaging analysis.
  • an antibody or staining material for fluorescence imaging analysis.
  • Any antibody or staining material that can be used can be used without limitation.
  • the thickness is such that imaging analysis is possible even when the cell film is maximally expanded into a thin hydrogel cell film.
  • a thin hydrogel cell film with a thickness of 0.17mm (170um) is subjected to repeated hydrogelation for 5 rounds, it can be enlarged up to 20 times.
  • the thickness of the enlarged hydrogel is about 2.5mm, and the hydrogel cell film is within the working distance of the microscope (usually 2mm). Enlarged cell imaging analysis within the gel is possible.
  • magnification is possible up to about 22 to 24 times, and even if the sample containing cells is large, the thickness is thin and can be used for super-resolution imaging analysis.
  • short-term and long-term storage is possible, and it can be used at any time without additional cell culture.
  • Figure 1 shows the results of comparing cell expansion by varying the hydrogel composition of the PBS-based solution and the dH 2 O-based solution of the present invention.
  • Figures 2a and 2b show the hydrogel cell film production process
  • Figure 2c shows the storage method of the hydrogel cell film.
  • Figures 3a to 3c show the results of cell expansion using the hydrogel cell film produced according to the present invention.
  • Figure 4 shows the process of expanding the hydrogelation and re-solidification process by repeating it.
  • Figures 5A to 5E are imaging results obtained by confirming the expansion ratio by repeating the hydrogelation and re-solidification process.
  • the hydrogel film solution and coagulation solution preparation method used is as follows.
  • Coagulant-1 (for initial film production): 10% APS dissolved in distilled water
  • Coagulant-2 (for round coagulation): 1% APS dissolved in distilled water
  • Acrylamide and bis-acrylamide are components that hydrogel by forming a cross-linking structure, and sodium acrylate has the property of absorbing moisture and expanding.
  • Hydrogel cell films are divided into short-term storage and long-term storage depending on the storage period. For long-term storage, 0.01% sodium azide, which has preservative properties, is added.
  • Table 2 shows the magnification when the acrylamide and bis-acrylamide concentrations were different and dissolved in PBS and dH 2 O.
  • the hydrogel film is made in a mold using 8 glass coverslips (24 It consists of a coverslip (22 x 22 mm or 24 x 24 mm) with cultured cells attached to the center.
  • the film solution When producing a single hydrogel cell film, the film solution is mixed with APS and undergoes a chemical reaction to undergo poly-hydrogelation.
  • a coverslip containing cells When producing each cell film, a coverslip containing cells is placed into a glass frame.
  • the coverslips used in the frame are carefully removed and the hydrogel cell film is placed on paraffin-based parafilm (4 x 10 mm).
  • the hydrogel cell film sandwiched with parafilm can be used by cutting it to the size according to the user's desired specifications using scissors.
  • hydrogel cell film Due to the nature of hydrogel, hydrogel cell film has strong adhesion, making it very difficult to apply and store safely. Parafilm is easy to seal and remove when applying the hydrogel cell film, and does not cause damage to the hydrogel cell film. In addition, parafilm is easy to cut using scissors while the hydrogel cell film is sealed and applied.
  • the hydrogel cell film is stored in a separate storage box with the hydrogel cell film preserved in Parafilm sealed in two zipper bags, and stored at room temperature for a long period of time with a separate preservative. Easy to store.
  • - Stained cell film stored in a light-blocking plastic zipper bag (e.g. 5 x 7 cm) and labeled with stickers
  • the produced hydrogel cell film grows about 2.7 to 3 times when transferred to 0.1M PBS and cultured, and when sequentially transferred to dH 2 O and cultured, it finally grows 5 to 5.5 times, and this step is referred to as 0 round.
  • an additional step of lowering the concentration of PBS and culturing in 0.01M PBS is included to ensure stable growth of the gel. can do.
  • the hydrogel which has grown 5 to 5.5 times larger, is recultured in 0.1 M PBS, the hydrogel decreases in size and returns to about 2.7 to 3 times the size of the previous step.
  • the expansion and contraction of this hydrogel can be repeated, and staining with antibodies and dyes for fluorescence imaging analysis is possible during the incubation stage in 0.1M PBS.
  • the present inventor pre-stained the cultured cells using DAPI dye and used this to produce a hydrogel cell film.
  • the hydrogel cell film was cut into horizontal cells of 2.7 mm x 2.7 mm or 3 mm x 3 mm using scissors, and then cell enlargement was performed (Figure 3b).
  • cells can ultimately be expanded 6.2 to 24 times in dH 2 O. Additionally, cells can be expanded to a larger size by repeating the process over 6 rounds, but this is not possible in the current universal image analysis microscope system due to limitations in the working distance. However, in the future, the limitation of working distance may be overcome and visual imaging analysis may be possible for microscopes that detect fine fluorescence signals. Therefore, due to the limitations of the imaging analysis system, the maximum applicable cell size when observed through a general microscope of the present invention is 16.7 to 22 times (18.5 to 24 times) 4-5 rounds.

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Abstract

본 발명은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 세포 필름 제조용 조성물, 세포 필름 제조 방법, 세포 필름 및 세포 확대 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 본 발명의 최적의 조성을 이용하는 경우, 세포 확대 방법으로 하이드로겔화와 재응고 과정을 통해 세포를 최대 20배 이상 확대가 가능하여 현미경에서 고해상도 이미지 분석을 진행하기에 우수하다.

Description

고배율의 세포 확대 분석을 위한 세포 필름, 이의 제조용 조성물 및 제조 방법
본 발명은 제한된 현미경 배율에서 더 높은 배율로 세포를 관찰하기 위한 세포 시료의 준비와 관련된 기법으로 세포를 하이드로겔화하고 하이드로겔화된 세포를 최소 5~5.5배 최대 22~24배까지 확대 가능한 하이드로겔 세포 필름 제조 방법에 관한 기술이다.
본 발명은 다음의 연구로부터 도출되었다.
1.
[과제고유번호]1345340971
[과제번호]2020R1A6A3A01097969
[부처명]교육부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 이공분야기초연구사업-학문후속세대양성사업
[연구과제명] 코로나바이러스 치료제의 신속 스크리닝을 위한 연구 플랫폼 개발: 생체내 세포기반시험 및 세균/바이러스 확대투명화 기반 초고해상도 이미징을 통한 바이러스 패키징 억제연구
[과제수행기관명] 연세대학교
[연구기간] 2021.09.01 ~ 2022.08.31
2.
[과제고유번호] 1711163452
[과제번호] 2020R1F1A1072307
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 이공분야기초연구사업-개인연구사업(기본연구)
[연구과제명] 척수손상 치료 및 검증을 위한 miRNA 기반 최적화된 초고해상도 이미징을 이용한 연구 플랫폼 구축
[과제수행기관명]연세대학교
[연구기간]2022.03.01 ~ 2023.02.28
3.
[과제번호] RS2023-00225555
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 원천기술개발사업-바이오·의료기술개발사업
[연구과제명] 내재 줄기세포 분화 조절을 통한 난치성 척추인대질환의 재생 기반기술 개발
[과제수행기관명] 연세대학교
[연구기간] 2023.04.01. ~ 2023.12.31
현재의 세포 이미징 분석하기 위한 방법은 현미경의 렌즈 배율(4~100 배율)에 의존하고 있으며, 그 이상의 배율로 관찰하기 위해서는 수 억원 상당의 고가 이미징 장비에 의존하거나, 이 또한 배율의 한계점을 지니고 있다. 따라서, 배율의 한계점을 지닌 현미경에서 더 큰 이미지 분석을 위해서는, 시료의 크기를 더 크게 만들면 현미경 분석에서의 배율의 한계를 극복할 수 있다.
MAP (magnified analysis of proteome) 기법은 조직 및 세포를 최대 4배 확대하는 기술로, 8 mm 둥근 커버슬립 위에 세포 배양 후, MAP 용액을 도포하여 하이드로겔을 제작하여 이루어진다. 다만, dH2O에서 4배 커진 결과물은 볼록렌즈 형태의 하이드로겔로 이미징 분석을 위한 하이드로겔을 고정하기 어려우며, 또한 하이드로겔 두께가 3mm 이상으로 부피가 상당히 컸다.
이후, 조직 및 세포를 최대 8배 확대 가능한 ZOOM 기법이 개발되었으며, 2가지의 ZOOM 용액을 사용하여 하이드로겔 배양을 총 4번의 round cycle을 걸쳐 최대 8배 커지게 하였다.
최근, 얇은 조직을 10배 확대 가능한 Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP) 기법이 보고되었으며, 총 3번의 round cycle을 걸쳐 약 10배 커지게 하였다. eMAP은 오직 조직을 대상으로 평가하였으며 세포를 대상으로 적용하지 않았다.
따라서, 세포의 크기를 흡수성이 있는 하이드로겔로 만들어 세포를 더 커지게 하고, 세포가 포함된 시료가 커지더라도 두께를 얇게하여 현미경에서 이미지 분석이 용이한 기술의 개발이 요구되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 증류수에 용해된 아크릴아마이드(acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 소듐아크릴레이트(sodium acrylate) 및 TEMED를 포함하는 세포 필름 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 세포에 제1용액과 제2용액을 도포하여 응고반응을 진행하는 단계를 포함하는 세포 필름 제조 방법으로서, 상기 제1용액은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 조성물이고, 상기 제2용액은 증류수에 용해된 5 내지 20% APS인, 세포 필름 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항의 상기 세포 필름 제조 방법으로 제조된 세포 필름을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한, (a) 상기 세포 필름을 제1용액에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 세포 필름에 제3용액을 도포하여 응고반응을 진행하는 단계;를 포함하는 세포 확대 방법으로서, 상기 제1용액은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 조성물이고, 상기 제3용액은 증류수에 용해된 0.5 내지 2% APS인, 세포 확대 방법을 제공한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 하이드로겔 조성을 최적화하여 기본 베이스 용액을 증류수 (dH2O)로 바꿔주어 세포 이미징에 활용할 수 있는 세포 필름 제조에 관한 것이다. 이러한 dH2O 기반 조성으로 0.17mm 두께의 커버슬립들을 이용하여 0.17mm 두께의 5배 확대 가능한 얇은 하이드로겔 세포 필름을 제작하였다(도 2). 또한, dH2O 기반 조성의 하이드로겔화 용액(이하 "필름"액)과 1% APS (응고액-2)를 이용한 배양 및 응고 과정을 총 5회에 걸쳐서 순차적으로 최대 약 22배 이상 커질 수 있게 하였음을 확인하였으며, 필름용액에서의 배양 횟수에 따른 세포의 크기들을 비교 분석하여 제시하였다(1회: 6.2~6.8배, 2회: 8.2~9배, 3회: 10.6~11.8배, 4회: 16.7~18.5배, 5회: 22~24배)([표 3] 및 도 3 내지 6 참조). 파라필름으로 밀봉하여 가위로 절단하기 쉽고, 간편하게 비닐 지퍼백에 넣어 상온에서 보관하기 용이하다. 따라서, 실험자가 세포 관찰 실험을 위하여 하이드로겔 세포 필름을 절단하고 원하는 세포 확대 비율에 따라 세포를 확장하여 현미경을 활용한 고해상도 이미지 분석을 진행하기에 용이하다. 또한, 이를 바탕으로 다양한 세포주들과 줄기세포 플라그, 인체 유래물, 박테리아 등을 대상으로 하이드겔 세포 필름들을 선택적으로 제작할 수 있으며, 초고해상도 이미징 분석용 하이드로겔 세포 필름으로 이용가능하다.
따라서, 본 발명은 증류수에 용해된 아크릴아마이드(acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 소듐아크릴레이트(sodium acrylate) 및 TEMED를 포함하는 세포 필름 제조용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "세포 필름"은 세포를 4배 내지 22배 확대/확장시켜 현미경으로 세포의 고해상도 이미징 분석을 수행하기 위한 하이드로겔화 된 고정된 세포 시료를 의미한다. 하이드로겔 "세포 필름"은 액체 흡수성 특성을 지니며 세포 필름 제조용 조성물에 배양 및 응고 반응을 반복 시행을 통해 세포 형태 및 세포내 소기관들을 확장시키는 특성을 지닌다. 기존 현미경의 렌즈 배율에만 의존하던 부분을 관찰 시료의 확대로 배율을 증가시켜 극복할 수 있으며, 세포의 구조를 고해상도의 이미지로 관찰할 수 있다. 또한, 세포, 박테리아, 곰팡이, 효모 등 다양한 세포 및 미생물을 대상으로 얇은 세포 필름으로 제작이 가능하며, 보관이 편리하고 사용이 매우 간편한 장점을 지닌다. 본 명세서에 있어서 "세포 필름"은 "하이드로겔 세포 필름"과 동일한 의미로 사용된다.
상기 조성물의 아크릴아마이드와 비스-아크릴아마이드는 크로스 링킹 구조를 이루어 하이드로겔화 하는 성분이고, 소듐아크릴레이트는 수분을 흡수하여 확장하는 특성을 지닌다.
본 발명의 조성물은 PBS가 아닌 증류수에 각각의 성분을 용해시켜 이미징 분석에 이용하기 위한 조성물이며, 구체적인 일실시예에서는 각각의 성분을 PBS와 증류수에 용해시켰을 때의 배율을 비교하였고, 이 때 증류수에 용해시킨 하이드로겔 조성물을 이용한 경우 확대 배율이 확실히 더 큰 것을 확인하였다(도 1 및 표 2). 0.1M PBS 용액 기반으로 0-round 경우 PBS에서 4배 확대 가능하지만, 본 발명을 이용한 dH2O 기반 조성물을 사용한 경우 0-round 경우 5~5.5배 확대가 가능한 것을 확인하였으며, 배양 및 응고 반응을 순차적으로 5회 round cycle까지 진행해주었을 경우 최대 22배 세포 확대가 가능함을 확인하였다.
본 발명의 세포 필름 제조용 조성물에 허용되는 부형제는 특정한 처리 형태 목적에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다.
세포 필름 제조용 조성물에 포함되는 예시적인 보존제는 항산화제, 킬레이트화제, 항미생물 보존제, 항진균 보존제, 알콜 보존제, 산성 보존제, 및 다른 보존제를 포함할 수도 있다. 예시적인 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 메타중아황산칼륨, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 아스코르브산나트륨, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 및 아황산나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산 1수화물, 이나트륨 에데테이트, 이칼륨 에데테이트, 에데트산, 푸마르산, 말산, 인산, 소듐 에데테이트, 타르타르산, 및 트리소듐 에데테이트를 포함한다. 예시적인 항미생물 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 브로노폴, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알콜, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐질산수은 (phenylmercuric nitrate), 프로필렌 글리콜, 및 티메로살을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 항진균 보존제는 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 히드록시벤조산, 칼륨 벤조에이트, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨, 및 소르브산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알콜 보존제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀계 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 히드록시벤조에이트, 및 페닐에틸 알콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 산성 보존제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 데히드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산, 및 피트산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 보존제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록시메 메실레이트, 세트리미드, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔드 (BHT), 에틸렌디아민, 소듐 라우릴 술페이트 (SLS), 소듐 라우릴 에테르 술페이트 (SLES), 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 칼륨 술파이트, 메타중아황산칼륨, 글리단트 플러스, 페노닙, 메틸파라벤, 저몰 115, 게르마벤 II, 네올론, 카톤, 및 에욱실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 포스페이트 완충제 용액, 염화암모늄, 탄산칼슘, 염화칼슘, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 글리세로인산칼슘, 락트산칼슘, 프로판산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 이염기성 인산칼슘, 인산, 삼염기성 인산칼슘, 수산화칼슘 포스페이트, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 글루콘산칼륨, 칼륨 혼합물, 이염기성 인산칼륨, 일염기성 인산칼륨, 인산칼륨 혼합물, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 인산나트륨 혼합물, 트로메타민, 수산화마그네슘, 수산화알루미늄, 알긴산, 피로겐-자유수, 등장성 염수, 링거(Ringer's) 용액, 에틸 알콜, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 윤활제는 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 글리세릴 베하네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 마그네슘 라우릴 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일양태에 있어서, 상기 아크릴아마이드의 농도는 20 내지 40 % (w/v)이고, 비스아크릴아마이드는 0.01 내지 0.1 % (v/v), 소듐아크릴레이트의 농도는 5 내지 20% (w/v), TEMED의 농도는 0.5 내지 0.8 % (v/v)일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 아크릴아마이드의 농도는 30%, 비스아크릴아마이드의 농도는 0.02%, 소듐아크릴레이트의 농도는 10%일 수 있으며, TEMED의 농도는 0.65 %일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 세포 확대가 원하는 만큼 이루어지지 않을 수 있다(도 1 참조).
본 발명의 세포 필름 제조에 이용될 수 있는 상기 세포는 동물, 원생동물, 갑각류, 파충류, 식물, 곤충 유래 세포, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종으로부터 유래된 세포일 수 있다. 상기 동물은 마우스, 랫트, 주머니쥐, 메추라기, 햄스터, 토끼, 개, 돼지, 기니피그, 양, 소, 고양이, 밍크, 오리, 닭 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포는 피부, 혈액, 뼈, 골수, 배아, 대식세포, 폐, 혈관, 뇌, 심장, 췌장, 정소, 난소, 근육, 연골, 간, 비장, 자궁경관,유방, 신경모세포종, 대장, 뇌하수체, 각막, 망막, 이자, 멜라노마, 감상선, 방광, 점액, 전립선, 성상세포, 신경교세포, 복막, 지방세포 및 흉선으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종으로부터 유래된 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 세포는 부착성(adherent) 세포, 부유성(suspension) 세포, 지방 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 줄기세포로부터 유도 분화된 세포, 293T, HeLa, 섬유아세포(fibroblast), 바이러스 및 박테리아에 감염된 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 상기 부착성 세포는 1차적으로 세포배양 된 피부 섬유아세포(skin fibroblast), 배아 섬유아세포(embryonic fibroblast), HEK293T 세포(human embryonic kidney cell), A549 폐암세포(lung carcinoma cell), Hela 자궁경부암세포(cervix adenocarcinoma cell), Raw 264.7 대식세포, U87 교모세포종세포(glioblastoma cell) 등을 포함한 하기 표 1의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 부유성 세포는 HL-60 전골수성 백혈병 세포(peripheral blood acute promyelocytic leukemia cell), U-937 단핵구 백혈별 세포(pleural effusion histiocytic lymphoma cell) 등을 포함한 하기 표 1의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일실시예에 있어서, 상기 세포는 하기 표 1에서 선택되는 어느 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
세포이름 유래 조직 표현형
k46 Mouse Lymphocyte Suspension
kt-3 Human Lymphocyte Suspension
ks cells Human Skin Adherent
kmst-6 Human Skin Adherent
kb Human Fibroblast Adherent
keratinocytes Human Keratinocyte Adherent
keratinocytes Mouse Keratinocyte Adherent
knrk Rat Epithelial Either
kc1 Drosophila melanogaster Default Adherent
kc18-2-40 cells Human Keratinocyte Adherent
kd83 Mouse Blood Suspension
kg-1 cells Human Bone marrow Suspension
k562 Human Bone Suspension
p19 cells Mouse Embryo Adherent
pc-3 Human Prostate Either
pu5-1.8 cells Mouse Macrophage Suspension
pc 6 (pheochromocytoma-6 ) Rat Glial Adherent
ps120, an nhe-deficient clone derived from ccl39 cells Hamster Lung Adherent
p815, mastocytoma cells Mouse Macrophage Adherent
p825, mastocytoma cells Mouse Macrophage Adherent
pancreatic islets Rat Pancreas Adherent
plb985 Human Blood Suspension
per.c6® Human Retina Either
p3.653 x ag8 murine myeloma cells Mouse Bone marrow Adherent
peripheral blood mononuclear cells (pbmc) Human Blood Suspension
pci-13 Human Skin Adherent
pac-1 Rat Aorta Adherent
peripheral blood lymphocytes Human Blood Either
p388d1 Mouse Macrophage Adherent
paju, human neural crest-derived cell line Human Brain Adherent
pc-12 Rat Brain Adherent
parp-/- mouse embryonic fibroblasts Mouse Fibroblast Suspension
pam212, mouse keratinocytes Mouse Keratinocyte Adherent
p19cl6 Mouse Heart Adherent
phoenix-eco cells Human Embryo Adherent
primary lymphoid (oka) organ from penaeus shrimp Shrimp Lymphocyte Adherent
pa 317 or pt67 mouse fibroblast with herpes thymidine kinase (tk) gene Mouse Fibroblast Adherent
panc1 Human Pancreas Adherent
ht4 Human Testes Adherent
hela t4 Human Blood Suspension
huvec, huaec Human Umbilicus Adherent
hit-t15 cells Hamster Epithelial Adherent
h19-7/igf-ir Rat Brain Suspension
h187 Human Lung Adherent
hm-1 embryonic stem cells Mouse Other Adherent
hitb5 Human Muscle Adherent
hut 78 Human Skin Suspension
hsy-eb Human Other Adherent
hos Human Osteoblast Adherent
hpb-all Human Lymphocyte Suspension
h-7 Mouse Bone marrow Suspension
hl-60 Human Lymphocyte Suspension
hs-578t Human Breast/Mammary Adherent
has-p Mouse Breast/Mammary Adherent
h1299 Human Lung Adherent
h9c2 Rat Myoblast Adherent
hc11 Mouse Breast/Mammary Adherent
hitb5 Human Muscle Adherent
hepatic stellate cells Rat Liver Adherent
hb60-5 cells Mouse Spleen Adherent
ht1080 Human Fibroblast Adherent
hbl100 cells Human Breast/Mammary Adherent
hl-1 Mouse Heart Adherent
hmec-1 Human Endothelial Adherent
hep2 Human Epithelial Adherent
hfff2 Human Foreskin Adherent
hepatocytes Rat Liver Adherent
hmcb Human Skin Adherent
h441 Human Lung Adherent
hybridoma Mouse Spleen Suspension
hmn 1 Mouse Neuroblastoma Adherent
haecs Human Aorta Adherent
hib5 Rat Brain Adherent
high 5 (bti-tn-5b1-4) Insect Embryo Adherent
hl-5 Mouse Heart Adherent
hep3b Human Liver Adherent
h4iie Rat Liver Adherent
htlm2 Mouse Breast/Mammary Adherent
hela s3 Human Cervix Adherent
hbec-90 Human Brain Adherent
hela cells Human Cervix Adherent
h35 Rat Liver Adherent
hcd57 Mouse Blood Suspension
htla230 Human Neuroblastoma Adherent
huh 7 Human Liver Adherent
hi299 Human Lung Adherent
ht-29 Human Colon Adherent
hel Human Lymphocyte Suspension
hela 229 cells Human Cervix Either
hca-7 Human Colon Adherent
hepg2 Human Liver Adherent
hct116 Human Colon Adherent
hs68 Human Foreskin Adherent
h4 Human Glial Adherent
hela-cd4 Human Epithelial Adherent
hasmcs Human Muscle Adherent
hepatocytes Mouse Liver Adherent
hutu 80 Human Colon Adherent
ht22 Mouse Brain Adherent
hre h9 Rabbit Uterus Adherent
hmvec-l Human Lung Adherent
hnscc Human Skin Adherent
hacat Human Keratinocyte Adherent
human skeletal muscle Human Muscle Adherent
h-500, leydig tumor cell Rat Testes Adherent
quail embryos Quail Embryo Either
qt6 Quail Fibroblast Adherent
a1.1 Mouse Lymphocyte Adherent
ab1 Mouse Embryo Adherent
alpha t3 Human Pituitary Adherent
ae-1 Mouse Spleen Suspension
att-20 Mouse Pituitary Adherent
a498 Human Kidney Adherent
a6 Frog Kidney Adherent
a-431 Human Skin Adherent
aortic endothelial cells Human Aorta Adherent
am12 Mouse Blood Suspension
arpe-19 Human Retina Adherent
a10 Rat Muscle Adherent
a204 Human Muscle Adherent
adventitial fibroblasts Human Aorta Adherent
achn Human Kidney Adherent
a549 Human Lung Adherent
a20 Mouse Lymphocyte Suspension
as52 Hamster Ovary Adherent
anjou 65 Human Default Either
ar4-2j Rat Pancreas Adherent
anterior pituitary gonadotropes Human Pituitary Adherent
a72 Dog Connective Adherent
a875 Human Melanoma Adherent
akr Mouse Spleen Adherent
a172 Human Brain Adherent
imr-90 Human Lung Adherent
imdf Mouse Skin Adherent
ins-1 Rat Pancreas Adherent
ib3-1 Human Lung Adherent
in vivo mouse brain Mouse Bone Either
in vivo pig Pig Other Either
ivec cells Human Endothelial Adherent
in vivo rat liver Rat Liver Either
iec-6 rie Rat Epithelial Adherent
imr-32 Human Neuroblastoma Adherent
in vivo rat lung Rat Lung Either
in vivo mouse Mouse Other Either
in vivo rabbit eye Rabbit Other Either
ic11 Mouse Testes Adherent
in vivo rat brain Rat Brain Either
4t1 Mouse Breast/Mammary Adherent
4de4 Mouse Bone marrow Either
vero Primate - Non Human Kidney Adherent
foreskin fibroblast Human Foreskin Adherent
fgc-4 Rat Liver Adherent
fibroblasts Chicken Skin Adherent
fl5.12 Mouse Liver Suspension
f442-a Mouse Preadipocyte Adherent
fibroblasts (cardiac) Rat Fibroblast Adherent
flp-in t-rex 293 Human Kidney Adherent
fetal neurons Rat Brain Adherent
f9 Mouse Testes Adherent
fibroblasts (normal) Human Fibroblast Adherent
flp-in jurkat Human Lymphocyte Suspension
flp-in cho Hamster Ovary Adherent
flp-in 293 Human Kidney Adherent
fibroblasts (embryo) Rat Fibroblast Adherent
fm3a Mouse Breast/Mammary Adherent
fak -/- Mouse Embryo Adherent
freestyle 293 Human Kidney Suspension
fsdc, murine dendritic cell Mouse Blood Either
fr Rat Fibroblast Adherent
fto-2b (rat hepatoma) cells Rat Liver Suspension
frt Rat Thyroid Suspension
fibroblasts (neonatal dermal) Human Skin Adherent
flp-in cv-1 Primate - Non Human Kidney Adherent
neurons (cortical) Mouse Other Adherent
neurospora crassa Fungi Embryo Adherent
nb324k Human Kidney Adherent
nhdf Human Fibroblast Adherent
nci-h358 Human Lung Adherent
nhbe Human Lung Adherent
nih 3t3, 3t3-l1 Mouse Fibroblast Adherent
n2a Mouse Neuroblastoma Adherent
nih 3t3-l1, nih 3t3 () Mouse Embryo Adherent
nt2-d1 Human Testes Adherent
nci-h23 Human Lung Adherent
nhf3 Human Fibroblast Adherent
neurons (post-natal/adult) Rat Brain Adherent
n1e-115 Mouse Brain Adherent
neuroblastoma Human Brain Adherent
n18tg cells Mouse Neuroblastoma Adherent
nci-h295 Human Kidney Adherent
nih 3t6 Mouse Fibroblast Adherent
nt2 Human Fibroblast Adherent
nrk Rat Fibroblast Adherent
neural stem cells Rat Brain Either
ng108-15 Mouse Neuroblastoma Adherent
neuons (astrocytes) Rat Astrocyte Adherent
nbt-ii Rat Bladder Adherent
nmumg Mouse Breast/Mammary Adherent
neurons Mouse Brain Adherent
neurons (astrocytes) Rat Brain Adherent
ns20y Mouse Neuroblastoma Adherent
neuons (hippocampal & septal) Rat Brain Adherent
neurons (embryonic cortical) Rat Brain Adherent
nhff Human Foreskin Adherent
neurons (ganglia) Frog Brain Either
neuro 2a, a murine neuroblastoma cell line Mouse Neuroblastoma Adherent
n13 Mouse Brain Adherent
ng 125 Human Neuroblastoma Adherent
ncb20 Mouse Neuroblastoma Adherent
nih 3t3-l1, nih 3t3 Mouse Embryo Adherent
nalm6 Human Other Suspension
nci-h460 Human Lung Adherent
neurons (superior cervical ganglia - scg) Rat Brain Adherent
5637 Human Bladder Adherent
wit49 wilms tumor Human Lung Either
guinea pig endometrial stromal cells Guinea Pig Ovary Adherent
granta-519 Human Blood Suspension
gc-2spd (ts) Mouse Epithelial Adherent
glya Hamster Ovary Adherent
g401 Human Connective Adherent
goto Human Neuroblastoma Adherent
glomeruli Rat Lung Adherent
gt1 Mouse Brain Adherent
gh4c1 Rat Pituitary Adherent
griptite? 293 msr Human Kidney Adherent
gamma 3t3 Mouse Fibroblast Adherent
granulosa cells Mouse Ovary Either
gh3 Rat Pituitary Adherent
293-h Human Kidney Either
293 ebna Human Kidney Adherent
293t Human Kidney Either
293s Human Kidney Either
2pk3 Mouse Lymphocyte Suspension
208f Rat Fibroblast Adherent
2008 Human Ovary Adherent
2774 Human Ovary Adherent
293 Human Kidney Either
293-f Human Kidney Either
2780 Human Ovary Adherent
ok, derived from renal proximal tubules Opossum Kidney Adherent
osteoblasts Rat Bone Adherent
o23 Hamster Fibroblast Adherent
orbital fibroblast Human Fibroblast Adherent
opaec cells Sheep Endothelial Adherent
ovcar-3 Human Ovary Adherent
ovarian surface epithelial (ose) Human Ovary Adherent
omega e Mouse Embryo Adherent
ohio helas Human Cervix Suspension
ta3 Mouse Breast/Mammary Adherent
t lymphocytes (t cells) Mouse Lymphocyte Adherent
thp-1 Human Blood Suspension
t47d,t-47d Human Breast/Mammary Adherent
tsa201 Human Embryo Adherent
t-rex-cho Hamster Ovary Adherent
tr2 Mouse Brain Adherent
tib-90 Mouse Fibroblast Adherent
tig Human Fibroblast Adherent
t lymphocytes (t cells) Human Lymphocyte Adherent
tgw-nu-1 Human Bladder Adherent
tobacco protoplasts Plant Other Suspension
t-rex-293 Human Kidney Adherent
tk.1 Mouse Lymphocyte Suspension
t lymphocytes cytotoxic (ctl) cells Mouse Lymphocyte Either
t-rex hela Human Cervix Adherent
t24 Human Bladder Adherent
tyknu cells Human Ovary Adherent
t3cho/at1a Hamster Ovary Either
t98g Human Brain Adherent
dictyostelium Amoeba Other Suspension
daoy Human Other Adherent
dgz Plant Other Adherent
d3 embryonic stem cells Mouse Embryo Adherent
d.mel-2 Insect Embryo Either
drosophila kc Insect Embryo Adherent
dt40 Chicken Bursa Suspension
duck (in vivo) Duck Other Suspension
du145 Human Prostate Adherent
df1 Chicken Fibroblast Adherent
d10 Mouse Lymphocyte Suspension
do-11.10 Mouse Lymphocyte Suspension
daudi Human Lymphocyte Suspension
dc 2.4 cells Mouse Blood Either
32d Mouse Bone marrow Either
3t3-f442a Mouse Other Adherent
3.l2 Mouse Lymphocyte Either
33.1.1 Mouse Lymphocyte Suspension
3y1 Rat Fibroblast Adherent
l6e9 Rat Muscle Adherent
lap1 Mouse Lymphocyte Suspension
l1210 Mouse Monocyte Suspension
l-m(tk-) Mouse Connective Adherent
lan-5 Human Brain Adherent
lmh Chicken Liver Adherent
lk35.2 Mouse Lymphocyte Suspension
lymphoid cell line Rat Lymphocyte Suspension
l6 cells Rat Muscle Adherent
l929 Mouse Fibroblast Adherent
lncap Human Prostate Adherent
ltk Mouse Connective Adherent
lap3 Mouse Embryo Adherent
l1210-fas Mouse Myoblast Suspension
lisn c4 (nih 3t3 derivative overexpressing egf) Mouse Fibroblast Adherent
l8 cells Rat Myoblast Adherent
llc-pk1 Pig Kidney Adherent
lsv5 Human Keratinocyte Adherent
lewis lung carcinoma, llc Mouse Lung Either
lovo Human Colon Adherent
umrc6 Human Kidney Adherent
uok257 Human Kidney Adherent
u-937 Human Macrophage Suspension
umr 106-01 Rat Bone Adherent
u2os Human Bone Adherent
u9737 Human Lymphocyte Suspension
u251 cells Human Glial Adherent
uc729-6 Human Lymphocyte Either
u87, u87mg Human Astrocyte Adherent
u373mg Human Astrocyte Adherent
e14tg2a Mouse Embryo Adherent
endothelial cells (aortic) Pig Aorta Adherent
embryonic stem cells Mouse Embryo Adherent
e36 Hamster Lung Adherent
endothelial cells (pulmonary aorta) Rat Aorta Adherent
ebc-1 Human Lung Adherent
ewing sarcoma coh cells Human Bone Suspension
ef88 Mouse Fibroblast Adherent
e1-ts20 Human Breast/Mammary Adherent
el-4 Mouse Thymus Suspension
es-d3 Mouse Embryo Adherent
e. histolytica Amoeba Other Suspension
ecv Human Endothelial Adherent
epithelial cells (sra01/04) Human Epithelial Adherent
ecr-293 Human Kidney Adherent
epithelial cells (rte) Rat Trachael Adherent
es-2 ovarian clear cell adenocarcinoma Human Ovary Adherent
rat-1, rat fibroblasts Rat Fibroblast Adherent
rin 1046-38 Rat Pancreas Suspension
rj2.2.5 Human Lymphocyte Suspension
raw cells Rat Peritoneum Suspension
raec, rat aortic endothelial cells Rat Aorta Adherent
ros, rat osteoblastic cell line Rat Osteoblast Adherent
rat-6 (r6), rat embryo fibroblast Rat Fibroblast Adherent
rk13 Rabbit Kidney Adherent
rabbit pleural mesothelial Rabbit Lung Adherent
rat epithelial cells Rat Epithelial Adherent
rat c5, glioma cells Rat Glial Adherent
rcme, rabbit coronary microvessel endothelial Rabbit Endothelial Adherent
rw-4 Mouse Embryo Adherent
rh18 Human Muscle Adherent
raw 264.7 cells, murine macrophage cells Mouse Macrophage Adherent
ramos Human Lymphocyte Suspension
rccd1 Rat Kidney Adherent
rpe.40 Hamster Kidney Adherent
rat 2, rat fibroblasts Rat Fibroblast Adherent
rcho Rat Default Adherent
r1 embryonic stem cell, es Mouse Embryo Either
rat hepatic ito cells Rat Liver Adherent
rat adipocyte Rat Adipose Adherent
rko, rectal carcinoma cell line Human Colon Adherent
remc Rat Breast/Mammary Adherent
raji Human Lymphocyte Suspension
rat glomerular mesangial mc cells Rat Kidney Adherent
rabbit vsmc, vascular smooth muscle cells Rabbit Muscle Adherent
mv1lu Mink Lung Adherent
m12.4 Mouse Lymphocyte Adherent
mewo Human Melanoma Adherent
ms1 Mouse Pancreas Adherent
mono-mac-6 cells Human Blood Suspension
mouse embryonic fibroblasts Mouse Fibroblast Adherent
m21-l4 Human Melanoma Adherent
mcf-10 Human Breast/Mammary Adherent
mtd-1a Mouse Epithelial Adherent
msc human mesenchymal stem cell Human Bone marrow Adherent
mca-rh7777 Rat Liver Adherent
monocytes Human Blood Suspension
mutu i Human Lymphocyte Suspension
m3z Human Breast/Mammary Adherent
mel Mouse Other Adherent
mcf-7 Human Breast/Mammary Adherent
magi-ccr5 Human Epithelial Adherent
maize protoplasts Plant Other Adherent
mutu group3, b-cell line Human Lymphocyte Suspension
mtln3 Rat Breast/Mammary Adherent
m-imcd Mouse Kidney Adherent
mda-mb-468 Human Breast/Mammary Adherent
mf4/4 Mouse Macrophage Adherent
mdck Dog Kidney Adherent
mc3t3-e1 Mouse Osteoblast Adherent
m21 Human Melanoma Adherent
mt-2 Human Lymphocyte Adherent
min6 Mouse Default Either
myocytes (ventricular) Rat Heart Adherent
mrc-5 Human Lung Adherent
mda-mb-231 Human Breast/Mammary Adherent
m21-l Human Melanoma Adherent
mes-sa Human Uterus Adherent
molt4 (human acute t lymphoblastic leukaemia) Human Blood Suspension
mg87 Mouse Fibroblast Adherent
mtsv1-7 Human Epithelial Adherent
mt4 Human Lymphocyte Suspension
ma104 Primate - Non Human Kidney Adherent
macrophages Human Blood Either
murine alveolar macrophages cell line mhs Rat Lung Adherent
mg-63 cells Human Bone Adherent
me-180 Human Cervix Adherent
mob cells Mouse Osteoblast Adherent
melenoma cells Human Melanoma Adherent
mr1 Rat Embryo Adherent
mda-mb-453 Human Breast/Mammary Adherent
macrophages Mouse Peritoneum Adherent
mnt1 Human Skin Adherent
mat b iii Rat Breast/Mammary Adherent
mkn45 gastric cancer Human Stomach Adherent
mc ardle 7777 Rat Liver Either
m1 Rat Embryo Adherent
mdbk Cow Kidney Adherent
82-6 Human Fibroblast Adherent
bjab Human Lymphocyte Suspension
baec Cow Aorta Adherent
b-tc3 Mouse Pancreas Adherent
bs-c-1, bsc-1 Primate - Non Human Kidney Adherent
b82 Mouse Fibroblast Adherent
bsc-40 Primate - Non Human Kidney Adherent
bcec Human Brain Adherent
b35 Rat Neuroblastoma Adherent
bowes melanoma cells Human Skin Adherent
beas-2b Human Lung Adherent
bc3h1 Mouse Brain Adherent
bm5 Insect Ovary Suspension
bac Cow Adrenal Gland Adherent
bewo Human Uterus Adherent
b65 Rat Neuroblastoma Adherent
bovine chromaffin cells Cow Adrenal Gland Adherent
bone marrow cells Mouse Bone marrow Suspension
bfc012 Mouse Embryo Adherent
b16-f10 Mouse Melanoma Adherent
boll weevil brl-ag-3c Insect Other Adherent
b82 m721 Mouse Fibroblast Adherent
balb/mk Mouse Epithelial Adherent
bms-black mexican sweet protoplasts Default Default Suspension
b lymphocytes Human Blood Suspension
bone marrow derived stromal cells Human Bone marrow Adherent
bhk-21 Hamster Kidney Either
balb/c 3t3, 3t3-a31 Mouse Fibroblast Adherent
be(2)-c Human Neuroblastoma Adherent
bnl cl.2 (cl2) Mouse Liver Adherent
b-lcl Human Blood Suspension
b4.14 Primate - Non Human Kidney Adherent
bcl-1 Mouse Lymphocyte Adherent
baf3, ba/f3 Mouse Lymphocyte Suspension
bt cells Cow Fibroblast Adherent
bewo Human Other Adherent
bt549 Human Breast/Mammary Adherent
btm (bovine trachael myocytes) Cow Muscle Adherent
b11 Mouse Spleen Suspension
bosc 23 Human Kidney Adherent
j82 Human Bladder Adherent
jeg-3 Human Other Adherent
j774 cells Mouse Macrophage Adherent
jy Human Lymphocyte Suspension
jb6 rt101 Mouse Epithelial Either
jurkat Human Lymphocyte Suspension
jcam1.6 Human Lymphocyte Suspension
j558l Mouse Blood Suspension
jb6 p+ c141 Mouse Skin Adherent
1064sk Human Foreskin Adherent
143b Human Bone marrow Either
16-9 Human hamster hybrid cell line - transfected with two human genes Other Adherent
sw620 Human Colon Adherent
sk-hep-1 cells Human Skin Either
saos-2 Human Bone Adherent
sw480 Human Colon Adherent
smooth muscle cells (aortic) Rat Muscle Adherent
sk-n-sh, neuronal cells Human Brain Adherent
smooth muscle cells (vascular) Human Muscle Adherent
sknmc Human Brain Adherent
svr Mouse Pancreas Adherent
sk-ut-1 Human Muscle Adherent
sf21ae Insect Other Either
sk-lms-1 Human Other Adherent
splenocytes Mouse Spleen Suspension
stem Rat Bone Suspension
splenocytes (b cells t2) Mouse Spleen Suspension
s194 cells Mouse Lymphocyte Adherent
spoc-1 Rat Trachael Adherent
sf21 Insect Other Either
sl2 Drosophila melanogaster Default Either
sk-n-be(2) Human Neuroblastoma Adherent
shep Human Brain Adherent
splenocytes (resting b cells) Mouse Spleen Suspension
sk-n-as Human Neuroblastoma Adherent
smooth muscle cells (vascular) Rat Muscle Adherent
sw13 Human Adrenal gland/cortex Adherent
sh-sy5y Human Brain Either
smooth muscle cells (vascular) Rabbit Aorta Adherent
snb19 Human Brain Adherent
smmc7721 Human Liver Adherent
smooth muscle cells (aortic) rasmc (a7-r5) Rat Aorta Adherent
sf9 Insect Ovary Suspension
sp1 Mouse Breast/Mammary Adherent
schizosaccharomyces pombe Yeast Other Either
skov3 Human Ovary Adherent
siha Human Cervix Adherent
s49.1 Mouse Thymus Suspension
scc12, human squamous cell carcinoma line (c12c20) Human Skin Adherent
s2-013 Human Pancreas Either
stem cells Human Bone marrow Suspension
sk-br-3 Human Breast/Mammary Adherent
9hte Human Trachael Adherent
c6 cells Rat Brain Adherent
ca77 Rat Thyroid Adherent
calu-6 Human Lung Adherent
chick embryo chondrocytes Chicken Embryo Adherent
colo205 Human Colon Adherent
cho-trvb Hamster Ovary Adherent
cho k1 Hamster Ovary Adherent
chicken sperm Chicken Sperm Adherent
c1c12 Mouse Muscle Adherent
ch12f3-2a Mouse Lymphocyte Suspension
cho -b53 Hamster Ovary Adherent
ccl-16-b9 Hamster Lung Adherent
cho-lec2 Hamster Ovary Adherent
cho dg44 Hamster Ovary Either
chick embryo blastodermal cells Chicken Embryo Adherent
cho 58 Hamster Ovary Adherent
ctll-2 Mouse Lymphocyte Suspension
cf2th Dog Thymus Adherent
cho - b53 jf7 Hamster Ovary Adherent
clone a Human Colon Adherent
c57bl/6 cells Mouse Heart Adherent
canine gastric parietal cells Dog Stomach Adherent
cwr22rv1 Human Prostate Adherent
ct26 Mouse Colon Either
cv-1 Primate - Non Human Kidney Adherent
cell.220(b8) Human Default Suspension
cem Human Blood Suspension
cj7 Mouse Embryo Adherent
cg-4 Rat Glial Adherent
capan-2 Human Pancreas Adherent
cos-gs1 Primate - Non Human Kidney Adherent
c33 Human Cervix Adherent
caco-2 cells Human Colon Adherent
cardiomyocytes Rat Heart Adherent
c3h 10t1/2 Mouse Fibroblast Adherent
c1.39t Human Fibroblast Adherent
cos-1 Primate - Non Human Kidney Adherent
cho-leu c2gnt Hamster Ovary Adherent
calu-3 Human Lung Adherent
c13-nj Human Glial Adherent
cho-b7 Hamster Ovary Adherent
cmt-93 Mouse Rectum Adherent
c3a Human Liver Adherent
c127 Mouse Epithelial Adherent
c4-2 Human Prostate Adherent
cfk2 Rat Bone Adherent
caski Human Cervix Adherent
c1r, hmy2.c1r Human Lymphocyte Adherent
crl6467 Mouse Liver Adherent
cho-lec1 Hamster Ovary Adherent
crfk Cat Kidney Adherent
ct60 Hamster Ovary Adherent
cowpea plant embryos Fungi Embryo Adherent
cerebellar Mouse Brain Adherent
chinese hamster lung Hamster Lung Adherent
cos-m6 Primate - Non Human Kidney Adherent
cho-s Hamster Ovary Suspension
c2c12 Mouse Muscle Adherent
catha, cath.a Mouse Brain Either
cos-7 Primate - Non Human Kidney Adherent
cardiomyocytes Human Heart Adherent
chicken hepatocytes Chicken Liver Adherent
cd34+ monocytes Human Monocyte Suspension
clone-13, mutant b lymphoblastoid Human Lymphocyte Suspension
cak Mouse Fibroblast Adherent
chu-2 Human Epithelial Adherent
chick embryo fibroblasts Chicken Embryo Adherent
구체적인 일 양태에서, 상기 조성물에 아자이드화나트륨(sodium azide)을 추가로 포함할 수 있다. 하이드로겔 세포 필름은 보관 기간에 따라 단기 보관용 및 장기 보관용으로 나뉘며 장기보관용은 방부제 특성의 0.01% 아자이드화나트륨이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 세포에 제1용액과 제2용액을 도포하여 응고반응을 진행하는 단계를 포함하는 세포 필름 제조 방법으로서, 상기 제1용액은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 조성물이고, 상기 제2용액은 증류수에 용해된 5 내지 20% APS인, 세포 필름 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서 상기 "제1용액"은 본 명세서에서 "필름액"과 동일한 의미로 사용되며, 상기 "제2용액"은 실시예상 "응고액-1"과 같은 의미로 사용될 수 있고, 제1용액인 "필름액"과 혼합시 화학 반응으로 폴리-하이드로겔화 반응을 진행시킬 수 있다.
구체적인 세포 필름 제조 방법은 도 2a 및 도 2b에 나타난 순서도와 같으며, 본발명의 세포 필름 제조 방법에 있어서, 상기 아크릴아마이드의 농도는 20 내지 40 % (w/v)이고, 비스아크릴아마이드는 0.01 내지 0.1 % (v/v), 소듐아크릴레이트의 농도는 5 내지 20% (w/v), TEMED의 농도는 0.5 내지 0.8 % (v/v)일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 아크릴아마이드의 농도는 30%, 비스아크릴아마이드의 농도는 0.02%, 소듐아크릴레이트의 농도는 10%일 수 있으며, TEMED의 농도는 0.65 %일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 세포 확대가 원하는 만큼 이루어지지 않을 수 있다(도 1 참조).
상기 세포 필름 제조 방법에 이용될 수 있는 세포는 동물, 원생동물, 갑각류, 파충류, 식물, 곤충 유래 세포, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종으로부터 유래된 세포일 수 있으며, 본 명세서의 표 1에서 선택되는 어느 1종 이상으로부터 유래한 세포일 수 있다. 이외에도 가능한 세포에 대해서는 상기 세포 필름 제조용 조성물에서 전술한 바와 같으므로, 기재를 생략한다.
세포 필름 제조 방법에 이용되는 제1용액에 아자이드화나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 이는 상기 세포 필름 제조용 조성물에서 전술한 바와 같으므로, 기재를 생략한다. 단기 및 장기 보관용 필름액으로 제작된 세포 필름을 비닐 지퍼백으로 밀봉하여 상온에서 간편하게 보관이 용이하며, 형광 항체 및 dye가 염색된 세포의 하이드로겔 세포 필름은 차광 비닐 지퍼백을 이용하여 보관이 가능하다.
상기 세포 필름 제조 방법에서 응고반응은 5분 내지 60분간 수행될 수 있으며, 바람직하게는 10분 내지 40분간 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 15분 내지 30분간 수행될 수 있다.
상기 응고된 세포 필름을 파라필름으로 밀봉하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 일실시예에서 커버슬립 내에서 하이드로겔 세포 필름의 정형화가 가능하였으며, 하이드로겔이 흡착되지 않는 파라필름을 부착하였고, 가위를 이용하여 사용자가 원하는 크기로 건조된 하이드로겔 세포 필름을 절단하여 사용 가능하도록 제조가능하다(도 2c). 이와 같은 방법으로 제조된 세포 필름은 세포 확대 이미징 분석이 필요한 사용자에게 번거러운 세포 배양 과정이 없이 일회성으로 사용이 가능하며 또한 세포 필름의 보관 또한 용이하다.
본 발명은 상기 세포 필름 제조 방법으로 제조된 세포 필름을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 전술한 세포 필름을 제1용액에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 세포 필름에 제3용액을 도포하여 응고반응을 진행하는 단계; 를 포함하는 세포 확대 방법으로서, 상기 제1용액은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 조성물이고, 상기 제3용액은 증류수에 용해된 0.5 내지 2% APS인, 세포 확대 방법을 제공한다.
세포 확대 방법은 전술된 방법으로 제조된 세포 필름을 추가적으로 필름액 또는 응고액에서 하이드로겔화 및 재응고화를 진행하여 세포를 확대시키를 방법을 의미하며, 구체적인 과정은 도 4에 나타난 바와 같다.
본 명세서에 있어서 상기 "제3용액"은 실시예상 "응고액-2"와 같은 의미로 사용될 수 있고, 제1용액인 "필름액"과 혼합시 화학 반응으로 폴리-하이드로겔화 반응을 진행시킬 수 있다.
세포 필름을 제1용액에 배양 및 제3용액으로 하이드로겔화 및 재응고 과정(1~5 회)을 반복하여 확대되는 비율을 확인한 결과는 [표 3]과 같고, 이를 이미징화 한 결과는 도 5a 내지 도 5e와 같다.
상기 세포 확대 방법에서 (a) 단계의 제1용액의 아크릴아마이드의 농도는 30 내지 40 %이고, 비스아크릴아마이드는 0.01 내지 0.1 %, 소듐아크릴레이트의 농도는 5 내지 20%, TEMED의 농도는 0.5 내지 0.8 %일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 아크릴아마이드의 농도는 30%, 비스아크릴아마이드의 농도는 0.02%, 소듐아크릴레이트의 농도는 10%일 수 있으며, TEMED의 농도는 0.65 %일 수 있다.
구체적인 일 양태에서, 상기 (a) 단계의 배양은 2℃ 내지 10℃에서 4시간 내지 12시간 동안 진행될 수 있으며, 바람직하게는 5시간 내지 8시간동안 진행될 수 있고, 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있다.
구체적인 일 양태에서, 상기 (b) 단계의 응고반응은 5분 내지 60분간 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5분 내지 30분간 수행될 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계 내지 (b) 단계를 1 내지 3회 반복할 수 있다. 상기 (a) 단계 내지 (b) 단계를 1 내지 3회 반복하여 제조된 세포 필름을 제1용액에서 2℃ 내지 10℃에서 6시간 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
전술한 세포 확대 방법에서 (b) 단계 이후, (c) 상기 (b) 단계에서 응고된 세포 필름을 PBS에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 배양된 세포 필름을 증류수에서 배양하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 하이드로겔 세포 필름을 PBS에서 배양하는 단계에서 PBS의 농도는 0.05 내지 0.2M 일 수 있으며, 바람직하게는 0.1M 일 수 있다.
일 양태에 있어서, 상기 (c) 단계 또는 (d) 단계에서 형광 이미징 분석을 위한 항체 또는 염색 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포 이미징 분석 기술 분야에 있어서. 이용될 수 있는 항체 또는 염색 물질이라면 제한없이 사용가능하다. 항체 염색을 진행하여 초고해상도 이미징 분석이 가능하여여 최대 22~24배 확대가 가능하다. 본 발명에 의한 확대 방법을 이용하는 경우, 얇은 두께의 하이드로겔 세포 필름으로 최대 확장되어도 이미징 분석 가능한 두께이다. 0.17mm (170um)의 두께의 얇은 하이드로겔 세포 필름을 5round의 반복적인 하이드로겔화를 진행시 최대 20배 확대가 되며, 확대된 하이드로겔 두께는 약 2.5mm로서 현미경의 작동거리 (보통 2mm)내에 하이드로겔 내의 확대된 세포 이미징 분석이 가능하다.
본 발명의 하이드로겔 세포 필름을 이용하는 경우, 최대 약 22~24배 확대가 가능하며, 세포가 포함된 시료가 커지더라도 두께가 얇아 초고해상도 이미징 분석에 이용될 수 있다. 또한, 단기 및 장기 보관이 가능하며, 추가적인 세포 배양 없이도 언제든지 사용이 가능하다.
도 1은 PBS 기반의 용액과 본 발명의 dH2O 기반 용액의 하이드로겔 조성을 달리하여 세포 확대를 비교한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 하이드로겔 세포 필름 제작 과정, 도 2c는 하이드로겔 세포 필름의 보관 방법을 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 본 발명에 따라 제작된 하이드로겔 세포 필름을 이용한 세포 확대 결과를 나타낸다.
도 4는 하이드로겔화 및 재응고 과정을 반복하여 확대시키는 과정을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5e는 하이드로겔화 및 재응고과정을 반복하여 확대되는 비율을 확인하여 이미징화 한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[준비예]
필요 시약 및 용품
50 mL conical tube, 유리 커버슬립 (24 x 24-mm), 유리 커버슬립 (24 x 60-mm), PALAFILM, Gel Releasers, 아크릴아마이드(acrylamide), 2% 비스-아크릴아마이드 용액(bis-acrylamide solution), 소듐아크릴레이트(sodium acrylate), 소듐 아자이드(sodium azide), 2~4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, (PFA)), 암모늄 펄설페이트(ammonium persulfate (APS)), 테트라메틸에틸렌다이아민(tetramethylethylenediamine, (TEMED)), 10X PBS (phosphate-Buffered Saline).
사용된 하이드로겔 필름액 및 응고액 제조법은 다음과 같다.
(1) 필름액 : 증류수에 용해된 30% 아크릴아마이드(acrylamide), 0.02% 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 10% 소듐아크릴레이트, 0.01% 소듐아자이드, 0.65% TEMED
(2) 응고액-1 (초기 필름 제작용) : 증류수에 용해된 10% APS
(3) 응고액-2 (Round 응고용) : 증류수에 용해된 1% APS
조성의 아크릴아마이드(acrylamide)와 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide)는 cross-linking 구조를 이루어 하이드로겔화 하는 성분이고 소듐아크릴레이트(sodium acrylate)는 수분을 흡수하여 확장하는 특성을 지닌다. 하이드로겔 세포 필름은 보관 기간에 따라 단기 보관용 및 장기 보관용으로 나뉘며 장기보관용은 방부제 특성의 0.01% sodium azide (아자이드화나트륨)가 추가 첨가된다.
<실시예 1>
세포 필름 제조용 조성물의 최적화
다양한 필름 용액의 조성물에 의한 하이드로겔의 확장된 크기를 비교하였다.
하기 표 2에서는 아크릴아마이드의 농도, 비스-아크릴아마이드의 농도를 각각 다르게 하고, PBS 및 dH2O에 용해시켰을 때의 확대 배율을 나타냈다.
Hydrogel 조성 Gel In 1X PBS In dH2O 배율
30% AA 0.1% BA 10% SA 1X PBS 8mm 18mm 30mm 3.8 X
0.05% BA 8mm 19mm 34mm 4.3 X
0.02% BA 8mm 20mm 38mm 4.8 X
0.1% BA dH2O 8mm 18mm 34mm 4.3 X
0.05% BA 8mm 20mm 39mm 4.9 X
0.02% BA 8mm 22mm 42mm 5.3 X
40% AA 0.1% BA 10% SA 1X PBS 8mm 18mm 30mm 3.8 X
0.05% BA 8mm 18mm 31mm 3.9 X
0.02% BA 8mm 19mm 36mm 4.5 X
0.1% BA dH2O 8mm 18mm 31mm 3.9 X
0.05% BA 8mm 19mm 34mm 4.3 X
0.02% BA 8mm 20mm 38mm 4.8 X
(AA : Acrylamide, BA : Bis-acrylamide, SA : Sodium Acrylate) 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, PBS 기반의 하이드로겔보다 본원발명의 dH2O 기반 하이드로겔이 더 큰 겔 확대를 이루는 것을 확인하였다. 또한, 30% 아크릴아마이드 및 0.02% 비스-아크릴아마이드가 첨가된 dH2O기반의 필름 용액은 0 round에서 5배 이상의 크기로 확장이 가능한 특징을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 하이드로겔 세포 필름을 제작 및 최대 24배 확장을 위한 배양 용액은 (30% 아크릴아마이드, 0.02% 비스-아크릴아마이드, 10% 소듐 아크릴레이트 in dH2O) 조성으로 하여, 추후 실험을 진행하였다.
<실시예 2>
하이드로겔 세포 필름의 제작 과정
하이드로겔 세포 필름의 제작 과정은 다음과 같다(도 2a 및 도 2b)
1) 세포의 준비
6 웰 플레이트에 24 x 24 mm 커버슬립을 넣고 각 웰당 세포가 포함된 세포 배양 배지 (DMEM or DMEM/F12 + 10% FBS + 50 μg/ml penicillin/streptomycin)을 2~3 mL 넣어준 뒤 24시간 CO2 인큐베이터에서 배양한다. 배지를 제거하고 0.1M PBS로 세척한다. 각 웰에 2~4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)를 1 mL씩 넣어 20-30분간 고정한다. PFA를 제거해준 후, 0.1M PBS로 3회에 걸쳐 세척해준다.
2) 하이드로겔 세포 필름 제작을 위한 유리틀 준비
하이드로겔 필름은 두께 0.17 mm (170μm)의 유리 커버슬립 8개 (24 x 60mm)를 이용하여 틀에서 만들어지며, 하단부 받침 (3개), 기둥 (각 2개씩 2세트), 덮개 (1개)로 이루어져 있고, 중심부에 배양된 세포가 부착된 커버슬립 (22 x 22mm 혹은 24 x 24 mm)을 배치한다.
3) 배양된 세포가 키워진 커버슬립을 유리틀 내에 배치
하나의 하이드로겔 세포 필름을 제작시 필름액은 APS와 혼합시 화학반응으로 폴리-하이드로겔화 진행이 되며, 각 세포 필름을 제작할 시에는 유리틀 안으로 세포가 포함된 커버슬립을 배치한다.
4) 필름액과 응고액의 혼합액 도포 후 하이드로겔화 진행
필름액 285 μL 및 응고액-1 (10% APS) 15 μL을 혼합 후 빠르게 세포를 도포하여 필름액이 하이드로겔화 응고되기 전에 덮개용 커버슬립으로 덮어준다. 20분간 하이드로겔화를 진행한다.
5) 유리틀 제거 후 세포 필름 분리
응고 반응 10~20분 후 틀에 사용된 커버슬립들을 조심스럽게 제거하여 하이드로겔 세포 필름을 파라핀 성분으로 이루어진 파라필름 (4 x 10mm) 위에 올린다.
6) 파라필름에 배치
이후, 다른 파라필름 (4 x 10mm)으로 덮어 2개의 파라필름 사이에 배치토록하여 추가 건조시킨다. 가위를 이용하여 하이드로겔 잔여물을 제거한다.
7) 보관
다듬어진 하이드로겔 세포 필름을 새로운 파라필름으로 옮기고, 파라필름 표면에 세포의 윗면 및 아랫면 위치를 라벨링해준 뒤, 지퍼백에 밀봉하여 실온에서 보관한다. 파라필름과 샌드위치된 하이드로겔 세포 필름은 가위를 이용하여 사용자의 원하는 사양에 따른 크기로 절단하여 사용이 가능하다.
하이드로겔 세포 필름은 하이드로겔 특성상 접착력이 강하여 안전하게 도포하여 보관하기가 매우 어렵다. 파라필름은 하이드로겔 세포 필름을 도포시 밀봉 및 제거가 용이하며, 하이드로겔 세포 필름에 데미지를 주지 않는다. 또한, 파라필름은 하이드로겔 세포 필름을 밀봉 도포한 상태에서 가위를 이용하여 절단하기가 쉽다.
하이드로겔 세포 필름의 보관
[도 2c]에 나타난 바와 같이, 하이드로겔 세포 필름의 보관은 파라필름에 보존된 하이드로겔 세포 필름을 2가지의 지퍼백에 밀봉된 상태에서 별도의 보관함에 보관하며, 별도의 방부제와 함께 실온에서 장기간 보관이 용이하다.
- 일반적인 세포 필름 : 투명비닐 지퍼백 (예: 5 x 7 cm) 보관 및 스티커 라벨링
- 염색된 세포 필름 : 차광비닐 지퍼백 (예: 5 x 7 cm) 보관 및 스티커 라벨링
<실시예 3>
하이드로겔 세포 필름을 이용한 세포 확대
제작된 하이드로겔 세포 필름은 0.1M PBS에 옮겨 배양시 약 2.7~3배 커지고, 순차적으로 dH2O에 옮겨 배양하면 최종적으로 5~5.5배 커지며, 본 단계를 0 round라고 지칭한다. 이 때에, 0.1M PBS에서 배양 후 dH2O에 옮겨 배양하면 겔이 급격하게 커질 수 잇으므로, 겔을 안정적으로 커지게 하기 위해, PBS의 농도를 낮추어 0.01M PBS에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
각각의 라운드 사이클을 반복할수록 확대 배율은 올라가고, 두께에는 큰 변화가 없음을 도 3a에서 확인할 수 있다.
5~5.5배 커진 하이드로겔을 0.1M PBS에 재배양시 하이드로겔은 크기가 작아져 이전 단계 약 2.7~3배의 크기로 되돌아간다. 이러한 하이드로겔의 팽창과 수축은 반복적으로 진행이 가능하며, 0.1M PBS에 배양 단계에서 형광 이미징 분석을 위한 항체 및 dye를 염색이 가능하다.
본 발명자는 사전에 배양된 세포를 DAPI dye를 이용하여 세포를 사전 염색하였고, 이를 이용하여 하이드로겔 세포 필름을 제작하였다. 하이드로겔 세포 필름을 가위로 이용화여 가로 세포 2.7mm x 2.7mm 혹은 3mm x 3mm 크기로 절단하여, 이후 세포 확대화를 진행하였다(도 3b).
도 3c에 나타난 바와 같이, 약 3mm의 하이드로겔 세포 필름 및 세포는 순차적으로 0.1M PBS에서 2.7~3배 커지며, 최종적으로 dH2O에서 5~5.5배 커지는 것을 확인하였다.
구체적으로, 하이드로겔화 및 재응고 과정(1~5 회)을 반복하여 확대시키는 과정은 도 4와 같다.
또한, 세포 필름을 필름액에 배양 및 응고액-2로 하이드로겔화 및 재응고 과정(1~5 회)을 반복하여 확대되는 비율을 확인한 결과는 하기 [표 3]와 같고, 이를 이미징화 한 결과는 도 5a 내지 도 5e와 같다.
횟수 세포 필름 크기 필름액에 배양 후 크기 0.1M PBS에 배양 후 크기 dH2O에 배양 후 크기
0 round 2.7 x 2.7 mm 또는 3 x 3 mm (1배) - 8 x 8 mm
(2.7~3배)		 15 x 15 mm (5~5.5배)
1 round 2.7 x 2.7 mm 또는
3 x 3 mm (1배)		 1회 7 x 7 mm
(2.3~2.6배)		 11.5 x 11.5 mm (3.8~4.2배) 18.5 x 18.5 mm (6.2~6.8배)
2 round 2.7 x 2.7 mm 또는
3 x 3 mm (1배)		 1회 7 x 7 mm
(2.3~2.6배)		 -
2회 9.5 x 9.5 mm
(3.2~3.5배)		 18 x 18 mm (6~6.7배) 24.5 x 24.5 mm (8.2~9배)
3 round 2.7 x 2.7 mm 또는
3 x 3 mm (1배)		 1회 7 x 7 mm
(2.3~2.6배)		 -
2회 9.5 x 9.5 mm
(3.2~3.5배)
3회 16.5 x 16.5 mm
(5.5~6.1배)		 28 x 28 mm (9.3~10.4배) 32 x 32 mm (10.6~11.8배)
4 round 2.7 x 2.7 mm 또는
3 x 3 mm (1배)		 1회 7 x 7 mm
(2.3~2.6배)		 -
2회 9.5 x 9.5 mm
(3.2~3.5배)
3회 16.5 x 16.5 mm (5.5~6.1배)
4회 22.5 x 22.5 mm
(7.5~8.3배)		 33.5 x 33.5 mm (11.2~12.4배) 50 x 50 mm (16.7~18.5배)
5 round 2.7 x 2.7 mm 또는
3 x 3 mm (1배)		 1회 7 x 7 mm
(2.3~2.6배)		 -
2회 9.5 x 9.5 mm
(3.2~3.5배)
3회 16.5 x 16.5 mm (5.5~6.1배)
4회 22.5 x 22.5 mm (7.5~8.3배)
5회 28.5 x 28.5 mm (9.5~10.5배) 42 x 42 mm (14~15.5배) 66 x 66 mm (22~24배)
[표 3]에 나타난 바와 같이, 최종적으로 dH2O에서 세포를 6.2~24배까지 확대시켜 줄 수 있다. 추가적으로 6 round 이상의 과정을 반복하여 세포를 더 크게 확장할 수 있으나, 현재의 보편적인 이미지 분석용 현미경 시스템에서는 작동거리 (Working distance)의 한계로 불가능하다. 하지만, 향후 작동거리의 한계가 극복되고 미세 형광 신호를 감지하는 현미경의 경우 시각적인 이미징 분석이 가능할 수 있다. 따라서, 이미징 분석 시스템의 한계로 인해 본 발명의 일반적인 현미경을 통한 관찰시 최대 적용 세포 크기는 4-5 round의 16.7배~22배 (18.5~24배)까지 가능하다. 이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였지만, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 증류수에 용해된 아크릴아마이드(acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 소듐아크릴레이트(sodium acrylate) 및 TEMED를 포함하는 세포 필름 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아크릴아마이드의 농도는 20 내지 40 % (w/v)이고, 비스아크릴아마이드는 0.01 내지 0.1 % (v/v), 소듐아크릴레이트의 농도는 5 내지 20% (w/v), TEMED의 농도는 0.5 내지 0.8 % (v/v)인, 세포 필름 제조용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 명세서 내 표 1에서 선택되는 어느 1종 이상인, 세포 필름 제조용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물에 아자이드화나트륨(sodium azide)을 추가로 포함하는, 세포 필름 제조용 조성물.
  5. 세포에 제1용액과 제2용액을 도포하여 응고반응을 진행하는 단계를 포함하는 세포 필름 제조 방법으로서,
    상기 제1용액은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 조성물이고,
    상기 제2용액은 증류수에 용해된 5 내지 20% APS인, 세포 필름 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아크릴아마이드의 농도는 30 내지 40 %이고, 비스아크릴아마이드는 0.01 내지 0.1 %, 소듐아크릴레이트의 농도는 5 내지 20%, TEMED의 농도는 0.5 내지 0.8 %인, 세포 필름 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 세포는 명세서 내 표 1에서 선택되는 어느 1종 이상인, 세포 필름 제조 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1용액에 아자이드화나트륨을 추가로 포함하는, 세포 필름 제조 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 응고반응은 5분 내지 60분간 수행되는, 세포 필름 제조 방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 응고된 세포 필름을 파라필름으로 밀봉하는 단계를 추가로 포함하는, 세포 필름 제조 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 필름 제조 방법으로 제조된 세포 필름.
  12. (a) 제11항의 세포 필름을 제1용액에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 세포 필름에 제3용액을 도포하여 응고반응을 진행하는 단계;
    를 포함하는 세포 확대 방법으로서,
    상기 제1용액은 증류수에 용해된 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 소듐아크릴레이트 및 TEMED를 포함하는 조성물이고,
    상기 제3용액은 증류수에 용해된 0.5 내지 2% APS인, 세포 확대 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 제1용액의 아크릴아마이드의 농도는 30 내지 40 %이고, 비스아크릴아마이드는 0.01 내지 0.1 %, 소듐아크릴레이트의 농도는 5 내지 20%, TEMED의 농도는 0.5 내지 0.8 %인, 세포 확대 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 배양은 2℃ 내지 10℃에서 4시간 내지 12시간 동안 배양되는, 세포 확대 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 응고반응은 5분 내지 60분간 수행되는, 세포 확대 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계 내지 (b) 단계를 1 내지 3회 반복하는, 세포 확대 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계 내지 (b) 단계를 1 내지 3회 반복하여 제조된 세포 필름을 제1용액에서 2℃ 내지 10℃에서 6시간 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 세포 확대 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 (b) 단계 이후,
    (c) 상기 (b) 단계에서 응고된 세포 필름을 PBS에서 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 배양된 세포 필름을 증류수에서 배양하는 단계;
    를 추가로 포함하는, 세포 확대 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 PBS의 농도는 0.05 내지 0.2M 인, 세포 확대 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 (c) 단계 또는 (d) 단계에서 형광 이미징 분석을 위한 항체 또는 염색 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 세포 확대 방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019056708A (ja) * 2014-02-21 2019-04-11 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 膨張顕微鏡法
KR102148747B1 (ko) * 2012-08-09 2020-08-27 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물
JP6909227B2 (ja) * 2016-02-25 2021-07-28 マサチューセッツ インスチチュート オブ テクノロジー 臨床組織標本を膨張させるための方法
WO2021183956A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Yale University Methods and systems for physical expansion and imaging of biological samples
KR102368585B1 (ko) * 2018-09-28 2022-03-03 서울대학교산학협력단 온도에 따라 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 이용한 생체조직 이미징

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102148747B1 (ko) * 2012-08-09 2020-08-27 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물
JP2019056708A (ja) * 2014-02-21 2019-04-11 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 膨張顕微鏡法
JP6909227B2 (ja) * 2016-02-25 2021-07-28 マサチューセッツ インスチチュート オブ テクノロジー 臨床組織標本を膨張させるための方法
KR102368585B1 (ko) * 2018-09-28 2022-03-03 서울대학교산학협력단 온도에 따라 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 이용한 생체조직 이미징
WO2021183956A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Yale University Methods and systems for physical expansion and imaging of biological samples

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