WO2024035104A1 - 세포-dna 하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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WO2024035104A1
WO2024035104A1 PCT/KR2023/011733 KR2023011733W WO2024035104A1 WO 2024035104 A1 WO2024035104 A1 WO 2024035104A1 KR 2023011733 W KR2023011733 W KR 2023011733W WO 2024035104 A1 WO2024035104 A1 WO 2024035104A1
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WO
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cell
cells
dna hydrogel
dna
functional group
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PCT/KR2023/011733
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Inventor
이종범
남향수
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주식회사 인스바이오팜
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to hydrogels.
  • Hydrogel is a physically or chemically cross-linked hydrophilic polymer matrix that has properties similar to living tissue, such as high moisture content, flexibility, and elasticity, so it is widely used as a material for tissue engineering and drug delivery in the biopharmaceutical field. there is.
  • the purpose of the present invention is to provide a cell-DNA hydrogel complex with excellent biocompatibility and tissue regeneration effect.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for producing a cell-DNA hydrogel complex with excellent biocompatibility and tissue regeneration effect.
  • a cell-DNA hydrogel complex comprising a DNA hydrogel containing nucleotides into which a second functional group is introduced, wherein the cells and the DNA hydrogel are connected by a bond between the first functional group and the second functional group.
  • the first functional group is an azide group
  • the second functional group is BCN, DBCO, DIFO, DIFO2, DIFO3, DIBO, BARAC, OCT, thiaOCT, ALO, MOFO, DIMAC, TMDIBO, COMBO,
  • a cell-DNA hydrogel complex selected from the group consisting of PYRROC, DIBAC, TMTH, Sondheimer diyne, S-DIBO, DIFBO and thiaDIFBO.
  • the cells include stem cells, vascular endothelial cells, osteocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, muscle cells, epidermal cells, fibroblasts, nerve cells, hepatocytes, enterocytes, gastric cells, skin cells, and fat.
  • a cell-DNA hydrogel complex which is at least one selected from the group consisting of cells, blood cells, and immune cells.
  • composition for tissue regeneration comprising the cell-DNA hydrogel complex of any one of items 1 to 4 above.
  • the first functional group is an azide group
  • the second functional group is BCN, DBCO, DIFO, DIFO2, DIFO3, DIBO, BARAC, OCT, thiaOCT, ALO, MOFO, DIMAC, TMDIBO, COMBO,
  • a method for producing a cell-DNA hydrogel complex which is any one selected from the group consisting of PYRROC, DIBAC, TMTH, Sondheimer diyne, S-DIBO, DIFBO and thiaDIFBO.
  • the cells include stem cells, vascular endothelial cells, osteocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, muscle cells, epidermal cells, fibroblasts, nerve cells, hepatocytes, enterocytes, gastric cells, skin cells, and fat.
  • a method of producing a cell-DNA hydrogel complex which is at least one selected from the group consisting of cells, blood cells, and immune cells.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention has soft mechanical properties and does not damage cells.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention promotes cell migration and angiogenesis at the wound site.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention has excellent biocompatibility and tissue regeneration effects.
  • Figure 1 schematically shows the and each configuration of the cell-DNA hydrogel complex.
  • (a) shows the process of introducing azide into cells so that azide protrudes from the cell surface.
  • (b) shows the manufacturing process of DNA hydrogel containing nucleotides substituted with DBCO.
  • (c) synthesizes a cell-DNA hydrogel complex by inducing a click chemical reaction between cells with azide protruding on the surface and DNA hydrogel containing nucleotides substituted with DBCO (5-DBCO-PEG 4 -dCTP). It represents the process.
  • Cell-DNA hydrogel complex (rCDH) has a uniform, high-density distribution throughout the structure.
  • (d) shows the wound healing process after injection of cell-DNA hydrogel complex (rCDH). The cell-DNA hydrogel complex promotes cell migration and angiogenesis to the wound site.
  • Figure 2 shows the results of an experiment confirming whether azide was successfully protruded onto the cell surface in HT29 cells cultured by treatment with Ac 4 ManNAz.
  • Figure 3 shows a microscale DNA hydrogel (DNA microscaffold) into which DBCO was introduced, a mixture of microscale DNA hydrogel into which DBCO was introduced and cells without azide, and a microscaffold into which DBCO was introduced. It shows a digital image of the cell-DNA hydrogel complex formed by combining DNA hydrogel and azide-introduced cells (AzPC).
  • AzPC azide-introduced cells
  • rCDH pseudo-colored SEM images of cell-DNA hydrogel complex
  • rCDH pseudo-colored SEM images of cell-DNA hydrogel complex
  • CDH is a DNA hydrogel reacted by mixing unpulverized DBCO-incorporated DNA hydrogel and azide-introduced cells
  • rCDH is a mixture of pulverized DBCO-incorporated DNA hydrogel and azide-introduced cells. It is a cell-DNA hydrogel complex that has been reacted and then reconstituted.
  • (d) shows fluorescence images of CDH and rCDH. It can be seen that AzPC stained with tubulin (green) is widely distributed in rCDH.
  • e shows the cell encapsulation efficiency of CDH and rCDH.
  • f shows cell viability in Control, CDH, or rCDH.
  • Control is a DNA hydrogel that is a mixture of DNA hydrogel without DBCO and cells without azide.
  • (h) shows the storage modulus (G') and loss modulus (G") of CDH and rCDH at 10 rad s -1.
  • (i) represents the number of bound (encapsulated) cells per volume of the cell-DNA hydrogel complex. p-values are determined by Dunnett's post hoc test (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001, ns not significant) calculated using one-way analysis of variance.
  • Figure 4(a) shows the cell density profile over time in the presence of a serum stability enhancer (histone).
  • (b) shows the results of proliferation of cells (AzPC) with azide protruding on the surface of the cell-hydrogel complex (rCDH) under serum-free conditions.
  • (c) shows the change in mechanical properties of cell-hydrogel complex (rCDH) in 10% serum from 0 to 48 hours.
  • (d) shows a cell-DNA hydrogel complex in which two types of cells (HDF (red) and HUVEC (green)) with azide protruding on the surface are combined.
  • (e) shows a comparison of the mechanical properties of a cell-DNA hydrogel complex with one type of cell (Mono-) and a cell-DNA hydrogel complex with two types of cells (Co-).
  • (f) shows a 3D confocal image (DNA: red (Cy5), living cells: green (Calcein-AM)) of the cell-DNA hydrogel complex injected into the capillary.
  • (g) shows the results of wound scratch analysis after processing the cell-DNA hydrogel complex. In the control group, no treatment was applied to the wound area. After treatment with the cell-DNA hydrogel complex, the movement of HDF was promoted, and the wound closure rate after 24 hours was significantly higher in the cell-DNA hydrogel complex treatment group compared to the control group.
  • Figure 5(a) shows a cell-DNA hydrogel complex flowing through a 31G syringe needle (top) and a cell-DNA hydrogel complex injected into a star-shaped mold (bottom).
  • (b) is a mouse liver perforation wound model (top) and a digital image of a portion of the liver wound (bottom).
  • (c) is an IVIS image immediately after injection of cy5-labeled cell-DNA hydrogel complex into the liver wound area and excised liver of a mouse.
  • (d) schematically shows the skin tissue regeneration process after injection of the cell-DNA hydrogel complex.
  • Figure 6 shows the change in size of DNA hydrogel before and after sonication.
  • the distribution of DBCO was confirmed through fluorescence after binding cy5-labeled azide using a click reaction.
  • Figure 7 shows the process in which DNA hydrogel is dehydrated in ethanol and rehydrated in water.
  • (b) shows the relative volumes of DNA hydrogel in water and ethanol.
  • (c) shows digital and SEM images of DNA hydrogel in water and ethanol.
  • (d) shows the fluorescence image of the cy5-labeled DNA hydrogel (left) and after pulverizing it (right).
  • (e) shows the diameter distribution of DNA hydrogel ground in ethanol and water. The diameter distribution was analyzed with ImageJ software based on fluorescence images.
  • Figure 8 shows fluorescence images of HDF and HUVEC cells treated with Ac4ManNAz (20 ⁇ M) and 72 hours later, after treatment with cy5-DBCO.
  • the red fluorescence signal expressed only in Ac 4 ManNAz-treated cells indicates successful introduction of azide in both cell types.
  • Figure 9 shows the change in shape of DNA hydrogel according to histone concentration (top: digital image and bottom: SEM image).
  • (b) shows the results of oscillation amplitude sweep analysis sweep analysis of the storage modulus (G') and loss modulus (G") of DNA hydrogel according to histone concentration.
  • (c) shows histone concentration and time in the presence of 10% serum. Shows the decomposition results of rCDH according to changes.
  • (d) Shows the storage modulus (G') and loss modulus (G") according to the angular frequency of rCDH with (+) and without (-) histones (25°C).
  • Figure 10 shows digital images of rCDH molded on the lid of a microcentrifuge tube showing the shape memory capacity of rCDH after dehydration and rehydration. GelRed staining reveals DNA as the structural backbone of the hydrogel.
  • the present invention relates to a cell-DNA hydrogel complex in which cells are linked to a DNA hydrogel.
  • 'DNA microscaffold' 'DNA microscaffold'
  • 'DNA microscaf' refer to a DNA hydrogel with a diameter of 1 ⁇ m to 1 mm.
  • the present invention relates to a cell having a first functional group protruding from the surface; It provides a cell-DNA hydrogel complex, comprising a DNA hydrogel containing nucleotides into which a second functional group is introduced, wherein the cells and the DNA hydrogel are connected by a bond between the first functional group and the second functional group.
  • the above cells are not limited as long as they are cells that can be used for tissue regeneration of nerves, muscles, bones, cartilage, blood vessels, teeth, skin, fat, organs, etc., such as stem cells, vascular endothelial cells, osteocytes, cartilage cells, It may be one or more selected from the group consisting of cardiomyocytes, muscle cells, epidermal cells, fibroblasts, nerve cells, hepatocytes, enterocytes, gastric cells, skin cells, adipocytes, blood cells, and immune cells, and the cells are human or It may be a mammalian derived cell.
  • the cell-DNA hydrogel complex may include two or more types of cells, and the cell-DNA in which fibroblasts and vascular endothelial cells into which the first functional group is introduced are each bound to the second functional groups of the DNA hydrogel. It may be a hydrogel composite.
  • the cell in which the first functional group protrudes on the surface is a cell in which the first functional group has been introduced so that the first functional group protrudes on the surface by a known method that does not damage the cell, for example, through sugar metabolism engineering or genetic modification. These are cells into which functional groups have been introduced.
  • the DNA hydrogel containing nucleotides into which the second functional group is introduced is a hydrogel using a DNA polynucleotide as a support, and the second functional group may be directly or indirectly bound to some nucleotide bases of the DNA polynucleotide, , DNA polynucleotides can be synthesized through enzymatic reactions.
  • Synthesis of DNA polynucleotides through enzymatic reactions can be performed by known methods, for example, by rolling circle amplification (RCA). By controlling the size of the synthesized DNA polynucleotide, a DNA hydrogel of the desired size can be obtained.
  • RCA rolling circle amplification
  • 'DNA hydrogel containing a nucleotide into which a second functional group is introduced' can be synthesized by adding a nucleotide into which a second functional group is introduced together with dNTP.
  • the ratio and position of "nucleotides into which a second functional group is introduced" contained in the DNA hydrogel can be adjusted by changing the sequence of the template DNA, through which the first functional group is introduced.
  • the binding efficiency with the cells can be adjusted.
  • the bond between the first functional group and the second functional group may be formed through a streptavidin-biotin binding reaction or a click chemical reaction.
  • the bond between the first functional group and the second functional group is formed through a streptavidin-biotin binding reaction, the first functional group may be streptavidin, and the second functional group may be biotin.
  • Cells with streptavidin protruding on the surface can be obtained through known methods, for example, "Tsai, P.: 'Cell surface streptavidin', IET Synthetic Biology, 2007, 1, (1), p. 32- 35, DOI: 10.1049/iet-stb:20070002.” It can be obtained through the method described in .
  • Biotin-incorporated nucleotides can be obtained through known methods.
  • the nucleotide into which biotin is introduced may be, for example, Biotin-16-dUTP or Biotin11-dUTP.
  • the bond between the first functional group and the second functional group is formed through a click chemical reaction, the first functional group is an azide group, and the second functional group is BCN (bicyclo[6.1.0]nonyne), DBCO (dibenzocyclooctyne), DIFO (difluorinated cyclooctyne), DIFO2, DIFO3, DIBO (dibenzoannulated cyclooctyne), BARAC (biarylazacyclooctynone), OCT (cyclooctyne), thiaOCT, ALO (aryl-less cyclooctyne), MOFO ((monofluorinated cyclooctyne), DIMAC (dimethoxyazacyclooctyne), TMDIBO ( 2,3,6,7-tetramethoxy-DIBO), carboxymethylmonobenzocyclooctyne (COMBO), pyrrolocycloocty
  • Cells with azide groups protruding on the surface can be obtained using sugar metabolic engineering, and more specifically, the cells are labeled with N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac 4 ManNAz), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac 4 GlcNAz), or N-azidoacetylgalactosamine- It may have been obtained by treating and culturing tetraacylated (Ac 4 GaINAz).
  • the nucleotide into which the second functional group is introduced may be, for example, 5-DBCO-PEG 4 -dCTP, 5-DBCO-PEG 4 -dATP, 5-DBCO-PEG 4 -dGTP or 5-DBCO-PEG 4 -dCTP.
  • the size of the DNA hydrogel is 1 ⁇ m to 10 mm, 1 ⁇ m to 1 mm, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, 10 ⁇ m to 10 mm, 10 ⁇ m to 1 mm, 100 ⁇ m to 10 mm, or 100 ⁇ m to 1 mm in diameter.
  • the DNA hydrogel may be synthesized to have the above size, or may be obtained by synthesizing a large chunk of hydrogel and then pulverizing it.
  • the size of the DNA hydrogel exceeds 10 mm, the surface area becomes small and the combined cell attachment efficiency decreases. If the size of the DNA hydrogel is less than 1 ⁇ m, the DNA-hydrogel complex is well formed. It doesn't work.
  • the DNA-hydrogel complex can be obtained by mixing and reacting cells expressing the first functional group with DNA hydrogel containing nucleotides into which the second functional group is introduced, and the reaction temperature and reaction time are adjusted so as not to damage the cells. It can be appropriately selected within the range.
  • the reaction temperature may be, for example, 0°C to 40°C, 10°C to 40°C, or 20°C to 40°C
  • the reaction time may be, for example, 10 minutes to 48 hours, 10 minutes to 24 hours, or 0.5 hours to 48 hours. , 0.5 hours to 24 hours, 0.5 hours to 12 hours, 0.5 hours to 6 hours, or 0.5 hours to 2 hours.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention connects the first functional group introduced into the cell and the second functional group of the DNA hydrogel by binding, so that the cell acts as a cross-linker for the DNA hydrogel and at the same time interacts with surrounding cells. It plays a role in promoting tissue regeneration.
  • the cells in the complex can be maintained for a long period of time, and the cells newly created through cell division also have a first functional group introduced and can combine with the second functional group of the DNA hydrogel, so they can be transplanted. It can promote long-term tissue regeneration until the DNA polynucleotide, which is the support for the cell-DNA hydrogel complex, decomposes at the wound site.
  • the DNA hydrogel of the cell-DNA hydrogel complex of the present invention serves as an extracellular matrix, helping interaction with surrounding cells, and has soft mechanical properties, so it can be implanted anywhere in the body.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention has excellent biocompatibility and, when transplanted in vivo, regenerates tissue by promoting cell migration and angiogenesis to the wound site.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention has excellent biocompatibility, and the DNA polynucleotide as a support is naturally decomposed by DNA degrading enzymes in vivo, so there is no side effect such as accumulation in the body or toxicity.
  • the cell-DNA hydrogel complex of the present invention can return to its original shape due to its shape memory properties even after repeated dehydration and rehydration.
  • the present invention provides a composition for tissue regeneration comprising the above-described cell-DNA hydrogel complex.
  • composition for tissue regeneration containing the cell-DNA hydrogel complex of the present invention can be implanted into damaged tissue.
  • the composition can promote tissue regeneration by inducing cell migration and angiogenesis in the damaged area.
  • the present invention includes the steps of introducing a first functional group into a cell so that the first functional group protrudes from the cell surface; Synthesizing a DNA hydrogel into which a second functional group is introduced; pulverizing the DNA hydrogel; and mixing and culturing the cells and the pulverized DNA hydrogel.
  • the cells, first functional group, second functional group, and DNA hydrogel are as described above.
  • a method of introducing a first functional group into a cell so that it protrudes onto the cell surface may be to treat the cell with a monosaccharide substituted with the first functional group and allow it to protrude onto the cell surface through glycosylation, such as a monosaccharide substituted with azide (e.g., Ac 4 ManNAz, Ac 4 GlcNAz or Ac 4 GaINAz) may be treated with the cells to cause azide to protrude on the cell surface.
  • a monosaccharide substituted with the first functional group such as a monosaccharide substituted with azide (e.g., Ac 4 ManNAz, Ac 4 GlcNAz or Ac 4 GaINAz) may be treated with the cells to cause azide to protrude on the cell surface.
  • the synthesis of the DNA hydrogel into which the second functional group is introduced may be synthesized by a rotational replication method, and more specifically, circular template DNA, DNA polymerase, dNTPs, and dNTPs into which the second functional group is introduced (e.g., 5-DBCO- It may be synthesized by putting PEG 4 -dCTP, 5-DBCO-PEG 4 -dATP, 5-DBCO-PEG 4 -dGTP or 5-DBCO-PEG 4 -dCTP) in a buffer.
  • a rotational replication method and more specifically, circular template DNA, DNA polymerase, dNTPs, and dNTPs into which the second functional group is introduced (e.g., 5-DBCO- It may be synthesized by putting PEG 4 -dCTP, 5-DBCO-PEG 4 -dATP, 5-DBCO-PEG 4 -dGTP or 5-DBCO-PEG 4 -dCTP) in a buffer.
  • the pulverization may be done using ultrasonic pulverization, and the DNA hydrogel is pulverized into a diameter of 1 ⁇ m to 10 mm, 1 ⁇ m to 1 mm, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, 10 ⁇ m to 10 mm, and 10 ⁇ m. It may be ground to a size of from 1 mm, 100 ⁇ m to 10 mm, or 100 ⁇ m to 1 mm.
  • the frequency of the ultrasonic pulverization can be appropriately selected at a level that does not denature the DNA or make the DNA hydrogel excessively small (diameter 1 ⁇ m or more), for example, 5 to 50 kHZ, 10 to 50 kHZ, 10 to 40 kHZ, It may be 10 to 30 kHZ, 15 to 25 kHZ.
  • the ultrasonic pulverization time can be appropriately selected at a level that does not denature the DNA or make the DNA hydrogel excessively small (diameter 1 ⁇ m or more), for example, 1 minute to 6 hours, 1 minute to 3 hours, or 1 minute to 1 hour.
  • the time may be 10 minutes to 6 hours, 10 minutes to 3 hours, 10 minutes to 1 hour, 30 minutes to 6 hours, 30 minutes to 3 hours, or 30 minutes to 1 hour.
  • the reaction temperature and reaction time may be appropriately selected within a range that does not damage the cells.
  • the reaction temperature may be, for example, 0°C to 40°C, 10°C to 40°C, or 20°C to 40°C
  • the reaction time may be, for example, 10 minutes to 48 hours, 10 minutes to 24 hours, or 0.5 hours to 48 hours. , 0.5 hours to 24 hours, 0.5 hours to 12 hours, 0.5 hours to 6 hours, or 0.5 hours to 2 hours.
  • a cell-DNA hydrogel complex in which DNA hydrogel and cells are cross-linked can be obtained.
  • the cells are evenly distributed inside and outside the hydrogel and are fixed by bonding, thereby maintaining the retention power within the hydrogel. This is excellent.
  • the method for producing a cell-DNA hydrogel complex of the present invention may further include the step of dehydrating the DNA hydrogel before pulverizing the DNA hydrogel.
  • Dehydration of the DNA hydrogel may be performed by treating the DNA hydrogel with ethanol.
  • DNA hydrogel can be effectively pulverized by dehydrating it.
  • the step of dehydrating the DNA hydrogel is further included before pulverizing the DNA hydrogel, the step of rehydrating the DNA hydrogel after pulverizing it may be further included.
  • the linear template DNA in Table 2 was hybridized with Primer 1 and ligated, and a very long DNA strand with a repetitive sequence complementary to the circular template DNA was prepared through RCA (Rolling Circle Amplification). Primer 2 was designed to form a robust DNA hydrogel with the complementary sequence of the cloned DNA strand.
  • a 92-base linear template DNA and a 22-base primer 1 were mixed in nuclease-free water to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • the mixture was heated to 95°C for 2 min and slowly cooled to 25°C for 1 h using a thermal cycler (Bio-Rad).
  • a thermal cycler Bio-Rad
  • 0.12U ⁇ L -1 of T4 DNA ligase and ligase buffer (30mM Tris-HCl (pH 7.8), 10mM MgCl 2 , 10mM dithiothreitol (DTT), and 1mM adenosine triphosphate (ATP) was incubated overnight at room temperature, and circular template DNA was obtained.
  • the circular template DNA obtained in the above process was mixed with ⁇ 29 DNA polymerase (0.5U ⁇ L -1 ), dNTP mix (1mM for each base), and 5-DBCO- They were incubated with PEG 4 -dCTP (0.33mM) and 2 ⁇ ⁇ 29 DNA polymerase buffer (100mM Tris-HCl, 20mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 8mM DTT, and 20mM MgCl 2 ) at 30°C for 20 h. And 5- Propargylamino -dCTP-cy5 (0.01mM) was added for fluorescence labeling.
  • DNA hydrogel 200 ⁇ L was exposed to 1.8 mL of ethanol for 30 min at room temperature. After the first contraction of the DNA hydrogel, the supernatant was removed. Afterwards, the DNA hydrogel was added to new ethanol and incubated at room temperature for 30 minutes to induce complete contraction, and the supernatant was removed. Finally, the dehydrated DNA hydrogel was sonicated for 15 minutes to obtain DNA microscaffolds. The resulting DNA microscaffold was pelleted by centrifugation at 6000 rpm for 1 minute, and the DNA microscaffold was rehydrated in 2 mL nuclease-free water for 30 minutes.
  • each sample was fixed and freeze-dried on a silicon wafer and coated with Au or Pt before imaging.
  • the SEM (SNE-3000M, SEC, SEC, Suwon-si, Korea or SU-70, Hitachi, Tokyo, Japan) was operated at 20.0 kV or 15.0 kV.
  • Cell culture samples were washed twice with DPBS.
  • Each sample was then treated with 1 mL 2.5% glutaraldehyde solution for 80 min and washed with 1 mL ddH 2 O for 10 min at room temperature. The supernatant was removed and the washing step was repeated four times. Next, 1 mL of 2% OsO 4 solution was added to the sample for 1.5 hours at 4°C.
  • Cells were cultured at 37°C in a 5% CO 2 atmosphere in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, 100 U/ml penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin. Cells were seeded in 6-well plates at a density of 1 x 10 5 cells/well. After 24 hours, 2 mL of RPMI1640 containing Ac 4 ManNAz (0, 5, 20, and 100 ⁇ M) was added to the plate and incubated for 2 days. Cells were washed twice with DPBS and incubated with DBCO-cy5 (final concentration, 5 ⁇ M) in DPBS for 30 min at 37°C.
  • Azide-presenting cells (1 x 10 6 ) were washed twice with DPBS and centrifuged at 13000 rpm for 3 minutes.
  • the cells used were human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human dermal fibroblasts (HDF).
  • the AzPC pellet was suspended in 100 ⁇ L of the DNA microscaffold of DPBS through gentle pipetting, and a click chemistry reaction was performed between AzPC and a DBCO-modified DNA hydrogel containing nucleotides into which DBCO was introduced. For this purpose, the cells were incubated for 30 minutes in a 5% CO 2 atmosphere at 37°C.
  • the cell-DNA hydrogel complex was washed twice with fresh DPBS, then histones (3 mg/mL) in DPBS were added, and the samples were incubated for 3 hours in a 5% CO 2 atmosphere at 37°C.
  • cells (7 x 10 3 cells/well) were seeded in 96-well plates and analyzed using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. Cells were treated with various types of DNA hydrogels for 24 hours in serum-free medium.
  • CCK-8 analysis was accomplished through the following steps: addition of CCK-8 solution, incubation at 37°C for 1 hour and 30 minutes, and measurement of absorbance at 450 nm. Each step was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Cells were stained with 5 ⁇ M Calcein-AM and washed twice with DPBS before imaging via confocal microscopy.
  • rCDH was treated with DNase I at 37°C for 6 hours. The cells were then washed twice with DPBS, centrifuged, resuspended, and counted using a hemocytometer.
  • the cell-DNA hydrogel complex was transferred into a syringe and extruded into a capillary using a 31-gauge needle. The cell-DNA hydrogel complex was observed by confocal microscopy, and 3D images of capillaries injected into rCDH were reconstructed using IMARIS imaging software.
  • HUVECs and HDFs were harvested by trypsinization and mixed with crushed cell-DNA hydrogel complexes. After linking the cells to the DNA microscaffold via click chemistry, HUVECs were labeled with Calcein-AM (5 ⁇ M) and HDF cells were labeled with Calcein RedTM AM (5 ⁇ M).
  • rCDH was incubated with histones (3 mg/mL) in DPBS for 3 h at 37°C. rCDH was then washed with DPBS and analyzed by confocal microscopy.
  • HDFs were seeded on Scar Block at a density of 6 ⁇ 10 4 cells/well. After culturing overnight, the Scar Block was removed and the medium was replaced with serum-free medium. Then, the cell-DNA hydrogel complex was added to the hanging well. Images of the wound area were taken using an inverted fluorescence microscope (Eclipse Ti-U, Nikon, Japan) at 0, 24, and 48 hours after wounding. Wound areas were analyzed using ImageJ software. HUVECs were cultured on Matrigel-coated cell culture plates at a density of 3 x 10 4 cells/well in 24-well plates. After 24 hours, co-cultures with rCDH were inserted into transwells and the angiogenic effect was observed over time. Angiogenic effects were analyzed using ImageJ software.
  • Nude mice male, 4 weeks old were purchased from Nara Biotech (Seoul, Korea) as a wound healing model. The abdomen of the mouse was incised, and a circular puncture wound was made in the liver with a biopsy punch (8 mm). For in vivo fluorescence imaging, Cy5-labeled cell-DNA hydrogel complexes were injected into mouse wounds.
  • the cell-DNA hydrogel complex contained 2 ⁇ 10 6 each of HDFs and HUVECs.
  • IVIS in vivo imaging system
  • mice were anesthetized and the midportion of the back skin was anesthetized using a 6 mm sterile biopsy punch.
  • the wound was fixed with a 0.5 mm silicone mold using instant adhesive.
  • cells were treated with a volume of 200 ⁇ L of cell-DNA hydrogel complex (containing 2 x 10 6 each of HDF and HUVEC). Wound images were taken using a digital camera.
  • the wound area was covered with sterile Tegaderm and tied with an elastic bandage. The area of each wound was measured using ImageJ software to calculate the percentage of wound area.
  • HT29 cells were treated with Ac4ManNAz. Afterwards, a fast click response was induced using cyanine 5-labeled DBCO (cy5-DBCO). As the Ac4ManNAz concentration increased, the fluorescence signal of cy5 increased proportionally, indicating that azide was successfully introduced into the cells and a click chemical reaction with cy5-DBCO was achieved ( Figure 2a). DAPI (blue) indicates nuclei ( Figure 2 a, b, d). The Ac4ManNAz concentration was set at 20 ⁇ M for further studies to maximize the number of azide groups displayed on the cell surface while minimizing cytotoxicity and morphological changes.
  • cy5-DBCO cyanine 5-labeled DBCO
  • a DBCO-introduced DNA hydrogel with a diameter of 1 centimeter (cm) was synthesized using the Rolling Circle Amplification (RCA) technique.
  • the DNA hydrogel was pulverized to a size of 1 ⁇ m to 1 mm in diameter and observed with a scanning electron microscope (SEM) (Figure 2e).
  • SEM scanning electron microscope
  • Figure 2e The DNA hydrogel exhibited a rough surface at the microscale, and this rough surface morphology may promote effective docking of cells. Additionally, the DNA hydrogel exhibited very soft mechanical properties (Figure 2f).
  • DBCO was introduced into the DNA hydrogel by adding DBCO-bound dNTPs and unmodified dNTPs together during the enzymatic reaction to synthesize the DNA hydrogel.
  • the position and density of DBCO introduced into the DNA hydrogel can be controlled by controlling the sequence of the template DNA and selecting the type of nucleotide bound to DBCO. , through which the binding efficiency with cells can be adjusted.
  • Successful introduction of DBCO into the DNA hydrogel was confirmed through cy5-azide modification of the DNA hydrogel through click chemistry ( Figure 2g).
  • AzPC was specifically bound to the DBCO-introduced DNA hydrogel through click chemistry, whereas the DNA hydrogel (CDH) without DBCO was simply captured by AzPC without binding to AzPC. showed that they were doing it.
  • the 3D reconstructed image further confirmed the successful encapsulation of AzPC throughout the DBCO-incorporated DNA hydrogel (Figure 2i).
  • the DBCO-introduced DNA hydrogel was pulverized to a size of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m through ultrasonic pulverization while minimizing the effect on chemical or thermal destruction of the structure (FIG. 6).
  • the DNA hydrogel was dehydrated ( Figure 7). Dehydrated pulverized DNA hydrogel can completely recover its original shape due to the swelling behavior of DNA hydrogel in the presence of water.
  • the rehydrated DBCO-incorporated DNA hydrogel was mixed with cells with azide protruding on the surface (AzPC) ( Figure 3a). Within 30 minutes, a cell-DNA hydrogel complex was formed through chemical networking. On the other hand, when cells and DNA hydrogel without azide were mixed, cell-DNA hydrogel complexes were not formed.
  • Reconstituted cell-DNA hydrogel complex showed uniform distribution of cells throughout the structure, not only on the surface but also on the inside ( Figure 3d).
  • rCDH increased the cell encapsulation efficiency by more than two-fold, resulting in a significantly higher number of cells than the CDH system ( Figure 3e). Nevertheless, cells remained viable in both cases ( Figure 3f).
  • Dynamic modulus evaluation showed that both CDH and rCDH exhibit very soft gel-like behavior (G > G" in the G' range of 1-20 Pa, Figure 3g), especially for the incorporation of mammalian cells into the hydrogel.
  • Cell-DNA hydrogel complexes are beneficial for wound healing because cell-cell interactions and cell maintenance at the wound site are important factors in effective regeneration of the wound site. Additionally, the cell-DNA hydrogel complex can be combined with two or more types of cells, making it suitable for cell co-culture.
  • click chemistry-capable human dermal fibroblasts (HDF) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were co-cultured. These two cell types were selected to evaluate their cell migration and angiogenic abilities, which are important processes in the proliferative phase of wound healing.
  • the cell-DNA hydrogel complex combining HDF and HUVEC cells significantly improved in vitro cell migration in scratch wounds. Wound closure increased two-fold over 48 hours when treated with cell-DNA hydrogel complexes combining HDF and HUVEC cells, suggesting that intercellular communication led to improved wound healing speed.
  • the ability to increase angiogenesis was also assessed through an in vitro tube formation assay on HUVEC ( Figure 4h). The group treated with cell-DNA hydrogel complex had a 1.7-fold increase in total tube branch length.
  • the cell-DNA hydrogel complex is viscoelastic and can be injected with a hypodermic needle (31G; ⁇ int. 0.9-1 mm). Additionally, the highly flexible cell-DNA hydrogel complex can adapt to the complex surrounding space after injection (Figure 5a). In particular, the cell-DNA hydrogel complex exhibits shape memory properties even after repeated dehydration and rehydration, so it can be easily operated with minimal possibility of deformation (Figure 10).
  • the function of the cell-DNA hydrogel complex developed through in vivo research was expanded to enable injection into a specific space, and the adaptability of the injectable cell-DNA hydrogel complex was confirmed in a normal mouse liver perforation wound model (Figure 5) b).
  • the DNA hydrogel promoted tissue regeneration, it showed a lower tissue regeneration promotion effect than the cell-DNA hydrogel complex combined with HUVEC and HDF.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • Collagen deposition was confirmed through Masson's trichrome (MT) staining, and it was confirmed that the outline of the collagen layer was increased in the group treated with the cell-DNA hydrogel complex combined with HUVEC and HDF ( Figure 5g).
  • the cell-DNA hydrogel complex was confirmed to rapidly regenerate damaged tissues by promoting angiogenesis, cell proliferation and migration, serving as an effective platform for intercellular communication along with direct delivery of therapeutic cells.

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Abstract

본 발명은 세포-DNA 하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 제1 작용기가 표면에 돌출된 세포와 제2 작용기가 도입된 DNA 하이드로젤을 결합으로 연결시켜 세포-DNA 하이드로젤 복합체 내 세포의 유지력이 뛰어나다. 본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 상처 부위의 세포이동(cellmigration) 및 혈관신생(angiogenesis)을 유도함으로써, 손상된 조직의 재생을 촉진할 수 있다.

Description

세포-DNA 하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법
본 발명은 하이드로젤에 관한 것이다.
하이드로젤은 물리적 또는 화학적으로 가교결합된 친수성의 고분자 매트릭스로, 높은 수분함량, 유연성, 탄력성 등 살아있는 조직과 유사한 성질을 지닌다는 면에서 바이오의약 분야의 조직공학 및 약물전달의 소재로 다양하게 응용되고 있다.
한편, 조직 재생에 이용되는 세포가 캡슐화된 하이드로젤의 경우 세포가 하이드로젤에서 빠져나오기 쉬워 세포가 잘 유지되지 않고 이로 인해 조직 재생효과가 떨어지는 문제점이 있으며, 세포유지력을 증가시키기 위해 하이드로젤 지지체에 여러 화학물질을 첨가하는 경우 세포독성을 일으키는 문제점이 있다.
(선행특허문헌)
한국공개특허 제 10-2022-0063135호
본 발명은 생체적합성 및 조직재생효과가 우수한 세포-DNA하이드로젤 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 생체적합성 및 조직재생효과가 우수한 세포-DNA하이드로젤 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 제1 작용기가 표면에 돌출된 세포 및;
제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드가 포함된 DNA 하이드로젤을 포함하고, 상기 세포 및 상기 DNA 하이드로젤은 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 결합으로 연결된 것인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1 작용기와 제2 작용기의 결합은 스트렙타비딘-바이오틴 결합 반응 또는 클릭화학반응으로 형성된, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
3. 위 1에 있어서, 상기 제1 작용기는 아자이드기이고, 상기 제2 작용기는 BCN, DBCO, DIFO, DIFO2, DIFO3, DIBO, BARAC, OCT, thiaOCT, ALO, MOFO, DIMAC, TMDIBO, COMBO, PYRROC, DIBAC, TMTH, Sondheimer diyne, S-DIBO, DIFBO 및 thiaDIFBO로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
4. 위 1에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 혈관내피세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포 및 면역세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 포함하는 조직 재생용 조성물.
6. 제1 작용기가 세포 표면에 돌출되도록 세포에 제1 작용기를 도입하는 단계; 제2 작용기가 도입된 DNA 하이드로젤을 합성하는 단계;
상기 DNA 하이드로젤을 직경 1 μm 내지 1 mm 크기로 분쇄하는 단계; 및 상기 세포 및 상기 분쇄된 DNA 하이드로젤을 혼합 배양하는 단계를 포함하는 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 제1 작용기는 아자이드기이고, 상기 제2 작용기는 BCN, DBCO, DIFO, DIFO2, DIFO3, DIBO, BARAC, OCT, thiaOCT, ALO, MOFO, DIMAC, TMDIBO, COMBO, PYRROC, DIBAC, TMTH, Sondheimer diyne, S-DIBO, DIFBO 및 thiaDIFBO로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
8. 위 6에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 혈관내피세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포 및 면역세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
9. 위 6에 있어서, 상기 DNA 하이드로젤의 분쇄는 초음파 분쇄인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
10. 위 6에 있어서, 상기 DNA 하이드로젤의 분쇄 전에 DNA 하이드로젤을 탈수시키는 단계를 더 포함하는, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 부드러운 기계적 특성을 가져 세포에 손상을 주지 않는다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 상처 부위의 세포이동(cell migration) 및 혈관신생(angiogenesis)을 촉진한다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 생체 적합성 및 조직재생효과가 우수하다.
도 1은 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 및 각 구성을 개략적으로 나타낸다. (a)는 세포 표면에 아자이드가 돌출되도록 아자이드를 세포에 도입하는 과정을 나타낸다. (b)는 DBCO로 치환된 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 하이드로젤의 제조과정을 나타낸다. (c)는 아자이드가 표면에 돌출된 세포와 DBCO로 치환된 뉴클레오티드(5-DBCO-PEG4-dCTP)가 포함된 DNA 하이드로젤의 클릭화학반응을 유도해 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 합성하는 과정을 나타낸다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체(rCDH)는 구조 전체에 균일한 고밀도 분포를 가지고 있다. (d)는 세포-DNA 하이드로젤 복합체(rCDH) 주사 후 상처치유 과정을 나타낸다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 상처부위로의 세포 이동과 혈관신생을 촉진한다.
도 2는 Ac4ManNAz를 처리하여 배양한 HT29 세포에서 아자이드가 성공적으로 세포 표면에 돌출되었는지 여부를 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 3의 (a)는 DBCO가 도입된 미세크기의 DNA 하이드로젤(DNA microscaffold), DBCO가 도입된 미세크기의 DNA 하이드로젤과 아자이드가 도입되지 않은 세포의 혼합물, 그리고 DBCO가 도입된 미세크기의 DNA 하이드로젤과 아자이드가 도입된 세포(AzPC)가 결합되어 형성된 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 디지털 이미지를 나타낸다. (b) 및 (c)는 세포-DNA 하이드로젤 복합체(rCDH)의 Pseudo-colored SEM 이미지를 나타낸다. 구조 전체에 AzPC(자홍색)가 고르게 분포되어 있음을 나다. (d) 내지 (h)에서 CDH는 분쇄되지 않은 DBCO 도입 DNA 하이드로젤과 아자이드 도입 세포를 혼합하여 반응시킨 DNA 하이드로젤이며, rCDH는 분쇄된 DBCO 도입 DNA 하이드로젤과 아자이드 도입 세포를 혼합하여 반응시킨 후 다시 재구성한 세포-DNA 하이드로젤 복합체이다. (d)는 CDH 및 rCDH의 형광이미지를 나타낸다. 튜불린(녹색)으로 염색된 AzPC가 rCDH에 많이 분포함을 알 수 있다. (e)는 CDH 및 rCDH의 세포 캡슐화 효율을 나타낸다. (f)는 Control(대조군), CDH 또는 rCDH에서의 세포 생존력을 나타낸다. Control은 DBCO가 도입되지 않은 DNA 하이드로젤과 아자이드가 도입되지 않은 세포를 혼합한 DNA 하이드로젤이다. (g)는 CDH와 rCDH의 각진동수에 따른( = 1%, 25℃) 저장 탄성률 (G') 및 and 손실 탄성률 (G")을 나타낸다. (h)는 CDH와 rCDH의 10 rad s-1에서의 Tanδ을 나타낸다. (i)는 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 부피 별 결합되어 있는(캡슐화된) 세포 수를 나타낸다. p-값은 Dunnett의 사후 검정(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s. 유의하지 않음)과 함께 일원 분산 분석을 통해 계산되었다.
도 4의 (a)는 혈청 안정성 향상제(히스톤) 존재 하에 시간 경과에 따른 세포 밀도 프로파일을 나타낸다. (b)는 혈청 없는 조건에서 세포-하이드로젤 복합체(rCDH) 내부 아자이드가 표면에 돌출된 세포(AzPC)의 증식결과를 나타낸다. (c)는 0시간에서 48시간까지 10% 혈청에서 세포-하이드로젤 복합체(rCDH)의 기계적 특성 변화를 나타낸다. (d)는 아자이드가 표면에 돌출된 2종류의 세포(HDF(빨간색) 및 HUVEC(녹색))가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 나타낸다. (e)는 1종류 세포가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체(Mono-)와 2 종류 세포가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체(Co-)의 기계적 특성 비교를 나타낸다. (f)는 모세관에 주입된 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 3D 공초점 이미지(DNA: 적색(Cy5), 살아있는 세포: 녹색(Calcein-AM))를 나타낸다. (g)는 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 처리한 후의 상처 스크래치 분석 결과를 나타낸다. 대조군(Control)은 상처 부위에 아무런 처리를 하지 않았다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체 처리 후 HDF의 이동이 촉진되어, 24시간 후 상처 봉합율이 대조군과 비교했을 때 세포-DNA 하이드로젤 복합체 처리군에서 현저하게 높았다. (h)는 세포-DNA 하이드로젤 복합체가 처리된 Matrigel에서 HUVEC에 대한 튜브 형성 분석결과를 나타낸다. 대조군(Control)은 상처 부위에 아무런 처리를 하지 않았다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체 처리 후 혈관 신생이 증가되었다. P-값은 Dunnett의 사후 검정(*p <0.05)과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 계산되었다.
도 5의 (a)는 31G 주사기바늘을 통해 흐르는 세포-DNA 하이드로젤 복합체(상단) 및, 별 모양의 몰드에 주입된 세포-DNA 하이드로젤 복합체 (하단)를 나타낸다. (b)는 마우스 간 천공 상처모델(상단) 및 간 상처 일부의 디지털 이미지(하단)이다. (c)는 마우스의 간 상처 부위 및 절제된 간에 cy5-표지된 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 주사한 직후의 IVIS 이미지이다. (d)는 세포-DNA 하이드로젤 복합체 주사 후 피부 조직 재생 과정을 개략적으로 나타낸다. (e)는 PBS, 세포가 결합되지 않은 DNA 하이드로젤(DNA hydrogel) 및 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 국소 주사 후의 생체 내 상처 봉합 변화 및 상처 봉합율(%)을 정량화한 그래프를 나타낸다(n=4; *p<0.05).
도 6은 초음파 처리 전후의 DNA 하이드로젤의 크기 변화를 나타낸다. DBCO의 분포는 cy5 표지된 azide를 클릭 반응을 이용해 결합시킨 후 형광을 통해 확인하였다.
도 7의 (a)는 DNA 하이드로젤이 에탄올에서 탈수가 일어나고 물에서 재수화가 일어나는 과정을 나타낸다. (b)는 물과 에탄올에서 DNA 하이드로젤의 상대적 부피를 나타낸다. (c)는 물과 에탄올에서 DNA 하이드로젤의 디지털 및 SEM 이미지를 나타낸다. (d)는 cy5가 표지된 DNA 하이드로젤(좌측)과 이를 분쇄한 후(우측)의 형광 이미지를 나타낸다. (e)는 에탄올과 물에서 분쇄된 DNA 하이드로젤의 직경 분포를 나타낸다. 직경 분포는 형광 이미지를 기반으로 하는 ImageJ 소프트웨어로 분석되었다.
도 8은 HDF 및 HUVEC 세포에 Ac4ManNAz를 처리(20μM)하고 72시간 후, cy5-DBCO를 처리 후의 형광 이미지를 나타낸다. Ac4ManNAz 처리된 세포에서만 발현되는 적색 형광 신호를 통해 두 세포 유형 모두에서 아자이드가 성공적으로 도입되었음을 알 수 있다.
도 9의 (a)는 DNA 하이드로젤의 히스톤 농도에 따른 형태 변화(상단: 디지털 이미지 및 하단: SEM 이미지)를 나타낸다. (b)는 히스톤 농도에 따른 DNA 하이드로젤의 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")에 대한 Oscillation amplitude sweep analysis 스윕 분석결과를 나타낸다. (c)는 10% 혈청 존재 하에서 히스톤 농도 및 시간 변화에 따른 rCDH의 분해 결과를 나타낸다. (d) 히스톤이 있거나(+) 없는(-) rCDH의 각진동수에 따른 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")을 나타낸다(25℃).
도 10은 탈수 및 재수화 후 rCDH의 형상 기억 용량을 보여주는 미세 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 성형된 rCDH의 디지털 이미지를 나타낸다. GelRed 염색은 DNA를 하이드로젤의 구조적 백본으로 나타낸다.
본 발명은 DNA 하이드로젤에 세포가 결합으로 연결된 세포-DNA 하이드로젤 복합체에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 'DNA 마이크로스캐폴드', 'DNA microscaffold' 및 'DNA microscaf'는 상호교환적으로 사용되며, 직경 1μm 내지 1mm 크기의 DNA 하이드로젤을 의미한다.
본 발명은 제1 작용기가 표면에 돌출된 세포 및; 제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드가 포함된 DNA 하이드로젤을 포함하고, 상기 세포 및 상기 DNA 하이드로젤은 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 결합으로 연결된 것인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 제공한다.
상기　세포는 신경, 근육, 뼈, 연골, 혈관, 치아, 피부, 지방, 장기, 등의 조직재생에 이용될 수 있는 세포이면 제한되지 않으며, 예컨대 줄기세포, 혈관내피세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포 및 면역세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 세포들은 사람 또는 포유류 유래 세포일 수 있다. 예컨대 상기 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 2 종류 이상의 세포를 포함할 수 있으며, 제1 작용기가 도입된 섬유아세포와 혈관내피세포가 각각 DNA 하이드로젤의 제2 작용기들에 결합되어 있는 형태의 세포-DNA 하이드로젤 복합체일 수 있다.
상기 제1 작용기가 표면에 돌출된 세포는 세포를 손상시키지 않는 공지의 방법으로 제1 작용기가 표면에 돌출되도록 제1 작용기를 도입한 세포로, 예를 들면 당대사공학 또는 유전자 변형을 통해 제1 작용기가 도입된 세포이다.
상기 제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드가 포함된 DNA 하이드로젤은 DNA 폴리뉴클레오티드를 지지체로 하는 하이드로젤로, 상기 제2 작용기는 상기 DNA 폴리뉴클레오티드의 일부 뉴클레오티드 염기에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있는 것일 수 있으며, DNA 폴리뉴클레오티드는 효소 반응을 통하여 합성될 수 있다.
효소 반응을 통한 DNA 폴리뉴클레오티드의 합성은 공지의 방법으로 수행될 수 있고, 예컨대 회전환복제(rolling circle amplification, RCA)방법을 통하여 합성될 수 있다. 합성되는 DNA 폴리뉴클레오티드의 크기를 조절함으로써 원하는 크기의 DNA 하이드로젤을 얻을 수 있다.
상기 효소 반응을 통하여 DNA 폴리뉴클레오티드를 합성하는 경우, dNTP와 함께 제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드를 함께 넣어줌으로써 '제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 하이드로젤'을 합성할 수 있다.
상기 효소 반응을 통하여 폴리뉴클레오티드를 합성하는 경우, 주형 DNA의 서열 변화를 통해 DNA 하이드로젤에 포함된 "제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드"의 비율 및 위치를 조절할 수 있으며, 이를 통해 제1 작용기가 도입된 세포와의 결합 효율을 조절할 수 있다.
상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 결합은 스트렙타비딘-바이오틴 결합 반응 또는 클릭화학반응으로 형성된 것일 수 있다.
상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 결합은 스트렙타비딘-바이오틴 결합 반응으로 형성된 것이고, 상기 제1작용기는 스트렙타비딘(streptavidin)이며, 상기 제2 작용기는 바이오틴(biotin)일 수 있다.
스트렙타비딘이 표면에 돌출된 세포는 공지된 방법을 통해 얻을 수 있으며, 예를 들면 "Tsai, P.: 'Cell surface streptavidin', IET Synthetic Biology, 2007, 1, (1), p. 32-35, DOI: 10.1049/iet-stb:20070002." 에 기재된 방법을 통해 얻을 수 있다.
바이오틴이 도입된 뉴클레오티드는 공지의 방법을 통해 얻을 수 있다. 상기 바이오틴이 도입된 뉴클레오티드는 예를 들면 Biotin-16-dUTP 또는 Biotin11-dUTP일 수 있다.
상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 결합은 클릭화학반응으로 형성된 것이고, 상기 제1 작용기는 아자이드기이며, 상기 제2 작용기는 BCN(bicyclo[6.1.0]nonyne), DBCO(dibenzocyclooctyne), DIFO(difluorinated cyclooctyne), DIFO2, DIFO3, DIBO(dibenzoannulated cyclooctyne), BARAC(biarylazacyclooctynone), OCT(cyclooctyne), thiaOCT, ALO(aryl-less cyclooctyne), MOFO((monofluorinated cyclooctyne), DIMAC (dimethoxyazacyclooctyne), TMDIBO(2,3,6,7-tetramethoxy-DIBO), COMBO(carboxymethylmonobenzocyclooctyne), PYRROC(pyrrolocyclooctyne), DIBAC(dibenzo-aza-cyclooctyne), TMTH(3,3,6,6-tetramethylthiacycloheptyne), Sondheimer diyne 및 S-DIBO(sulfonylated DIBO), DIFBO(difluorobenzocyclooctyne) 및 thiaDIFBO로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
아자이드기가 표면에 돌출된 세포는 당대사공학을 이용하여 얻을 수 있으며, 보다 구체적으로 세포에 N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated(Ac4ManNAz), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated(Ac4GlcNAz) 또는 N-azidoacetylgalactosamine-tetraacylated(Ac4GaINAz)을 처리하고 배양함으로써 얻어진 것일 수 있다.
제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드는 예컨대 5-DBCO-PEG4-dCTP, 5-DBCO-PEG4-dATP, 5-DBCO-PEG4-dGTP 또는 5-DBCO-PEG4-dCTP일 수 있다.
상기 DNA 하이드로젤의 크기는 직경 1 μm 내지 10 mm, 1 μm 내지 1 mm, 1 μm 내지 100 μm, 10 μm 내지 10 mm, 10 μm 내지 1 mm, 100 μm 내지 10 mm 또는 100 μm 내지 1 mm 일 수 있다. DNA 하이드로젤은 예컨대 상기 크기를 갖도록 합성된 것일 수도 있고, 큰 덩어리의 하이드로젤을 합성한 후에 이를 분쇄하여 얻어진 것일 수 있다. 세포와 DNA 하이드로젤을 결합시킬 때 DNA 하이드로젤의 크기가 10mm를 초과하는 경우 표면적이 작아져 결합 세포 부착 효율이 낮아지며, DNA 하이드로젤의 크기가 1 μm 미만인 경우에는 DNA-하이드로젤 복합체가 잘 형성되지 않는다.
상기 DNA-하이드로젤 복합체는 상기 제1 작용기가 표출된 세포와 상기 제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드가 포함된 DNA 하이드로젤을 혼합하여 반응시킴으로써 얻을 수 있으며, 반응 온도 및 반응 시간은 세포에 손상을 주지 않는 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 반응 온도는 예를 들면 0℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 40℃ 또는 20℃ 내지 40℃일 수 있으며, 반응 시간은 예를 들면 10분 내지 48시간, 10분 내지 24시간, 0.5시간 내지 48시간, 0.5시간 내지 24시간, 0.5시간 내지 12시간, 0.5시간 내지 6시간 또는 0.5시간 내지 2시간 일 수 있다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 세포에 도입된 제1 작용기와 DNA 하이드로젤의 제2 작용기가 결합으로 연결되어, 세포가 DNA 하이드로젤의 가교제 역할을 함과 동시에 주변 세포와의 상호작용으로 조직 재생을 촉진하는 역할을 한다.
또한, 세포와의 직접적인 결합으로 연결되어 있어 복합체 내 세포는 장기간 유지될 수 있고, 세포 분열로 새롭게 생성되는 세포 역시 제1 작용기가 도입되어 있어 DNA 하이드로젤의 제2 작용기와 결합할 수 있으므로 이식된 상처 부위에서 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 지지체인 DNA 폴리뉴클레오티드가 분해되기 전까지 장기간 조직 재생을 촉진할 수 있다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 DNA 하이드로젤은 세포외기질 역할을 수행함으로써 주변 세포와의 상호 작용을 도와주며, 부드러운 기계적 특성을 가지고 있어 생체 내 어느 부위에든 이식될 수 있다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 생체적합성이 우수하고, 생체 내 이식되는 경우 상처 부위로의 세포이동(cell migration) 및 혈관신생(angiogenesis)을 촉진함으로써 조직을 재생시킨다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 생체적합성이 우수하고, 지지체인 DNA 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서 DNA 분해효소에 의해 자연분해되므로 생체 내에 축적되거나 독성을 나타내는 등의 부작용이 없다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 탈수 및 재수화를 반복해도 형상 기억 특성으로 인해 본래의 형상으로 되돌아올 수 있다.
본 발명은 전술한 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 포함하는 조직 재생용 조성물은 손상된 조직에 이식될 수 있다. 상기 조성물은 손상된 부위의 세포이동(cell migration) 및 혈관신생(angiogenesis)을 유도함으로써, 조직 재생을 촉진할 수 있다.
본 발명은 제1 작용기가 세포 표면에 돌출되도록 세포에 제1 작용기를 도입하는 단계; 제2 작용기가 도입된 DNA 하이드로젤을 합성하는 단계; 상기 DNA 하이드로젤을 분쇄하는 단계; 및 상기 세포 및 상기 분쇄된 DNA 하이드로젤을 혼합 배양하는 단계를 포함하는 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법에서 세포, 제 1작용기, 제2 작용기 및 DNA 하이드로젤은 전술한 바와 같다.
제1 작용기가 세포 표면에 돌출되도록 세포에 도입하는 방법으로는 제1 작용기로 치환된 단당류를 세포에 처리하여 당화를 통해 세포 표면에 돌출되도록 하는 것일 수 있으며, 예컨대 아자이드로 치환된 단당류(예컨대 Ac4ManNAz, Ac4GlcNAz 또는 Ac4GaINAz)를 세포에 처리하여 세포 표면에 아자이드가 돌출되도록 하는 것일 수 있다.
상기 제2 작용기가 도입된 DNA 하이드로젤의 합성은 회전환복제 방법으로 합성하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 원형 주형 DNA, DNA 중합효소, dNTPs, 제2 작용기가 도입된 dNTP(예컨대 5-DBCO-PEG4-dCTP, 5-DBCO-PEG4-dATP, 5-DBCO-PEG4-dGTP 또는 5-DBCO-PEG4-dCTP)를 버퍼에 넣어 합성하는 것일 수 있다.
상기 DNA 하이드로젤을 분쇄하는 단계에서 분쇄는 초음파 분쇄를 이용하는 것일 수 있으며, DNA 하이드로젤을 직경 1 μm 내지 10 mm, 1 μm 내지 1 mm, 1 μm 내지 100 μm, 10 μm 내지 10 mm, 10 μm 내지 1 mm, 100 μm 내지 10 mm 또는 100 μm 내지 1 mm 크기로 분쇄하는 것일 수 있다.
상기 초음파 분쇄의 진동수는 DNA가 변성되거나 DNA 하이드로젤이 과도하게 작아지지 않는 수준(직경 1 μm 이상)에서 적절하게 선택될 수 있으며, 예컨대 5 내지 50 kHZ, 10 내지 50 kHZ, 10 내지 40 kHZ, 10 내지 30 kHZ, 15 내지 25 kHZ일 수 있다.
상기 초음파 분쇄 시간은 DNA가 변성되거나 DNA 하이드로젤이 과도하게 작아지지 않는 수준(직경 1 μm 이상)에서 적절하게 선택될 수 있으며, 예컨대 1분 내지 6시간, 1분 내지 3시간, 1분 내지 1시간, 10분 내지 6시간, 10분 내지 3시간, 10분 내지 1시간, 30분 내지 6시간, 30분 내지 3시간 또는 30분 내지 1시간일 수 있다.
상기 세포 및 상기 분쇄된 DNA 하이드로젤을 혼합 배양하는 단계에서 반응 온도 및 반응 시간은 세포에 손상을 주지 않는 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 반응 온도는 예를 들면 0℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 40℃ 또는 20℃ 내지 40℃일 수 있으며, 반응 시간은 예를 들면 10분 내지 48시간, 10분 내지 24시간, 0.5시간 내지 48시간, 0.5시간 내지 24시간, 0.5시간 내지 12시간, 0.5시간 내지 6시간 또는 0.5시간 내지 2시간 일 수 있다.
상기 분쇄된 DNA 하이드로젤을 세포와 혼합 배양함으로써 DNA 하이드로젤과 세포가 가교된 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 얻을 수 있으며, 세포는 하이드로젤 내외부에 골고루 분포되어 있고 결합으로 고정되어 있어 하이드로젤 내 유지력이 우수하다.
본 발명의 세포-DNA 하이드로젤 복합체 제조방법은 상기 DNA 하이드로젤의 분쇄하는 단계 전에 DNA 하이드로젤을 탈수시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 하이드로젤의 탈수는 DNA 하이드로젤에 에탄올을 처리함으로써 수행되는 것일 수 있다. DNA 하이드로젤을 탈수함으로써 DNA 하이드로젤을 효과적으로 분쇄할 수 있다.
상기 DNA 하이드로젤의 분쇄 전에 DNA 하이드로젤을 탈수시키는 단계를 더 포함하는 경우, DNA 하이드로젤의 분쇄 후 재수화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
1. 재료 및 실험 방법
1.1. 재료 및 시약
본 발명에서 사용한 재료 및 시약의 입수방법은 표 1에 기재 되어있다.
Figure PCTKR2023011733-appb-img-000001
1.2. DNA 하이드로젤 제작
표 2의 선형 주형 DNA을 프라이머 1과 혼성화하고 연결하였으며, RCA(Rolling Circle Amplification)를 통해 원형 주형 DNA에 상보적인 반복 서열을 갖는 매우 긴 DNA 가닥을 제조하였다. 프라이머 2는 복제된 DNA 가닥의 상보적 서열로 튼튼한 DNA 하이드로겔을 형성하도록 설계되었다.
Figure PCTKR2023011733-appb-img-000002
(1) 원형 주형 DNA 제작
92개 염기의 선형 주형 DNA와 22개 염기의 프라이머 1을 최종 농도가 10μM가 되도록 뉴클레아제 프리 워터(nuclease-free water)에 혼합하였다. 변성 및 어닐링을 위해 혼합물을 2분 동안 95℃로 가열하고 서멀 사이클러(thermal cycler, Bio-Rad)를 사용하여 1시간 동안 25℃로 천천히 냉각했다. 원형 DNA의 nick을 연결하기 위해 0.12UμL-1의 T4 DNA 리가아제 및 리가아제 완충액(30mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨(DTT) 및 1mM 아데노신 삼인산(ATP))이 첨가된 용액을 함께 실온에서 밤샘 배양하였고, 이를 통해 원형 주형 DNA를 얻었다.
(2) DNA 하이드로젤 제작
DBCO-modified DNA 하이드로젤을 합성하기 위해 상기 과정에서 얻은 원형 주형 DNA(0.5μM의 최종 농도)를 Φ29 DNA 중합효소(0.5U μL-1), dNTP 믹스(각 염기 마다 1mM), 5-DBCO-PEG4-dCTP(0.33mM) 및 2 Х Φ29 DNA 중합효소 완충액(100mM Tris-HCl, 20mM (NH4)2SO4, 8mM DTT 및 20mM MgCl2)과 함께 20시간 동안 30℃에서 배양했다. 그리고 형광 표지를 위해 5-Propargylamino-dCTP-cy5(0.01mM)를 첨가하였다.
3. DNA 마이크로스캐폴드 제작
DNA 마이크로스캐폴드를 제작하기 위해 DNA 하이드로젤(200 μL)을 실온에서 30분 동안 1.8 mL의 에탄올에 노출시켰다. DNA 하이드로젤의 첫 번째 수축 후, 상층액을 제거했다. 그 후 새로운 에탄올에 DNA 하이드로젤을 넣고 실온에서 30분 동안 배양하여 완전한 수축을 유도하였고, 상층액을 제거하였다. 마지막으로 탈수된 DNA 하이드로젤을 15분 동안 초음파 처리하여 DNA 마이크로스캐폴드를 얻었다. 생성된 DNA 마이크로스캐폴드를 6000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿화 하였고, DNA 마이크로스캐폴드를 2mL 뉴클레아제가 없는 물에서 30분 동안 재수화(rehydration)했다.
1.4. 물리적 특성 측정
세포-DNA하이드로젤 복합체의 SEM 이미징을 위해 각 샘플을 실리콘 웨이퍼에 고정 및 동결 건조하고 이미징 전에 Au 또는 Pt로 코팅했다. SEM(SNE-3000M, SEC, SEC, Suwon-si, Korea 또는 SU-70, Hitachi, Tokyo, Japan)은 20.0kV 또는 15.0kV에서 작동되었다. 세포 배양 샘플을 DPBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 각 샘플을 80분 동안 1mL 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 처리하고 실온에서 10분 동안 1mL ddH2O로 세척했다. 상층액을 제거하고 세척 단계를 4회 반복하였다. 다음으로 2% OsO4 용액 1mL를 4℃에서 1.5시간 동안 샘플에 첨가했다. 고정된 샘플을 실온에서 10분 동안 1mL ddH2O로 세척하고 상층액을 제거했다. 세척 단계를 4회 반복하였다. 그런 다음 샘플을 실온에서 각각 10분 동안 에탄올(25, 50, 70, 90 및 100%)의 농도 구배를 증가시켜 탈수했다. 마지막으로, 샘플을 밤새 동결 건조시켰다. ImageJ 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 처리했다. MCR 레오미터(Anton Paar, VA, USA)와 25mm 평행판이 장착된 스트레인 컨트롤 레오미터를 사용하여 실온에서 리올로지특성을 측정했다. 세포-DNA하이드로젤 복합체를 플레이트 사이의 1mm 간격에 로딩하고 이완시켰다.
1.5. 세포 표면에 아자이드 도입
세포를 10% FBS, 100U/ml 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 5% CO2 분위기에서 37°C로 배양했다. 세포를 6웰 플레이트에 1 x 105개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 24시간 후, Ac4ManNAz(0, 5, 20 및 100μM)를 포함하는 RPMI1640 2mL를 플레이트에 첨가하고 2일 동안 배양했다. 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 37°C에서 30분 동안 DPBS에서 DBCO-cy5(최종 농도, 5μM)와 함께 배양했다. 상층액을 제거한 후 세포를 4% 포름알데히드-글루타르알데히드 고정제로 상온에서 5분간 고정하였다. 고정된 세포는 공초점 현미경(TCS SP5, Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 분석되었다.
1.6. 세포-DNA하이드로젤 복합체 제작
아자이드가 표면에 돌출된 세포(Azide-presenting cell, AzPC)(1 x 106)를 DPBS로 두 번 세척하고 13000rpm에서 3분 동안 원심분리 했다. 세포는 인간 제대정맥내피세포(HUVEC)와 인간 진피섬유아세포(HDF)가 사용되었다. AzPC 펠릿은 부드러운 파이펫팅을 통해 DPBS의 DNA 마이크로스캐폴드 100μL로 현탁되었고 AzPC와 DBCO가 도입된 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 하이드로젤 (DBCO-modified DNA hydrogel) 사이의 클릭화학반응(Click chemistry reaction)을 위해 37℃의 5% CO2 분위기에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 새로운 DPBS로 두 번 세척한 다음, DPBS의 히스톤(3 mg/mL)을 첨가하고 샘플을 37℃의 5% CO2 분위기에서 3시간 동안 배양했다. 세포 생존력 측정을 위해, 세포(7 x 103 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 접종하고 세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석을 사용하여 분석하였다. 세포를 무혈청 배지에서 24시간 동안 다양한 유형의 DNA 하이드로젤로 처리하였다. CCK-8 분석은 CCK-8 용액 추가, 37℃에서 1시간 30분 배양 및 450nm에서 흡광도 측정의 단계들을 통해 이뤄졌으며, 각 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행되었다.
1.7. 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 기능분석(functional assay)
세포를 5μM Calcein-AM으로 염색하고 공초점 현미경을 통해 이미징하기 전에 DPBS로 두 번 세척했다. DNA 스캐폴드를 분해하기 위해 rCDH에 DNase I를 37°C에서 6시간 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 DPBS로 2회 세척, 원심분리 및 재현탁하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 주사 가능성을 평가하기 위해 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 주사기로 옮기고 31 게이지 바늘을 사용하여 모세관으로 압출했다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 공초점 현미경으로 관찰되었으며, rCDH에 주입된 모세혈관의 3D 이미지는 IMARIS 이미징 소프트웨어를 사용하여 재구성되었다. 공동 배양을 위해 azide-positive HUVEC 및 HDF를 트립신 처리하여 채취하고 분쇄된 세포-DNA 하이드로젤 복합체와 혼합했다. 클릭 화학 반응을 통해 세포를 DNA 마이크로스캐폴드와 링크시킨 후, HUVEC는 Calcein-AM(5μM)으로 표지하였고 HDF 세포는 Calcein Red™ AM(5μM)으로 표지하였다. rCDH를 37°C에서 3시간 동안 DPBS에서 히스톤(3mg/mL)과 함께 배양했다. 그런 다음 rCDH를 DPBS로 세척하고 공초점 현미경으로 분석했다.
1.8. 상처부위에 2 종류 이상 세포가 공동으로 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체 처리 후 세포 이동 및 혈관신생 효과 분석
HDF는 Scar Block에 6 Х 104 세포/웰의 밀도로 시딩되었다. 밤새 배양한 후 Scar Block을 제거하고 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 그런 다음 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 행잉 웰(hanging well)에 첨가했다. 상처부위 이미지는 상처 후 0, 24 및 48시간에 도립 형광 현미경(Eclipse Ti-U, Nikon, Japan)을 사용하여 촬영하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 상처 부위를 분석했다. HUVEC를 24웰 플레이트에서 3 x 104세포/웰의 밀도로 마트리겔 코팅된 세포 배양 플레이트에서 배양하였다. 24시간 후, rCDH와의 공동 배양물을 트랜스웰에 삽입하고 시간 경과에 따른 혈관 신생 효과를 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 혈관신생 효과를 분석했다.
1.9. 상처 치료 모델 및 치료효과
상처 치료모델로 Nude mice (male, 4 weeks old)를 Nara Biotech (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 마우스의 복부를 절개하고, 바이옵시 펀치(8 mm)로 간에 원형의 천공 상처를 냈다. 생체 내 형광 영상화를 위해, 마우스 상처에 Cy5-표지된 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 주사하였다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체 내에는 HDF 및 HUVEC가 각각 2 Х 106 개 포함되었다.
주사 후 생체 내 이미징 시스템(IVIS) Lumina Series III(PerkinElmer)를 이용하여 전신 및 간 형광 이미지를 촬영하였다.
마우스를 마취시키고 6mm 멸균 바이옵시 펀치를 사용하여 등 피부의 중간 부분을 마취시켰다. 상처는 순간접착제로 0.5mm 실리콘 몰드를 고정시켰다. 그 후 0, 3 및 8일차에 200μL 부피의 세포-DNA 하이드로젤 복합체(HDF 및 HUVEC 가 각각 2 x 106가 포함된)로 처리되었다. 상처 이미지는 디지털 카메라를 사용하여 촬영했다. 상처 부위를 멸균 테가덤(Tegaderm)으로 덮고 탄력 붕대로 묶었다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 상처의 면적을 측정하여 상처 면적의 백분율을 계산했다.
1.10. 피부 조직의 조직학적 분석
세포-DNA 하이드로젤 복합체를 처리하고 10일 후 절개된 등 피부를 파라핀 포매하여 5μm 절편으로 절단하고 hematoxylin과 eosin(H&E)으로 염색하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다. 또한, 콜라겐 생성을 관찰하기 위하여 Masson's trichrome 염색을 하였다. 탈파라핀화된 조직 슬라이드를 Bouin 용액으로 염색하고 56°C에서 1시간 동안 배양했다. 피부 조직 슬라이드들은 각각 순서대로 Weigert's iron hematoxylin 용액, Biebrich scarlet acid fuchsin, phosphomolybdic-phosphotungstic acid 용액, aniline blue를 5분간 처리 후 1% 아세트산을 2분 처리하여 염색하였다. 광학 현미경과 이미지 전송 소프트웨어(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 상처부위를 관찰했다.
1.11. 통계분석
모든 데이터는 GraphPad Prism 8 소프트웨어 패키지(GraphPad Software, CA, USA)를 사용하여 분석되었다. 모든 그룹은 Student's t-test 또는 one-way ANOVA로 분석하였으며 p<0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 결과
2.1. 아자이드가 표면에 돌출된 세포 제작
아자이드가 표면에 돌출된 세포(AzPC, Unit A)를 제작하기 위해 HT29 세포에 Ac4ManNAz를 처리했다. 그 후 cyanine 5-labeled DBCO(cy5-DBCO)를 사용하여 빠른 클릭 반응을 유도했다. Ac4ManNAz 농도가 증가함에 따라 cy5의 형광 신호가 비례적으로 증가하였고, 이는 아지드가 성공적으로 세포 내 도입되었고 cy5-DBCO와의 클릭화학반응이 이뤄졌음을 나타낸다(도 2의 a). DAPI(파란색)는 핵을 나타낸다(도 2의 a, b, d). Ac4ManNAz 농도는 세포 독성 및 형태학적 변화를 최소화하면서 세포 표면에 표출되는 아지드기 수를 최대화하기 위한 추가 연구를 위해 20 μM으로 설정하였다. 표적 세포 표면에서 DBCO의 균질한 접합은 단면 cy5 신호 프로파일에서 추가로 확인되었다(도 2의 b). 표적 세포에 대한 cy5 분자의 화학 특이적 결합은 AzPC에서 높은 표지 효율을 나타냈다. 반면에, 아자이드가 도입되지 않은 세포(대조군)는 검출 가능한 결합을 나타내지 않았으며, 이는 아자이드가 도입된 세포 표면에서 성공적인 클릭 반응이 발생했음을 나타낸다(도 2의 c). 또한, 단일 세포 단면 형광 강도 프로파일은 클릭화학반응이 무작위적으로 일어난 것이 아니라, 세포막에서 발생했음을 보여준다(도 2의 d).
2.2. DBCO가 도입된 자기조립성 DNA 하이드로젤 합성
Rolling Circle Amplification(RCA) 기법을 이용하여 직경 1 센티미터(cm) 크기의 DBCO가 도입된 DNA 하이드로젤을 합성하였다.
그 후 DNA 하이드로젤을 직경 1um ~ 1mm 크기로 분쇄하고 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰하였다(도 2의 e). DNA 하이드로젤은 마이크로 규모의 거친 표면을 보였으며, 이러한 거친 표면 형태는 세포의 효과적인 도킹을 촉진할 수 있다. 또한, DNA 하이드로젤은 매우 부드러운 기계적 특성을 나타냈다(도 2의 f). DNA 하이드로젤을 합성하는 효소 반응 동안 DBCO가 결합된 dNTPs와 변형되지 않은 dNTPs를 함께 넣어주는 방법으로 DNA 하이드로젤에 DBCO를 도입하였다. 이와 같이 사전-변형된 dNTPs를 활용하여 DNA 하이드로젤을 합성하는 경우 주형 DNA의 서열을 조절하고 DBCO와 결합시킨 뉴클레오티드의 종류를 선택함으로써, DNA 하이드로젤에 도입되는 DBCO의 위치 및 밀도를 조절할 수 있으며, 이를 통해 세포와의 결합 효율을 조절할 수 있다. DNA 하이드로젤의 성공적인 DBCO 도입여부는 클릭 화학을 통한 DNA 하이드로젤의 cy5-azide 변형을 통해 확인되었다(도 2의 g). 도 2 h에 도시된 바와 같이, AzPC는 클릭 화학을 통해 DBCO가 도입된 DNA 하이드로젤에 특이적으로 결합된 반면, DBCO를 도입하지 않은 DNA 하이드로젤(CDH)은 AzPC와의 결합없이 단순히 AzPC를 포획하고 있음을 보여주었다. 또한, 3D 재구성된 이미지를 통해 DBCO가 도입된 DNA 하이드로젤 전체에서 AzPC의 성공적인 캡슐화(encapsulation)를 추가로 확인했다(도 2의 i). 하이드로젤 내 세포의 균일한 분포를 더욱 향상시키기 위해 DBCO가 도입된 DNA 하이드로젤을 초음파 분쇄를 통해 구조의 화학적 또는 열적 파괴에 대한 영향을 최소화하면서 1μm 내지 100μm 크기로 분쇄하였다(도 6). DNA 하이드로 젤의 효율적인 분쇄를 위해 DNA 하이드로 젤을 탈수시켰다(도 7). 탈수된 DNA 하이드로젤 분쇄물은 물이 있을 때 DNA 하이드로젤의 팽윤 거동으로 인해 원래 모양을 완전히 회복할 수 있다.
2.3. 클릭 반응을 통한 세포-DNA 하이드로젤 복합체 제조
재수화된 DBCO 도입 DNA 하이드로젤을 아자이드가 표면에 돌출된 세포(AzPC)와 혼합하였다(도 3의 a). 30분 이내에, 화학적 네트워킹을 통해 세포-DNA 하이드로젤 복합체가 형성되었다. 반면에, 아자이드가 도입되지 않은 세포와 DNA 하이드로젤을 혼합한 경우 세포-DNA 하이드로젤 복합체가 형성되지 않았다.
세포-DNA 하이드로젤 복합체(rCDH)에서 거미줄과 같은 나노 규모 구조가 세포를 고정하기 위해 덮여 있었으며, DNA 하이드로젤과 아자이드가 표면에 돌출된 세포(AzPC)간 성공적인 네트워킹이 이뤄졌음을 확인하였다(도 3의 b). 세포는 세포-DNA 하이드로젤 복합체 내부에 잘 분포되어 있었다(도 3의 c). CDH(분쇄되지 않은 DBCO 도입 DNA 하이드로젤과 아자이드 도입 세포를 반응시킨 DNA 하이드로젤)는 표면에서만 효과적인 세포 포획을 허용했지만, rCDH(분쇄된 DBCO 도입 DNA 하이드로젤과 아자이드 도입 세포를 반응시킨 후 다시 재구성한 세포-DNA 하이드로젤 복합체)표면뿐만 아니라 내부까지 구조 전체적으로 세포의 균일한 분포를 나타냈다(도 3의 d). rCDH는 세포 캡슐화 효율이 2배 이상 증가하여 CDH 시스템에 비해 세포 수가 현저히 많았다(도 3의 e). 그럼에도 불구하고 세포는 두 경우 모두에서 생존 가능한 상태로 유지되었다(도 3의 f). 동적 계수 평가는 CDH와 rCDH가 모두 매우 부드러운 젤과 같은 거동을 나타냄을 보여주었다(1-20Pa 범위의 G'에서 G > G", 도 3의 g). 특히, 하이드로젤에 포유동물 세포를 통합하면 세포가 없는 초기 DNA 하이드로젤에 비해 더 높은 탄성(낮은 저장 탄성률)이 유도되었다. 더 높은 유연성은 조직 적합성을 제공하고 초연성(ultrasoft) 기계적 특성은 모든 천연 조직 이식시에 고유한 주입성을 제공한다. 대조적으로, 세포와 DNA 하이드로젤 간의 생체 직교 클릭 화학을 통해 유도된 긴밀한 접합은 CDH에 비해 rCDH의 기계적 강성(stiffness)을 향상시켰다(도 3의 h).
또한, rCDH의 세포 캡슐화 효율을 평가했다(그림 3i). 단위 조립 접근 방식을 통해 네트워크의 세포 수가 DNA 마이크로스캐폴드의 부피에 정비례할 수 있게 되었고, 이는 재료의 손쉬운 제어성을 의미한다.
2.4. 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 특성 및 세포 유지력
DNA 하이드로젤과 세포 사이의 화학적 연결은 세포의 조기 방출을 방지하고 연조직과 같은 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 세포의 기능적 활성을 유지시킨다. 같은 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 특성 및 세포 체류 시간을 측정하기 위해 히스톤을 사용하였다. 히스톤을 같은 세포-DNA 하이드로젤 복합체 백본에 정전기적으로 결합시켜 생리학적 및 기계적 안정성을 조작했다(도 9). 도 4의 a 및 도 9에 표시된 대로 히스톤 결합은 혈청 뉴클레아제로부터 DNA 하이드로젤을 보호함으로써 구조적 변성을 지연시키고 세포가 더 오래 체류할 수 있게 한다. 시간이 지날수록 세포-DNA 하이드로젤 복합체 내의 세포가 증식하였으며, 이는 같은 세포-DNA 하이드로젤 복합체 내의 세포 활동이 치료 매트릭스 역할을 수행할 수 있음을 시사한다(도 4의 b). 세포가 증식함에 따라 DBCO가 도입된 DNA 하이드로젤과 모세포(아자이드가 표면에 돌출된 세포)로부터 분열된 딸세포는 세포-DNA 하이드로젤 복합체에 새롭게 연결되었으며, 시간이 지남에 따라 자연스럽게 조직이 교체되었음을 알 수 있다(도 4의 c).
2.5. 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 상처 부위 재생 효과
상처부위의 효과적인 재생에 있어, 상처 부위의 세포 간 상호 작용과 세포 유지가 중요한 요소 이기 때문에 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 상처 치유에 유익하다. 또한, 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 2종류 이상의 세포와도 결합되어 세포 공동배양에도 적합하다. 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 치료 효능을 평가하기 위해 클릭화학반응이 가능한 인간 진피 섬유아세포(HDF) 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 공동 배양했다. 이 두 가지 세포 유형은 상처 치유의 증식 단계에서 중요한 과정인 세포이동 및 혈관신생 능력을 평가하기 위해 선택되었다. HDF과 HUVEC가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 빨간색(Calcein red-stained azide-presenting HDF)과 녹색(Calcein AM-stained azide-presenting HUVEC) 형광 신호를 통해 세포-DNA 하이드로젤 복합체 내에 HDF 및 HUVEC가 잘 결합되어 있음을 확인하였다(도 4의 d). 단일 종류 세포가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체와 2종 이상의 세포가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 점탄성 차이는 유의하지 않았다(도 4의 e). 특히, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 매우 부드러운 기계적 특성은 관형 구조를 포함한 다양한 3차원 주변 환경에 쉽게 적응할 수 있도록 함과 동시에 세포 생존율에 부정적인 영향을 미치지도 않는다(도 4의 f). 도 4의 g에 도시된 바와 같이, HDF 및 HUVEC 세포가 결합되어 있는 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 긁힌 상처에서 in vitro 세포 이동을 유의하게 향상시켰다. 상처 봉합은 HDF 및 HUVEC 세포가 결합되어 있는 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 처리하였을 때 48시간 동안 2배 증가했으며, 이는 세포 간 상호 소통이 향상된 상처 치유 속도를 가져왔음을 시사한다. 혈관 신생을 증가시키는 능력은 또한 HUVEC에 대한 시험관 내 튜브 형성 분석을 통해 평가되었다(도 4의 h). 세포-DNA 하이드로젤 복합체로 처리된 그룹은 전체 튜브 가지 길이가 1.7배 증가했다. 이 결과는 2종 이상의 세포가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 세포간 통신을 촉진함으로써 우수한 조직 재생 효과를 나타냄을 시사한다.
2.6. 세포-DNA 하이드로젤 복합체 이식을 통한 생체 내 조직 복구
세포-DNA 하이드로젤 복합체는 점탄성을 가져 피하 주사바늘(31G; Ψ int. 0.9-1 mm)로 주입할 수 있다. 또한 높은 유연성을 가진 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 주입된 후 복잡한 주변 공간에 적응할 수 있다(도 5의 a). 특히, 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 탈수 및 재수화를 반복한 후에도 형상 기억 특성을 나타내므로 변형 가능성을 최소화하면서 쉽게 작동할 수 있다(도 10). 생체 내 연구를 통해 개발된 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 기능을 특정 공간에 주입할 수 있도록 확장했으며, 주사 가능한 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 적응성을 정상 마우스 간 천공 상처 모델에서 확인하였다(도 5의 b). 도 5의 c에서, cy5-표지된 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 8mm 상처에 주사한 직후, 주사된 부위의 이미지를 생체내 이미징 시스템(IVIS)으로 촬영하였다. 생체 내 치료 효과를 조사하기 위해 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 피부 상처 모델에 이식했다(도 5의 d). 상처 치유 효과를 모니터링하기 위해 각 샘플(PBS, DNA 하이드로젤 및 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체)을 피부 절제 후 0, 3 및 6일 차에 상처 부위에 3회 주입했다. PBS 그룹과 비교하여 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체 처리군은 8일째에 상처 봉합을 상당히 가속화했다(도 5의 e). DNA 하이드로젤은 조직 재생을 촉진하기는 했지만 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체 보다 낮은 조직 재생 촉진 효과를 보였다. 또한, 조직 부위의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 통해 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체로 처리된 상처부위에서 더 많은 육아 조직이 형성되고 더 두꺼운 진피층 이 형성됨을 확인했다. 즉, 했지만 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체로 처리된 상처 부위는 조직이 완전히 재생됐음을 확인했다(도 5의 f). 콜라겐 증착은 Masson's trichrome (MT) 염색을 통해 확인하였으며, 했지만 HUVEC 및 HDF가 결합된 세포-DNA 하이드로젤 복합체 처리군에서 콜라겐 층의 윤곽 형성이 증가되었음을 확인하였다(도 5의 g). 즉, 세포-DNA 하이드로젤 복합체는 혈관신생, 세포 증식 및 이동을 촉진하여 치료 세포의 직접 전달과 함께 세포간 통신을 위한 효과적인 플랫폼 역할을 함으로써 손상된 조직을 신속하게 재생시킴을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 제1 작용기가 표면에 돌출된 세포 및;
    제2 작용기가 도입된 뉴클레오티드가 포함된 DNA 하이드로젤을 포함하고, 상기 세포 및 상기 DNA 하이드로젤은 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 결합으로 연결된 것인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 작용기와 제2 작용기의 결합은 스트렙타비딘-바이오틴 결합 반응 또는 클릭화학반응으로 형성된, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 작용기는 아자이드기이고, 상기 제2 작용기는 BCN, DBCO, DIFO, DIFO2, DIFO3, DIBO, BARAC, OCT, thiaOCT, ALO, MOFO, DIMAC, TMDIBO, COMBO, PYRROC, DIBAC, TMTH, Sondheimer diyne, S-DIBO, DIFBO 및 thiaDIFBO로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 혈관내피세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포 및 면역세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 세포-DNA 하이드로젤 복합체를 포함하는 조직 재생용 조성물.
  6. 제1 작용기가 세포 표면에 돌출되도록 세포에 제1 작용기를 도입하는 단계;
    제2 작용기가 도입된 DNA 하이드로젤을 합성하는 단계;
    상기 DNA 하이드로젤을 직경 1 μm 내지 1 mm 크기로 분쇄하는 단계; 및
    상기 세포 및 상기 분쇄된 DNA 하이드로젤을 혼합 배양하는 단계를 포함하는 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 제1 작용기는 아자이드기이고, 상기 제2 작용기는 BCN, DBCO, DIFO, DIFO2, DIFO3, DIBO, BARAC, OCT, thiaOCT, ALO, MOFO, DIMAC, TMDIBO, COMBO, PYRROC, DIBAC, TMTH, Sondheimer diyne, S-DIBO, DIFBO 및 thiaDIFBO로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 혈관내피세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포 및 면역세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 DNA 하이드로젤의 분쇄는 초음파 분쇄인, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 DNA 하이드로젤의 분쇄 전에 DNA 하이드로젤을 탈수시키는 단계를 더 포함하는, 세포-DNA 하이드로젤 복합체의 제조방법.
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