WO2024053316A1 - 化合物、細胞外小胞染色剤、および、細胞外小胞の蛍光染色方法 - Google Patents
化合物、細胞外小胞染色剤、および、細胞外小胞の蛍光染色方法 Download PDFInfo
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Classifications
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- C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
- C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Definitions
- the disclosure in this application relates to compounds, extracellular vesicle staining agents, and methods for fluorescent staining of extracellular vesicles.
- Extracellular vesicles exist in human body fluids such as blood and urine, but they are also found in food. These extracellular vesicles exhibit various usefulness by regulating the functions of the cells into which they are taken up. It is proposed that it acts on the skin by accelerating metabolism.
- Patent Document 1 a method of staining extracellular vesicles with a specific compound is also known.
- Patent Document 1 can detect extracellular vesicles, it cannot be used for size measurement using liquid chromatography or the like.
- the disclosure in this application provides a new compound that binds to extracellular vesicles and whose size can be measured using liquid chromatography, an extracellular vesicle staining agent, and a method for fluorescently staining extracellular vesicles. That is the issue.
- R 1 represents H, a C 1 -C 6 alkyl group, a hydroxy group, an amino group, or a carboxy group.
- R 2 represents H, a C 1 -C 18 alkyl group, C 1 -C 18 alkoxy group, NO 2 or N(CH 3 ) 2.
- R 3 and R 4 each independently represent H or CH 3. However, R 3 and R 4 combine with each other to form a ring. In that case, R 3 and R 4 are CH 2.
- a represents 0 or 1
- b represents 1, 2 or 3.
- Z is a group consisting of C, O, N.
- the compound represented by formula (1) is a compound represented by formula (2) below, The compound described in [1] above.
- R 1 represents H or CH 3 .
- R 2 represents H, CH 3 , OCH 3 or N(CH 3 ) 2 .
- R 3 and R 4 each independently represent H or represents CH 3.However , R 3 and R 4 may be combined with each other to form a ring, in which case R 3 and R 4 are CH 2.
- a represents 0 or 1
- b represents 1, 2 or 3.
- Y is a C 1 - C 5 alkyl group, an ether chain represented by the following formula (2a), an amide-containing ether chain represented by the following formula (2b), or the following: It represents a triazole represented by formula (2c).
- n1 in formula (2a) represents an integer from 1 to 3.
- n2 in formula (2b) represents an integer from 1 to 3.
- n3 represents an integer from 0 to 6, and n4 represents an integer from 0 to 3.
- the compound represented by formula (1) is a compound represented by formula (3) below, The compound described in [1] above. (In formula (3), R 3 and R 4 each independently represent H or CH 3 .
- R 3 and R 4 may be combined with each other to form a ring, and in that case, R 3 and R 4 is CH 2.
- n represents an integer from 0 to 3.
- the sample contains a pharmaceutical, Evaluating drugs by measuring extracellular vesicles taken into cells. The method for fluorescent staining of extracellular vesicles according to [9] above.
- the sample contains cells, Assessing the state of cells by measuring extracellular vesicles within cells. The method for fluorescent staining of extracellular vesicles according to [9] above.
- the sample contains food or drink, Evaluate food or beverages by measuring extracellular vesicles in foods or beverages, The method for fluorescent staining of extracellular vesicles according to [9] above.
- the sample includes biological tissue collected from a living body, Evaluating living tissues by measuring extracellular vesicles in collected living tissues. The method for fluorescent staining of extracellular vesicles according to [9] above.
- Example 2 is a graph showing the results of analyzing stained milk-derived extracellular vesicles using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Comparative Example 1.
- 3 is a graph showing the results of analyzing stained milk-derived extracellular vesicles using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 10.
- 3 is a graph showing the results of analyzing stained milk-derived extracellular vesicles using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 10.
- Example 10 is a graph showing the results of analyzing stained milk-derived extracellular vesicles using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 10.
- 3 is a graph showing the results of analyzing stained milk-derived extracellular vesicles using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 10.
- 3 is a graph showing the results of analyzing stained milk-derived extracellular vesicles using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 10.
- 3 is a graph showing the results of heat-treating stained milk-derived extracellular vesicles and analyzing them using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Comparative Example 2.
- 12 is a graph showing the results of heat-treating stained milk-derived extracellular vesicles and analyzing them using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 11.
- 12 is a graph showing the results of heat-treating stained milk-derived extracellular vesicles and analyzing them using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 11.
- 12 is a graph showing the results of heat treating stained extracellular vesicles derived from various lactic acid bacteria and analyzing them using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Example 12.
- FIG. 13 is a graph showing that stained milk and extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria could be size-separated using a high-performance liquid chromatography gel filtration system in Example 13.
- Example 3 is a graph showing the results of analyzing stained extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Comparative Example 3.
- 12 is a graph showing the results of analyzing stained extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Example 14.
- 12 is a graph showing the results of analyzing stained extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Example 14.
- 12 is a graph showing the results of analyzing stained extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Example 14.
- 12 is a graph showing the results of analyzing stained extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Example 14.
- 12 is a graph showing the results of analyzing stained extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) using a high performance liquid chromatography gel filtration system in Example 14. This is a photograph confirming that in Example 15, milk-derived extracellular vesicles labeled with GIF-2276 can be tracked within transfected cells.
- Example 17 and Comparative Example 4 milk-derived extracellular vesicles stained with GIF-2250 described in Patent Document 1 and GIF-2276 synthesized in Example 1 were analyzed using a high performance liquid chromatography gel filtration system. This is a graph showing the results.
- Example 17 and Comparative Example 4 extracellular vesicles were detected by a plate reader using GIF-2250 described in Patent Document 1, and extracellular vesicles were detected by gel filtration using GIF-2276 synthesized in Example 1. It is a graph showing that there is a correlation in the detection of cells.
- 18 is a graph showing the results of analyzing extracellular vesicles contained in milk of different degrees of freshness using GIF-2276 synthesized in Example 1 in Example 18.
- the compound according to the embodiment is characterized by being a compound represented by the following formula (1).
- the compound represented by formula (1) specifically binds to extracellular vesicles and emits fluorescence.
- extracellular vesicle refers to a general term for vesicles secreted from cells, such as exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies.
- R 1 represents H, a C 1 -C 6 alkyl group, a hydroxy group, an amino group or a carboxy group.
- the C 1 -C 6 alkyl group may be straight chain, branched or cyclic.
- Examples of C 1 -C 6 alkyl groups include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, Examples include isopentyl group, sec-pentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group, sec-hexyl group, cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, and cyclohexyl group.
- R 2 represents H, a C 1 -C 18 alkyl group, a C 1 -C 18 alkoxy group, NO 2 or N(CH 3 ) 2 .
- the C 1 -C 18 alkyl group may be straight chain, branched or cyclic.
- Examples of the C 1 -C 18 alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, sec-pentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group, sec-hexyl group, n-heptyl group, isoheptyl group, sec-heptyl group, n-octyl group, isooctyl group, sec-octyl group, Nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, heptadecyl group, oc
- the C 1 -C 18 alkoxy group may be saturated or unsaturated and may have an aromatic ring. Further, the C 1 -C 18 alkoxy group may be linear, branched or cyclic. Examples of the C 1 -C 18 alkoxy group include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, cyclopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, tert-butoxy group, pentyloxy group, hexyloxy group , octyloxy group, nonaoxy group, decaneoxy group, undecaneoxy group, dodecaneoxy group, tridecaneoxy group, tetradecaneoxy group, pentadecaneoxy group, hexadecaneoxy group, heptadecanoxy group, octadecaneoxy group, vinyloxy group, allyloxy group , 1-propenyloxy group, isopropenyloxy group, 1-butenyloxy group,
- R 3 and R 4 each independently represent H or CH 3 , and R 3 and R 4 may be the same or different. However, R 3 and R 4 may be combined with each other to form a ring, and in that case, R 3 and R 4 are CH 2 .
- a 0 or 1
- b 1, 2 or 3.
- Z represents a linker that links the fluorescent group described on the left side of (Z) in formula (1) and the chemical structure on the right side of (Z).
- the linker (Z) is a combination of 0 to 12 chain molecules composed of an element selected from the group consisting of C, O, and N, and the chain molecules may include a cyclic structure or a branched chain.
- the linker (Z) will be explained in more detail with reference to an example in which three chain molecules (x, y, z) are bonded (-xyz-).
- Each of the chain molecules x, y, and z may be any element selected from C, O, and N.
- the selected elements may be the same or different.
- the linker may be composed of the same element as in -cc-, or may be composed of different elements bonded together as in -cnc-.
- any one or more of the chain molecules x, y, and z may be composed of two or more elements as long as they are composed of elements selected from the group consisting of C, O, and N.
- any one or more chain molecules may include a cyclic structure comprised of elements selected from the group consisting of C, O, and N.
- the cyclic structure may be monocyclic, bicyclic, or tricyclic. Further, the bond between the ring atoms may be completely saturated or unsaturated.
- any one or more chain molecules may include a branched chain composed of an element selected from the group consisting of C, O, and N.
- More specific examples of the compound represented by formula (1) include a compound represented by formula (2) below and a compound represented by formula (3) below.
- R 1 represents H or CH 3 .
- R 2 represents H, CH 3 , OCH 3 or N(CH 3 ) 2 .
- R 3 and R 4 each independently represent H or represents CH 3.However , R 3 and R 4 may be combined with each other to form a ring, in which case R 3 and R 4 are CH 2.
- a represents 0 or 1
- b represents 1, 2 or 3.
- Y is a C 1 -C 5 alkyl group, an ether chain represented by the following formula (2a), an amide-containing ether chain represented by the following formula (2b), or It represents a triazole represented by the following formula (2c).
- the "-" at both ends of the formulas (2a), (2b), and (2c) shown below represent "-(Y)" in the formula (2). Corresponds to the “-” at both ends of “-”.
- n1 in formula (2a) represents an integer from 1 to 3.
- n2 in formula (2b) represents an integer from 1 to 3.
- n3 represents an integer from 0 to 6, and n4 represents an integer from 0 to 3.
- equations (2a), (2b), and (2c) may be replaced with "-(Y)-" in the direction written on the paper, or may be replaced by being reversed horizontally.
- the description of formulas (2a) to (2c) includes both replacement with "-(Y)-" in the direction written on the paper and replacement with left and right reversal.
- R 3 and R 4 each independently represent H or CH 3 . However, R 3 and R 4 may be combined with each other to form a ring, and in that case, R 3 and R 4 is CH 2. n represents an integer of 0 to 3.
- the compound represented by formula (1) itself does not emit fluorescence.
- fluorescence was confirmed when mixed with extracellular vesicles, and fluorescence was also confirmed when size-separated by liquid chromatography.
- the compound represented by formula (1) changes its structure by reacting with extracellular vesicles, ⁇ It is thought that it binds tightly to extracellular vesicles, rather than by ionic bonding due to electrostatic attraction.
- the compound disclosed in this application is a fluorescent group of the compound represented by formula (1) when it comes into contact with extracellular vesicles. is removed, and the -o- moiety of the fluorescent group is thought to covalently bond to the amino group of lysine in the extracellular vesicle.
- the compounds according to the above embodiments can also be dissolved in a solvent and used as an extracellular vesicle staining agent.
- the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the compound represented by formula (1).
- examples of the solvent include acetone, DMSO, ethanol, and aqueous solutions thereof. It can also be used as an aqueous solution or buffer solution itself.
- the extracellular vesicle staining agent according to the embodiment may optionally contain, in addition to the compound represented by formula (1), another fluorescent compound that fluorescently stains elements different from extracellular vesicles, such as mitochondria and cell membranes. may also be included.
- another fluorescent compound that fluorescently stains elements different from extracellular vesicles, such as mitochondria and cell membranes.
- multiple elements can be dyed simultaneously.
- the interaction between the compound represented by formula (1) and a fluorescent compound can sensitize the compound represented by formula (1), or cause the compound represented by formula (1) to be transferred to cellular vesicles. specificity can be improved.
- the method for staining extracellular vesicles includes a staining step of staining extracellular vesicles using a compound represented by formula (1) or an extracellular vesicle staining agent, and a staining step of staining extracellular vesicles using a compound represented by formula (1) or an extracellular vesicle staining agent. a detection step of detecting vesicles, and optionally an evaluation step of evaluating the sample after the detection step.
- extracellular vesicles are fluorescently stained with a compound represented by formula (1).
- a compound represented by formula (1) may be added to the extracellular vesicle solution.
- extracellular vesicles may be purified by a known method.
- the culture solution of the cultured cells may be collected, and the compound represented by formula (1) may be added to the collected culture solution.
- a compound represented by formula (1) may be added to a solution containing the extracellular vesicles.
- the amount of the compound represented by formula (1) to be added may be in a final concentration range of 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M after addition, preferably in a range of 0.3 ⁇ M to 3 ⁇ M.
- excitation light corresponding to the fluorescent group of the compound represented by formula (1) is irradiated to detect the fluorescence emitted from the compound represented by formula (1) bound to extracellular vesicles in the sample.
- an irradiation means similar to that used for general fluorescence detection may be used, and for example, a predetermined wavelength may be selected as necessary from a laser light source provided in a fluorescence microscope.
- the fluorescence detector connected to the high performance liquid chromatography may be set to fluorescence excitation and fluorescence wavelength.
- the method for fluorescent staining with an extracellular vesicle staining agent optionally includes an evaluation step of evaluating the sample.
- the evaluation step the sample is evaluated based on extracellular vesicles detected by the compound represented by formula (1).
- the degree of cell differentiation by detecting intracellular vesicles, and to detect diseases and the like by detecting exosomes in body fluids.
- extracellular vesicles are labeled in advance with the compound represented by formula (1), and the presence of the cosmetics or pharmaceuticals allows the labeled extracellular vesicles to be incorporated into cells.
- Cosmetics and pharmaceuticals can be evaluated by detecting and observing. For example, by fluorescently labeling melanosomes, which are vesicles that store melanin, pigmentation and associated skin diseases can be evaluated from the uptake of the labeled substance into keratinocytes.
- Foods can also be evaluated by measuring extracellular vesicles contained in them. For example, food function can be predicted by the uptake efficiency of miRNAs in vesicles that affect intestinal function.
- Extracellular vesicles labeled with the compound represented by formula (1) can be size-separated by gel filtration.
- Shodex OHpak SB-807 Showa Denko
- TSKgel G7000HHR Tosoh
- Gen 2 qEV original/70 nm or Gen 2 qEV Original/35nm (iZQN)
- iZQN Gen 2 qEV Original/35nm
- the compound and the method for fluorescent staining of extracellular vesicles according to the embodiment have the following effects.
- the compound represented by formula (1) itself does not emit fluorescence. Therefore, removal of unreacted substances is not necessary.
- the compound represented by formula (1) strongly binds to extracellular vesicles. Therefore, extracellular vesicles stained with the compound described in Patent Document 1 could not be used for size separation by liquid chromatography, whereas the compound represented by formula (1) disclosed in this application could not be used for size separation by liquid chromatography. It can also be used for size separation where fluid pressure such as For example, different types of dairy products have different sizes of extracellular vesicles. If extracellular vesicles can be separated by size, they can be used for purposes such as identifying the type of food.
- (3) By detecting extracellular vesicles using the compound represented by formula (1) cosmetics, pharmaceuticals, foods, the degree of cell differentiation, diseases, etc. can be evaluated.
- 5-(2-hydroxyethoxy)-1-indanone Potassium carbonate (829 mg) and 2-chloroethanol (1 mL) were added to a solution of 5-hydroxy-1-indanone (741 mg, 5 mmol) in N,N-dimethylformamide (15 mL), and the mixture was heated and stirred at 100° C. for 30 hours. After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, it was poured into water, and the product was extracted with dichloromethane and dried over anhydrous sodium sulfate.
- reaction solution was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with dichloromethane, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- the extract was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, acetone) to obtain the title compound (249 mg, 68%) as a pale yellow oil.
- 5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-1-indanone To a solution of 5-hydroxy-1-indanone (435 mg, 2.94 mmol) in ethyl acetate (20 mL) were added potassium carbonate (1.47 g), bis(2-bromoethyl) ether (1.82 mL), and benzyltriethylammonium chloride (TEBA). ) (76 mg) were added one after another, and the mixture was heated under reflux for 24 hours. The reaction solution was allowed to cool to room temperature, poured into ice water, extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- TEBA benzyltriethylammonium chloride
- 5-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]-1-indanone To a solution of 5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-1-indanone (378 mg, 1.26 mmol) in acetonitrile (12 mL) were added acetic acid (0.43 mL) and N,N-diisopropylethylamine (1.45 mL). The mixture was then heated under reflux for 26 hours. The reaction solution was allowed to cool to room temperature, then poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with ethyl acetate, washed with dilute hydrochloric acid and brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- Compound 2 (C2. Hereinafter may be referred to as "GIF-2277”): 2-(2- ⁇ [1-( ⁇ 3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl ⁇ (methyl)amino)indan-5-yl]oxy ⁇ ethoxy)-1-ethanol (23 mg, 55 ⁇ mol) in dichloromethane NBD-F (10 mg) and N,N-diisopropylethylamine (12 ⁇ L) were added to the solution (0.5 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 48 hours. A saturated aqueous sodium bicarbonate solution was added to the reaction mixture, extracted with dichloromethane, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- 5-[(11-acetoxy-3,6,9-trioxaundecyl)oxy]-1-indanone To a solution of 5-hydroxy-1-indanone (741 mg, 5 mmol) in acetonitrile (10 mL) were added potassium carbonate (1.38 g) and tetraethylene glycol dimesylate (2.63 g), and the mixture was heated under reflux for 22 hours. After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, it was poured into brine, and the product was extracted with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate.
- the extract was concentrated under reduced pressure to obtain 5-[(11-mesyloxy-3,6,9-trioxaundecyl)oxy]-1-indanone as a light brown oil.
- the obtained monomesylate was dissolved in acetonitrile (20 mL), acetic acid (2.86 mL) and N,N-diisopropylethylamine (8.7 mL) were added, and the mixture was heated under reflux for 30 hours. After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, it was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, and the product was extracted with ethyl acetate, washed with dilute hydrochloric acid and brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- the reaction solution was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with dichloromethane, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- the residue obtained by concentrating the extract under reduced pressure was dissolved in methanol (5 mL), Pd/Fib (2.5%, 50 mg) was added, and the mixture was reacted under a hydrogen atmosphere of 1 atm (balloon) at room temperature for 22 hours.
- the reaction mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
- Compound 3 (C3. Hereinafter may be referred to as "GIF-2282”): By a method similar to the synthesis of compound 2, 11- ⁇ [1-( ⁇ 3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl ⁇ (methyl)amino)indan-5-yl]oxy ⁇ -1-(3, Compound 3 (8 mg, 22%) was obtained from 6,9-trioxa)undecanol (27.5 mg, 55 ⁇ mol).
- 5-((6-hydroxyhexyl)oxy)-1-indanone Potassium carbonate (415 mg), 6-chloro-1-hexanol (0.8 mL), and sodium iodide (30 mg) were added to a solution of 5-hydroxy-1-indanone (296 mg, 2 mmol) in acetonitrile (10 mL) and heated for 30 hours. It refluxed. After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, it was poured into water, and the product was extracted with ethyl acetate, washed with an aqueous sodium thiosulfate solution and brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- Compound 5 (C5. Hereinafter may be referred to as "GIF-2279”): Compound 5 (7.1 mg, 21%) was obtained from the above carbamate (26 mg, 52 ⁇ mol) by a method similar to the synthesis of compound 2.
- 5-(2-bromoethoxy)-1-indanone After dissolving 5-hydroxy-1-indanone (745 mg, 5.03 mmol) in ethyl acetate (15 mL), potassium carbonate (2.45 g) and 1,2-dibromoethane were suspended in ethyl acetate (15 mL). (3.27 mL) and benzyltriethylammonium chloride (121 mg) were added sequentially, and the mixture was heated under reflux for 24 hours. After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, it was poured into ice water, extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- 5-(2-azidoethoxy)-1-indanone 5-(2-bromoethoxy)-1-indanone (410 mg, 1.61 mmol) was dissolved in N,N-dimethylformamide (5.0 mL), sodium azide (129 mg) was added, and the mixture was heated under reflux for 35 minutes. . After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, it was poured into water, extracted with diethyl ether, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The extract was concentrated under reduced pressure to obtain the title compound (346 mg, 99%) as a reddish-brown solid.
- reaction solution was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with ethyl acetate, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- reaction mixture was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with dichloromethane, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- Compound 6 (C6. Hereinafter may be referred to as "GIF-2278"): Compound 6 (21 mg, 60%) was obtained from the above triazole (26 mg, 55 ⁇ mol) by the same method as in the synthesis of Compound 2.
- 5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-1-indanylamine A solution of 5-(2-azidoethoxy)-1-indanone (100 mg, 0.46 mmol) in methanol (3 mL) was added with 4-(dimethylamino)benzylamine dihydrochloride (155 mg), triethylamine (216 ⁇ L), and cyanohydrogenation. Sodium boron (48.5 mg) and acetic acid (100 ⁇ L) were sequentially added, and the mixture was heated under reflux for 42 hours. After the reaction solution was allowed to cool to room temperature, hydrochloric acid (1M, 2 mL) was added to quench excess hydride.
- 5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-1-indanylamine 5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-1-indanylamine (57.5 mg, 0.164 mmol) was dissolved in methanol (0.8 mL) and paraformaldehyde (27 .1 mg) and sodium cyanoborohydride (16.0 mg) were added sequentially, and the mixture was reacted at room temperature for 7 hours. Hydrochloric acid (1M) was added to the reaction solution to quench excess hydride.
- the reaction solution was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with dichloromethane, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- the residue (416 mg) obtained by concentrating the extract under reduced pressure was dissolved in methanol (4 mL), paraformaldehyde (90 mg), acetic acid (57 ⁇ L), and sodium cyanoborohydride (94 mg) were added, and the mixture was reacted at room temperature for 20 hours.
- the reaction solution was poured into a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
- Example 9 Compound 9 (hereinafter sometimes referred to as "GIF-2283”): Compound 9 was synthesized from 2-(4- ⁇ 6-[4-(dimethylamino)phenyl]-3-methyl-3-azahexyl ⁇ phenoxy)-1-ethanol (20 mg, 55 ⁇ mol) by a method similar to the synthesis of compound 2. (16.4 mg, 56%) was obtained.
- extracellular vesicles remained on the 0.1 ⁇ m filter, so it was washed three times with 5 mL of phosphate buffer. Finally, extracellular vesicles were collected with 1 mL of phosphate buffer. 10 ⁇ L of purified extracellular vesicles was diluted with 40 ⁇ L of phosphate buffer (hereinafter referred to as “extracellular vesicle preparation solution”).
- Example 10 - Preparation of staining agent used in Example 10
- the staining agent used in Example 10 was prepared by diluting Compounds 1 to 9 synthesized in Examples 1 to 9 with DMSO.
- ⁇ Preparation of the staining agent used in Comparative Example 1 The staining agent of Comparative Example 1 was prepared by diluting ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red (ExoSP model number EX02: Dojinsha) with a DMSO solution according to the instruction manual. .
- Example 10 Staining and detection of extracellular vesicles
- the staining agent prepared in Example 10 was added to the extracellular vesicle preparation solution at a final concentration of 1 ⁇ M. Furthermore, 1 ⁇ L of the staining agent prepared in Comparative Example 1 was added to the extracellular vesicle preparation solution. In Example 10 and Comparative Example 1, the staining agent was added to the extracellular vesicle preparation solution and then left at room temperature for 12 hours. After 12 hours, 10 ⁇ L of the reaction product was analyzed using a high performance liquid chromatography gel filtration system. The developing solvent for the column used was 10mM Tris (pH 6.8), 0.25mM EDTA, and 50mM NaCl.
- Excitation was performed at 560 nm and fluorescence detection was performed at 600 nm for ExoSP, and excitation was performed at 480 nm for the compounds synthesized in Examples 1 to 8. , fluorescence detection was performed at 530 nm.
- the column used was a 3 cm Gen 2 qEV original/70 nm (iZQN) connected to Shodex OHpak SB-807 (Showa Denko).
- the results are shown in Figures 1a to 1f.
- the horizontal axis of the graph represents the outflow time (minutes), and the vertical axis represents the fluorescence intensity.
- the graph also includes the numbers and chemical formulas of the synthesized compounds.
- the compounds synthesized in Examples 1 to 9 have a stronger fluorescence intensity than ExoSP of Comparative Example 1, which is known as a staining agent for gel filtration of extracellular vesicles. showed that. Therefore, it was confirmed that the compounds disclosed in this application can be used as stains for gel filtration of extracellular vesicles.
- Example 11 and Comparative Example 2 Regarding reaction conditions>
- Example 10 After adding the staining agent to the extracellular vesicle preparation solution, the sample was analyzed using the column immediately (untreated), treated at 80°C for 5 minutes, or treated at 80°C for 15 minutes and then analyzed using the column.
- An experiment was conducted using the same procedure as in Example 10.
- GIF numbers are written in the graph.
- Comparative Example 2 In Comparative Example 1, the staining agent was added to the extracellular vesicle preparation solution and then immediately analyzed using the column (Untreated), treated at 80°C for 5 minutes, or treated at 80°C for 15 minutes and then analyzed using the column. An experiment was conducted using the same procedure as in Comparative Example 1.
- Example 12 Regarding various lactic acid bacteria drinks>
- A Yakult (Yakult Co., Ltd.)
- B Stomach-pleasing Lactic Acid Bacteria (Kurashimoa Co., Ltd.)
- C Pirkul (Nissin Food Products Co., Ltd.) were used.
- 500 mL of the lactic acid bacteria drinks A to C above were centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was filtered through a coffee filter.
- the filtered liquid was filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Sartorius), and the filtrate was filtered through a 0.033 ⁇ m filter (GVS).
- Example 13 About size separation of extracellular vesicles>
- milk-derived extracellular vesicles prepared according to the procedure described in Example 10 and lactic acid bacteria prepared according to the procedure described in Example 12 were used as samples.
- Size separation of extracellular vesicles was performed using extracellular vesicles derived from a beverage (Yakult).
- GIF-2276 was added to the extracellular vesicle preparation solution to a final concentration of 1 ⁇ M, and after being left at room temperature for 12 hours, an experiment was conducted according to the procedure described in Example 10. The results are shown in Figure 4. As shown in FIG.
- extracellular vesicles derived from milk were eluted earlier than extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria. This means that extracellular vesicles derived from milk are larger than those derived from lactic acid bacteria. This was consistent with the fact that extracellular vesicles derived from milk do not pass through a 0.1 ⁇ m filter, but extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria do. From the above results, it was confirmed that when the compound (staining agent) disclosed in this application is used, the size of stained extracellular vesicles can be analyzed by a gel filtration system.
- Example 14 and Comparative Example 3 Regarding the staining effect of each synthesized compound on lactic acid bacteria extracellular vesicles>
- An experiment was conducted in the same manner as in Example 10, except that extracellular vesicles derived from a lactic acid bacteria drink (Yakult) prepared according to the procedure described in Example 12 were used instead of the pasteurized milk in Example 10. The results are shown in Figures 5a-5f. As is clear from the graphs shown in FIGS. 5a to 5f, it was confirmed that the compounds synthesized in Examples 1 to 9 can be used as staining agents for gel filtration of different types of extracellular vesicles.
- the sensitivity was highest in the order of GIF-2281, GIF-2280, and GIF-2276.
- the sensitivity was highest in the order of GIF-2277, GIF-2281, and GIF-2282. Therefore, it was confirmed that the compounds disclosed in this application can be appropriately selected depending on the type of extracellular vesicles to be stained. By selecting a compound with high sensitivity, the amount of compound used can be reduced.
- Example 15 Regarding extracellular vesicles derived from milk> Milk-derived extracellular vesicles (exosomes) prepared according to the procedure of Example 10 were labeled with GIF-2276 at room temperature for 12 hours. Unreacted GIF-2276 was removed using Microcon 300K (Millipore). Lysosomes of HEK293 cells (ThermoFisher) were labeled with LysoBrite Red, and GIF-2276-labeled milk-derived extracellular vesicles were added. It was observed under a microscope after 3 hours. The results are shown in Figure 6. 2276 in the upper left of FIG.
- FIG. 6 is a fluorescent photograph of extracellular vesicles labeled with GIF-2276.
- LysoBright in the upper right corner of FIG. 6 is a fluorescent photograph of lysosomes labeled with LysoBrite Red.
- the lower left of FIG. 6 is a photograph obtained by merging a fluorescent photograph of extracellular vesicles labeled with GIF-2276 and a fluorescent photograph of lysosomes labeled with LysoBrite Red.
- the lower right of FIG. 6 is a photograph of HEK293 cells taken with visible light.
- most of the extracellular vesicle signals were localized in lysosomes. From the above results, it was confirmed that extracellular vesicles labeled with GIF-2276 could be tracked within the introduced cells.
- Example 16 Regarding extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria> An experiment was conducted in the same manner as in Example 15, except that extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) were used instead of extracellular vesicles derived from milk. The results are shown in Figure 7. As is clear from the merge photograph in FIG. 7, it was confirmed that even when extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria (Yakult) were used, extracellular vesicles labeled with GIF-2276 could be tracked within the introduced cells.
- the compounds disclosed in the present application can label extracellular vesicles and be tracked intracellularly in both mammals and microorganisms.
- tracking is performed using specific markers, which is impossible for biological species for which markers do not exist.
- tracking methods that nonspecifically label membranes, but final tracking is difficult because the labeled compound moves to other membrane structures within the cell.
- the compounds disclosed in the present application are superior in that they are independent of biological species and can track the fate of extracellular vesicles.
- FIG. 8 shows a graph in which the results of each experiment are superimposed.
- the peak of extracellular vesicles derived from milk was not observed in the extracellular vesicles stained with the compound of Patent Document 1.
- GIF-2276 was used, a clear peak was observed in the size of milk-derived extracellular vesicles.
- the compound disclosed in this application does not emit fluorescence itself, but it emits fluorescence when it reacts with extracellular vesicles, so it is thought that there has been a change in the structure of the compound, and the fluid pressure
- the fluorescent group part separates from the compound, and the fluorescent group part covalently bonds with the components of the extracellular vesicle. What can be considered.
- the separated fluorescent group was covalently bonded to the amino group of lysine on the surface of the extracellular vesicle.
- Patent Document 1 describes that extracellular vesicles can be quantified with a plate reader by using GIF-2250.
- Pasteurized milk (Takanashi) was heated at 60, 70, and 80°C for 30 minutes and then returned to room temperature. Thereafter, extracellular vesicles were prepared according to the procedure described in Example 10, and the extracellular vesicles were labeled by adding GIF-2276 synthesized in Example 1 to a final concentration of 1 ⁇ M. Analysis was performed using a high performance liquid chromatography gel filtration system, and the area of the peak was determined. Similarly, the prepared extracellular vesicles were reacted with 3 ⁇ M GIF-2250, and the amount of fluorescence was determined using a fluorescence plate reader. The respective values were plotted and the correlation was determined.
- Example 18 Measurement of freshness of milk> Using GIF-2276, extracellular vesicles contained in milk with different degrees of freshness before the expiration date and after the expiration date were analyzed, with the expiration date set at 0 days. An experiment was conducted in the same manner as in Example 10, except that milk of different degrees of freshness was used as samples.
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Abstract
細胞外小胞に結合し、液体クロマトグラフィーなどのサイズ測定も可能な新たな化合物、細胞外小胞染色剤、および、細胞外小胞の蛍光染色方法を提供することを課題とする。 下記式（１）で表される化合物により、課題を解決できる。（式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。Ｚは、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された鎖分子が０～１２個結合したリンカーを表し、鎖分子は環状構造または分岐鎖を含んでもよい。）
Description
本出願における開示は、化合物、細胞外小胞染色剤、および、細胞外小胞の蛍光染色方法に関する。
近年、細胞性小胞とりわけエクソソームを始めとする細胞外小胞の役割が注目されている。細胞外小胞は、我々ヒトの血液や尿など体液中に存在するが、食品中にも含まれる。これら細胞外小胞は、取り込んだ細胞の機能を調節することで、様々な有用性を発揮する。皮膚では新陳代謝の亢進に作用すると提案されている。
ヒトや実験動物であるマウスは、細胞外小胞表面のマーカーを利用して定量することが可能である。一方、その他多くのマーカーのない生物種では、細胞性小胞の直径とブラウン運動もしくは電気抵抗などが相関を示すことから、定量とサイズ計測するシステムが構築されている。しかし、ブラウン運動もしくは電気抵抗は、溶媒の組成に大きく影響を受けるため、正確な測定には結びつかないという問題がある。
細胞外小胞を定量するその他の方法としては、特定の化合物で細胞外小胞を染色する方法も知られている（特許文献１）。
しかしながら、本発明者らは、様々な実験を通して、特許文献１に記載の化合物は、細胞外小胞を検出できるものの、液体クロマトグラフィーなどのサイズ測定には利用できないという問題を新たに見出した。
そこで、本出願における開示は、細胞外小胞に結合し、液体クロマトグラフィーなどのサイズ測定も可能な新たな化合物、細胞外小胞染色剤、および、細胞外小胞の蛍光染色方法を提供することを課題とする。
〔１〕下記式（１）で表される化合物。
（式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。Ｚは、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された鎖分子が０～１２個結合したリンカーを表し、鎖分子は環状構造または分岐鎖を含んでもよい。）
〔２〕式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、
上記〔１〕に記載の化合物。
（式（２）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。ＹはＣ1－Ｃ５のアルキル基、下記式（２ａ）で表されるエーテル鎖、下記式（２ｂ）で表されるアミドを含むエーテル鎖、または、下記式（２ｃ）で表されるトリアゾール、を表す。
式（２ａ）のｎ１は、１～３の整数を表す。式（２ｂ）のｎ２は、１～３の整数を表す。式（２ｃ）のｎ３は０～６の整数を表し、ｎ４は０～３の整数を表す。）
〔３〕式（１）で表される化合物が、下記式（３）で表される化合物である、
上記〔１〕に記載の化合物。
（式（３）中、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｎは０～３の整数を表す。）
〔４〕上記〔１〕に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。
〔５〕上記〔２〕に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。
〔６〕上記〔３〕に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。
〔７〕さらに、他の蛍光化合物を含む、
上記〔４〕に記載の細胞外小胞染色剤。
〔８〕上記〔１〕～〔３〕に記載の化合物および上記〔４〕～〔６〕に記載の細胞外小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞外小胞を染色する染色工程と、
試料中の染色された細胞外小胞を検出する検出工程と、を含む、
細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔９〕検出工程後に、試料を評価する評価工程を含む、
上記〔８〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１０〕試料が化粧品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞外小胞を測定して化粧品を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１１〕試料が医薬品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞外小胞を測定して医薬品を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１２〕試料が細胞を含み、
細胞内の細胞外小胞を測定して細胞の状態を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１３〕試料が食品または飲料を含み、
食品内または飲料内の細胞外小胞を測定して食品または飲料を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１４〕試料が生体から採取された生体組織を含み、
採取された生体組織中の細胞外小胞を測定して生体組織を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
（式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。Ｚは、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された鎖分子が０～１２個結合したリンカーを表し、鎖分子は環状構造または分岐鎖を含んでもよい。）
〔２〕式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、
上記〔１〕に記載の化合物。
（式（２）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。ＹはＣ1－Ｃ５のアルキル基、下記式（２ａ）で表されるエーテル鎖、下記式（２ｂ）で表されるアミドを含むエーテル鎖、または、下記式（２ｃ）で表されるトリアゾール、を表す。
式（２ａ）のｎ１は、１～３の整数を表す。式（２ｂ）のｎ２は、１～３の整数を表す。式（２ｃ）のｎ３は０～６の整数を表し、ｎ４は０～３の整数を表す。）
〔３〕式（１）で表される化合物が、下記式（３）で表される化合物である、
上記〔１〕に記載の化合物。
（式（３）中、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｎは０～３の整数を表す。）
〔４〕上記〔１〕に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。
〔５〕上記〔２〕に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。
〔６〕上記〔３〕に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。
〔７〕さらに、他の蛍光化合物を含む、
上記〔４〕に記載の細胞外小胞染色剤。
〔８〕上記〔１〕～〔３〕に記載の化合物および上記〔４〕～〔６〕に記載の細胞外小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞外小胞を染色する染色工程と、
試料中の染色された細胞外小胞を検出する検出工程と、を含む、
細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔９〕検出工程後に、試料を評価する評価工程を含む、
上記〔８〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１０〕試料が化粧品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞外小胞を測定して化粧品を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１１〕試料が医薬品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞外小胞を測定して医薬品を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１２〕試料が細胞を含み、
細胞内の細胞外小胞を測定して細胞の状態を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１３〕試料が食品または飲料を含み、
食品内または飲料内の細胞外小胞を測定して食品または飲料を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
〔１４〕試料が生体から採取された生体組織を含み、
採取された生体組織中の細胞外小胞を測定して生体組織を評価する、
上記〔９〕に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
本出願で開示する化合物で細胞外小胞を染色すると、液体クロマトグラフィーなどのサイズ測定も可能である。
（化合物の実施形態）
以下に、実施形態に係る化合物について説明する。
以下に、実施形態に係る化合物について説明する。
実施形態に係る化合物は、下記式（１）で表される化合物であることを特徴とする。式（１）で表される化合物は、細胞外小胞に特異的に結合し蛍光を発する。なお、本明細書において「細胞外小胞」とは、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等の細胞から分泌される小胞の総称を意味する。
式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｃ1－Ｃ6のアルキル基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。Ｃ1－Ｃ6のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｃ1－Ｃ18のアルキル基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。Ｃ1－Ｃ18のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、イソヘプチル基、ｓｅｃ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、イソオクチル基、ｓｅｃ－オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロウンデシル基、シクロドデシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基、シクロヘキサデシル基、シクロヘプタデシル基、シクロオクタデシル基等が挙げられる。Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基は、飽和または不飽和でもあってもよく、芳香環を有してもよい。また、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ノナオキシ基、デカンオキシ基、ウンデカンオキシ基、ドデカンオキシ基、トリデカンオキシ基、テトラデカンオキシ基、ペンタデカンオキシ基、ヘキサデカンオキシ基、ヘプタデカンオキシ基、オクタデカンオキシ基、ビニルオキシ基、アリルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、１－ブテニルオキシ基、２－ブテニルオキシ基、３－ブテニルオキシ基、１，３－ブタンジエニルオキシ基、１－ペンテニルオキシ基、２－ペンテニルオキシ基、３－ペンテニルオキシ基、４－ペンテニルオキシ基、ヘキシニルオキシ基、ヘキシジニルオキシ基、ヘプチニルオキシ基、ヘプチジニルオキシ基、オクチニルオキシ基、オクチジニルオキシ基、ノニニルオキシ基、ノニジニルオキシ基、デシニルオキシ基、デシジニルオキシ基、ウンデシニルオキシ基、ウンデシジニルオキシ基、ドデシルオキシ基、ドデシジニルオキシ基、トリデシニルオキシ基、トリデシジニルオキシ基、テトラデシニルオキシ基、テトラデシジニルオキシ基、ペンタデシニルオキシ基、ペンタデシジニルオキシ基、ヘキサデシニルオキシ基、ヘキサデシジニルオキシ基、ヘプタデシニルオキシ基、ヘプタデシジニルオキシ基、オクタデシニルオキシ基、オクタデシジニルオキシ基、フェノキシ基、ナフトキシ基、アンスリルオキシ基、メチルフェノキシ基、ジメチルフェノキシ基、トリメチルフェノキシ基、エチルフェノキシ基、ジエチルフェノキシ基、トリエチルフェノキシ基、プロピルフェノキシ基、ブチルフェノキシ基、メチルナフトキシ基、ジメチルナフトキシ基、トリメチルナフトキシ基、メチルアンスリルオキシ基、エチルアンスリルオキシ基、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、ナフチルメチルオキシ基、フルオレニルメチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立に、ＨまたはＣＨ3を表し、Ｒ3、Ｒ4は同じであってもよく、異なってもよい。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。
ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。
Ｚは、式（１）の（Ｚ）より左側に記載の蛍光基と（Ｚ）より右側の化学構造をリンクするリンカーを表す。リンカー（Ｚ）は、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された鎖分子が０～１２個結合したものであり、鎖分子は環状構造または分岐鎖を含んでもよい。リンカー（Ｚ）について、例えば、３個の鎖分子（ｘ、ｙ、ｚ）が結合（－ｘ－ｙ－ｚ－）した例を参照して、より具体的に説明する。
鎖分子ｘ、ｙ、ｚのそれぞれは、Ｃ、Ｏ、Ｎから選択された任意の元素であってもよい。その場合、選択した元素は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、―ｃ－ｃ－ｃ－の様に同じ元素でリンカーが構成されてもよいし、－ｃ－ｎ－ｃ－の様に、異なる元素が結合することで構成されてもよい。
鎖分子ｘ、ｙ、ｚの任意の一つ以上は、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成される範囲内であれば、２以上の元素で構成されていてもよい。例えば、任意の一つ以上の鎖分子は、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された環状構造を含んでもよい。環状構造としては、単環、２環、３環であってもよい。また、環原子環の結合は完全に飽和されてもよいし、不飽和であってもよい。
また、任意の一つ以上の鎖分子は、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された分岐鎖を含んでもよい。分岐鎖としては、－ｘ－ｙ－ｚ－を構成するＣ、Ｏ、Ｎ元素に置換できるものであれば特に制限はない。メチル、エチル等の直鎖状の炭素鎖であってもよいし、Ｃに“＝０”が結合（鎖分子としてはケトン）したものであってもよい。
式（１）で表される化合物のより具体的な例として、下記式（２）で表される化合物および下記式（３）で表される化合物が挙げられる。
（式（２）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。Ｙは、Ｃ1－Ｃ５のアルキル基、下記式（２ａ）で表されるエーテル鎖、下記式（２ｂ）で表されるアミドを含むエーテル鎖、または、下記式（２ｃ）で表されるトリアゾール、を表す。なお、以下に示す式（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）の両末端の“－”は、式（２）の“－（Ｙ）－”の両末端の“－”に相当する。
式（２ａ）のｎ１は、１～３の整数を表す。式（２ｂ）のｎ２は、１～３の整数を表す。式（２ｃ）のｎ３は０～６の整数を表し、ｎ４は０～３の整数を表す。また、式（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）は、紙面に記載の方向で“－（Ｙ）－”に置き換えてもよいし、左右反転して置き換えてもよい。本出願において、式（２ａ）～（２ｃ）の記載は、紙面に記載の方向で“－（Ｙ）－”に置き換えることと、左右反転して置き換えることの両方を含む。
（式（３）中、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｎは０～３の整数を表す。
式（２）で表される化合物および式（３）で表される化合物の具体例を以下に示すが、これら例示された化合物に制限されるものではない。
式（１）で表される化合物は、そのものは蛍光を発しない。一方、後述する実施例では、細胞外小胞と混合することで蛍光を確認できたこと、および、液体クロマトグラフィーでサイズ分離した際にも蛍光を確認できたことから、
・式（１）で表される化合物は、細胞外小胞と反応することで構造変化し、
・細胞外小胞に静電引力によるイオン結合ではなく、強固に結合していると考えられる。
・式（１）で表される化合物は、細胞外小胞と反応することで構造変化し、
・細胞外小胞に静電引力によるイオン結合ではなく、強固に結合していると考えられる。
式（１）の構造から見て、本出願で開示する化合物は、細胞外小胞と接触すると、式（１）で表される化合物の蛍光基である
が外れて、蛍光基の－ｏ－部分が細胞外小胞のリシンのアミノ基と共有結合すると考えられる。
が外れて、蛍光基の－ｏ－部分が細胞外小胞のリシンのアミノ基と共有結合すると考えられる。
（細胞外小胞染色剤の実施形態）
上記の実施形態に係る化合物は、溶媒に溶解して細胞外小胞染色剤として用いることもできる。溶媒は式（１）で表される化合物を溶解できるのであれば、特に制限はない。溶媒としては、例えば、アセトン、ＤＭＳＯ、エタノール、およびこれらの水溶液等が挙げられる。また、水溶液・緩衝液そのものでも利用できる。
上記の実施形態に係る化合物は、溶媒に溶解して細胞外小胞染色剤として用いることもできる。溶媒は式（１）で表される化合物を溶解できるのであれば、特に制限はない。溶媒としては、例えば、アセトン、ＤＭＳＯ、エタノール、およびこれらの水溶液等が挙げられる。また、水溶液・緩衝液そのものでも利用できる。
実施形態に係る細胞外小胞染色剤は、式（１）で表される化合物の他に、例えば、ミトコンドリア、細胞膜等の細胞外小胞と異なる要素を蛍光染色する他の蛍光化合物を任意付加的に含んでもよい。式（１）で表される化合物と蛍光化合物を用いることで、複数の要素を同時に染色できる。また、式（１）で表される化合物と蛍光化合物の相互作用により、式（１）で表される化合物を増感させることや、式（１）で表される化合物の細胞性小胞への特異性を向上させることができる。
（細胞外小胞染色剤の実施形態）
実施形態に係る細胞外小胞の染色方法は、式（１）で表される化合物または細胞外小胞染色剤を用い細胞外小胞を染色する染色工程と、試料中の染色された細胞外小胞を検出する検出工程と、を少なくとも含み、任意付加的に、検出工程後に試料を評価する評価工程を含む。
実施形態に係る細胞外小胞の染色方法は、式（１）で表される化合物または細胞外小胞染色剤を用い細胞外小胞を染色する染色工程と、試料中の染色された細胞外小胞を検出する検出工程と、を少なくとも含み、任意付加的に、検出工程後に試料を評価する評価工程を含む。
染色工程は、式（１）で表される化合物によって細胞外小胞を蛍光染色する。例えば、精製された細胞外小胞の染色を行う場合、細胞外小胞溶液へ式（１）で表される化合物を添加すればよい。なお、細胞外小胞の精製は、公知の方法で実施すればよい。また、培養された細胞の培養液を回収し、回収した培養液へ式（１）で表される化合物を添加してもよい。細胞外小胞が細胞内へ取り込まれた後にそれらの追跡を行う場合には、細胞外小胞を含む溶液に式（１）で表される化合物を添加すればよい。
染色工程において、添加する式（１）で表される化合物の量としては、添加した後の最終濃度が０．０１μＭ～１０μＭの範囲でよく、０．３μＭ～３μＭの範囲が好ましい。
検出工程は、式（１）で表される化合物の蛍光基に応じた励起光を照射して、試料中の細胞外小胞に結合した式（１）で表される化合物から発せられる蛍光を検出する。励起光の照射には、一般的な蛍光検出と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択すればよい。また、高速液体クロマトグラフィーに接続した蛍光の検出機は、蛍光励起と蛍光波長をセットすればよい。式（１）で表される化合物の蛍光基によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒から目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合があっても、カメラ等による画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に通過させるフィルタを用いてもよい。
また、細胞外小胞染色剤の蛍光染色方法は、任意付加的に試料を評価する評価工程を含む。評価工程は、式（１）で表される化合物によって検出された細胞外小胞により試料を評価する。何を評価するかは試料によって異なるが、例えば、化粧品、医薬品、食品等の評価を行うことができる。さらに、細胞内小胞を検出して細胞の分化度合いの評価や体液中のエクソソームを検出し、疾患等を評価することもできる。
例えば、化粧品や医薬品を評価する場合、あらかじめ式（１）で表される化合物によって細胞外小胞をラベル化しておき、化粧品や医薬品の存在によって、ラベル化された細胞外小胞の細胞へ取り込みを検出・観察することで、化粧品や医薬品を評価できる。例えば、メラニンを溜め込む小胞であるメラノソームを蛍光標識し、その標識物のケラチノサイトへの取り込みから色素沈着や、それに伴う皮膚疾患が評価できる。また、食品中に含まれる細胞外小胞を測定することで、食品の評価もできる。例えば、腸の機能に影響を与える小胞内のｍｉＲＮＡの取り込み効率で、食品機能を予測できる。
式（１）で表される化合物でラベル化された細胞外小胞は、ゲル濾過でサイズ分離ができる。高速液体クロマトグラーのゲル濾過システムで分離する際は、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０７（昭和電工社）、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ７０００ＨＨＲ（東ソー社）、Ｇｅｎ ２ ｑＥＶ ｏｒｉｇｉｎａｌ／７０ｎｍ、または、Ｇｅｎ ２ ｑＥＶ ｏｒｉｇｉｎａｌ／３５ｎｍ（ｉＺＱＮ社）等のカラム、もしく、これらカラムの組み合わせが利用できる。
また、ゲル濾過システムで分離した後に、細胞外小胞を分取することも可能である。
実施形態に係る化合物、細胞外小胞の蛍光染色方法は、以下の効果を奏する。
（１）式（１）で表される化合物そのものは蛍光を発さない。そのため、未反応物の除去は不要である。
（２）式（１）で表される化合物は、細胞外小胞と強固に結合する。そのため、特許文献１に記載の化合物で染色した細胞外小胞は液体クロマトグラフィーによるサイズ分離に使用できなかったのに対し、本出願で開示する式（１）で表される化合物は液体クロマトグラフィー等の流体圧力が付与されるサイズ分離にも使用できる。例えば、乳製品でも種類が異なれば細胞外小胞のサイズは異なる。細胞外小胞のサイズ分離ができると、食品の種類の特定等の用途に用いることができる。
（３）式（１）で表される化合物を用いて細胞外小胞を検出することで、化粧品、医薬品、食品、細胞の分化度合い、疾患等の評価ができる。
（１）式（１）で表される化合物そのものは蛍光を発さない。そのため、未反応物の除去は不要である。
（２）式（１）で表される化合物は、細胞外小胞と強固に結合する。そのため、特許文献１に記載の化合物で染色した細胞外小胞は液体クロマトグラフィーによるサイズ分離に使用できなかったのに対し、本出願で開示する式（１）で表される化合物は液体クロマトグラフィー等の流体圧力が付与されるサイズ分離にも使用できる。例えば、乳製品でも種類が異なれば細胞外小胞のサイズは異なる。細胞外小胞のサイズ分離ができると、食品の種類の特定等の用途に用いることができる。
（３）式（１）で表される化合物を用いて細胞外小胞を検出することで、化粧品、医薬品、食品、細胞の分化度合い、疾患等の評価ができる。
以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
［化合物の合成］
＜実施例１＞
以下に記載する手順で、化合物１（Ｃ１）を合成した。
＜実施例１＞
以下に記載する手順で、化合物１（Ｃ１）を合成した。
５－（２－ヒドロキシエトキシ）－１－インダノン：
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（８２９ｍｇ）と２－クロロエタノール（１ｍＬ）を加え、１００℃で３０時間加熱撹拌した。反応液を室温まで放冷したのち水に注ぎ込み、生成物をジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣に酢酸エチル／ヘキサンの１：４混合液を加え、析出した沈殿を濾別して淡黄色固体の標記化合物（６９９ｍｇ、収率７３％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.68(m、2H、COCH2)、3.09(t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.98―4.05(br、2H、CH 2 OH)、4.17(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.9―6.95(complex、2H、ArH)、7.70(d、J=8.7Hz、2H、ArH)
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（８２９ｍｇ）と２－クロロエタノール（１ｍＬ）を加え、１００℃で３０時間加熱撹拌した。反応液を室温まで放冷したのち水に注ぎ込み、生成物をジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣に酢酸エチル／ヘキサンの１：４混合液を加え、析出した沈殿を濾別して淡黄色固体の標記化合物（６９９ｍｇ、収率７３％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.68(m、2H、COCH2)、3.09(t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.98―4.05(br、2H、CH 2 OH)、4.17(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.9―6.95(complex、2H、ArH)、7.70(d、J=8.7Hz、2H、ArH)
２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール：
５－（２－ヒドロキシエトキシ）－１－インダノン（１９２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、室温でメチルアミン塩酸塩（２０３ｍｇ）と酢酸ナトリウム（２４６ｍｇ）を加え、３０分間撹拌した。続いて、反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２６ｍｇ）を加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、薄黄色固体の２－｛［１－（メチルアミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール（２１０ｍｇ）を得た。得られたメチルアミン体（２１０ｍｇ）と３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロパナール（１７７ｍｇ）をジクロロエタン（５ｍＬ）に溶解し、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（３７１ｍｇ）を加えて室温で２３時間撹拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（２４９ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR(400MHz、MeOH－d4) δ:1.7―1.88(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.02―2.1(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.35―2.45(m、2H、ArCH2)、2.45―2.54(br t、NCH2)、2.71―2.92(m、2H、ArCH2)、2.86(s、6H、N(CH3)2)、3.85(t、J=4.8Hz、2H、CH 2 OH)、4.01(t、J=4.8Hz、2H、ArOCH2)、4.33(br t、J=6.4Hz、1H、ArCHNH)、6.72(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、6.77(d、J=8.7Hz、1H、ArH)、6.79(s、1H、ArH)、7.0(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.21(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
５－（２－ヒドロキシエトキシ）－１－インダノン（１９２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、室温でメチルアミン塩酸塩（２０３ｍｇ）と酢酸ナトリウム（２４６ｍｇ）を加え、３０分間撹拌した。続いて、反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２６ｍｇ）を加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、薄黄色固体の２－｛［１－（メチルアミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール（２１０ｍｇ）を得た。得られたメチルアミン体（２１０ｍｇ）と３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロパナール（１７７ｍｇ）をジクロロエタン（５ｍＬ）に溶解し、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（３７１ｍｇ）を加えて室温で２３時間撹拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（２４９ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR(400MHz、MeOH－d4) δ:1.7―1.88(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.02―2.1(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.35―2.45(m、2H、ArCH2)、2.45―2.54(br t、NCH2)、2.71―2.92(m、2H、ArCH2)、2.86(s、6H、N(CH3)2)、3.85(t、J=4.8Hz、2H、CH 2 OH)、4.01(t、J=4.8Hz、2H、ArOCH2)、4.33(br t、J=6.4Hz、1H、ArCHNH)、6.72(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、6.77(d、J=8.7Hz、1H、ArH)、6.79(s、1H、ArH)、7.0(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.21(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
化合物１（Ｃ１。以下「ＧＩＦ－２２７６」と記載することがある。）：
２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール（３６ｍｇ、９７μｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｆ、１８ｍｇ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ）を加え、室温で４３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した残渣をＰＬＣ（シリカゲル、アセトン／メタノール＝８５／１５）で精製し、褐色固体の化合物１（２０ｍｇ、３９％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.78―1.88(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.04―2.13(br m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.22(s、3H、NCH3)、2.46―2.61(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.76―2.83(m、1H、ArCH2)、2.86―2.94(m、1H、ArCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、4.43―4.5(br、1H、ArCHN)、4.50(t、J=3Hz、2H、OCH2CH2Ar)、4.78(br t、J=3Hz、2H、ArOCH2)、6.69(d、J=5.8Hz、2H、ArH)、6.76―6.8(complex、2H、ArH)、6.83(d、J=5.5Hz、1H、ArH)、7.05(d、J=5.8Hz、2H、ArH)、7.26―7.31(1H、ArH)、8.57(d、J=5.5Hz、1H、ArH)
２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール（３６ｍｇ、９７μｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｆ、１８ｍｇ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ）を加え、室温で４３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した残渣をＰＬＣ（シリカゲル、アセトン／メタノール＝８５／１５）で精製し、褐色固体の化合物１（２０ｍｇ、３９％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.78―1.88(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.04―2.13(br m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.22(s、3H、NCH3)、2.46―2.61(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.76―2.83(m、1H、ArCH2)、2.86―2.94(m、1H、ArCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、4.43―4.5(br、1H、ArCHN)、4.50(t、J=3Hz、2H、OCH2CH2Ar)、4.78(br t、J=3Hz、2H、ArOCH2)、6.69(d、J=5.8Hz、2H、ArH)、6.76―6.8(complex、2H、ArH)、6.83(d、J=5.5Hz、1H、ArH)、7.05(d、J=5.8Hz、2H、ArH)、7.26―7.31(1H、ArH)、8.57(d、J=5.5Hz、1H、ArH)
＜実施例２＞
以下に記載する手順で、化合物２（Ｃ２）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物２（Ｃ２）を合成した。
５－［２－（２－ブロモエトキシ）エトキシ］－１－インダノン：
５－ヒドロキシ－１－インダノン（４３５ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（２０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１．４７ｇ）、ビス（２－ブロモエチル）エーテル（１．８２ｍＬ）、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（ＴＥＢＡ）（７６ｍｇ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。室温まで放冷した反応液を氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の標記化合物（６５４ｍｇ、７４％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.66(m、2H、COCH2)、3.07(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.49(t、J=6.2Hz、2H、BrCH2)、3.88(t、J=6.4Hz、2H、OCH2)、3.90(t、J=5Hz、2H、OCH2)、4.21(t、J=5Hz、2H、ArOCH2)、6.89―6.93(br m、2H、ArH)、7.68(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－ヒドロキシ－１－インダノン（４３５ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（２０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１．４７ｇ）、ビス（２－ブロモエチル）エーテル（１．８２ｍＬ）、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（ＴＥＢＡ）（７６ｍｇ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。室温まで放冷した反応液を氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の標記化合物（６５４ｍｇ、７４％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.66(m、2H、COCH2)、3.07(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.49(t、J=6.2Hz、2H、BrCH2)、3.88(t、J=6.4Hz、2H、OCH2)、3.90(t、J=5Hz、2H、OCH2)、4.21(t、J=5Hz、2H、ArOCH2)、6.89―6.93(br m、2H、ArH)、7.68(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］－１－インダノン：
５－［２－（２－ブロモエトキシ）エトキシ］－１－インダノン（３７８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１２ｍＬ）溶液に酢酸（０．４３ｍＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．４５ｍＬ）を加えて２６時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのち飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、希塩酸および食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して得られた薄褐色油状の５－［２－（２－アセトキシエトキシ）エトキシ］－１－インダノン（３８５ｍｇ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（８３ｍｇ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液に水を注ぎ込み、生成物をジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して白色固体の標記化合物（２９８ｍｇ、定量的）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.66―2.69(m、2H、COCH2)、3.09(t、J=4Hz、2H、ArCH2)、3.67―3.7(m、2H、OCH2)、3.77―3.8(m、2H、OCH2)、3.89―3.92(m、2H、OCH2)、4.22(t、J=3Hz、2H、ArOCH2)、6.92(s、1H、ArH)、6.92―6.94(m、2H、ArH)、7.69(d、J=6.2Hz、1H、ArH)
５－［２－（２－ブロモエトキシ）エトキシ］－１－インダノン（３７８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１２ｍＬ）溶液に酢酸（０．４３ｍＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．４５ｍＬ）を加えて２６時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのち飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、希塩酸および食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して得られた薄褐色油状の５－［２－（２－アセトキシエトキシ）エトキシ］－１－インダノン（３８５ｍｇ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（８３ｍｇ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液に水を注ぎ込み、生成物をジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して白色固体の標記化合物（２９８ｍｇ、定量的）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.66―2.69(m、2H、COCH2)、3.09(t、J=4Hz、2H、ArCH2)、3.67―3.7(m、2H、OCH2)、3.77―3.8(m、2H、OCH2)、3.89―3.92(m、2H、OCH2)、4.22(t、J=3Hz、2H、ArOCH2)、6.92(s、1H、ArH)、6.92―6.94(m、2H、ArH)、7.69(d、J=6.2Hz、1H、ArH)
２－（２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝エトキシ）－１－エタノール：
５－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］－１－インダノン（５９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）と４－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン塩酸塩（６４ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、酢酸ナトリウム（２５ｍｇ）を加えて室温で３０分間撹拌した。続いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２４ｍｇ）と酢酸（１７μＬ）を加え、室温で４２時間反応させた。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して得られた薄黄色固体（１１９ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（３８ｍｇ）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３２ｍｇ）を加えて室温で２２時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／メタノール＝９／１）にて精製し、無色油状の標記化合物（５７ｍｇ、収率５５％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.73―1.85(m、2H、CH2CH 2 CH2)、1.99―2.08(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.4―2.64(complex、4H、 ArCH2 and NCH2)、2.71―2.81(m、1H、ArCH2)、2.83―2.9(m、1H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.68(t、J=4.3Hz、2H、OCH2)、3.76(t、J=4.3Hz、2H、OCH2)、3.87(t、J=4.8Hz、2H、OCH2)、4.13(t、J=4.8Hz、2H、ArOCH2)、4.37(br t、J=7.1Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.75―6.79(1H、ArH)、7.06(d,J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23―7.26(1H、ArH)
５－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］－１－インダノン（５９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）と４－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン塩酸塩（６４ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、酢酸ナトリウム（２５ｍｇ）を加えて室温で３０分間撹拌した。続いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２４ｍｇ）と酢酸（１７μＬ）を加え、室温で４２時間反応させた。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して得られた薄黄色固体（１１９ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（３８ｍｇ）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３２ｍｇ）を加えて室温で２２時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／メタノール＝９／１）にて精製し、無色油状の標記化合物（５７ｍｇ、収率５５％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.73―1.85(m、2H、CH2CH 2 CH2)、1.99―2.08(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.4―2.64(complex、4H、 ArCH2 and NCH2)、2.71―2.81(m、1H、ArCH2)、2.83―2.9(m、1H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.68(t、J=4.3Hz、2H、OCH2)、3.76(t、J=4.3Hz、2H、OCH2)、3.87(t、J=4.8Hz、2H、OCH2)、4.13(t、J=4.8Hz、2H、ArOCH2)、4.37(br t、J=7.1Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.75―6.79(1H、ArH)、7.06(d,J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23―7.26(1H、ArH)
化合物２（Ｃ２。以下「ＧＩＦ－２２７７」と記載することがある。）：
２－（２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝エトキシ）－１－エタノール（２３ｍｇ、５５μｍｏｌ）のジクロロメタン（０．５ｍＬ）溶液にＮＢＤ－Ｆ（１０ｍｇ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２μＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をＰＬＣ（シリカゲル、アセトン／メタノール＝９／１）にて精製し、化合物２（１６．２ｍｇ、５１％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.75―1.86(br、2H、CH2CH 2 CH2)、2.0―2.1(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.17(s、3H、NCH3)、2.43―2.64(complex、4H、 ArCH2 and NCH2)、2.7―2.8(m、1H、ArCH2)、2.81―2.9(m、1H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.94(t、J=4.4Hz、2H、OCH2)、4.09―4.15(complex、4H、OCH2)、4.37―4.44(br、1H、ArCHN)、4.6(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.66―6.73(complex、4H、ArH)、6.76(d、J=8.2Hz、1H、ArH)、7.05(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、7.21―7.26(1H、ArH)、8.47(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
２－（２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝エトキシ）－１－エタノール（２３ｍｇ、５５μｍｏｌ）のジクロロメタン（０．５ｍＬ）溶液にＮＢＤ－Ｆ（１０ｍｇ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２μＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をＰＬＣ（シリカゲル、アセトン／メタノール＝９／１）にて精製し、化合物２（１６．２ｍｇ、５１％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.75―1.86(br、2H、CH2CH 2 CH2)、2.0―2.1(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.17(s、3H、NCH3)、2.43―2.64(complex、4H、 ArCH2 and NCH2)、2.7―2.8(m、1H、ArCH2)、2.81―2.9(m、1H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.94(t、J=4.4Hz、2H、OCH2)、4.09―4.15(complex、4H、OCH2)、4.37―4.44(br、1H、ArCHN)、4.6(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.66―6.73(complex、4H、ArH)、6.76(d、J=8.2Hz、1H、ArH)、7.05(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、7.21―7.26(1H、ArH)、8.47(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
＜実施例３＞
以下に記載する手順で、化合物３（Ｃ３）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物３（Ｃ３）を合成した。
５－［（１１－アセトキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノン：
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（１．３８ｇ）、テトラエチレングリコールジメシラート（２．６３ｇ）を加えて２２時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷したのち食塩水に注ぎ込み、生成物を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して薄褐色油状の５－［（１１－メシルオキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノンを得た。得られたモノメシラートをアセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解し、酢酸（２．８６ｍＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｍＬ）を加えて３０時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷したのち飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、生成物を酢酸エチルで抽出、希塩酸および食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、無色油状の標記化合物（１．０２ｇ、５６％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.07(s、3H、OCOCH3)、2.65―2.7(m、2H、COCH2)、3.08(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.65―3.76(complex、10H、OCH2)、3.89(t、J=4.8Hz、2H、OCH2)、4.19―4.24(complex、4H、ArOCH2 and CH3COOCH 2 )、6.91(s、1H、ArH)、6.91―6.94(1H、ArH)、7.68(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（１．３８ｇ）、テトラエチレングリコールジメシラート（２．６３ｇ）を加えて２２時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷したのち食塩水に注ぎ込み、生成物を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して薄褐色油状の５－［（１１－メシルオキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノンを得た。得られたモノメシラートをアセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解し、酢酸（２．８６ｍＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｍＬ）を加えて３０時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷したのち飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、生成物を酢酸エチルで抽出、希塩酸および食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、無色油状の標記化合物（１．０２ｇ、５６％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.07(s、3H、OCOCH3)、2.65―2.7(m、2H、COCH2)、3.08(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.65―3.76(complex、10H、OCH2)、3.89(t、J=4.8Hz、2H、OCH2)、4.19―4.24(complex、4H、ArOCH2 and CH3COOCH 2 )、6.91(s、1H、ArH)、6.91―6.94(1H、ArH)、7.68(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－［（１１－ヒドロキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノン：
５－［（１１－アセトキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノン（１．０２ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（３８ｍｇ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後に水を注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して薄黄色油状の標記化合物（７８１ｍｇ）を得た。この化合物は精製せずに次の工程に使用した。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.65―2.7(m、2H、COCH2)、3.09(t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.61(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、3.64―3.77(complex、10H、OCH2)、3.89(t、J=4.7Hz、2H、OCH2)、4.21(t、J=4.8Hz、2H、ArOCH2)、6.92(s、1H、ArH)、6.91―6.95(1H、1H、ArH)、7.68(d、J=9.6Hz、1H、ArH)
５－［（１１－アセトキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノン（１．０２ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（３８ｍｇ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後に水を注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮して薄黄色油状の標記化合物（７８１ｍｇ）を得た。この化合物は精製せずに次の工程に使用した。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.65―2.7(m、2H、COCH2)、3.09(t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.61(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、3.64―3.77(complex、10H、OCH2)、3.89(t、J=4.7Hz、2H、OCH2)、4.21(t、J=4.8Hz、2H、ArOCH2)、6.92(s、1H、ArH)、6.91―6.95(1H、1H、ArH)、7.68(d、J=9.6Hz、1H、ArH)
１１－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－（３，６，９－トリオキサ）ウンデカノール：
５－［（１１－ヒドロキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノン（３２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、室温でメチルアミン塩酸塩（２０３ｍｇ）と酢酸ナトリウム（２４６ｍｇ）を加え、３０分間撹拌した。続いて、反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２６ｍｇ）を加え、２２時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、薄黄色固体の１１－｛［１－（メチルアミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－（３，６，９－トリオキサ）ウンデカノール（３６９ｍｇ）を得た。得られたメチルアミン体（３６９ｍｇ）を１，２－ジクロロエタン（４ｍＬ）に溶解し、４－（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド（１７５ｍｇ）と水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（３７１ｍｇ）を加え、室温で２１時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をメタノール（５ｍＬ）に溶解してＰｄ／Ｆｉｂ（２．５％、５０ｍｇ）を加え、１気圧（バルーン）の水素雰囲気化、室温で２２時間反応させた。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝９／１）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（２４０ｍｇ、４８％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.72―1.85(m、2H、CH2CH 2 CH2)、1.99―2.06(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.38―2.63(complex、4H、 ArCH2 and NCH2 )、2.7―2.8(m、1H、ArCH2)、2.82―2.91(m、1H、ArCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.61(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、3.66―3.76(complex、10H、OCH2)、3.85(t、J=4.8Hz、2H、OCH2)、4.12(t、J=5Hz、2H、ArOCH2)、4.36(br t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.76―6.79(1H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
５－［（１１－ヒドロキシ－３，６，９－トリオキサウンデシル）オキシ］－１－インダノン（３２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、室温でメチルアミン塩酸塩（２０３ｍｇ）と酢酸ナトリウム（２４６ｍｇ）を加え、３０分間撹拌した。続いて、反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２６ｍｇ）を加え、２２時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、薄黄色固体の１１－｛［１－（メチルアミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－（３，６，９－トリオキサ）ウンデカノール（３６９ｍｇ）を得た。得られたメチルアミン体（３６９ｍｇ）を１，２－ジクロロエタン（４ｍＬ）に溶解し、４－（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド（１７５ｍｇ）と水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（３７１ｍｇ）を加え、室温で２１時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をメタノール（５ｍＬ）に溶解してＰｄ／Ｆｉｂ（２．５％、５０ｍｇ）を加え、１気圧（バルーン）の水素雰囲気化、室温で２２時間反応させた。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝９／１）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（２４０ｍｇ、４８％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.72―1.85(m、2H、CH2CH 2 CH2)、1.99―2.06(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.38―2.63(complex、4H、 ArCH2 and NCH2 )、2.7―2.8(m、1H、ArCH2)、2.82―2.91(m、1H、ArCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.61(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、3.66―3.76(complex、10H、OCH2)、3.85(t、J=4.8Hz、2H、OCH2)、4.12(t、J=5Hz、2H、ArOCH2)、4.36(br t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.76―6.79(1H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
化合物３（Ｃ３。以下「ＧＩＦ－２２８２」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、１１－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－（３，６，９－トリオキサ）ウンデカノール（２７．５ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物３（８ｍｇ、２２％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.8―1.9(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.05―2.15(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.22(s、3H、NCH3)、2.46―2.9(complex、6H、ArCH2 and NCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.65―3.78(complex、8H、OCH2)、3.82―3.9(m、2H、OCH2)、4.02(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、4.08―4.14(m、2H、OCH2)、4.45―4.5(br、1H、ArCHN)、4.55(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.67(dd、J=3.4 and 8.5Hz、2H、ArH)、6.7―6.8(complex、3H、ArH)、7.22―7.26(1H、ArH)、8.50(d、J=8.7Hz、1H、ArH)
化合物２の合成と同様の手法により、１１－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－（３，６，９－トリオキサ）ウンデカノール（２７．５ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物３（８ｍｇ、２２％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.8―1.9(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.05―2.15(m、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.22(s、3H、NCH3)、2.46―2.9(complex、6H、ArCH2 and NCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.65―3.78(complex、8H、OCH2)、3.82―3.9(m、2H、OCH2)、4.02(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、4.08―4.14(m、2H、OCH2)、4.45―4.5(br、1H、ArCHN)、4.55(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.67(dd、J=3.4 and 8.5Hz、2H、ArH)、6.7―6.8(complex、3H、ArH)、7.22―7.26(1H、ArH)、8.50(d、J=8.7Hz、1H、ArH)
＜実施例４＞
以下に記載する手順で、化合物４（Ｃ４）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物４（Ｃ４）を合成した。
５－（（６－ヒドロキシヘキシル）オキシ）－１－インダノン：
５－ヒドロキシ－１－インダノン（２９６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（４１５ｍｇ）、６－クロロ－１－ヘキサノール（０．８ｍＬ）、ヨウ化ナトリウム（３０ｍｇ）を加えて３０時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷したのち水に注ぎ込み、生成物を酢酸エチルで抽出、チオ硫酸ナトリウム水溶液と食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝２／１）にて精製し、白色固体の標記化合物（４２４ｍｇ、８５％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.41―1.67(complex、8H、CH2)、1.84(quin、J=6.9Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、2.67(t、J=5.9Hz、2H、COCH2)、3.08(t、J=5.9Hz、2H、ArCH2)、3.62―3.72(m、2H、CH 2 OH)、4.04(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、6.85―6.92(br、2H、ArH)、7.68(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－ヒドロキシ－１－インダノン（２９６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（４１５ｍｇ）、６－クロロ－１－ヘキサノール（０．８ｍＬ）、ヨウ化ナトリウム（３０ｍｇ）を加えて３０時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷したのち水に注ぎ込み、生成物を酢酸エチルで抽出、チオ硫酸ナトリウム水溶液と食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝２／１）にて精製し、白色固体の標記化合物（４２４ｍｇ、８５％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.41―1.67(complex、8H、CH2)、1.84(quin、J=6.9Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、2.67(t、J=5.9Hz、2H、COCH2)、3.08(t、J=5.9Hz、2H、ArCH2)、3.62―3.72(m、2H、CH 2 OH)、4.04(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、6.85―6.92(br、2H、ArH)、7.68(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
６－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－ヘキサノール：
化合物３の中間体ジアルキルアミンの合成と同様の手法により、５－（（６－ヒドロキシヘキシル）オキシ）－１－インダノン（４１９ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を用いて標記化合物（４２１ｍｇ、３段階で５９％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.38―1.54(complex、4H、CH2)、1.60(quin、J=6.9Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、1.74―1.83(complex、4H、CH2)、1.99―2.06(m、2H、CH2)、2.16(s、3H、NCH3)、2.37―2.63(complex、4H、 ArCH2 and NCH2 )、2.71―2.8(m、1H、ArCH2)、2.82―2.9(m、1H、ArCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.65(t、J=6.7Hz、CH 2 OH)、3.94(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、4.36(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.73(s、1H、ArH)、6.73―6.76(1H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H)、7.23(d、J=8.2Hz、ArH)
化合物３の中間体ジアルキルアミンの合成と同様の手法により、５－（（６－ヒドロキシヘキシル）オキシ）－１－インダノン（４１９ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を用いて標記化合物（４２１ｍｇ、３段階で５９％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.38―1.54(complex、4H、CH2)、1.60(quin、J=6.9Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、1.74―1.83(complex、4H、CH2)、1.99―2.06(m、2H、CH2)、2.16(s、3H、NCH3)、2.37―2.63(complex、4H、 ArCH2 and NCH2 )、2.71―2.8(m、1H、ArCH2)、2.82―2.9(m、1H、ArCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.65(t、J=6.7Hz、CH 2 OH)、3.94(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、4.36(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.73(s、1H、ArH)、6.73―6.76(1H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H)、7.23(d、J=8.2Hz、ArH)
化合物４（Ｃ４。以下「ＧＩＦ－２２８０」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、６－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－ヘキサノール（２３ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物４（３０ｍｇ、９３％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.57―1.72(complex、8H、CH2)、1.79―1.87(m、2H、CH2)、2.0―2.08(m、2H、CH2)、2.17(s、3H、NCH3)、2.44―2.63(complex、4H、 ArCH2 and NCH2)、2.72―2.9(complex、2H、 ArCH2 )、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.97(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、4.38―4.43(2H、ArOCH2 and ArCHN)、6.65(d、J=8.5Hz、1H、ArH)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.73(s、1H、ArH)、6.73―6.76(1H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、8.53(d、J=8.5Hz、1H、ArH)
化合物２の合成と同様の手法により、６－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－ヘキサノール（２３ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物４（３０ｍｇ、９３％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.57―1.72(complex、8H、CH2)、1.79―1.87(m、2H、CH2)、2.0―2.08(m、2H、CH2)、2.17(s、3H、NCH3)、2.44―2.63(complex、4H、 ArCH2 and NCH2)、2.72―2.9(complex、2H、 ArCH2 )、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.97(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、4.38―4.43(2H、ArOCH2 and ArCHN)、6.65(d、J=8.5Hz、1H、ArH)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.73(s、1H、ArH)、6.73―6.76(1H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、8.53(d、J=8.5Hz、1H、ArH)
＜実施例５＞
以下に記載する手順で、化合物５（Ｃ５）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物５（Ｃ５）を合成した。
２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝エチル［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル］カルバマート：
化合物１の合成中間体である２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール（５６ｍｇ、１５２μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６４μＬ）とクロロギ酸４－ニトロフェニル（３７ｍｇ）を順次室温で加え、１５時間反応させた。続いて、反応液に室温で２－（２－アミノエトキシ）エタノール（２３μＬ）を加え、さらに７時間撹拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、標記化合物（２６ｍｇ、３４％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.7―1.82(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.02(q、J=7.3Hz、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.15(s、3H、NCH3)、2.38―2.46 and 2.46―2.62(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.7―2.79 and 2.8―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.34―3.42(m、2H、CONHCH 2 )、3.56(br m、4H、OCH2)、3.72(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、4.12―4.17(br m、2H、OCH2)、4.35(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、4.39―4.44(br、2H、ArOCH2)、5.38(br s、1H、CONH)、6.69(d、J=8.6Hz、2H、ArH)、6.74(s、1H、ArH)、6.74―6.78(m、1H、ArH)、7.06(d、J=8.6Hz)、7.24(d、J=7.8Hz、1H、ArH)
化合物１の合成中間体である２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝－１－エタノール（５６ｍｇ、１５２μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６４μＬ）とクロロギ酸４－ニトロフェニル（３７ｍｇ）を順次室温で加え、１５時間反応させた。続いて、反応液に室温で２－（２－アミノエトキシ）エタノール（２３μＬ）を加え、さらに７時間撹拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、標記化合物（２６ｍｇ、３４％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.7―1.82(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.02(q、J=7.3Hz、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.15(s、3H、NCH3)、2.38―2.46 and 2.46―2.62(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.7―2.79 and 2.8―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.34―3.42(m、2H、CONHCH 2 )、3.56(br m、4H、OCH2)、3.72(t、J=4.6Hz、2H、OCH2)、4.12―4.17(br m、2H、OCH2)、4.35(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、4.39―4.44(br、2H、ArOCH2)、5.38(br s、1H、CONH)、6.69(d、J=8.6Hz、2H、ArH)、6.74(s、1H、ArH)、6.74―6.78(m、1H、ArH)、7.06(d、J=8.6Hz)、7.24(d、J=7.8Hz、1H、ArH)
化合物５（Ｃ５。以下「ＧＩＦ－２２７９」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、上記のカルバマート（２６ｍｇ、５２μｍｏｌ）から化合物５（７．１ｍｇ、２１％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.75―1.87(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.0―2.1(2H、ArCH2CH 2 CH)、2.18(s、3H、NCH3)、2.42―2.63(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.71―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.38―3.46(m、2H、CONHCH 2 )、3.64―3.68(m、2H、OCH2)、3.96―4.0(br、2H、OCH2)、4.1―4.16(2H、OCH2)、4.37―4.44(br、3H、OCH2 and ArCHN)、4.54(br t、J=4.1Hz、2H、ArOCH2)、5.15(br s、CONH)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.73(s、1H、ArH)、6.73―6.77(m、1H、ArH)、7.05(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23―7.26(1H、ArH)、8.51(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
化合物２の合成と同様の手法により、上記のカルバマート（２６ｍｇ、５２μｍｏｌ）から化合物５（７．１ｍｇ、２１％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.75―1.87(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.0―2.1(2H、ArCH2CH 2 CH)、2.18(s、3H、NCH3)、2.42―2.63(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.71―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.38―3.46(m、2H、CONHCH 2 )、3.64―3.68(m、2H、OCH2)、3.96―4.0(br、2H、OCH2)、4.1―4.16(2H、OCH2)、4.37―4.44(br、3H、OCH2 and ArCHN)、4.54(br t、J=4.1Hz、2H、ArOCH2)、5.15(br s、CONH)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.73(s、1H、ArH)、6.73―6.77(m、1H、ArH)、7.05(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23―7.26(1H、ArH)、8.51(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
＜実施例６＞
以下に記載する手順で、化合物６（Ｃ６）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物６（Ｃ６）を合成した。
５－（２－ブロモエトキシ）－１－インダノン：
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４５ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１５ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（２．４５ｇ）、１，２－ジブロモエタン（３．２７ｍＬ）、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（１２１ｍｇ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の標記化合物（１．０６ｇ、８３％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.67(m、2H、COCH2)、3.08(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.66(t、J=6.4Hz、2H、BrCH2)、4.35(t、J=6.4Hz、2H、OCH2)、6.89―6.93(br m,2H、ArH)、7.69(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４５ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１５ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（２．４５ｇ）、１，２－ジブロモエタン（３．２７ｍＬ）、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（１２１ｍｇ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の標記化合物（１．０６ｇ、８３％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.67(m、2H、COCH2)、3.08(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.66(t、J=6.4Hz、2H、BrCH2)、4.35(t、J=6.4Hz、2H、OCH2)、6.89―6.93(br m,2H、ArH)、7.69(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－（２－アジドエトキシ）－１－インダノン：
５－（２－ブロモエトキシ）－１－インダノン（４１０ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１２９ｍｇ）を加えて３５分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、赤褐色固体の標記化合物（３４６ｍｇ、９９％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.66―2.7(m、2H、COCH2)、3.09(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.63(t、J=5Hz、2H、N3CH2)、4.21(t、J=5Hz、2H、OCH2)、6.90―6.94(br m、2H、ArH)、7.70(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－（２－ブロモエトキシ）－１－インダノン（４１０ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１２９ｍｇ）を加えて３５分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、赤褐色固体の標記化合物（３４６ｍｇ、９９％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.66―2.7(m、2H、COCH2)、3.09(br t、J=6Hz、2H、ArCH2)、3.63(t、J=5Hz、2H、N3CH2)、4.21(t、J=5Hz、2H、OCH2)、6.90―6.94(br m、2H、ArH)、7.70(d、J=9.2Hz、1H、ArH)
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン：
５－（２－アジドエトキシ）－１－インダノン（１０９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２ｍＬ）溶液に、室温でメチルアミン塩酸塩（１０１ｍｇ）と酢酸ナトリウム（１２３ｍｇ）を加え、３０分間撹拌した。続いて、反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（６３ｍｇ）を加え、３０時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、薄褐色油状の５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン（１１８ｍｇ）を得た。得られたメチルアミン体（１１８ｍｇ）を１，２－ジクロロエタン（２ｍＬ）に溶解し、３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロパナール（８８ｍｇ）と水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１８５ｍｇ）を加え、室温で２３時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（１６１ｍｇ、８２％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.72―1.85(m、2H、CH2CH2CH2)、2.03(br q、J=7.6Hz、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.38―2.64(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.72―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.58(t、J=4.6Hz、2H、CH2N3)、4.14(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、4.36(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.76―6.78(1H、ArH)、7.06(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、7.23―7.26(1H、ArH)
５－（２－アジドエトキシ）－１－インダノン（１０９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２ｍＬ）溶液に、室温でメチルアミン塩酸塩（１０１ｍｇ）と酢酸ナトリウム（１２３ｍｇ）を加え、３０分間撹拌した。続いて、反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（６３ｍｇ）を加え、３０時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに水に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、薄褐色油状の５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン（１１８ｍｇ）を得た。得られたメチルアミン体（１１８ｍｇ）を１，２－ジクロロエタン（２ｍＬ）に溶解し、３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロパナール（８８ｍｇ）と水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１８５ｍｇ）を加え、室温で２３時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（１６１ｍｇ、８２％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.72―1.85(m、2H、CH2CH2CH2)、2.03(br q、J=7.6Hz、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.16(s、3H、NCH3)、2.38―2.64(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.72―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.58(t、J=4.6Hz、2H、CH2N3)、4.14(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、4.36(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、6.69(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.76―6.78(1H、ArH)、7.06(d、J=8.2Hz、2H、ArH)、7.23―7.26(1H、ArH)
３－［１－（２－｛［１－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）インダン－５－イル］オキシ｝エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］－１－プロパノール：
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン（３０ｍｇ、７６μＬ）のＴＨＦ（３００μＬ）溶液に、４－ペンチン－１－オール（７．８μＬ）、水（５０μＬ）、硫酸銅水溶液（０．１６Ｍ、５０μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（４．８ｍｇ）を順次加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／酢酸エチル／メタノール＝４／４／１．５）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（３６ｍｇ、定量的）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.72―1.84(m、2H、CH2CH 2 CH2)、1.93(quin、J=6.8Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、1.99―2.06(m,2H、ArCH2CH 2 CH)、2.15(s、3H、NCH3)、2.38―2.62(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.7―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.83(t、J=7.3Hz、2H、C=CCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.69(t、J=6.2Hz、2H、CH 2 OH)、4.32(t、J=5Hz、2H、OCH2CH 2 N)、4.35(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、4.71(t、J=5Hz、2H、ArOCH 2 CH2N)、6.67―6.73(complex、4H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.24(d、J=7.8Hz、1H、ArH)、7.52(s、1H、NCH=C)
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン（３０ｍｇ、７６μＬ）のＴＨＦ（３００μＬ）溶液に、４－ペンチン－１－オール（７．８μＬ）、水（５０μＬ）、硫酸銅水溶液（０．１６Ｍ、５０μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（４．８ｍｇ）を順次加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／酢酸エチル／メタノール＝４／４／１．５）にて精製し、薄黄色油状の標記化合物（３６ｍｇ、定量的）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.72―1.84(m、2H、CH2CH 2 CH2)、1.93(quin、J=6.8Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、1.99―2.06(m,2H、ArCH2CH 2 CH)、2.15(s、3H、NCH3)、2.38―2.62(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.7―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.83(t、J=7.3Hz、2H、C=CCH2)、2.9(s、6H、N(CH3)2)、3.69(t、J=6.2Hz、2H、CH 2 OH)、4.32(t、J=5Hz、2H、OCH2CH 2 N)、4.35(t、J=6.9Hz、1H、ArCHN)、4.71(t、J=5Hz、2H、ArOCH 2 CH2N)、6.67―6.73(complex、4H、ArH)、7.06(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.24(d、J=7.8Hz、1H、ArH)、7.52(s、1H、NCH=C)
化合物６（Ｃ６。以下「ＧＩＦ－２２７８」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、上記のトリアゾール体（２６ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物６（２１ｍｇ、６０％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.74―1.84(m、2H、 CH2CH 2 CH2)、1.88―1.95(m、1H、 CH2CH 2 CH2 )、1.98―2.08(m、3H、CH2CH 2 CH2 and ArCH2CH 2 CH )、2.18(s、3H、NCH3)、2.36―2.62(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.69―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90 (s、6H、N(CH3)2)、3.00(t、J=7.1Hz、2H、 C=CCH2)、4.32(t、J=5Hz、2H、 ArOCH2CH 2 N)、4.35―4.44(br、1H、ArCHN)、4.48(t、J=4.3Hz、2H、ArOCH2)、4.73(t、J=5Hz、2H、AOCH 2 CH2N)、6.62―6.72(complex、5H、ArH)、7.04(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.22―7.26(1H、ArH)、7.59(s、1H、NCH=C )、8.49(d、J=8.3Hz、1H、ArH)
化合物２の合成と同様の手法により、上記のトリアゾール体（２６ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物６（２１ｍｇ、６０％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.74―1.84(m、2H、 CH2CH 2 CH2)、1.88―1.95(m、1H、 CH2CH 2 CH2 )、1.98―2.08(m、3H、CH2CH 2 CH2 and ArCH2CH 2 CH )、2.18(s、3H、NCH3)、2.36―2.62(complex、4H、ArCH2 and NCH2)、2.69―2.9(complex、2H、ArCH2)、2.90 (s、6H、N(CH3)2)、3.00(t、J=7.1Hz、2H、 C=CCH2)、4.32(t、J=5Hz、2H、 ArOCH2CH 2 N)、4.35―4.44(br、1H、ArCHN)、4.48(t、J=4.3Hz、2H、ArOCH2)、4.73(t、J=5Hz、2H、AOCH 2 CH2N)、6.62―6.72(complex、5H、ArH)、7.04(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.22―7.26(1H、ArH)、7.59(s、1H、NCH=C )、8.49(d、J=8.3Hz、1H、ArH)
＜実施例７＞
以下に記載する手順で、化合物７（Ｃ７）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物７（Ｃ７）を合成した。
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－［４－（ジメチルアミノ）ベンジル］－１－インダニルアミン：
５－（２－アジドエトキシ）－１－インダノン（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）溶液に、４－（ジメチルアミノ）ベンジルアミン二塩酸塩（１５５ｍｇ）、トリエチルアミン（２１６μＬ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４８．５ｍｇ）、酢酸（１００μＬ）を順次加え、４２時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに塩酸（１Ｍ、２ｍＬ）を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液が弱塩基性になるまで水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）を滴下し、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の標記化合物（１３０ｍｇ、８０％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.88―2.0 and 2.35―2.45(complex、each 1H、ArCH2CH2)、2.78(dt、J=7.8 and 15.8Hz、1H、ArCH2)、2.91(s、6H、N(CH3)2)、3.0(ddd、J=5、8.5、and 15.8、1H、ArCH2)、3.56(t、J=5Hz、2H、N3CH2)、3.77 and 3.81(d、J=12.8Hz、2H、ArCH2N)、4.11(t、J=5Hz、2H、OCH2)、4.26(t、J=6.4Hz、1H、ArCHN)、6.70(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(d、J=8.3Hz,1H、ArH)、6.78(br s、1H、ArH)、7.22―7.25(2H、ArH)、7.27(d、J=8.3Hz、1H、ArH)
５－（２－アジドエトキシ）－１－インダノン（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）溶液に、４－（ジメチルアミノ）ベンジルアミン二塩酸塩（１５５ｍｇ）、トリエチルアミン（２１６μＬ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４８．５ｍｇ）、酢酸（１００μＬ）を順次加え、４２時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷したのちに塩酸（１Ｍ、２ｍＬ）を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液が弱塩基性になるまで水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）を滴下し、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の標記化合物（１３０ｍｇ、８０％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.88―2.0 and 2.35―2.45(complex、each 1H、ArCH2CH2)、2.78(dt、J=7.8 and 15.8Hz、1H、ArCH2)、2.91(s、6H、N(CH3)2)、3.0(ddd、J=5、8.5、and 15.8、1H、ArCH2)、3.56(t、J=5Hz、2H、N3CH2)、3.77 and 3.81(d、J=12.8Hz、2H、ArCH2N)、4.11(t、J=5Hz、2H、OCH2)、4.26(t、J=6.4Hz、1H、ArCHN)、6.70(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(d、J=8.3Hz,1H、ArH)、6.78(br s、1H、ArH)、7.22―7.25(2H、ArH)、7.27(d、J=8.3Hz、1H、ArH)
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－［４－（ジメチルアミノ）ベンジル］－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン：
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－［４－（ジメチルアミノ）ベンジル］－１－インダニルアミン（５７．５ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）をメタノール（０．８ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（２７．１ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１６．０ｍｇ）を順次加え、室温で７時間反応させた。反応液に塩酸（１Ｍ）を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液が弱塩基性になるまで水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の標記化合物（５８ｍｇ、９７％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.6―1.8 and 2.0―2.11(complex、each 1H、ArCH2CH2)、2.12(s、3H、NCH3)、2.71―2.83 and 2.86―2.95(complex、each 1H、ArCH2)、2.91(s、6H、N(CH3)2)、3.32(d、J=12.8Hz、1H、ArCH2)、3.50(d、J=12.8Hz、1H、ArCH2)、3.57(t、J=5Hz、2H、N3CH2)、4.13(t、J=5Hz、2H、OCH2)、4.40(t、J=7.1Hz、1H、ArCHN)、6.70(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.78(d、J=8.2Hz、1H、ArH)、7.21(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.33(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－［４－（ジメチルアミノ）ベンジル］－１－インダニルアミン（５７．５ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）をメタノール（０．８ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（２７．１ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１６．０ｍｇ）を順次加え、室温で７時間反応させた。反応液に塩酸（１Ｍ）を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液が弱塩基性になるまで水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の標記化合物（５８ｍｇ、９７％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.6―1.8 and 2.0―2.11(complex、each 1H、ArCH2CH2)、2.12(s、3H、NCH3)、2.71―2.83 and 2.86―2.95(complex、each 1H、ArCH2)、2.91(s、6H、N(CH3)2)、3.32(d、J=12.8Hz、1H、ArCH2)、3.50(d、J=12.8Hz、1H、ArCH2)、3.57(t、J=5Hz、2H、N3CH2)、4.13(t、J=5Hz、2H、OCH2)、4.40(t、J=7.1Hz、1H、ArCHN)、6.70(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.76(s、1H、ArH)、6.78(d、J=8.2Hz、1H、ArH)、7.21(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.33(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
化合物７（Ｃ７。以下「ＧＩＦ－２２７４」と記載することがある。）：
ＮＢＤ－Ｆ（３６．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、３－ブチン－１－オール（２３μＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４２μＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。反応液を飽和食塩水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮することで４－（３－ブチン－１－イルオキシ）－７－ニトロベンゾフラザン（４６．７ｍｇ）を得た。この粗生成物（１０ｍｇ）と５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－［４－（ジメチルアミノ）ベンジル］－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン（１７ｍｇ）をＴＨＦ（０．１ｍＬ）に溶解し、硫酸銅水溶液（０．０８Ｍ、２５μＬ）とアスコルビン酸ナトリウム（２．２ｍｇ）を加えて室温で１７時間反応させた。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、黒色固体の化合物７（６．５ｍｇ、２５％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.07―2.2(complex、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.14(s、3H、NCH3)、2.71―2.82(m、1H、ArCH2)、2.85―2.92(1H、ArCH2)、3.37―3.57(complex、4H、C=CCH2 and ArCH2N)、4.27―4.35(complex、2H、ArOCH2CH 2 N)、4.52(t、J=6.9Hz、1H、ArCH2N)、4.67(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、4.74(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.65―6.75(complex、5H、ArH)、7.20(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.32(d、J=7.8Hz、1H、ArH)、7.79(s、1H、NCH=C)、8.48(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
ＮＢＤ－Ｆ（３６．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、３－ブチン－１－オール（２３μＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４２μＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。反応液を飽和食塩水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮することで４－（３－ブチン－１－イルオキシ）－７－ニトロベンゾフラザン（４６．７ｍｇ）を得た。この粗生成物（１０ｍｇ）と５－（２－アジドエトキシ）－Ｎ－［４－（ジメチルアミノ）ベンジル］－Ｎ－メチル－１－インダニルアミン（１７ｍｇ）をＴＨＦ（０．１ｍＬ）に溶解し、硫酸銅水溶液（０．０８Ｍ、２５μＬ）とアスコルビン酸ナトリウム（２．２ｍｇ）を加えて室温で１７時間反応させた。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、黒色固体の化合物７（６．５ｍｇ、２５％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:2.07―2.2(complex、2H、ArCH2CH 2 CH)、2.14(s、3H、NCH3)、2.71―2.82(m、1H、ArCH2)、2.85―2.92(1H、ArCH2)、3.37―3.57(complex、4H、C=CCH2 and ArCH2N)、4.27―4.35(complex、2H、ArOCH2CH 2 N)、4.52(t、J=6.9Hz、1H、ArCH2N)、4.67(t、J=6.4Hz、2H、ArOCH2)、4.74(t、J=4.6Hz、2H、ArOCH2)、6.65―6.75(complex、5H、ArH)、7.20(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.32(d、J=7.8Hz、1H、ArH)、7.79(s、1H、NCH=C)、8.48(d、J=8.2Hz、1H、ArH)
＜実施例８＞
以下に記載する手順で、化合物８（Ｃ８）を合成した。
以下に記載する手順で、化合物８（Ｃ８）を合成した。
２－［４－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）フェノキシ］－１－エタノール：
４－（２－ヒドロキシエトキシ）ベンズアルデヒド（１６６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の１，２－ジクロロエタン溶液（３ｍＬ）に１，２－ジクロロエタン（１ｍＬ）に溶解した４－（２－アミノエチル）Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン（１９６ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌した。この溶液に水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（３７１ｍｇ）を加え、室温で１５時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣（４１６ｍｇ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（９０ｍｇ）、酢酸（５７μＬ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９４ｍｇ）を加えて、室温で２０時間反応させた。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝９／１）にて精製し、淡黄色油状の標記化合物（２３２ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.80(quin、J=7.6Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、2.17(s、3H、NCH3)、2.39(t、J=7.6Hz、2H、NCH 2 CH2)、2.54(t、J=7.6Hz、2H、ArCH 2 CH2)、2.91(s、6H、N(CH3)2)、3.42(s、2H、ArCH2N)、3.95(t、J=4.5Hz、2H、CH2OH)、4.08(t、J=4.5Hz、2H、ArOCH2)、6.69(d、J=8.5Hz、2H、ArH)、6.86(d、J=8.5Hz、2H、ArH)、7.05(d、J=8.5Hz、2H、ArH)、7.22(d、J=8.5Hz、2H、ArH)
４－（２－ヒドロキシエトキシ）ベンズアルデヒド（１６６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の１，２－ジクロロエタン溶液（３ｍＬ）に１，２－ジクロロエタン（１ｍＬ）に溶解した４－（２－アミノエチル）Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン（１９６ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌した。この溶液に水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（３７１ｍｇ）を加え、室温で１５時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジクロロメタンで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣（４１６ｍｇ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（９０ｍｇ）、酢酸（５７μＬ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９４ｍｇ）を加えて、室温で２０時間反応させた。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝９／１）にて精製し、淡黄色油状の標記化合物（２３２ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.80(quin、J=7.6Hz、2H、CH2CH 2 CH2)、2.17(s、3H、NCH3)、2.39(t、J=7.6Hz、2H、NCH 2 CH2)、2.54(t、J=7.6Hz、2H、ArCH 2 CH2)、2.91(s、6H、N(CH3)2)、3.42(s、2H、ArCH2N)、3.95(t、J=4.5Hz、2H、CH2OH)、4.08(t、J=4.5Hz、2H、ArOCH2)、6.69(d、J=8.5Hz、2H、ArH)、6.86(d、J=8.5Hz、2H、ArH)、7.05(d、J=8.5Hz、2H、ArH)、7.22(d、J=8.5Hz、2H、ArH)
化合物８（以下「ＧＩＦ－２２８１」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、上記の２－［４－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）フェノキシ］－１－エタノール（１９ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物８（１５ｍｇ、５４％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.79―1.88(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.29(s、3H、NCH3)、2.49―2.55(complex、4H、ArCH 2 CH2CH 2 N)、3.54―3.58(br、2H、ArCH2N)、4.49(t、J=4.7Hz、2H、ArOCH2CH 2 )、4.78(t、J=4.7Hz、2H、ArOCH 2 CH2)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.79(d、J= Hz、1H、ArH)、6.87(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.04(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、8.56(d、J=8.7Hz、1H、ArH)
化合物２の合成と同様の手法により、上記の２－［４－（｛３－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］プロピル｝（メチル）アミノ）フェノキシ］－１－エタノール（１９ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物８（１５ｍｇ、５４％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.79―1.88(m、2H、CH2CH 2 CH2)、2.29(s、3H、NCH3)、2.49―2.55(complex、4H、ArCH 2 CH2CH 2 N)、3.54―3.58(br、2H、ArCH2N)、4.49(t、J=4.7Hz、2H、ArOCH2CH 2 )、4.78(t、J=4.7Hz、2H、ArOCH 2 CH2)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.79(d、J= Hz、1H、ArH)、6.87(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.04(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.23(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、8.56(d、J=8.7Hz、1H、ArH)
＜実施例９＞
化合物９（以下「ＧＩＦ－２２８３」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、２－（４－｛６－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］－３－メチル－３－アザヘキシル｝フェノキシ）－１－エタノール（２０ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物９（１６．４ｍｇ、５６％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.77―1.86(br、2H、ArCH2CH2CH2)、2.38(s、3H、NCH3)、2.5―2.57(complex、4H、ArCH2)、2.63―2.8(complex、4H、NCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.94(t、J=4.5Hz、2H、ArOCH2)、4.05(t、J=4.5Hz、2H、ArOCH2)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.79(d、J=8.5Hz、1H、ArH)、6.84(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.04(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.12(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、8.55(d、J=8.5Hz、1H、ArH)
化合物９（以下「ＧＩＦ－２２８３」と記載することがある。）：
化合物２の合成と同様の手法により、２－（４－｛６－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］－３－メチル－３－アザヘキシル｝フェノキシ）－１－エタノール（２０ｍｇ、５５μｍｏｌ）から化合物９（１６．４ｍｇ、５６％）を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3) δ:1.77―1.86(br、2H、ArCH2CH2CH2)、2.38(s、3H、NCH3)、2.5―2.57(complex、4H、ArCH2)、2.63―2.8(complex、4H、NCH2)、2.90(s、6H、N(CH3)2)、3.94(t、J=4.5Hz、2H、ArOCH2)、4.05(t、J=4.5Hz、2H、ArOCH2)、6.68(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、6.79(d、J=8.5Hz、1H、ArH)、6.84(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.04(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、7.12(d、J=8.7Hz、2H、ArH)、8.55(d、J=8.5Hz、1H、ArH)
［合成した化合物を用いた細胞外小胞の染色と検出］
＜実施例１０および比較例１：合成した各化合物の染色効果について＞
・細胞外小胞（エクソソーム）の調整
１Ｌの市販の低温殺菌牛乳（関牛乳もしくはタカナシ）を８０００ｒｐｍで３０分遠心し、上清をコーヒーフィルターで濾過した。続いて、酢酸を１％になるように添加し、さらに８０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。その上清をさらにコーヒーフィルターで濾過した。濾過後の液を、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス社）で濾過し、濾液を０．１μｍのフィルター（ザルトリウス社）で濾過した。細胞外小胞は０．１μｍのフィルター上に残るため、リン酸緩衝液５ｍＬで３回洗浄した。最終的に、１ｍＬのリン酸緩衝液で 細胞外小胞を回収した。精製した細胞外小胞１０μＬをリン酸緩衝液４０μＬで希釈した（以下「 細胞外小胞調整液」と記載する。）。
＜実施例１０および比較例１：合成した各化合物の染色効果について＞
・細胞外小胞（エクソソーム）の調整
１Ｌの市販の低温殺菌牛乳（関牛乳もしくはタカナシ）を８０００ｒｐｍで３０分遠心し、上清をコーヒーフィルターで濾過した。続いて、酢酸を１％になるように添加し、さらに８０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。その上清をさらにコーヒーフィルターで濾過した。濾過後の液を、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス社）で濾過し、濾液を０．１μｍのフィルター（ザルトリウス社）で濾過した。細胞外小胞は０．１μｍのフィルター上に残るため、リン酸緩衝液５ｍＬで３回洗浄した。最終的に、１ｍＬのリン酸緩衝液で 細胞外小胞を回収した。精製した細胞外小胞１０μＬをリン酸緩衝液４０μＬで希釈した（以下「 細胞外小胞調整液」と記載する。）。
・実施例１０で用いた染色剤の作製
実施例１～９で合成した化合物１～９をＤＭＳＯで希釈することで、実施例１０で使用する染色剤を作製した。
・比較例１で用いた染色剤の作製
ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－Ｒｅｄ（ＥｘｏＳＰ 型番ＥＸ０２：同仁社）を、使用説明書に準じてＤＭＳＯ溶液で希釈することで比較例１の染色剤を作製した。
実施例１～９で合成した化合物１～９をＤＭＳＯで希釈することで、実施例１０で使用する染色剤を作製した。
・比較例１で用いた染色剤の作製
ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－Ｒｅｄ（ＥｘｏＳＰ 型番ＥＸ０２：同仁社）を、使用説明書に準じてＤＭＳＯ溶液で希釈することで比較例１の染色剤を作製した。
・細胞外小胞の染色と検出
細胞外小胞調整液に、実施例１０で作製した染色剤を最終濃度が１μＭとなるように添加した。また、細胞外小胞調整液に、比較例１で作製した染色剤１μＬを添加した。実施例１０および比較例１では、染色剤を細胞外小胞調整液に添加後、室温で１２時間放置した。１２時間経過後、反応物１０μＬを高速液体クロマトグラフィーゲル濾過システムで解析した。カラムの展開溶媒は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌを使用し、検出は、ＥｘｏＳＰは励起５６０ｎｍ、蛍光検出６００ｎｍを、実施例１～８で合成した化合物は励起４８０ｎｍ、蛍光検出５３０ｎｍで行った。カラムは、Ｇｅｎ ２ ｑＥＶ ｏｒｉｇｉｎａｌ／７０ｎｍ（ｉＺＱＮ社）を３ｃｍと、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０７（昭和電工社）を連結したものを使用した。
細胞外小胞調整液に、実施例１０で作製した染色剤を最終濃度が１μＭとなるように添加した。また、細胞外小胞調整液に、比較例１で作製した染色剤１μＬを添加した。実施例１０および比較例１では、染色剤を細胞外小胞調整液に添加後、室温で１２時間放置した。１２時間経過後、反応物１０μＬを高速液体クロマトグラフィーゲル濾過システムで解析した。カラムの展開溶媒は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌを使用し、検出は、ＥｘｏＳＰは励起５６０ｎｍ、蛍光検出６００ｎｍを、実施例１～８で合成した化合物は励起４８０ｎｍ、蛍光検出５３０ｎｍで行った。カラムは、Ｇｅｎ ２ ｑＥＶ ｏｒｉｇｉｎａｌ／７０ｎｍ（ｉＺＱＮ社）を３ｃｍと、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０７（昭和電工社）を連結したものを使用した。
図１ａ～図１ｆに結果を示す。グラフの横軸は流出時間（分）で、縦軸は蛍光強度を表す。グラフには、合成した化合物の番号と化学式についても併せて記載する。図１ａ～図１ｆに示すグラフから明らかなように、実施例１～９で合成した化合物は、細胞外小胞のゲル濾過用の染色剤として知られている比較例１のＥｘｏＳＰより強い蛍光強度を示した。したがって、本出願で開示する化合物は、細胞外小胞のゲル濾過用の染色剤として使用できることを確認した。
＜実施例１１および比較例２：反応条件について＞
次に、染色剤と細胞外小胞調整液の反応条件を変えた実験を行った。
・実施例１１
実施例１０において、染色剤を細胞外小胞調整液に添加後、直ちにカラムで解析（未処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ））、８０℃で５分間処理または８０℃で１５分間処理した後にカラムで解析した以外は、実施例１０と同様の手順で実験を行った。なお、実施例１１で実験を行った化合物は、グラフ中にＧＩＦ番号を記載した。
・比較例２
比較例１において、染色剤を細胞外小胞調整液に添加後、直ちにカラムで解析（未処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ））、８０℃で５分間処理または８０℃で１５分間処理した後にカラムで解析した以外は、比較例１と同様の手順で実験を行った。
次に、染色剤と細胞外小胞調整液の反応条件を変えた実験を行った。
・実施例１１
実施例１０において、染色剤を細胞外小胞調整液に添加後、直ちにカラムで解析（未処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ））、８０℃で５分間処理または８０℃で１５分間処理した後にカラムで解析した以外は、実施例１０と同様の手順で実験を行った。なお、実施例１１で実験を行った化合物は、グラフ中にＧＩＦ番号を記載した。
・比較例２
比較例１において、染色剤を細胞外小胞調整液に添加後、直ちにカラムで解析（未処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ））、８０℃で５分間処理または８０℃で１５分間処理した後にカラムで解析した以外は、比較例１と同様の手順で実験を行った。
図２ａ～図２ｃに結果を示す。グラフの横軸は流出時間（分）で、縦軸は蛍光強度を表す。図２ａ～図２ｃに示すグラフから明らかなように、比較例１のＥｘｏＳＰは、加熱処理の影響は殆ど見られなかった。一方、実施例で合成した化合物（ＧＩＦ－２２７４、ＧＩＦ－２２７６、ＧＩＦ－２２７７、ＧＩＦ－２２７８）は、何れも、加熱処理により蛍光強度が大幅に増加した。その理由としては、反応速度の亢進が考えられる。以上の結果から、本出願で開示する化合物は、加熱により細胞外小胞と染色剤の結合が顕著に増加することから、短時間解析に有用であることを確認した。
＜実施例１２：各種乳酸菌飲料について＞
次に、各種乳酸菌飲料を用いた実験を行った。乳酸菌飲料には、Ａ：ヤクルト（ヤクルト社）、Ｂ：おなかよろこぶ乳酸菌（くらしもあ社）、Ｃ：ピルクル（日清食品社）を用いた。上記Ａ～Ｃの乳酸菌飲料５００ｍＬを、８０００ｒｐｍで３０分遠心し、上清をコーヒーフィルターで濾過した。濾過後の液を、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス社）で濾過し、濾液を０．０３３μｍのフィルター（ＧＶＳ社）で濾過した。細胞外小胞は０．０３３μｍのフィルター上に残るため、リン酸緩衝液５ｍＬで３回洗浄した。最終的に、１ｍＬのリン酸緩衝液で細胞外小胞を回収した。回収した細胞外小胞液５０μＬに、実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６を最終濃度が１μＭとなるように添加し、それぞれのサンプルを、８０℃で１５分、室温で１２時間放置した以外は、実施例１１と同様の手順で実験を行った。
次に、各種乳酸菌飲料を用いた実験を行った。乳酸菌飲料には、Ａ：ヤクルト（ヤクルト社）、Ｂ：おなかよろこぶ乳酸菌（くらしもあ社）、Ｃ：ピルクル（日清食品社）を用いた。上記Ａ～Ｃの乳酸菌飲料５００ｍＬを、８０００ｒｐｍで３０分遠心し、上清をコーヒーフィルターで濾過した。濾過後の液を、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス社）で濾過し、濾液を０．０３３μｍのフィルター（ＧＶＳ社）で濾過した。細胞外小胞は０．０３３μｍのフィルター上に残るため、リン酸緩衝液５ｍＬで３回洗浄した。最終的に、１ｍＬのリン酸緩衝液で細胞外小胞を回収した。回収した細胞外小胞液５０μＬに、実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６を最終濃度が１μＭとなるように添加し、それぞれのサンプルを、８０℃で１５分、室温で１２時間放置した以外は、実施例１１と同様の手順で実験を行った。
図３に結果を示す。グラフの横軸は流出時間（分）で、縦軸は蛍光強度を表す。また、グラフ中の「Ｏ／Ｎ」は室温で１２時間放置したサンプルを示す。図３から明らかなように、各種乳酸菌飲料に含まれる細胞外小胞に対して、本出願で開示する染色剤が有用であることを確認した。また、乳酸菌飲料に含まれる細胞外小胞に対しても、実施例１１と同様に、加熱処理により蛍光強度が大幅に増加することを確認した。
＜実施例１３：細胞外小胞のサイズ分離について＞
次に、染色剤として実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６を用い、サンプルとして、実施例１０に記載の手順で調整した牛乳由来の細胞外小胞および実施例１２に記載の手順で調整した乳酸菌飲料（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いて、細胞外小胞のサイズ分離を行った。細胞外小胞調整液に、ＧＩＦ―２２７６を最終濃度が１μＭとなるように添加し、室温で１２時間放置した後、実施例１０に記載の手順で実験を行った。図４に結果を示す。図４に示すように、牛乳由来の細胞外小胞は、乳酸菌由来の細胞外小胞よりも早く溶出した。すなわち、牛乳由来の細胞外小胞の方が、乳酸菌由来の細胞外小胞より大きいことを意味する。このことは、牛乳由来の細胞外小胞が０．１μｍフィルターを通過しないが、乳酸菌由来細胞外小胞は通過する事実と一致した。以上の結果から、本出願で開示する化合物（染色剤）を用いると、染色した細胞外小胞をゲル濾過システムによりサイズ解析できることを確認した。
次に、染色剤として実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６を用い、サンプルとして、実施例１０に記載の手順で調整した牛乳由来の細胞外小胞および実施例１２に記載の手順で調整した乳酸菌飲料（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いて、細胞外小胞のサイズ分離を行った。細胞外小胞調整液に、ＧＩＦ―２２７６を最終濃度が１μＭとなるように添加し、室温で１２時間放置した後、実施例１０に記載の手順で実験を行った。図４に結果を示す。図４に示すように、牛乳由来の細胞外小胞は、乳酸菌由来の細胞外小胞よりも早く溶出した。すなわち、牛乳由来の細胞外小胞の方が、乳酸菌由来の細胞外小胞より大きいことを意味する。このことは、牛乳由来の細胞外小胞が０．１μｍフィルターを通過しないが、乳酸菌由来細胞外小胞は通過する事実と一致した。以上の結果から、本出願で開示する化合物（染色剤）を用いると、染色した細胞外小胞をゲル濾過システムによりサイズ解析できることを確認した。
＜実施例１４および比較例３：合成した各化合物の乳酸菌細胞外小胞の染色効果について＞
実施例１０の低温殺菌牛乳に替え、実施例１２に記載の手順で調整した乳酸菌飲料（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いた以外は、実施例１０と同様の手順で実験を行った。図５ａ～図５ｆに結果を示す。図５ａ～図５ｆに示すグラフから明らかなように、実施例１～９で合成したい化合物は、種類が異なる細胞外小胞のゲル濾過用の染色剤として使用できることを確認した。なお、実施例１０の低温殺菌牛乳の染色では、ＧＩＦ－２２８１、ＧＩＦ－２２８０、ＧＩＦ－２２７６の順に感度が高かった。一方、実施例１４の乳酸菌では、ＧＩＦ－２２７７、ＧＩＦ－２２８１、ＧＩＦ－２２８２の順に感度が高かった。したがって、本出願で開示する化合物は、被染色細胞外小胞の種類に応じて適宜選択すればよいことを確認した。高感度の化合物を選択することで、化合物の使用量を少なくできる。
実施例１０の低温殺菌牛乳に替え、実施例１２に記載の手順で調整した乳酸菌飲料（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いた以外は、実施例１０と同様の手順で実験を行った。図５ａ～図５ｆに結果を示す。図５ａ～図５ｆに示すグラフから明らかなように、実施例１～９で合成したい化合物は、種類が異なる細胞外小胞のゲル濾過用の染色剤として使用できることを確認した。なお、実施例１０の低温殺菌牛乳の染色では、ＧＩＦ－２２８１、ＧＩＦ－２２８０、ＧＩＦ－２２７６の順に感度が高かった。一方、実施例１４の乳酸菌では、ＧＩＦ－２２７７、ＧＩＦ－２２８１、ＧＩＦ－２２８２の順に感度が高かった。したがって、本出願で開示する化合物は、被染色細胞外小胞の種類に応じて適宜選択すればよいことを確認した。高感度の化合物を選択することで、化合物の使用量を少なくできる。
［染色剤でラベル化した細胞外小胞の細胞内導入および追跡について］
＜実施例１５：牛乳由来の細胞外小胞について＞
実施例１０の手順で調整した牛乳由来の細胞外小胞（エクソソーム）を、ＧＩＦ－２２７６で室温１２ｈ染色することで細胞外小胞をラベル化した。未反応のＧＩＦ－２２７６をＭｉｃｒｏｃｏｎ ３００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で除去した。ＨＥＫ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のリソソームをＬｙｓｏＢｒｉｔｅ Ｒｅｄラベルし、ＧＩＦ－２２７６ラベル牛乳由来細胞外小胞を添加した。３時間後に顕微鏡で観察した。図６に結果を示す。図６の左上の２２７６は、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞の蛍光写真である。図６の右上のＬｙｓｏＢｒｉｇｈｔは、ＬｙｓｏＢｒｉｔｅ Ｒｅｄでラベルされたリソソームの蛍光写真である。図６の左下は、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞の蛍光写真およびＬｙｓｏＢｒｉｔｅ Ｒｅｄでラベルされたリソソームの蛍光写真をＭｅｒｇｅした写真である。図６の右下は、可視光で撮影したＨＥＫ２９３細胞の写真である。図６のＭｅｒｇｅ写真から明らかなように、細胞外小胞のシグナルの殆どがリソソームに局在していた。以上の結果から、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞を導入細胞内で追跡できることを確認した。
＜実施例１５：牛乳由来の細胞外小胞について＞
実施例１０の手順で調整した牛乳由来の細胞外小胞（エクソソーム）を、ＧＩＦ－２２７６で室温１２ｈ染色することで細胞外小胞をラベル化した。未反応のＧＩＦ－２２７６をＭｉｃｒｏｃｏｎ ３００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で除去した。ＨＥＫ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のリソソームをＬｙｓｏＢｒｉｔｅ Ｒｅｄラベルし、ＧＩＦ－２２７６ラベル牛乳由来細胞外小胞を添加した。３時間後に顕微鏡で観察した。図６に結果を示す。図６の左上の２２７６は、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞の蛍光写真である。図６の右上のＬｙｓｏＢｒｉｇｈｔは、ＬｙｓｏＢｒｉｔｅ Ｒｅｄでラベルされたリソソームの蛍光写真である。図６の左下は、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞の蛍光写真およびＬｙｓｏＢｒｉｔｅ Ｒｅｄでラベルされたリソソームの蛍光写真をＭｅｒｇｅした写真である。図６の右下は、可視光で撮影したＨＥＫ２９３細胞の写真である。図６のＭｅｒｇｅ写真から明らかなように、細胞外小胞のシグナルの殆どがリソソームに局在していた。以上の結果から、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞を導入細胞内で追跡できることを確認した。
＜実施例１６：乳酸菌由来の細胞外小胞について＞
牛乳由来の細胞外小胞に換え、乳酸菌（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いた以外は、実施例１５と同様の手順で実験を行った。図７に結果を示す。図７のＭｅｒｇｅ写真から明らかなように、乳酸菌（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いた場合でも、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞を導入細胞内で追跡できることを確認した。
牛乳由来の細胞外小胞に換え、乳酸菌（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いた以外は、実施例１５と同様の手順で実験を行った。図７に結果を示す。図７のＭｅｒｇｅ写真から明らかなように、乳酸菌（ヤクルト）由来の細胞外小胞を用いた場合でも、ＧＩＦ－２２７６でラベルされた細胞外小胞を導入細胞内で追跡できることを確認した。
実施例１５および１６の結果から、本出願で開示する化合物は、哺乳類および微生物を問わず細胞外小胞をラベルし、細胞内で追跡できる。従来の方法では、特定のマーカーを利用しての追跡であり、マーカーの存在しない生物種では不可能である。一方、非特異的に膜をラベルする追跡法も存在するが、細胞内でラベル化合物が別の膜構造体へ移動するため、最終的な追跡は困難である。その点で、本出願で開示する化合物は生物種に依存せず、細胞外小胞の運命を追跡できる点で優れている。
＜実施例１７および比較例４：特許文献１に記載の化合物との対比＞
（１）ゲル濾過
本出願人は、特許文献１において、以下に示すＧＩＦ－２２５０を開示している。ＧＩＦ－２２５０は、→で示す部分がＮＨである点で本出願の化合物と異なる。先ず、当該構造の違いが、ゲル濾過によるサイズ分離に与える影響を確認した。なお、ＧＩＦ－２２５０の合成手順は、特許文献１に記載されている。特許文献１に記載されている事項は、参照により、その全てが本明細書に含まれる。
（１）ゲル濾過
本出願人は、特許文献１において、以下に示すＧＩＦ－２２５０を開示している。ＧＩＦ－２２５０は、→で示す部分がＮＨである点で本出願の化合物と異なる。先ず、当該構造の違いが、ゲル濾過によるサイズ分離に与える影響を確認した。なお、ＧＩＦ－２２５０の合成手順は、特許文献１に記載されている。特許文献１に記載されている事項は、参照により、その全てが本明細書に含まれる。
ＧＩＦ－２２７６および特許文献１に記載のＧＩＦ－２２５０（比較例４）を用い、反応時間を室温で３時間とした以外は、実施例１０と同様の手順でそれぞれ実験を行った。図８にそれぞれの実験結果を重ねたグラフを示す。図８から明らかなように、特許文献１の化合物で染色した細胞外小胞は、牛乳由来の細胞外小胞のピークが見られなかった。一方、ＧＩＦ－２２７６を用いた場合は、牛乳由来の細胞外小胞のサイズに明確なピークが見られた。
以上の結果から、特許文献１に記載のＧＩＦ－２２５０は、細胞外小胞の染色の用途には使用できるものの、流体圧力がかかる液体クロマトグラフィーによるサイズ分離には使用できないことを確認した。また、本出願で開示する化合物と特許文献１に記載のＧＩＦ－２２５０の構造上の違いは、上記のとおり、“→”部分が“ＮＨ”であるか、または“Ｏ”である。流体圧力により、図８に示すように著しく異なる結果が得られたのは、以下の理由が考えられる。
（１）ＧＩＦ－２２５０は、流体圧力により細胞外小胞から容易に分離する程度の力で結合していること（例えば、弱い静電引力によりイオン結合していると想定される）。
（２）本出願で開示する化合物は、化合物自体は蛍光を発しないが、細胞外小胞と反応することで蛍光を発することから化合物の構造に変化があったと考えられること、および、流体圧力に抗するほど強く細胞外小胞に結合していることから、化合物が細胞外小胞に接すると、蛍光基部分が化合物から分離し、蛍光基部分が細胞外小胞の成分と共有結合したためと考えられること。なお、蛍光基の構造から見て、分離した蛍光基は細胞外小胞の表面のリシンのアミノ基と共有結合したと考えられる。
（１）ＧＩＦ－２２５０は、流体圧力により細胞外小胞から容易に分離する程度の力で結合していること（例えば、弱い静電引力によりイオン結合していると想定される）。
（２）本出願で開示する化合物は、化合物自体は蛍光を発しないが、細胞外小胞と反応することで蛍光を発することから化合物の構造に変化があったと考えられること、および、流体圧力に抗するほど強く細胞外小胞に結合していることから、化合物が細胞外小胞に接すると、蛍光基部分が化合物から分離し、蛍光基部分が細胞外小胞の成分と共有結合したためと考えられること。なお、蛍光基の構造から見て、分離した蛍光基は細胞外小胞の表面のリシンのアミノ基と共有結合したと考えられる。
（２）ゲル濾過とプレートレーダーの相関関係について
特許文献１において、ＧＩＦ―２２５０を用いることで、プレートリーダーにより、細胞外小胞を定量できることが記載されている。ＧＩＦ－２２５０を用いたプレートリーダーによる細胞外小胞の検出と、実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６を用いたゲル濾過による細胞外小胞の検出の相関関係について調べた。
特許文献１において、ＧＩＦ―２２５０を用いることで、プレートリーダーにより、細胞外小胞を定量できることが記載されている。ＧＩＦ－２２５０を用いたプレートリーダーによる細胞外小胞の検出と、実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６を用いたゲル濾過による細胞外小胞の検出の相関関係について調べた。
低温殺菌牛乳（タカナシ）を６０、７０、８０℃で３０分加温し、室温へ戻した。その後、実施例１０に記載の手順により細胞外小胞を調整し、実施例１で合成したＧＩＦ－２２７６の最終濃度が１μＭとなるように添加することで細胞外小胞をラベル化した。高速液体クロマトグラフィーゲル濾過システムで解析し、ピークの面積を求めた。同様に、調整した細胞外小胞を３μＭのＧＩＦ－２２５０と反応させ、蛍光プレートリーダーで蛍光量を求めた。それぞれの値をプロットし、相関を求めた。
図９に結果を示す。ＧＩＦ－２２７６のゲル濾過解析によるピーク面積とＧＩＦ－２２５０の蛍光強度に高い相関が検出された。図示は省略するが、ＧＩＦ－２２７６はプレートリーダーでも細胞外小胞を定量できた。したがって、ＧＩＦ－２２７６は、プレートリーダーおよびゲル濾過の何れの方法でも、細胞外小胞の品質管理に利用できる。ゲル濾過解析では、サイズの大きさからもエクソソームの品質管理（壊れていないか）を確認できる。したがって、本出願で開示する化合物は、プレートリーダーおよびゲル濾過の何れの方法にも用いることができるので、細胞外小胞の分析目的に応じて使用方法を選択できるという効果を有する。
＜実施例１８：牛乳の鮮度の測定＞
ＧＩＦ－２２７６を用い、消費期限を０日として、消費期限前と消費期限経過後の鮮度が異なる牛乳に含まれる細胞外小胞の分析を行った。鮮度が異なる牛乳をサンプルとして用いた以外は、実施例１０と同様の手順で実験を行った。
ＧＩＦ－２２７６を用い、消費期限を０日として、消費期限前と消費期限経過後の鮮度が異なる牛乳に含まれる細胞外小胞の分析を行った。鮮度が異なる牛乳をサンプルとして用いた以外は、実施例１０と同様の手順で実験を行った。
図１０に結果を示す。図１０から明らかなように、牛乳の鮮度に応じて測定した細胞外小胞の量が変わることを確認した。したがって、本出願で開示する化合物は、食品の鮮度の測定に使用できることを確認した。
細胞外小胞の定量・定性に利用できる。したがって、細胞外小胞の定量が求められる食品、医療産業等にとって有用である。
Claims (14)
- 下記式（１）で表される化合物。
（式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。Ｚは、Ｃ、Ｏ、Ｎからなる群から選択した元素で構成された鎖分子が０～１２個結合したリンカーを表し、鎖分子は環状構造または分岐鎖を含んでもよい。） - 式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、
請求項１に記載の化合物。
（式（２）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ａは０または１を表し、ｂは１、２または３を表す。ＹはＣ1－Ｃ５のアルキル基、下記式（２ａ）で表されるエーテル鎖、下記式（２ｂ）で表されるアミドを含むエーテル鎖、または、下記式（２ｃ）で表されるトリアゾール、を表す。
式（２ａ）のｎ１は、１～３の整数を表す。式（２ｂ）のｎ２は、１～３の整数を表す。式（２ｃ）のｎ３は０～６の整数を表し、ｎ４は０～３の整数を表す。) - 式（１）で表される化合物が、下記式（３）で表される化合物である、
請求項１に記載の化合物。
（式（３）中、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｎは０～３の整数を表す。） - 請求項１に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。 - 請求項２に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。 - 請求項３に記載の化合物を含む、
細胞外小胞染色剤。 - さらに、他の蛍光化合物を含む、
請求項４に記載の細胞外小胞染色剤。 - 請求項１～請求項３に記載の化合物および請求項４～請求項６に記載の細胞外小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞外小胞を染色する染色工程と、
試料中の染色された細胞外小胞を検出する検出工程と、を含む、
細胞外小胞の蛍光染色方法。 - 検出工程後に、試料を評価する評価工程を含む、
請求項８に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。 - 試料が化粧品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞外小胞を測定して化粧品を評価する、
請求項９に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。 - 試料が医薬品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞外小胞を測定して医薬品を評価する、
請求項９に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。 - 試料が細胞を含み、
細胞内の細胞外小胞を測定して細胞の状態を評価する、
請求項９に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。 - 試料が食品または飲料を含み、
食品内または飲料内の細胞外小胞を測定して食品または飲料を評価する、
請求項９に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。 - 試料が生体から採取された生体組織を含み、
採取された生体組織中の細胞外小胞を測定して生体組織を評価する、
請求項９に記載の細胞外小胞の蛍光染色方法。
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|---|---|---|---|
| JP2022141909 | 2022-09-07 | ||
| JP2022-141909 | 2022-09-07 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/028846 WO2024053316A1 (ja) | 2022-09-07 | 2023-08-08 | 化合物、細胞外小胞染色剤、および、細胞外小胞の蛍光染色方法 |
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|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022163446A1 (ja) * | 2021-01-28 | 2022-08-04 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 化合物、細胞性小胞染色剤および細胞性小胞の蛍光染色方法 |
-
2023
- 2023-08-08 WO PCT/JP2023/028846 patent/WO2024053316A1/ja unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022163446A1 (ja) * | 2021-01-28 | 2022-08-04 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 化合物、細胞性小胞染色剤および細胞性小胞の蛍光染色方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAMAGUCHI, TAKAO ET AL.: "Turn-ON fluorescent affinity labeling using a small bifunctional O-nitrobenzoxadiazole unit", CHEMICAL SCIENCE, vol. 5, no. 3, 2014, pages 1021 - 1029, XP093079913, DOI: 10.1039/ C3SC52704B * |
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