KR102025636B1 - 모낭 외모낭초로부터 멜라닌세포를 유도하기 위한 방법 및 이식을 위한 제조 - Google Patents

모낭 외모낭초로부터 멜라닌세포를 유도하기 위한 방법 및 이식을 위한 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은
(i) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하는 단계;
(ii) 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터 분리된 줄기세포를, 줄기세포, 멜라닌세포 전구체 및 멜라닌세포의 분화를 유도하고 성장을 촉진하며, 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계
를 포함하는 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법에 관한 것이다.
추가로, 피부의 탈색 연관 질환의 치료 또는 흉터의 치료를 위한 자가이식체, 이종이식체 및 이형이식체 또는 멜라닌세포 뿐만 아니라, 멜라닌세포를 포함하는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법이 여기에 개시된다.

Description

모낭 외모낭초로부터 멜라닌세포를 유도하기 위한 방법 및 이식을 위한 제조{Method for deriving Melanocytes from the hair follicle outer root sheath and preparation for grafting}
본 발명은 생물학 및 의약학, 특히 줄기세포 생물학, 보다 특히 인간 모근으로부터 유래한 줄기세포 및 전구체로부터 멜라닌세포를 생산 또는 생성하는 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 멜라닌세포를 포함하는 자가이식체, 동종이식체 또는 이종이식체를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
탈색(Depigmentation)는 피부의 미백 또는 색소의 상실이다. 피부의 탈색은 다수의 국부 및 전신적 조건에 의해 야기될 수 있다. 색소 상실은 부분적(예컨대, 피부의 상처)이거나 (백반증과 같이) 전체적, 일시적이거나 영구적일 수 있다.
피부의 탈색은 밝고 어두운 피부의 상이한 영역을 만들어내는 백반증을 앓고 있는 사람들에서 랜드파크가 되는 질병이다. 화장품의 단점 다음으로, 저색소침착을 갖는 피부 영역은 태양 화상 또는 최악의 경우 피부암이 발생하는, 더 많은 부작용이 나타나기 쉽다. 그러므로, 색소침착을 제공함으로써 탈색된 영역을 보호하기 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하기 위한 실질적은 노력이 현재 이루어지고 있다. 한 방안은 탈색된 피부 영역에 멜라닌세포를 적용하는 것이다. 멜라닌세포는 멜라닌-생산 세포, 그 중에서도, 피부 표피의 맨 아래층(기저층)에 위치하는 것이다. 멜라닌은 피부의 색상을 일차적으로 결정하고 태양 방사선으로부터 피부의 일차적인 보호를 가능하게 하는 색소이다.
백반증에 대한 기존의 의학적 치료는 부분적으로만 도움이 되고, 일시적인 처방이거나 침습적이다. 그러므로, 원인적, 자가의, 비침습적 치료를 위한 높은 건강에 대한 관심과 시장 잠재력이 존재한다.
일시적으로 세포, 전구체 및 분화된 세포를 증폭시키는 만능 성체 줄기세포를 함유하는 모낭(hair follicle) 외모낭초 (outer root sheath, ORS)의 개발 잠재성이 알려져 있다. 이들 세포는 (다른 세포 타입 중에서) 멜라닌세포가 생기게 할 수 있다. 여러 방법적 개선은 1995년 인간 모낭 멜라닌세포 (HM)의 첫번째 장기 배양을 통해 지속시간, 수율 및 배양 순도에 접근하였다(Tobin D J, Colen S R, Bystryn J C. J Invest Dermatol 1995: 104: 86-89).
그러나, 추가의 가공 및 피부상에의 적용을 위해 순수한 멜라닌세포를 회수하기 위해서는 멜라닌세포-산출 세포(melanocyte-yielding cell)를 분리하고 분화시키는 방법에 대한 필요가 있다. 또한, 짧은 배양 기간 후 산출되는 멜라닌세포의 수를 증가시킬 수 있는 방법을 제공할 필요가 있다. 이에 본 발명자들는 이러한 문제들을 해결하는 수단 및 방법을 하기 개시된 바와 같이 제공한다. 본 발명자들은 또한 그러한 멜라닌세포는 탈색의 치료에 매우 적합하며 예기치못하게도 높은 멜라닌 생산과 3차원적 구조에서 높은 효소적 효능을 나타낼 수 있음을 밝혔다.
멜라닌세포를 어떻게 얻고 배양하는지에 대한 공지의 방법이 존재한다. 한가지 방안은 모낭 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 분화 및 배양이다(WO-A2　2009/049734). 그러한 목적을 위해, 발모된 모발을 효소적으로 처리하여 모낭으로부터 줄기세포를 분리한다. 분화 및 배양 후, 영향을 받는 영역에 대한 적용이 제안되었다. 그러나, 본 발명자들은 WO-A2　2009/049734에 개시된 방법에 의해, 치료의 효능에 악영향을 보이는 섬유아세포 및 케라틴세포와 같은 세포 타입들이 치료의 요구에 과잉하여 배양되는 것을 관찰하였다. 공지의 방법으로 불필요한 세포 타입들이 또한 배양되고, 이는 탈색 치료의 효능의 손실을 야기하고 탈색 치료를 더 복잡하게 만든다. 그러므로, 멜라닌세포를 생성하고 얻기 위한 개선된 방법에 대한 필요가 있다. 나아가, 고순도의 멜라닌세포를 제공할 필요가 있다.
Dieckmann et al. (2010); Experimental Dermatology; 19(6):543-545는 뽑아낸 모낭의 외모낭초 (ORS)로부터 이들 성체 줄기세포를 얻기 위한 비침습적 방법을 개시한다. 그러나, Dieckmann (loc. cit.)는 (1) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하고 발모된 모발의 남은 부분을 사용하는 점; 및 (2) 발모된 모발을 콜라게나제로 처리하는 점은 개시하고 있지 않다. 또한, 본 발명에서 제공하는 방법과 관련한 배양은 제넥티신 처리를 포함하는 멜라닌세포를 선별 및/또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 단계는 Dieckmann (loc. cit.)에 개시되어 있지 않다.
실시예 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교하여 멜라닌세포의 매우 확인한 성장 및 증식을 가능하게 한다. 도 15는 본 발명의 방법이 여러 계대에 거쳐 세포 수에서의 기하급수적인 증가를 제공하는 반면, Dieckmann (loc. cit.)의 방법을 사용하는 경우 세포수 조차 감소됨을 보여준다. 실시예 2에서 증명된 바와 같이, 그 외에는 비교가능한 조건하에서 6계대 후 Dieckmann (loc. cit.)의 방법은 총 710,000 개 이상의 멜라닌세포의 생산을 가능하게 하지 못하는 반면 본 발명의 방법은 대략 총 80,875,000개의 멜라닌세포의 생산을 가능하게 한다. 다시 말하면, 본 발명은 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교하여 100배 이상 더 높은 멜라닌세포의 생산을 가능하게 한다. 발모된 인간 모발 당(또는 다르게는 모낭 당) 생성된 멜라닌세포의 상응하는 숫자를 계산한 경우, 그 외에는 비교가능한 조건하에서 6계대 후 Dieckmann (loc. cit.)의 방법은 발모된 인간 모발 당(또는 다르게는 모낭 당) 약 7,000개 (보다 정확하게는 7,717개의 멜라닌세포) 이상의 생산을 가능하게 하지 못하는 반면, 본 발명의 방법은 발모된 인간 모발 당(또는 다르게는 모낭 당) 약 2,700,000개의 멜라닌세포의 생산을 가능하게 한다. 다시 말해, 본 발명은 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교하여 100배 이상 더 높은 멜라닌세포의 생산을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 유리하게는 멜라닌세포의 부착 배양(adherent culture)을 포함할 수 있다.
Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 여기에서 제공되는 방법의 첫번째 차이점은 발모된 인간 모발의 모구의 제거이다. 모구는 섬유아세포의 주요량(major amounts)을 포함하고 가지고 가는 것으로 여겨진다. 모구의 제거에 의해, 여기에서 사용되는 발모된 모발은 더 적은 수의 섬유아세포를 함유/산출한다. 따라서, 여기에서 제공되는 방법은 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교할 때 초기 시작에서부터 더 적은 섬유아세포가 존재하게 된다. 이는 멜라닌세포의 성장을 더 낫게 하는데 세포 배양이 섬유아세포로 덜 오염되고 그러므로 아주 시작다는 단계부터 영양소와 공간에 대한 경쟁을 줄이기 때문이다.
Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교한 본 발명의 방법의 두번째 차이점은 (콜라게나제와 같은) 콜라겐분해제와 함께 발모된 모발을 인큐베이션하는 것이다. 상기 인큐베이션은 10분간 수행될 수 있다. 콜라겐분해제는 발모된 모발의 세포외 기질을 느슨하게 한다. 이러한 느슨하게 하는 것은 세포외 기질로부터 줄기세포의 이탈 또는 이동을 촉진한다고 여겨진다. 따라서, 콜라겐분해제와의 인큐베이션은 외모낭초로부터 줄기세포를 분리할 수 있다. 실시예 2, 도 13 및 도 14에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 방법이 사용되는 경우 외모낭초 표면/세포 수는 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교하여 실제로 증가한다. 실제, 외모낭초 표면/세포 수는 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교하여 거의 2배만큼 높다(팩터 1.84).
섬유아세포의 감소 및 세포외 기질로부터의 줄기세포의 더 쉽고/더 빠르고/증가된 이탈로 인해 본 발명의 방법은 실시예 2에서 증명된 바와 같이 본 발명에 따른 멜라닌세포의 성장 및 발달에서 현저한 증가에 대해 이점 및 놀라운 효과를 가져다준다. Dieckmann (loc. cit.)의 방법은 모구의 제거 또는 콜라게나제 처리에 대해 그에 따라 주어지는 어떠한 이점은 커녕 아무런 힌트도 제공해 주지 못한다. 그와는 반대로, Dieckmann (loc. cit.)은 세포에 대한 잠재적인 불리함 때문에 효소적 처리를 배제하도록 하고 있다.
이하 설명하는 바와 같이, 제넥티신 처리는 본 발명의 방법의 추가의 이로운 측면이다. 도 15/16에서 볼 수 있는 바와 같이, Dieckmann (loc. cit.)의 방법에서 제넥티신의 사용은 본 발명의 방법과는 달리, 멜라닌세포의 실질적인 성장 또는 선별/분리를 가능하게 하지 못한다. 섬유아세포 및 케라틴세포와 같은 빠른 대사 및 증식을 갖는 세포들을 일차적으로 타겟으로 하는 반면 느리게 분열하는 멜라닌세포에는 영향을 미치기 어렵기 때문에 본 발명의 방법에 따른 제넥티신 처리는 이점이 있다. 따라서, 제넥티신 처리는 세포 배양물 내에 멜라닌세포를 풍부하게 하고 멜라닌세포 수의 현저한 증가를 가능하게 한다. Dieckmann (loc. cit.) 방법에서의 제넥티신 처리는 그러한 바람직한 효과를 전혀 보여주지 않는다. 그러므로, 제넥티신 처리 이전의 Dieckmann (loc. cit.)에 따른 세포 배양물은, 본 발명의 방법과는 달리, 상당수의 섬유아세포 및 케라틴세포를 함유하고 멜라닌세포는 미량만 함유하는 것으로 여겨진다. 따라서, Dieckmann (loc. cit.) 세포 배양물의 제넥티신 처리 후의 멜라닌세포의 양은 멜라닌세포의 효율적인 선별/분리 및 성장을 위해 충분하지 않다.
상기 설명한 바와 같이, 이에 본 발명자들은 뽑아낸 모낭의 외모낭초 (ORS)로부터 성체 줄기세포를 얻고 순수 배양의 기능적인 멜라닌세포로 분화시키기 위한 개선된 비침습적인 방법을 개발하였다. 여기에서 나타낸 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 멜라닌세포는 현탁액, 액제 또는 에어로졸의 형태로, 단독 배양물로서 또는 케라틴세포와의 복합하여 백반증의 치료를 위해 손쉽게 사용될 수 있다. 상기 멜라닌세포는 추가로 케라틴세포와 함께 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체로 제공된다. 제공되는 이식체는 생체적합성 (스캐폴드) 담체에 의해 안정화된다.
본 발명은 발모된 인간 모발의 외모낭초로부터의 줄기세포에서의 분화를 통해 멜라닌세포를 비침습적으로 고함량 및 순도로 4주 미만의 단시간 내에 얻는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 줄기세포 및/또는 멜라닌세포 전구체로부터 멜라닌세포를 생성하기 위한 향상된 방법을 제공한다. 그러므로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 줄기세포로부터 멜라닌세포를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다:
(i) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하는 단계;
(ii) 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터 분리된 줄기세포를, 줄기세포, 멜라닌세포 전구체 및 멜라닌세포의 분화를 유도하고 성장을 촉진하며, 오직 분화된 멜라닌성 멜라닌세포가 배양물 내에 남을때까지 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계.
본 발명자들은 예기치않게도 모발의 모구가 제거되는 경우 섬유아세포 및 기타 세포 타입들로의 오염이 크게 감소될 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따른 방법은 더 짧은 시간 내에 순수한 멜라닌 세포의 수율을 증가시킬 수 있다. 상기 방법의 단계 (i) 및 단계 (ii)의 조합에 의해 본 발명은 예를 들어 Diekmann et al (2010)과 비교할 때 더 짧은 시간 내에 고순도로 증가된 양의 멜라닌세포를 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 멜라닌세포는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체를 위해 놀랍게도 매우 적합하다. 그러므로, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 멜라닌세포를 포함하는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체를 생산하는 방법에 관한 것이다:
(i) 본 발명에 따른 줄기세포로부터의 멜라닌세포 생성 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포를 포함하는 현탁액을 제공하는 단계;
(ii) 생체적합성 담체를 제공하는 단계; 및
(iii) 상기 생체적합성 담체 상에서 멜라닌세포를 배양하는 단계;
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체를 생산하는 방법에 의해 얻을 수 있는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 줄기세포 및/또는 멜라닌세포 전구체로부터 멜라닌세포를 생성하는 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법에 관한 것이다:
(i) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하는 단계;
(ii) 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터 분리된 줄기세포를, 줄기세포, 멜라닌세포 전구체 및 멜라닌세포의 분화를 유도하고 성장을 촉진하며, 오직 분화된 멜라닌성 멜라닌세포가 배양물 내에 남을 때까지 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계.
본 발명자들은 예기치 않게도 모낭/발모된 인간 모발의 근위부, 즉 모구를 잘라낸 경우, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 멜라닌세포의 수율 및 순도를 크게 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법은 발모된 모발의 모구를 제거하는 것을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 발모된 인간 모발의 "모구(bulb)"는 모근의 근위부이며, 이는 대개 분화된 세포들, 대부분 섬유아세포를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 탈모 동안 상실되지 않은 경우, "모낭 돌출부(bulge)"라고도 불리는 모간(hair shaft)의 원위부를 잘라낸다. 바람직한 구체예에서, 발모된 모근의 중간 부분(mid-part)만이 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 발모된 모발의 중간 부분은 바람직하게는 모구(근위부)와 피지선 채널(sebaceous gland channel) 사이의 형태학적 단위이다. 이 부분은 (완전히 분화된 세포에 대해 상피성, 뉴런성, 지방세포성, 연골세포성, 골세포성인, 대부분은 상피성 전구체인) 부분적으로 분화된 전구체 집합체에 걸쳐 다능성 신경능 유사 세포(Neural-Crest-Like-Cells)로부터의 이종적으로 분화된 세포의 풀(pool)을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 용어 발모된 모발 및 발모된 모낭은 상호교환적으로 사용된다.
당업자는 생성되는 멜라닌세포의 총량을 조절하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된 발모된 모발의 양을 조정할 수 있다. 한 구체예에서, 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법의 단계 (i)에서 1 내지 500개의 발모된 모발의 모구들이 제거되고, 바람직하게는 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법의 단계 (i)에서 10 내지 80개의 발모된 모발의 모구들이 제거되며, 보다 바람직하게는 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법의 단계 (i)에서 30 내지 60개의 발모된 모발의 모구들이 제거된다.
줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법의 한 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 단계 (ii)과 단계 (iii) 사이에 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션 후 세척액으로 세척하는 추가의 단계를 포함한다.
적합한 세척액은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 한 바랍직한 구체예에서, 세척액은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 세척액은 바람직하게는 젠타마이신, 암포테리신 B, 페니실린, 스트렙토마이신, 네오마이신, 카베니실린, 페니실린 G, 암피실린, ㅍ폴리믹신-B, 테트라실린, 시프로플록사신, 린코마이신, 스펙티노마이신, 카베니실린, 티오스트렙톤, 세프타시딘, 아프라마이신, 반코마이신, 토브라마이신, 리파마이신 및 히그로마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항생제를 포함하며, 바람직하게는 상기 세척액은 젠타마이신, 암포테리신 B, 페니실린, 스트렙토마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항생제를 포함한다.
당업자는 세척액에 대한 항생제의 농도 및 또는 적합한 염을 결정할 수 있다. 그러나, 바람직한 항생제 및 바람직한 농도는 다음과 같이 괄호 안에 주어진다: 페니실린, 예컨대페니실린 (50 U/ml 내지 150 U/ml, 바람직하게는 100U/ml), 스트렙토마이신-설페이트 (50pg/ml 내지 20 mg/ml, 바람직하게는 100㎍/ml), 젠타마이신-설페이트 (5 ㎍/ml 내지 3000 ㎍/ml, 바람직하게는 50 ㎍/ml), 암포테리신 B (0,25 pg/ml 내지 30 ㎍/ml, 바람직하게는 2,5 ㎍/ml), 니스타틴(25 ㎍/ml 내지 600 ㎍/ml, 바람직하게는 50 ㎍/ml), 카나마이신-설페이트 (50 pg/ml 내지 10000 ㎍/ml, 바람직하게는 100 ㎍/ml), 네오마이신-설페이트 (25 ㎍/ml 내지 3000 ㎍/ml, 바람직하게는 50 ug/ml), 스트렙토마이신-설페이트, 암피실린트리하이드레이트 (50 U/ml 내지 200 U/ml, 바람직하게는 100U/ml), 카베니실린, 바람직하게는 디-소듐-카베니실린, (50 U/ml 내지 200 U/ml, 바람직하게는 100U/ml), 암피실린 소듐염 (50 U/ml 내지 200 U/ml, 바람직하게는 100 U/mL), 폴리믹신-B-설페이트 (25㎍/ml 내지 3000 ㎍/ml, 바람직하게는 100 ㎍/ml), 7-클로르테트라사이클린-하이드로클로라이드 (2 ㎍/ml 내지 80 ㎍/ml, 바람직하게는 10㎍/ml), 옥시테트라사이클린-하이드로클로라이드 또는 7-하이드록시-테트라사이클린(각각 2 내지 25 ㎍/ml, 바람직하게는 5 ㎍/ml), 테트라사이클린-HCl (5 내지 35 ㎍/ml, 바람직하게는 10 ㎍/ml), 에리트로마이신(50 ㎍/ml 내지 300 ㎍/ml, 바람직하게는 100 ㎍/ml), 틸로신-타르트레이트 (2㎍/ml 내지 300 ㎍/ml, 바람직하게는 10 ㎍/ml), 클로르암페니콜(2 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml, 바람직하게는 5 ㎍/ml), 시프로플록사신(1㎍/ml 내지 10㎍/ml), 린코마이신(50㎍/ml), FungizoneTM(스트렙토마이신) (5 ㎍/ml 내지 50㎍/ml, 바람직하게는 10 ㎍/ml), 카베니실린(100U/ml), 티오스트렙톤(25㎍/ml), 세프타시딘-하이드레이트 (100㎍/ml), 아프라마이신 (2,5 ㎍/ml 내지 25 ㎍/ml), 반코마이신-하이드로클로라이드(100㎍/ml), 토브라마이신(4 ㎍/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 80㎍/ml), 리파마이신 (400㎍/ml), 히그로마이신 (200㎍/ml).
바람직한 구체예에서, 상기 세척액은 젠타마이신, 바람직하게는 10 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml의 농도, 보다 바람직하게는 25 ㎍/ml 내지 75 ㎍/ml의 농도, 보다 더 바람직하게는 50 ㎍/ml의 농도의 젠타마이신을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 상기 세척액은 암포테리신 B, 바람직하게는 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml의 농도의, 보다 바람직하게는 5 ㎍/ml 내지 15 ㎍/ml의 농도의, 보다 더 바람직하게는 10 ㎍/ml의 농도의 암포테리신 B를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 세척액은 2 종의 항생제, 바람직하게는 젠타마이신 및 암포테리신 B를 포함한다.
추가의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 세척액은 DMEM, 50 ㎍/ml의 농도의 젠타마이신 및 10 ㎍/ml의 농도의 암포테리신 B를 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 상기 세척액은 DMEM, 50 ㎍/ml의 농도의 젠타마이신 및 10 ㎍/ml의 농도의 암포테리신 B로 이루어진다.
콜라겐분해제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 맥락에서 콜라겐분해제는 단백질을 구성하고 있는 고분자인 콜라겐을 더 작은 단위로 분해하는 모든 시약이다. 본 발명자들은 흥미롭게도 콜라겐분해제로의 처리에 의해 배양 동안 모발 근초세포(hair root sheath 세포)의 나머지들로부터 외모낭초 (ORS)의 세포들이 보다 쉽게 분리된다는 점을 발견하였다. 콜라겐의 분해는 세포외기질을 약하게 하며 줄기세포, 전구체 및 분화된 세포들을 포함한 세포들을 이탈시킨다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 콜라겐분해제는 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 콜라겐 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 콜라겐을 분해한다. 바람직한 구체예에서, 콜라겐분해제는 효소,바람직하게는 콜라게나제이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 콜라겐분해제는 콜라게나제 I, IV 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 콜라게나제이다. 당업자는 콜라겐 I, IV 및 V가 세포 표면, 세포 기저막의 베이스, 피부 및 모발을 각각 뒤덮고 있음을 인지할 것이다. 콜라게나제는 바랍직하게는 하나 이상의 타입의 콜라겐을 분해할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서 콜라겐분해제는 콜라게나제 V이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 콜라겐분해제는 5 mg/ml의 농도의 콜라게나제 V이다.
당업자는 줄기세포, 멜라닌세포 전구체 및 멜라닌세포의 분화를 유도하고 성장을 자극하는 분화 배지의 적합한 조성을 알고 있으며, 여기에서 배지는 기능적인 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함한다. 당업계에 공지된 표준 분화 배지가 여기에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 분화 배지는 Szabad et al. Arch. Derm. Res. (2007) 299:191-200, Kauser et al. Endocrinology (2005) 146 (2):532-543, http://lifelinecelltech.com/docs/SPM_DermaLife_M에 기술되어 있다. 바람직하게는, 여기에서 사용되는 분화 배지는 (포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와 같은) 종양 프로모터는 함유하지 않는다. 바람직한 구체예에서 분화 배지는 영양 베이스, 바람직하게는 낮은 소 혈청 함량의 더마라이프 배지(DermaLife medium, DLM) 베이스(Life Line Cell Technology), DMEM 배지((Dulbeccos Modified Eagle Medium) 베이스(Sigma-Aldrich), F12 Ham's nutrient mixture (Sigma-Aldrich), 및 PC-1 배지 베이스 (Lonza)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영양 베이스를 포함한다. 바람직한 구체예에서 분화 배지는 영양 베이스로서 더마라이프 배지 베이스를 포함하며, 보다 바람직하게는 더마라이프 배지는 단일의 영양 베이스이다. 특히 바람직하게는 콜라겐분해제는 콜라게나제 V이고; 분화 배지는 영양 베이스로서 ㄷ더마라이프 배지(DLM) 베이스를 포함하며, 보다 바람직하게는 DLM은 분화 배지 내에 포함된 단일의 영양 베이스이다. 본 발명에 따른 방법은 예기치않게도 혈청 농도가 낮거나 혈청이 없는 배지의 사용을 가능하게 한다. 그러므로, 분화 배지는 낮은 혈청 농도, 바람직하게는 2.5 % 미만, 보다 바람직하게는 2 % 미만, 보다 더 바람직하게는 1 % 미만, 보다 더 바람직하게는 0.5 % 또는 그 미만의 혈청 농도를 갖는 것이 바람직하다. 보다 더 바람직하게는 분화 배지의 혈청 농도는 0.5 %이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 분화 배지는 무혈청이다.
추가의 영양성분 및 첨가제가 적용될 수 있다. 바람직한 구체예에서 분화 배지는 에피네프린 및 그의 유도체와 같은 β-아드레날린성 수용체 리간드, Ca2 +, L-글루타민, 인슐린, 비타민 C, 송아지 혈청, 상피세포성장인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 및 그의 변이체 bFGF/FGF2, 엔도텔린-1, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 하이드로코르티손, 줄기세포 Factor (SCF), 신경성장인자 β (NGF-β), 간세포 성장인자 (HGF), StiMel 인자 칵테일 (Life Line Cell Technology), 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물들을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서 분화 배지는 영양 베이스로서 더마라이프 배지(DLM) 베이스, 및 에피네프린 및 그의 유도체와 같은 β-아드레날린성 수용체 리간드, Ca2 +, L-글루타민, 인슐린, 비타민 C, 송아지 혈청, 상피세포성장인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 및 그의 변이체 bFGF/FGF2, 엔도텔린-1, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 하이드로코르티손, 줄기세포 Factor (SCF), 신경성장인자 β (NGF-β), 간세포 성장인자 (HGF), StiMel 인자 칵테일 (Life Line Cell Technology), 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하며, 바람직하게는 DLM은 분화배지에 포함되어 있는 단일의 영양 베이스이고, 분화 배지는 에피네프린 및 그의 유도체와 같은 β-아드레날린성 수용체 리간드, Ca2 +, L-글루타민, 인슐린, 비타민 C, 송아지 혈청, 상피세포성장인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 및 그의 변이체 bFGF/FGF2, 엔도텔린-1, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 하이드로코르티손, 줄기세포 Factor (SCF), 신경성장인자 β (NGF-β), 간세포 성장인자 (HGF), StiMel 인자 칵테일 (Life Line Cell Technology), 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 추가로, 바람직한 구체예에서 콜라겐분해제는 콜라게나제 V이고; 분화 배지는 영양 베이스로서 더마라이프 배지(DLM) 베이스 및 에피네프린 및 그의 유도체와 같은 β-아드레날린성 수용체 리간드, Ca2 +, L-글루타민, 인슐린, 비타민 C, 송아지 혈청, 상피세포성장인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 및 그의 변이체 bFGF/FGF2, 엔도텔린-1, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 하이드로코르티손, 줄기세포인자(SCF), 신경성장인자 β (NGF-β) , 간세포 성장인자 (HGF), StiMel 인자 칵테일 (Life Line Cell Technology), 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하며, 바람직하게는 DLM은 분화 배지 내에 포함되는 단일의 영양 베이스이고 분화 배지는 에피네프린 및 그의 유도체와 같은 β-아드레날린성 수용체 리간드, Ca2 +, L-글루타민, 인슐린, 비타민 C, 송아지 혈청, 상피세포성장인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 및 그의 변이체 bFGF/FGF2, 엔도텔린-1, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 하이드로코르티손, 줄기세포 Factor (SCF), 신경성장인자 β (NGF-β), 간세포 성장인자 (HGF), StiMel 인자 칵테일 (Life Line Cell Technology), 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함한다.
추가의 영양성분 및 첨가제는 당업계에 잘 알려진 적합한 농도로 적용될 수 있다. 그러나, 바람직한 농도는 하기 주어진 바와 같다:
바람직한 구체예에서 분화 배지는 L-글루타민을, 바람직하게는 3 mM 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 4 mM 내지 8 mM, 보다 더 바람직하게는 5　mM 내지 7 mM의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직하게는 분화 배지는 6 mM의 농도의 L-글루타민을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서 분화 배지는 인슐린을, 바람직하게는 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 2 ㎍/ml 내지 8 ㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 4 ㎍/ml 내지 6 ㎍/ml의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화 배지는 5 ㎍/ml의 농도의 인슐린을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서 분화 배지는 비타민 C를, 바람직하게는 10 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 20 ㎍/ml 내지 80 ㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 40 ㎍/ml 내지 60 ㎍/ml의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 50 ㎍/ml의 농도의 비타민 C를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 에피네프린을, 바람직하게는 0.1 μM 내지 5 μM, 보다 바람직하게는 0.3 μM 내지 2.5 μM, 보다 더 바람직하게는 0.5 μM 내지 1.5 μM의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 1 μM의 농도의 에피네프린을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 칼슘 클로라이드를, 바람직하게는 0.1 mM 내지 0.4mM, 보다 바람직하게는 1.5 mM 내지 2.5 mM의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 0.2 mM의 농도의 칼슘 클로라이드를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 소 뇌하수체 추출물을, 바람직하게는 10㎍/ml 내지 40㎍/ml, 보다 바람직하게는 15㎍/ml 내지 35㎍/ml의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 25㎍/ml의 농도의 소 뇌하수체 추출물을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 염기성 섬유아세포 성장인자 bFGF/FGF2를, 바람직하게는 1ng/ml 내지 20ng/ml, 보다 바람직하게는 5ng/ml 내지 15ng/ml의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 10 ng/ml의 농도의 염기성 섬유아세포 성장인자 bFGF/FGF2를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 상피세포성장인자 EGF을, 바람직하게는 0.2ng/ml 내지 20ng/ml, 보다 바람직하게는 1.5 ng/ml 내지 5 ng/ml의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 2.5 ng/ml의 농도의 상피세포성장인자 EGF를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 엔도텔린을, 바람직하게는 0.2ng/ml 내지 20ng/ml, 보다 바람직하게는 1 ng/ml 내지 10 ng/ml의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 5 ng/ml의 농도의 엔도텔린을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서 분화 배지는 StiMel 인자 칵테일 (Life Line Scientific Inc.)을, 바람직하게는 0.1 % 내지 5 %, 보다 바람직하게는 0.3 μM 내지 2.5 μM, 보다 더 바람직하게는 0.5 % 내지 1.5 %의 농도로 포함하며, 보다 더욱 더 바람직한 분화배지는 1%의 농도의 StiMel 인자 칵테일을 포함한다.
추가의 구체예에서 분화 배지는 콜레라 독소를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서 분화 배지는 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA, TPA)와 같은 종양 프로모터를 포함하지 않는다. 바람직한 구체예에서 분화 배지는 콜라겐 독소와 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA, TPA)와 같은 종양 프로모터 중 어느 것도 포함하지 않는다.
본 발명의 맥락에서 "항생제"는 박테리아 또는 곰팡이와 같은 미생물의 성장을 저해 및/또는 미생물의 사멸을 유도할 수 있는 시약, 및/또는 빠르게 분열하는 세포에 대한 추가의 선택적인 시약으로서 언급된다. 적합한 항생제는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 항생제는 페니실린, 암포테리신 B, 젠타마이신, 스트렙토마이신 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 항생제의 바람직한 조합은 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B 및 제넥티신이다.
바람직한 구체예에서 분화 배지는 페니실린을, 바람직하게는 1.000 units/ml 내지 20.000 units/ml, 보다 바람직하게는 5.000 units/ml 내지 15.000 units/ml의 농도로 포함하며, 보다 더 바람직하게는 분화 배지는 10.000 units/ml의 농도의 페니실린을 포함한다.
바람직한 구체예에서 분화 배지는 암포테리신 B를, 바람직하게는 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 5 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml의 농도로 포함하며, 보다 더 바람직하게는 분화 배지는 10 ㎍/ml의 농도로 암포테리신 B를 포함한다.
매우 바람직한 구체예에서 분화 배지는 젠타마이신을, 바람직하게는 10 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 25 ㎍/ml 내지 75 ㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 50 ㎍/ml의 농도로 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서 분화 배지는 10.000 units/ml의 농도의 페니실린, 10.000 ㎍/ml의 농도의 스트렙토마이신, 및 25 ㎍/ml의 농도의 암포테리신 B를 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서 분화 배지는 DLM이고 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서 분화 배지는 10.000 units/ml의 농도의 페니실린, 10.000 ㎍/ml의 농도의 스트렙토마이신, 및 25 ㎍/ml농도의 암포테리신 B를 포함한다.
또다른 특히 바람직한 구체예에서 분화 배지 베이스는 Dulbecco, R and Freeman, G. (1959) Virology 8:396)에 개시된 공지의 포뮬레이션을 갖는Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 보다 더 바람직하게는 GMP-수준의 품질로 Sigma®에서 생산된 DMEM 5030이다.
분화 동안 배지는 원하는 대로 교환될 수 있다. 당업자는 언제 어떻게 배지를 교체할지 알고 있다. 바람직한 구체예에서 배지는 분화 동안 2일마다 교체된다.
당업자는 분화 배지에 대한 적합한 배합과 농도를 선택할 수 있다. 그러나, 일부 바람직한 배합과 농도는 아래에 주어진다.
바람직한 구체예에서 Life Line Cell Technology에서 구입한 더마라이프 분화 배지가 분화 배지로서 사용되며, 이는 낮은 소 혈청 함량(0.5%)의 DLM 배지 베이스, L-글루타민 (6 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), StiMel 인자 칵테일 (1 %) 및 항미생물 서플먼트(Antimicrobial supplement) (페니실린 10.000 units/ml, 스트렙토마이신 10.000 ㎍/ml, 및 암포테리신 B 25 ㎍/ml)를 포함한다. 다른 구체예에서 분화 배지는 낮은 소 혈청 함량(0.5%)의 DLM 배지 베이스, L-글루타민 (6 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), StiMel 인자 칵테일 (1 %) (성장인자의 혼합물, LifeLine Technology) 및 젠타마이신 (50 ㎍/ml)을 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서 Life Line Cell Technology에서 구입한 더마라이프 분화 배지가 분화 배지로서 사용되며, 이는 낮은 소 혈청 함량(0.5%)의 DLM 배지 베이스, L-글루타민 (6 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), StiMel 인자 칵테일 (1 %) 및 젠타마이신 (50 ㎍/ml)을 포함한다. 다른 구체예에서 분화 배지는 낮은 소 혈청 함량(0.5%)의 DLM 배지 베이스, L-글루타민 (6 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), 및 StiMel 인자 칵테일 (1 %) (성장인자의 혼합물, LifeLine Technology)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 DLM 기초 배지, L-글루타민 (6 mM), Ca2 + (0,2 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), 및/또는 EGF (1ng/ml), 및/또는 bFGF/FGF2 (10 ng/ml), 및/또는 엔도텔린-1 (20 nM), 및/또는 α-MSH (5 nM), 및/또는 하이드로코르티손 (0,5 ㎍/ml), 및/또는 SCF (10 ng/ml), 및/또는 NGF-β(20　ng/ml), 및/또는 HGF (10 ng/ml), 및/또는 젠타마이신 (50 ㎍/ml)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 무혈청 PC-1 배지 베이스 및/또는 DMEM 및/또는 F12,, 1-10% 인간 혈청, L-글루타민 (6mM), Ca2 + (0,2 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (0,2%), 에피네프린 (0,2%), EGF (1ng/ml), 및/또는 bFGF/FGF2 (10 ng/ml), 엔도텔린-1 (20 nM), 및/또는 α-MSH (5 nM), 하이드로코르티손 (0,5 ㎍/ml), SCF (10 ng/ml), 및/또는 NGF-β(20 ng/ml), 및HGF (10 ng/ml), 젠타마이신 (f.c. 50 ㎍/ml)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 DMEM 기초 배지, L-글루타민 (6 mM), Ca2 + (0,2 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), 및/또는 EGF (1ng/ml), 및/또는 bFGF/FGF2 (10 ng/ml), 및/또는 엔도텔린-1 (20 nM), 및/또는 α-MSH (5 nM), 및/또는 하이드로코르티손 (0,5 ㎍/ml), 및/또는 SCF (10 ng/ml), 및/또는 NGF-β(20　ng/ml), 및/또는 HGF (10 ng/ml), 및/또는 젠타마이신 (50 ㎍/ml)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 DMEM 배지 베이스, 1-10% 인간 혈청, L-글루타민 (6mM), Ca2+ (0,2 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (0,2%), 에피네프린 (0,2%), EGF (1ng/ml), 및/또는 bFGF/FGF2 (10 ng/ml), 엔도텔린-1 (20 nM), 및/또는 α-MSH (5 nM), 및/또는 하이드로코르티손 (0,5 ㎍/ml), 및/또는 SCF (10 ng/ml), 및/또는 NGF-β(20 ng/ml), 및 HGF (10 ng/ml), 젠타마이신 (f.c. 50 ㎍/ml)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 분화 배지는 DMEM 배지 베이스, 1-10% 인간 혈청, L-글루타민 (6mM), Ca2+ (0,2 mM), 소 뇌하수체 추출물 (25㎍/ml), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (0,2%), 에피네프린 (0,2%), EGF (1ng/ml), bFGF/FGF2 (10 ng/ml), 상피세포성장인자 EGF (2.5 ng/ml), 엔도텔린-1 (20 nM), 젠타마이신 (50 ㎍/ml)을 포함한다.
더욱 더 바람직한 구체예에서 분화 배지는 DMEM 배지 베이스, 5% 인간 혈청, L-글루타민 (6mM), Ca2+ (0,2 mM), 소 뇌하수체 추출물 (25㎍/ml), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (0,2%), 에피네프린 (0,2%), EGF (1ng/ml), bFGF/FGF2 (10 ng/ml), 상피세포성장인자 EGF (2.5 ng/ml), 엔도텔린-1 (20 nM), 젠타마이신 (50 ㎍/ml)을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 성장인자 및 배양 시약은 당업자에게 알려져 있으며 필요에 따라 조정할 수 있다. 바람직하게는 이들 성장인자 및 배양 시약은 줄기세포의 멜라닌세포로의 분화를 촉발하거나, 또는 적어도 멜라닌세포 분화 과정을 방해하지 않고 멜라닌세포의 성장과 스케일업을 이롭게 한다. 그러나, 본 발명에 따른 멜라닌세포 생성 방법의 한 구체예에서 성장인자 및 배양 시약은 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 하이드로코르티손, 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF), 디부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (dbcAMP), 멜라닌세포 성장인자 (MeGF), 카포시 육종 유래 FGF-유사 인자 (hst/K-FGF), 간세포 성장인자 (HGF), 줄기세포 성장인자 (SCF), 엔도텔린-1, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH) 및 배양된 인간 케라틴세포에 의해 조성된 배지로부터의 또는 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 또는 소 뇌 추출물 (Wilkins et al. 1985)로부터의 천연인자의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서 줄기세포 및/또는 멜라닌세포 전구체로부터의 멜라닌세포 생성 방법의 분화 단계 (ii)는 저산소 조건(hypoxic conditions) 또는 정상산소 조건(normoxic conditions) 하에서 수행된다. 보다 바람직하게는, 분화 단계는 저산소 조건 하에서 수행된다.
"저산소 조건"은 정상 대기 산소 함량 아래의 산소 함량을 갖는 조건을 말한다. 그러므로 한 구체예에서 줄기세포 및/또는 멜라닌세포 전구체로부터의 멜라닌세포 생성 방법의 단계 (ii)는 20 % 이하, 바람직하게는 10 % 이하의 O2 함량을 갖는 조건, 보다 더 바람직하게는 1 % 내지 5 %의 O2 함량을 갖는 조건 하에서 수행된다. 바람직한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 배양 단계는 5 %의 O2 함량 및 5 %의 CO2 함량을 갖는 조건 하에서 수행된다.
또한, 바람직한 구체예에서 분화 단계 (ii)는 배지-공기 인터페이스(medium-air interface)에서 수행된다. 당업자는 배지-공기 인터페이스에서의 분화를 어떻게 수행하는지 알고 있다. 바람직하게는 단계 (i)의 발모된 모낭의 남은 부분을 메쉬(mesh), 바람직하게는 나일론 메쉬 상에 위치시키며, 여기에서 나일론 메쉬는 분화 배지와 접촉하고 있다. 바람직한 나일론 메쉬는 1 μm 이하, 바람직하게는 0.5 μm 이하의 기공 크기를 가지며, 보다 바람직하게는 나일론 메쉬는 0.4 μm 기공 크기를 갖는다. 가장 바람직한 구체예에서 단계 (i)의 발모된 모낭을 0.4 μm 기공 폴리에스테르 멤브레인 인서트(Corning)를 갖는 24 mm Transwell® 상에 두고 배지-공기 인터페이스 조건에서 자라게 함으로써 배지-공기 인터페이스가 생성된다. 배지-공기 인터페이서의 바람직한 구체예에서 단계(i)의 발모된 모낭의 남은 부분은 저산소 조건 하에서 인큐베이션되며, 바람직하게는 그들은 저산소 가스 혼합물에 노출된다. 저산소 가스 혼합물은 바람직하게는 5 %의 O2 가스 분압을 가지며, 보다 바람직하게는 저산소 가스 혼합물은 추가로 5%의 CO2 가스 분압을 가지며, 가장 바람직하게는 저산소 가스 혼합물은 5 %의 O2 가스 분압, 5%의 CO2 가스 분압, 및 90%의 N2 가스 분압을 가진다.
본 발명자들은 예기치 않게도 본 발명에 따른 멜라닌세포 생성 방법의 배양 단계 (iii)은 배지가 줄기세포로부터 멜라닌세포의 생성을 위해 선택적이므로 모든 다른 세포들이 사라질때까지 수행될 수 있음을 발견하였다. 다른 세포 타입들은 흥미롭게도 선택적으로 사라지며 오로지 멜라닌세포만 남는다. 그러므로, 본 발명의 한 구체예에서 단계 (iii)은 세포의 적어도 85 %가 분화된 멜라닌세포일때까지, 바람직하게는 세포의 적어도 95 %가, 보다 바람직하게는 세포의 적어도 99 %가, 보다 더 바람직하게는 모든 세포가 분화된 멜라닌세포일 때까지 수행된다.
당업자는 세포가 분화된 멜라닌세포인지 아닌지 결정하는 방법을 알고 있다. 예를 들어 당업자는 세포가 멜라닌세포 마커를 발현하는지 섬유아세포 마커를 발현하지 않는지를 결정할 수 있다. 공지의 멜라닌세포 마커는 예를 들어 멜라닌세포에서 특성적으로 발현되는 유전자로서 티로시나제, 당단백질 100(glycoprotein 100, (gp100)) 변이체, 칼슘-결합 S100 단백질(calcium-binding S100 proteins), MITF(Microphtalmia-associated Transcription Factor); 추가로, DOPA-토토머라제 활성 및 다음으로 멜라닌 함량이 멜라닌세포의 기능의 신뢰할만한 마커이다. 섬유아세포 마커는 예를 들어 CD-90(Cluster of Differentiation 90 세포 표면 protein), CD34(Cluster of Differentiation 34), 섬유아세포 표면 항원(SFA), HSP47(Heat Shock Protein 47)이다. 완전히 분화된 멜라닌세포 및 섬유아세포는 또한 특성적인 형태를 띤다.
그러나, 본 발명에 따른 멜라닌세포 생성 방법의 한 구체예에서 상기 방법은 배양물 중의 분화된 멜라닌세포를 선별 및 분리하는 추가의 단계 (iv)를 포함한다.
이에 따르면, 하기 단계를 포함하는 줄기세포로부터 멜라닌세포의 생성 방법이 제공된다:
(i) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하는 단계;
(ii) 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터 분리된 줄기세포를, 줄기세포, 멜라닌세포 전구체 및 멜라닌세포의 분화를 유도하고 성장을 촉진하며, 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계,
(iv) 배양물 중에서 분화된 멜라닌성 멜라닌세포를 분리해 내는 단계,
여기에서 멜라닌 세포는 단계 (iv)에서 모근 소부의 해부학적 선별을 이용하여 분리된다. 단계 (iv)는 모근 소부의 해부학적 선별을 이용하는 것을 대체하여 또는 추가로 분별적 트립신처리(분별적 트립신처리)를 포함할 수 있다. 단계 (iv)는 모근 소부의 해부학적 선별을 이용하는 것을 대체하여 또는 추가로 및 또는 분별적 트립신처리를 대체하여 또는 추가로, 제넥티신 처리를 포함할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 여기에서 제공된 방법에 따라 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계는 예컨대, 세포외 기질로부터의 줄기세포의 이탈/이동/이주를 포함할 수 있다.
하기 단계를 포함하는 줄기세포로부터 멜라닌세포의 생성 방법이 제공된다:
(i) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하는 단계;
(ii) 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터 분리된 줄기세포를, 줄기세포, 멜라닌세포 전구체 및 멜라닌세포의 분화를 유도하고 성장을 촉진하며, 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계,
(iv) 배양물 중에서 분화된 멜라닌성 멜라닌세포를 분리해 내는 단계,
여기에서 선별 단계는 제넥티신 처리를 포함한다.
여기에서 제공되는 방법에서 선별 및/또는 분리 단계는 분별적 트립신처리 및 계속적으로 제넥티신 처리를 이용하여 멜라닌세포를 분리하는 것을 포함한다. 다시 말해, 여기에서 제공된 방법에서 선별 및/또는 분리 단계는 분별적 트립신처리와 함께 제넥티신 처리를 이용하여 멜라닌세포를 분리하는 것을 포함한다.
배양물로부터 분화된 멜라닌성 멜라닌세포를 선택 및 분리하기 위한 다른 방법이 알려져 있다. 분별적 트립신처리 또는 제넥티신 처리의 방법은 공지의 방법이다(In Vitro. 1984 May;20(5):447-50, Exp Cell Res. 1982 Dec;142(2):309-15, Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Mar;79(6):2018-22). 당업자들은 이들 방법을 알고 있다. 그러나, 본 발명자들은 예기치 않게도 위에서 개략된 방법에 의해 얻어진 멜라닌세포의 순도와 양이 분별적 트립신처리 및/또는 제넥티신 처리를 이용하여 추가적으로 향상될 수 있음을 발견하였다. 그러므로, 본 발명에 따른 멜라닌세포의 생성 방법의 한 구체예에서, 멜라닌성 멜라닌세포는 분별적 트립신처리 및/또는 제넥티신 처리를 이용하여 단계 (iv)에서 분리된다. 예기치 않게도 본 발명자들은 이들 두 방법 모두를 수행할 경우, 바람직하게는 분별적 트립신처리는 세포 배양의 매 계대에서 수행하는 반면 제넥티신 처리는 24 내지 48 시간의 과정에서 1번, 바람직하게는 48시간의 과정에서 1번 적용할 때, 분화된 멜라닌성 멜라닌세포의 선별 및 분리가 크게 향상됨을 밝혀냈다. 본 발명의 한 구체예에서 멜라닌성 멜라닌세포는 단일의 제넥티신 처리와 조합되어 분별적 트립신처리를 이용하여 분리된다.
분별적 트립신처리는 당업자에게 알려져 있다. 분별적 트립신처리의 한 구체예에서 세포들을 완충액으로 세척하고 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 처리한다. 트립신처리의 보다 바람직한 구체예에서, 세포들을 HEPES 완충액으로 세척하고, 0,04 % 트립신/0,03 % EDTA로 4 분 동안 처리한다. 4분은 멜라닌세포가 트립신의 자극 하에서 그들의 덴드라이트(dendrites)를 빼내고 세포 배양 용기의 폴리스티렌 표면으로부터 떨어지기에 충분한 시간을 나타낸다. 섬유아세포 및 케라틴세포는 커다란 세포체으로 부착되어 있으므로 더 강한 부착력을 갖고 있어 스트레스 자극에 대해 더 강하므로, 그들은 멜라닌세포에 비해 트립신에 대해 더 길게 노출될 필요가 있고 트립신 소화의 4분 후에도 여전히 부착되어 있다. 트립신처리된 느슨한 순수한 멜라닌세포를 갖는 상층액을 다음 계대 배양으로 가져가 추가로 배양한다.
제넥티신 처리는 당업자에게 알려져 있다. 제넥티신은 항생제로서, 80S 리보좀 및 그에 따른 단백질 합성의 잘 알려진 저해제이다. 제넥티신에의 노출은 단백질 합성에 대한 많은 필요를 갖는 빠르게 분열하는 세포, ORS 초기 배양의 경우에서는 타겟이되는 멜라닌세포 배양의 주요 오염원이 되는 케라틴세포 및 섬유아세포에 가장 강한 영향을 미친다. 다시 말하면, 멜라닌세포는 느리게 분열하는 세포이므로 제넥티신 스트레스에 꽤 영향을 받지 않고, 따라서 그들은 48시간까지 계속되는 제넥티신처리에도 모두 생존하게 된다. 이러한 과정에서, 건강하게 부착되어 있는 멜라닌세포와 세포고사성, 그리고 세포괴사성의 둥글게 반쯤 느슨해진 섬유아세포와 케라틴세포를 처리된 배양물 내에서 관찰할 수 있다. 비-선별된 섬유아세포와 케라틴세포의 떨어져나간 대부분은 HEPES 완충액으로 흘려보내고, 부착되어 남아있는 것들은 생존하지는 않으므로 다음 계대에서 이탈하게 된다. 한 구체예에서 제넥티신은 12시간 내지 48시간 동안, 바람직하게는 24시간 내지 48시간 동안, 보다 바람직하게는 약 24시간 동안, 보다 더 바람직하게는 약 48시간 동안 적용된다. 당업자는 제넥티신이 적용되는 시간을 결정할 수 있을 것이다. 이 처리는 진핵세포의 번역을 차단한다. 빠르게 분열하는 세포들은 매우 활동적인 단백질 생산(그에 따라 매우 강력한 번역)을 하기 때문에 제넥티신에 대해 보다 더 민감하다. 본 발명자들은 서섬유아세포와 케라틴세포는 빠르게 분열하여 선별에서 배제되는 반면 멜라닌세포는 느리게 분열하여 선별에서 생존함을 발견하였다. 그러므로, 당업자는 섬유아세포 및 케라틴세포의 양을 관찰함으로써 제넥티신으로 처리할 세포에 대한 시간을 결정하고 그에 기초하여 처리의 최적 시간을 확립할 수 있다.
또한, 여기에서 제공되는 방법은 멜라닌세포의 유리하고도 개선된 생성을 가능하게 함이 여기에서 증명되었다. 여기에서 기술한 바와 같이(예컨대, 실시예1의 방법 섹션 참조) 모낭의 배지-공기-인터페이스 배양 후 멜라닌세포는 추가로 부착 배양과 규칙적인 계대로 배양될 수 있다. 따라서, 여기에서 제공되는 방법은 유리하게는 멜라닌세포의 부착 배양을 포함할 수 있다. 여기에서 제공된 방법은 추가로 멜라닌세포의 계대배양을 포함할 수 있다.
예를 들어, 멜라닌세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 이상(15회까지) 멜라닌세포의 수 또는 수율을 증가시키기 위해 계대배양될 수 있다. "계대(passaging)"는 특정 수의 세포(예컨대, 세포 용기 표면의 10% 이상을 뒤덮기에 충분한, 바람직하게는 25 cm2 용기 당 100.000 세포)를 본 발명에 따라 생산되는 첫번째 배지-공기-인터페이스 모낭 배양물로부터 얻는 것을 의미한다. 이들 세포는 여기에서 기술된, 실시예 1의 부착 배양과 같은 부착 배양 조건 하에서 배양된다. 세포들이 증식하여 주어진 표면 상의 80% 이상의 컨플루언스(confluence)에 도달할 때, 트립신에 의해 이들을 떼어내고 더 큰 용기 표면으로 옮긴다. 이 과정/사이클을 여기에서 계대라고 부른다.
이러한 과정은 장기간 동안 멜라닌세포 집단을 유지하기 위해 여러번 수행할 수 있다. 이 과정은 또한 본 발명과 관련하여 멜라닌세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 여기에서 제공된 멜라닌세포 생성 방법에 의해 얻을 수 있는 또는 얻어진 멜라닌세포를 제공한다. 첨부된 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 얻어진 멜라닌세포(또한 여기에서는 인간 모낭 멜라닌세포 또는 줄여서 "HM"이라고 부름)는 특징적인 수지상 형태, 마커 단백질(예컨대, 티로시나제, gp100 단백질의 변이체, NKI-beteb, HMB45)의 발현과 같은 멜라닌세포의 특징적인 특성을 갖는다. 또한, 여기에서 제공된 멜라닌세포는 이소부틸-메틸잔틴(IBMX)에 대한 반응성을 보인다. 그들은 또한 자발적인 멜라닌 생산 뿐만 아니라 L-DOPA의 멜라닌으로의 전환에서 사용되는 티로시나제, CDT/TRP-2, 및 TRP-1의 활성을 나타낸다. 멜라닌세포는 멜라닌 함량이 표시되며 CD90 신호/발현의 부재에 의해 특징 지워진다. 이들 특징적인 특성에 기인하여, 여기에서 제공된 멜라닌세포 (HM)는 정상적인 인간 상피 멜라닌세포 (NHEM)에 대한 좋은 대체물이다; 실시예 1 및 3 참조. 그렇지만, 여기에서 제공되는 멜라닌세포는 또한 NHEM과 같은, 다른 멜라닌세포와 비교하여 중요한 차이점을 보인다. 예를 들어, 여기에서 제공된 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 NHEM과 비교할 때 상이한 세포 표면 마커를 갖는다. 이러한 상이한 표면 마커에 기인하여, 여기에서 제공되는 멜라닌세포는 실시예 3에서 증명된 바와 같이, FACS와 같은, 통상적인 방법에 의해 예컨대, NHEM 세포로부터 쉽게 구별될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 NHEM과 같은 성체 피부 멜라닌세포와 같은 다른 멜라닌세포에 비해 더 작은 세포체과 더 짧은 덴드라이트(dendrites)를 갖고 있다; 실시예 3 및 도 17 참조. 또한 덴드라이트의 수가 NHEM과 같은 성체 피부 멜라닌세포와 같은 다른 멜라닌세포에 비해 본 발명에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포에서 약간 더 낮다. NHEM의 세포 표면은 본 발명의 멜라닌세포(HM 세포)에 비해 평균 23% 더 크고 그들의 덴드라이트는 39% 더 길다. 또한, NHEM는 평균적으로 HM에 비해 더 많은 덴드라이드를 갖고 있는 경향이 있다.
NHEM 세포는 377±135㎛2의 평균 표면을 나타내는 반면, HM는 290±74㎛2의 평균 표면을 나타내며, 그에 따라 NHEM 세포체은 HM 세포체에 비해 표면에서 23% 더 크다(p=0,0451). 따라서 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 NHEM과 같은 성체 피부 멜라닌세포와 같은 다른 멜라닌세포에 비해 평균 더 작은 표면 또는 세포체을 가지고 있다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포의 평균 표면 또는 세포체은 NHEM과 같은 성체 피부 멜라닌세포와 같은 다른 멜라닌세포의 평균 표면 또는 세포체에 비해 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 바람직하게는 적어도 20 % 더 작다.
NHEM의 덴드라이트는 평균 35,73±15 ㎛ 길이이며, 이는 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포 (HM 세포)의 덴드라이트의 21,57±10㎛ 길이에 비해 39% 더 길다(p=0,045). 따라서 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 NHEM과 같은 성체 피부 멜라닌세포와 같은 다른 멜라닌세포에 비해 평균적으로 더 짧은 덴드라이트를 갖는다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포의 평균 덴드라이트는 NHEM과 같은 성체 피부 멜라닌세포와 같은 다른 멜라닌세포의 평균 덴드라이트에 비해 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33 또는 34, 바람직하게는 적어도 35 % 더 짧다.
추가로, 실시예 3에서 볼 수 있는 바와 같이, NHEM은 덴드라이트의 평균 수(3,13±1,19)가 HM (2,47±0,64)에 비해 약간 더 높다(p=0,065, 유의성 없음).
표 3. 본 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포(여기에서 또한 "HM"로 지칭함)에서 발현되는 표면 마커의 표
Figure 112014050284570-pct00001

여기에서 제공되는 표 5는 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 또는 얻어진 멜라닌세포에 대한 특징적인 마커의 종합적인 요약을 보여준다("+"는 마커의 존재/발현을 나타낸다). 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 또는 얻어진 멜라닌세포는 표 5의 상기 마커들 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 다시 말해, 여기에서 제공되는 멜라닌세포는 하나의 마커를 단독으로 또는 다른 마커들 중 임의의 것과 조합하여(즉, 다른 마커들 중 하나 이상과 조합하여) 발현할 수 있다.
표 3은 여기에서 제공되는 멜라닌세포에서 발현/존재하고 NHEM 세포에서는 발현/존재하지 않는 마커들을 제공한다. 또한, 이 맥락에서, 여기에서 제공되는 멜라닌세포는 하나의 마커를 단독으로 또는 표 3의 다른 마커들 중 임의의 것과 조합하여(즉, 다른 마커들 중 하나 이상과 조합하여) 발현할 수 있다. 여기에서 기술한 바와 같이, 하나의 마커가 단독으로 또는 다른 마커와 조합으로 존재하는 것을 조사/분석할 수 있다.
여기에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 멜라닌세포는 표 3 및 5에 예시된 하나 이상의 잘 알려진 마커 유전자들을 발현한다. 그러한 마커의 비제한적인 예는 CD1a, CD28, CD77, CD79b, CD137 리간드, CD140a, CD140b, CD282, HLA-A2, HLA-DQ, CD104, CD106, CD142이다.
여기에서 제공되고 기술되는 멜라닌세포는 상기 유전자 중 적어도 하나를 단독으로 또는 표 3 및 5에 예시된 바와 같이 이들 또는 추가의 마커 유전자 중 하나 이상과 조합하여 발현한다.
여기에서 사용되는 이들 마커 유전자의 핵산 또는 단백질 서열은 NCBI와 같은 각각의 데이터베이스로부터 추론할 수 있다. 상기 표는 또한 각각의 데이터베이스의 기탁번호를 제공한다.
표식 "+" (예컨대, CD1a+)는 각각의 마커의 존재를 나타낸다, 즉, 이들 마커 유전자의 탐지가능한 발현 수준(단백질, mRNA 등)으로 반영될 수 있는 마커의 발현을 나타낸다. 일반적으로 세포는 여기에서 기술된 마커 유전자들 중 적어도 하나가 탐지가능한 발현 수준으로 존재한다면 여기에서 제공된 방법에 의해 얻을 수 있는 또는 얻어진 "멜라닌세포"로 구분된다. 그러한 유전자의 발현 수준의 탐지 및 평가 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 첨부된 실시예에서 또한 증명되고 있다. 따라서 여기에서 제공된 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 멜라닌세포일 수 있다(CD1a+, CD28+, CD77+, CD79b+, CD137 리간드+, CD140a+, CD140b+, CD282+, HLA-A2+, HLA-DQ+, CD104+, CD106+, 및/또는 CD142+).
예를 들어, 단백질 발현 수준은 FACS, 면역응집법(immunoagglutination), 면역침강법(immunoprecipitation)(예컨대 면역확산법(immunodiffusion), 면역전기영동법(immunelectrophoresis), 면역고정법(immune fixation)), 웨스턴 블로팅 기법, (인 시츄) 면역조직화학법, (인 시츄) 면역세포화학법, 친화성 크로마토그래피, 효소 면역어세이 등의 장점을 취하여 탐지할 수 있다. 단백질과 접촉하는 이들 및 다른 적합한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 또한, 예를 들어, Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Burke et al. (1990), Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990.)에 기술되어 있다.
유전자 산물이 mRNA인 경우, 접촉과 결합은 인 시츄 PCR과 같은 PCR 기법 및 노던 블로팅 기법의 장점을 취하여 수행할 수 있다. (특이적인) mRNA의 결합에 적합한 이들 또는 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Sambrook and Russell (2001, loc. cit.)에 기술되어 있다.
단백질 수준의 정량은 위에서 언급된 기법들, 특히 웨스턴 블로팅 기법의 장점을 취하여 수행될 수 있다. 일반적으로 숙력된 사람은 폴리펩티드의 정량을 위한 방법을 인지하고 있다. 용액 중 정제된 폴리펩티드의 양은 물리학적 방법, 예를 들어 광도측정법에 의해 조사할 수 있다. 혼합물 내 특정 폴리펩티드를 정량하는 방법은 예컨대, 항체의 특이적 결합에 의존한다. 항체의 특이성을 활용하는 특이적인 탐지 및 정량 방법은 예를 들어 면역조직화학법 (인 시츄)을 포함한다. 웨스턴 블로팅은 전기영동에 의한 단백질의 혼합물의 분리 및 항체에 의한 특이적인 탐지가 결합된 것이다. 전기영동은 2D 전기영동과 같은 다차원적일 수 있다. 대개, 폴리펩타이드들은 하나의 차원을 따라 그들의 명백한 분자량에 의해 그리고 다른 방향을 따라 그들의 등전점에 의해 2D 전기영동에서 분리된다.
유전자 산물, 특히 RNA/mRNA의 수준의 정량은 노던 블로팅 기법, mRNA 전사체에 대해 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트를 구비한 마이크로어레이 또는 DNA 칩 상에서의 혼성화 또는 상기 언급된 PCR 기법, 예컨대 실시간 PCR과 같은 정량적 PCR 기법 등의 장점을 취해 수행할 수 있다. 숙련된 사람은 성분의 양, 특히 상기 유전자 산물의 양을 신호의 강도와 조사되는 성분의 양 간의 상관관계(correlation), 바람직하게는 선형 상관관계(linear correlation) 분석의 이점을 취하여 조사할 수 있다.
당업자는 그의 통상적이고 일반적인 지식 및 여기에서 제공된 교시에 근거하여 여기에서 기술된 마커 유전자의 발현 수준을 쉽게 조사할 수 있는 위치에 있다. 특히, 숙련된 사람은 특정 마커가 여기에서 제공된 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포에서 발현되는지 또는 발현되지 않는지 신속하게 결정할 수 있다.
표면 단백질의 발현을 조사하기 위해 여기에서 사용된 예시적인 방법 또는 수반된 실시예에서 사용된 예시적인 방법은 형광 표지된 항체 결합 및 유세포분석법에 이한 분석의 조합에 근거한다. 상기 방법은 레이저 빔에 노출된 모세관을 통해 단일세포 현탁액을 움직이는데 근거한다. 세포벽 측(전방산란, FSC)과 그의 세포내 내용물(측방산란, SSC)에 이르기까지 회절로 정량될 수 있으며 상대적인 크기(FSC 해독) 또는 복잡성(SSC 해독)으로 해석될 수 있다. 모든 해독은 분석 시점에서 기본적인 형태적 파라미터 해독을 정의한 그래프의 x 및 y축 상에 플로팅될 수 있다. 전방 및 측방산락 측정은 형광신호에 독립적이다. 형광 신호 그 자체는 결합된 형광물질의 수에 직접적으로 비례한다, 실시예 3에 기재된 경우: 형광 항체(도 17, b)로 레이블링된 표면 수용체 마커(도 17, a). 실시예 3에서 사용된, BD FACS-Array와 같은 고속측정 유세포분석 장치는 형광물질의 페이드아웃(fadeout)이나 손실의 위험 없이 항체 패널의 신속한 측정을 가능하게 한다.
여기에서 사용된 세포 표면 마커 분석의 원리 및 방법론은 실시예 3에 증명 및 기술되어 있다(예컨대 실시예3의 방법 섹션 참조).
본 발명자들은 예기치못하게도 본 발명에 따른 멜라닌세포 수득 방법에 의해 유도된 멜라닌세포가 이식체 구성요소로서 이례적이게도 우수한 특성을 보임을 밝혔다. 그러므로, 본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, 멜라닌세포를 포함하는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법에 관한 것이다.
(i) 본 발명에 따른 줄기세포로부터의 멜라닌세포 생성 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포를 포함하는 현탁액을 제공하는 단계;
(ii) 생체적합성 담체를 제공하는 단계; 및
(iii) 상기 생체적합성 담체 상에서 멜라닌세포를 배양하는 단계.
멜라닌세포를 포함하는 현탁액은 추가로 피브린, 트롬빈, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
멜라닌세포는 추가로 다음 경로를 따라 적용될 수 있다: 액체 현탁액의 형태, 에어로졸(스프레이)로서, 표피 등가물(epidermal equivalent )을 형성하기 위한 단일 멜라닌세포 배양물 또는 케라틴세포와 배합된 배양물로서 또는 기저 멜라닌세포층 및 층상화된 케라틴세포로 구성된 세포성 표피 등가물로서 생체적합성 담체 상에서 키운 것. 추가적 구체예에서 멜라닌세포는 섬유아세포 및 케라틴세포와 배합되어, 멜라닌세포, 케라틴세포 및 섬유아세포를 포함하는 진피 등가물(dermal equivalent)을 형성할 수 있다.
한 구체예에서 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 케라틴세포를 포함한다.
케라틴세포를 얻는 방법 및/또는 층상화하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 그러나, 케라틴세포는 다른 방식으로 멜라닌세포와 함께 적용될 수 있다. 예를 들어, 케라틴세포는 생성되는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체 내에 포함될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 한 구체예에서, 상기 방법은 상기 생체적합성 담체 상에서 배양된 멜라닌세포 상에 케라틴세포를 층상화시키는 단계 (iv); 및 상기 생체적합성 담체 상에서 배양된 멜라닌세포 상의 상기 케라틴세포를 배양하는 단계 (v)를 추가로 포함한다. 또한, 상기 케라틴세포는 개별적으로, 예컨대 현탁액 또는 스프레이로서, 선택적으로는 추가의 생체적 담체 상에 제공될 수 있다.
본 발명자들은 멜라닌세포가 다른 방식으로 치료되는 영역에 적용될 수 있음을 밝혔다. 예를 들어, 고상 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체가 사용될 수 있다. 이 경우 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법에서 사용되는 생체적합성 담체는 스캐폴드로서 제공되며 치료되는 영역의 모양으로서 제공될 수 있다. 그러나, 다른 경우들에서는 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 예정되지 않은 모양으로 제공되는 것이 이로울 수도 있을 것이다. 그러한 경우에 대해 본 발명자들은 현탁액 또는 스프레이로서의 제공이 큰 이점을 보임을 밝혔다. 현탁액 또는 스프레이는 생체적합성 담체 없이도 제공될 수 있을 것이다. 그러나, 한 구체예에서 현탁액 도는 스프레이는 하기 개략된 바와 같은 생체적합성 담체를 포함하며, 여기에서 생체적합성 담체는 미시적(microscopic) 입자(미시적 생체적합성 담체) 폴리머성 네트워크로 구성된다. 미시적은 입자 또는 생체적합성 담체가 나노미터 또는 마이크로미터 범위의 두께를 가짐을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 "생체적합성 담체"는 인간 또는 동물 몸에 이식될 수 있고 세포가 그의 표면에 부착하는 것을 허용하는 구조 및 생체역학적 지지체를 제공할 수 있는 담체이다. 또한, 당업자는 담체가 무독성이며 이식받는 자의 생물학적 기능과 양립할 수 있어야 하며, 인 시츄 상에서 생물학적으로 분해가능 및/또는 조직과 양립가능함을 이해할 것이다. 바람직한 구체예에서 생체적합성 담체는 섬유의 네트워크로 이루어진 3차원적 구조를 제공한다. 그러한 구조는 세포들에게 세포의 배양, 올바른 형태와 기능성을 촉진하고 세포가 담체에 부착하는 것을 증가시켜 이식체의 기능성을 향상시킬 수 있는 세포에 대한 스캐폴드를 제공한다. 본 발명자들은 그러한 섬유의 네트워크가 멜라닌세포에게 효율적인 환경을 제공하고 그들의 멜라닌성 특성을 향상시킴을 밝혔다. 그러한 특성은 도파-토토머라제 및/또는 세포의 멜라닌 생산에 의해 측정될 수 있다. 본 발명자들은 예기치않게도 이들 특성이 본 발명에 따른 생체적합성 담체의 사용에 의해 향상됨을 밝혔다. 세포들이 섬유와 접할 수 있도록 모든 방향으로 섬유들이 돌출되어 있는 메쉬 또는 네트워크를 제공하는 다양한 물질들이 존재한다. 또한, 섬유는 세포가 그에 부착할 수 있는 크기/두께를 가져야 한다. 본 발명자들은 또한 그러한 생체적합성 담체 상에서 배양된 세포가 이들의 메쉬 내에서 3차원적 형태를 형성하는 반면, 세포 배양 내 납작한 표면에서는 오직 세포의 2차원적인 네트워크만 형성됨을 발견하였다. 당업자는 3차원적 구조가 멜라닌세포로아혀금 섬유의 네트워크에 의해 형성된 메쉬를 통해 이동하도록 하며 전체 스캐폴드에 이주시킴을 수 있음을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, Loth, T. (Electrospinning als Methode zur Herstellung von fibrillaren Zelltragern aus bioabbaubaren Polymeren, 2009)는 그러한 스캐폴드 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 생체적합성 담체는 폴리카프로락톤 (PCL), 콜라겐, 인간 콜라겐 I, 인간 콜라겐 IV, 인간 콜라겐 V, 단축 및 화학적으로 가교된 또는 다른 방식으로 개질된 콜라겐 체인, 피브린, 젤라틴, 및 표피-등가물 케라틴세포-기반 담체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질 중 적어도 하나로 구성된다. 케라틴세포를 포함하는 생체적합성 담체는 당업자에게 알려져 있으며 상업적으로 입수가능하다. 본 발명의 한 구체예에서 케라틴세포를 포함하는 생체적합성 담체는 Epidex® 케라틴세포-기반 표피 시스(epidermal sheath)(Euroderm Biotech & Aesthetics, Germany)이다. 특히 바람직한 구체예에서 생체적합성 담체는 폴리카프로락톤 (PCL)으로 구성된다. 그러한 생체적합성 담체를 생산하는 방법은 당업자가 잘 알고 있다.
한 구체예에서 본 발명에 따른 멜라닌세포는 콜라겐 및 피브린을 갖는 현탁액으로 제공된다.
본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 현택액, 에어로졸, 상피 등가물로서의 고상 이식체(스캐폴드로서 고상 생체적합성 담체를 이용)로서 상이한 이식 적용 경로를 통해 적용되는 것이 바람직하다. 상이한 경로에 대한 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 특성은 생체적합성 담체의 특성을 통해 조정될 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 생체적합성 담체는 상이한 형태로 제공될 수 있을 것이다. 상기 생체적합성 담체는 예를 들어, 스캐폴드로서의 고상 생체적합성 담체와 같은 미시적 형태로서 예컨대, 이종이식체 또는 이형이식제가 제공되는 영역에 맞춘 모양으로 제공된다. 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 현탁액 및/또는 에어로졸로서 제공될 수 있다, 즉, 치료될 영역에 맞게 또는 스프레이로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 생체적합성 담체는 생산되는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체에 대한 미시적 매트릭스로서 제공된다. 다른른 구체예에서 생체적합성 담체는 현탁액 및/또는 스프레이로서 제공된다.
생성된 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 또한 질환의 치료를 위해 사용되기 전까지 저작을 위해 제조될 수 있다. 따라서, 상기 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법은 추가로 적합한 완충액 및/또는 배지의 적용을 포함할 수 있다. 당업자는 생성된 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체가 상기 방법에서 사용된 생체적합성 담체의 형태에 대개 의존하는 상이한 형태로 제공될 수 있음을 인지할 것이다.
당업자는 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법에서 멜라닌세포의 배양을 위한 기간을 조정할 수 있다. 본 발명자들은 기저층의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서의 멜라닌세포의 배양이 표피 내에서와 동일한 올바른 형태와 세포 상호작용을 가능하게 함으로써 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 치료 잠재력을 대폭 향상시킴을 발견하였다. 그러므로, 본 발명의 한 구체예에서 멜라닌세포는 기저층의 형성을 해부학적으로 자극하기 위해 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법에서 배양된 멜라닌세포이다.
당업자는 멜라닌세포가 기저층을 형성하는지 아닌지를 조사하는 방법을 알고 있다. 기저층은 표피의 기저층으로서 멜라닌세포가 살고 있는 곳이다. 표피는 고려되는 피부의 지역에 따라 4-5개의 층으로 이루어져 있다. 이들 층은 오름차순으로 기저층/배반층(stratum basale / germinativum ), 가시층(stratum spinosum), 과리립층tratum granulosum), 투명층/반투명층(stratum lucidum), 및 각질층(stratum corneum)이다. 케라틴세포은 상부 4개의 층 내의 세포의 대부분에 존재한다. 그러므로 배양에서 케라틴세포는 표피의 해부적 구조을 모방하기 위해 층상화될 수 있다(소위 표피 등가물). 본 발명자들은 표피의 해부학적 구조에 상응하는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 제공이 멜라닌세포의 기능성을 보존하며 탈색소 질환의 궁극적인 치료를 위한 잠재력을 제공함을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 각질층의 형성시까지의 케라틴세포의 배양이 자가이식, 이종이식 또는 이형이식의 치료 결과를 대폭 향상시킴을 발견하였다. 그러므로 본 발명의 한 구체예에서 케라틴세포는 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 층상화 이전에 각질층의 형성시까지 배지-공기 인터페이스에서 배양된다. 각질층은 표피의 가장 윗층이다. 이는 납작하고 케라틴화된 케라틴세포로 구성되어 있다. 층상화된 표피 균등물의 절단면에서 상부층이 케라틴화되어 있는지를 형태학적으로 결정할 수 있다. 또한, 형태학적 분석을 뒷받침하기 위해 케라틴화된 세포의 염색도 가능하다. 그러므로, 당업자는 케라틴세포가 각질층을 언제 형성하였는지 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 바람직한 구체예에서, 케라틴세포는 8 내지 20 일, 바람직하게는 10 내지 15 일, 보다 더 바람직하게는 11 내지 12 일 동안 배양될 수 있다. 바람직한 구체예에서 케라틴세포는 배지-공기 인터페이스에서 배양된다.
케라틴세포의 배양을 위한 배지 및 조건은 당업자에게 알려져 있다. 적합한 배양 방법, 예컨대 배지 및 조건은 Int Wound J. 2009 Jun;6(3):226-32에 개시되어 있다.
본 발명자들은 예기치않게도 10:1의 케라틴세포: 멜라닌세포의 비율이 표피 내와 유사하여 멜라닌세포 기능 및 세포 상호작용을 유지시킴으써 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 효능을 증가시키고 그에 따라 하기 개략된 질환의 치료를 전망하게 함을 발견하였다. 그러므로, 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 한 구체예에서, 케라틴세포는 10:1의 비율로 배양된 멜라닌세포의 맨위에 층상화된다.
자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 단계 내에서 배양은 멜라닌세포 및 케라틴세포 모두를 배양하기 위해 수행될 수 있다. 한 구체예에서 배양 단계는 중립적 배양 배지에서 수행된다. 본 발명의 맥락에서 "중립적 배지"는 멜라닌세포 또는 케라틴세포에 영향을 미치는 보충성분을 함유하지 않는 배지에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서 중립적 배지는 에피네프린 및 그의 유도체와 같은 β-아드레날린성 수용체 리간드, 및/또는 Ca2 + 및/또는 비타민 C 및/또는 EGF 및/또는 bFGF/FGF2 및/또는 엔도텔린-1, α-MSH, SCF 및/또는 NGF-β 및/또는 HGF 및/또는 젠타마이신, 상피세포성장인자, 하이드로코르티손, 콜레라 독소, 아데닌, 트리요오드사이로닌, 및 알파-MSH로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 성장인자를 포함하지 않는다. 추가적 구체예에서 중립적 배양 배지는 배지 베이스, 바람직하게는 DLM 베이스 또는 DMEM 베이스, 섬유아세포 성장인자, N6-2'-디부티릴 아데노신-3'-5'-사이클릭 모노포스페이트 (dbAMP), L-글루타민, 0.5 % 내지 20 %의 혈청, 바람직하게는 0.5 %의 태아 혈청 또는 10 % 이하의 인간 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다.
바람직한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 배양 단계는 저산소 조건; 또는 정상산소 조건 하에서 수행된다.
추가로, 한 구체예에서, 배양은 배지-공기 인터페이스 또는 배지-커버된 표피 등가물(medium-covered epidermal equivalent)로서 수행될 수 있다.
"저산소 조건"은 정상 대기 산소 함량 미만의 산소 함량을 갖는 조건을 말한다. 따라서, 한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 단계(iv)는 20 % 이하, 바람직하게는 10 % 이하의 O2 함량, 보다 더 바람직하게는 1 % 내지 5 %의 O2 함량을 갖는 조건 하에서 수행된다. 바람직한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 배양 단계는 5 %의 O2 함량 및 5 %의 CO2 함량을 갖는 조건 하에서 수행된다. .
"정상산소 조건"은 정상 대기 산소 함량에서의 산소 함량을 갖는 조건을 말한다. 따라서, 한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생상 방법의 배양 단계는 대략 20%의 O2 함량을 갖는 조건 하에서 수행된다.
바람직한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법은 하기 조건하에서 수행된다: 대략 5 %의 O2 함량, 대략 5 %의 CO2 함량, 및 37℃의 온도 (Dieckmann et al, Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5에서 밝혀짐).
당업자는 세포의 배양 및/또는 인큐베이션을 수행하기 위한 방법을 알고 있다. 예를 들어 세포는 배지로 덮이거나 세포는 배지-공기 인터페이스에 존재할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서 생체적합성 담체는 배지-대기 인터페이스에 위치, 즉 생체적합성 담체는 그의 아래 측면에서 배지와 접촉하고 그의 위 측면에서 공기와 접촉한다. 본 발명의 다른 구체예에서 세포를 갖는 생체적합성 담체는 배지로 덮이며, 즉, 공기와 접촉하지 않는다.
추가의 바람직한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 인큐베이션 단계는 정상산소 조건 하에서 수행되며, 여기에서 생체적합성 담체는 인큐베이션 배지로 덮인다. 다른 구체예에서, 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 인큐베이션 단계는 정상산소 조건 하에서 수행되며, 여기에서 생체적합성 담체는 배지/공기 인터페이스에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 인큐베이션 단계는 저산소 조건 하에서 수행되며, 여기에서 생체적합성 담체는 배지/공기 인터페이스에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 인큐베이션 단계는 저산소 조건 하에서 수행되며, 여기에서 생체적합성 담체는 인큐베이션 배지로 덮인다.
자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 인큐베이션 단계는 원하는 특성에 도달할 때까지 수행된다. 이는 생체역학적 안정성을 포함한다, 즉 케라틴세포 및 멜라닌세포로 덮인 생성된 생체적합성 담체가 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 붕괴 없이 표적 지역에 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 적용을 가능하게 하는 강도를 제공해야 할 것이다. 추가로, 멜라닌, 티로시나제, gp100 변이체의 염색시 절단면은 기저층의 해부학적 등가물인 이식체의 낮은 단계에서 멜라닌세포의 존재를 나타내어야 한다. 멜라닌세포는 그들의 덴드라이트를 케라틴세포로 이루어진 높은 단계에까지 뻗친다(상부층의 해부학적 등가물-가시층(stratum spinosum), 과립층(stratum granulosum), 투명층/반투명층(stratum lucidum), 및 각질층(stratum corneum). 각각의 멜라닌세포는 40개에 이르는 케라틴세포와 접해 있으며 소위 표피성 단위를 형성한다. 멜라닌세포의 세포 세포체 및 덴드라이트는 타입 I-IV의 가시적인 멜라노좀을, 특히 케라틴세포와의 접점에서 함유하여야 한다. 멜라노좀은 멜라닌의 분비를 제공하는 운반 패키지 소포이다. 멜라노좀은 멜라닌 및 다양한 아이소폼의 당단백질 100(gp100)을 함유하며, 그러므로 그들은 gp100 단백질의 염색에 의해 관찰될 수 있다(예를 들어, HMB45 및 NKI-beteb 변이체).
바람직한 구체예에서 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법의 인큐베이션 단계는 1 내지 10 일, 바람직하게는 2 내지 3 일 동안 수행된다.
당업자는 인큐베이션 온도는 세포의 필요에 따라 조정되어야 한다는 사실을 깨닫고 있다. 본 발명 내의 모든 인큐베이션은 대략 20 내지 37℃에서 수행되며, 바람직하게는 여기에서 개시된 방법들의 모든 인큐베이션 단계는 37℃에서 수행된다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체 및/또는 본 발명에 따른 멜라닌세포가 피부의 탈색소의 치료에 사용될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 또한 질환의 치료를 위한, 바람직하게는 흉터의 치료를 위한 및/또는 백색피부증(leukoderma), 백반증(vitiligo), 쿼디크롬 백반증(quadrichrome vitiligo), 반점성 백반증(vitiligo ponctue), 백색증 증후군(syndromic Albinism)(예컨대, 알레잔드리니 증후군(Alezzandrini syndrome), 헤르만스키-푸들라크 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 세디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 그리셀리 증후군(Griscelli syndrome)(엘레잘데 증후군(Elejalde syndrome), 그리셀리 증후군 타입 2(Griscelli syndrome type 2) 및 그리셀리 증후군 타입 3(Griscelli syndrome type 3)), 바르덴부르크 증후군(Waardenburg syndrome), 티쩨 증후군(Tietz syndrome), 크로스-먹큐직-브린 증후군(Cross-MuKusick-Breen syndrome), ABCD 증후군(ABCD syndrome), 백색증-청각장애 증후군(Albinism-deafness syndrome) 및 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)), 눈 피부 백색증(oculocutaneous albinism), 저멜라닌증(hypomelanosis)(물방울모양 저멜라닌증(idiopathic guttate hypomelanosis), 잎모양 저멜라닌증(phylloid hypomelanosis), 진행성 반상 저멜라닌증(progressive macular hypomelanosis)), 얼룩백색증(piebaldism), 탈색 모반(nevus depigmentosus), 염증후 색소침착저하증(postinflammatory hypopigmentation), 백색비강진(pityriasis alba), 바가본드 백반흑피증(Vagabond's leukomelanoderma), 예맨 시청각장애 색소침착저하 증후군(Yemenite deaf-blind hypopigmentation syndrome), 웬드-바우쿠스 증후군(Wende-Bauckus syndrome), 워로노프 반지증(Woronoff's ring), 멜라닌결핍증(amelanism), 루시즘(Leucism), 및 피부 탈색소 관련 질환의 그룹으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체 및/또는 본 발명에 따른 멜라닌세포에 관한 것이다 .
한 구체예에서 본 발명은 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법에 의해 얻을 수 있는질환의 치료에 사용하기 위한 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 또한 흉터의 치료 및/또는 백색피부증, 백반증, 백색증 증후군 얼룩백색증, 탈색 모반, 염증후 색소침착저하증, 및 피부 탈색소 관련 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체 및/또는 본 발명에 따른 멜라닌세포에 관한 것이다.
자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 탈색된 피부 영역 또는 흉터 상에 직접 적용될 수 있다. 그러나, 치료될 영역은 한 구체예에서 선처리될 수 있다. 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 치료될 피부 영역은 이식체의 구께에 상응하는 표피층을 피부찰상법에 의해, 바람직하게는 에르븀/YAG 레이져를 이용하여 선처리된다.
바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 생산 방법에 의해 얻을 수 있는 질환의 치료에서 사용을 위한 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 현탁액 또는 스프레이로서 치료되는 영역에 적용된다. 다른 구체예에서 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 치료되는 영역에 고상의 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체로서 적용된다. 바람직한 구체예에서 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 상기 설명한 바와 같이 피부찰상법 후 치료될 영역 상에 적용된다. 본 발명의 한 구체예에서 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 분리된 멜라닌세포를 포함한다.
상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 적용은 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 고상 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체가 사용되는 경우, 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 치료되는 영역에 직접 적용될 수 있다. 그러나, 상기 기술한 바와 같이, 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 본 발명의 한 구체예에서 현탁액 또는 스프레이이다. 그러한 경우 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체는 각각 치료되는 영역에 현탁액으로서 적용되거나 그에 스프레이하게 된다. .
한 구체예에서 멜라닌세포 및 케라틴세포는 치료되는 영역 상에 적용된다. 분리된 멜라닌세포 및 케라틴세포를 갖는 현탁액 또는 스프레이로 수행될 경우, 상이한 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 멜라닌세포를 포함하는 현탁액 또는 스프레이는 여기에서 기술된 케라틴세포를 포함하는 현탁액과 혼합되어 현탁액 또는 스프레이로서 함께 적용될 수 있다. 다른 구체예에서본 발명에 따른 멜라닌세포를 포함하는 현탁액이 치료될 영역에 현탁액 또는 스르페이로서 적용된 후 상기 기술된 케라틴세포를 포함하는 현탁액이 상기 영역에 현탁액 또는 스프레이로서 적용될 수 있다. 스프레이튼 추가로 상기 기술된 섬유아세포 및 케라틴세포를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서 치료되는 영역은 각각의 현탁액 또는 고상 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체의 적용 후 봉해진다.
여기에서 기술된 치료되는 영역은 한 구체예에서 치료 후 비자극되어 회복하고 고유의 색소화를 얻게된다. 추가적 구체예에서 상기 영역은 이전에 기술된 바와 같이 (Dermatology. 2009;218(4):342-3) 홍반발생미만의 도즈의 311 nm UVB를 이용하여 UV 광으로 주 2-3회 자극된다.
본 발명에 따른 상기 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체및/또는 멜라닌세포는 미용, 예를 들어 화장품의 목적으로 또한 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체 및/또는 멜라닌세포를 포함하는 화장품 조성물이 제공된다. 유사하게 본 발명은 여기에서 제공되는 자가이식체, 이종이식체 또는 이형이식체및/또는 멜라닌세포로 객체 또는 대상체를 처치하는 것을 포함하는 화장품적 처치 방법에 관한 것이다.
하기 비제한적 실시예 및 도는 본 발명을 예시적으로 설명한다:
도 1: ORS 세포의 배양, 선별 및 모근의 ORS로부터의 4주 이내에 멜라닌세포의 순수 배양물로의 확장. A: 배양 첫째날에서의 트랜스웰 마이크로기공 막(배지-공기-인터페이스) 상에서의 발모되어 준비된 측두부 모근 세트의 중간 부분. 촘촘한 외모낭초 (ORS)를 볼 수 있다. B: ORS 밖으로 이주하는 첫번째 세포를 갖는 자라난 ORS . C: 크게 증가한 세포들이 ORS로부터 떨어져 응집을 형성한다. D: 배양 4주 후 ORS 멜라닌세포의 순수 배양물. 세포은 커다란 세포체와 3개 내지 다수개의 덴드라이트를 나타낸다(3극 내지 성상 형태).
도 2: ORS 멜라닌세포의 순수 배양의 과정에서의 방법적 개선의 조합. A: 준비되지 않은, 미처리된 모발. ORS는 촘촘하다(화살표) B: 중간부의 ORS 바깥쪽 및 근위 (모구) 부분(화살표)의 바깥쪽에서도 가시적으로 이주된 세포를 갖는, 준비되지 않은, 콜라게나제 V-처리된 모발. C: 촘촘한 ORS(화살표)를 나타내는, 콜라게나제 V로 미처리된, 모구 부분이 잘려나간(점선) 준비된 모발. D: ORS의 바깥쪽으로(화살표) 이주된 세포를 갖는 자라난 ORS를 나타내는, 콜라게나제 V로 처리된, 모구 부분이 잘려나간(점선) 준비된 모발. 스케일 바는 500㎛에 상응한다. E: 배양 14일에서의 ORS의 바깥쪽으로 자라난, 거의 컨플루언트하게 퍼진 세포. F: 20일에서의 비-콜라겐처리된 모발로부터 발달한 ORS 세포 풀의 초대 배양물. 여러 세포 종류를 볼 수 있다. G: 20일에서의 콜라겐처리된 모발로부터 발달한 ORS 세포 풀의 초대 배양물. 배양된 세포는 보다 전형적인 형태를 나타낸다. H: 26일에서의 선별되니 멜라닌세포의 순수 배양물. I: 30일에서 순수 배양물 내 분화된 멜라닌세포. 스케일 바는 100 ㎛에 상응한다.
도 3: ORS 배양물의 면역세포화학적 성질결정. A: NKI＼beteb는 모든 표피 멜라닌세포 (NHEM)에서 발현한다; B: 티로시나제는 모든 표피 멜라닌세포 (NHEM)에서 발현한다; C: CD 90는 모든 비-멜라닌세포에서, 일반적으로 섬유아세포에서 발현한다; D: NKI＼beteb는 거의 모든 ORS 멜라닌세포 (HM)에서 발현한다; E: 티로시나제는 거의 모든 HM에서 발현한다; F: 순수 HM-배양물 내에서의 CD 90 발현의 부재. 바는 50 ㎛에 상응한다.
도 4: ORS 멜라닌세포 배양물의 순도. 회색 막대는 배양물 중의 NKI/beteb-양성 멜라닌세포의 퍼센테이지를 보여주고 있다. 표는 배양 중 확장, 분화 및 선별의 과정을 나타내는데, 배양 과정의 적당한 조합으로의 96　%의 NKI-beteb-발현 멜라닌세포에 이르는 멜라닌세포의 명확한 증가 경향을 보여준다. Coll+/- 는 콜라게나제 V 처리에 상응하고, HW+는 모구의 존재를 나타내며 HW-는 모구의 부재를 나타내고(모구는 모낭의 나머지로부터 잘린다), G+/- 는 제넥티신 처리를 나타내며, DLM은 적용된 더마라이프 배양 배지를 나타낸다. 검정색 막대는 99　%의 NKI/beteb-발현 세포를 보이는, 별도 배지에서 자란, 표피 멜라닌세포 대조군(분화된 NHEM)을 나타낸다. 모든 차이는 DLM/-Col/-HW/+G (비-분해된 짧은 모낭, 제넥티신으로 처리, DLM 배지에서 분화) 및 카테고리의 나머지 간의 차이를 제외하고는, 통계학적으로 유의(p　<　0.05) 내지 매우 높게 유의(p　<　0.005)하다.
도 5: ORS 멜라닌세포 배양물 중의 섬유아세포 오염. 회색 막대는 배양물 중의 CD-90-양성 세포의 퍼센테이지를 보여주고 있다(일반적으로 섬유아세포). 표는 배양 중 멜라닌세포의 확장, 분화 및 선별의 과정을 나타내는데, 배양 과정의 최적의 조합으로의 2　%의 CD-90-발현 세포에 이르는 배양물 중의 섬유아세포의 명확한 감소 경향을 보여준다. Coll+/- 는 콜라게나제 V 처리에 상응하고, HW+는 모구의 존재를 나타내며 HW-는 모구의 부재를 나타내고(모구는 모낭의 나머지로부터 잘린다), G+/- 는 제넥티신 처리를 나타내며, DLM은 적용된 더마라이프 배양 배지를 나타낸다. 흰색 막대는 100　%의 CD-90-발현 세포를 보이는, 별도 배지에서 자란, 섬유아세포 대조군을 나타낸다. 모든 차이는 DLM/-Col/-HW/+G 군 및 카테고리의 나머지 간의 차이를 제외하고는, 통계학적으로 유의(p　<　0.05) 내지 매우 높게 유의(p　<　0.005)하다.
도 6: 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 구조. A: 8 내지 10 ㎛ 섬유의 REM 캡처 사진, 800배 확대. B: 2-3 ㎛ 섬유의 REM 캡처 사진, 800배 확대. 스케일 바는 25㎛에 상응한다.
도 7: PCL 스캐폴드 상의 HM 및 NHEM의 레이져-스캐닝 현미경 캡처 사진. PCL-섬유(반사된 적색광으로부터의 신호). 티로시나제를 발현하는 NHEM 멜라닌세포 (녹색 형광) 및 핵(DAPI UV-fluorescence)을 볼 수 있다. A: 티로시나제를 발현하는 HM ; B: NKI＼beteb를 발현하는 NHEM; C: ORS 멜라닌세포-이주된 PCL-스캐폴드의 측면 모습 (절단 3-D 모델); HM은 티로시나제 항체(녹색 신호)로 표지되었다. D: 표피 멜라닌세포-이주된 PCL-스캐폴드의 측면 모습(절단 3-D 모델). 절단면은 세포가 PCL 스캐폴드의 완전한 심부까지 이주하는 것을 보여준다. 스케일 바는 200 ㎛에 상응한다. 화살표는 메쉬 섬유와 접속하고 있는 전형적인 세포의 세포체와 확장된 덴드라이트를 가리키고 있다.
도 8: PCL 스캐폴드 및 폴리스티렌 부착 표면 상의 멜라닌세포 마커 발현. 마커-양성 세포에 대한 핵의 수의 비율을 퍼센테이지로 표현한다. 표피(어두운 갈색) 및 ORS 멜라닌세포(베이지)의 티로시나제 및 NKI/beteb 마커 발현은 폴리스티렌 부착 표면 상의 표피 멜라니니세포(검정)의 것과 동일하여, HM과 NHEM 모두 PCL 스캐폴드 상에서 그들의 특성을 유지함을 나타낸다.
도 9: 표피 멜라닌세포 (NHEM) 및 ORS 멜라닌세포 (HM) 모두에서 덴드라이트의 발단으로부터 분비될 준비가 된 멜라노좀이 형성되고 있다. 도면은 NHEM 및 HM에서 멜라노좀의 NKI/beteb 표지를 나타낸다.
A: 3 ㎛ PCL 스캐폴드 상의 NHEMs, B: 10 ㎛ PCL 스캐폴드 상의 NHEMs, C: 3 ㎛ PCL 스캐폴드 상의 HM, D: 10 ㎛ PCL 스캐폴드 상의 HM. 스케일 바는 50 ㎛에 상응한다, 40배 확대.
도 10: PCL 스캐폴드 및 부착 표면 상의 NHEM 및 HM의 멜라닌 함량 및 L-DOPA-토토머라제 활성. 모든 그래프는 PS-부착 표면에서 보다 PCL 스캐폴드 상에서 멜라닌 함량 및 L-DOPA-토토머라제 활성이 더 높은 뚜렷한 경향을 보인다. 검정색 막대는 NHEM를 회색 막대는 HM를 나타낸다. (A) 부착 표면과 비교한 PCL 스캐폴드 상의 표피 멜라닌세포에서의 멜라닌 함량: 표피 멜라닌세포는 부착 폴리스티렌 표면 상에서 보다 PCL 스캐폴드 상에서 4,59 배의 멜라닌을 생산한다. (B) 부착 표면과 비교한 PCL 스캐폴드 상의 ORS 멜라닌세포에서의 멜라닌 함량: HM ORS 멜라닌세포는 부착 폴리스티렌 표면 상에서 보다 PCL 스캐폴드 상에서 2,58 배의 멜라닌을 생산한다. (C) 부착 표면과 비교한 PCL 스캐폴드 상의 표피 멜라닌세포에서의 L-DOPA 활성: 표피 멜라닌세포는 부착 폴리스티렌 표면 상에서 보다 PCL 스캐폴드 상에서 6,65 배의 L-DOPA를 전환한다. (D) 부착 표면과 비교한 PCL 스캐폴드 상의 ORS 멜라닌세포에서의 L-DOPA 활성: HM ORS 멜라닌세포는 부착 폴리스티렌 표면 상에서 보다 PCL 스캐폴드 상에서 1,72배의 L-DOPA를 전환한다. 모든 값은 부착 표면 상에서의 특정 세포 유형의 상응하는 수치를 100으로 놓고 이에 대해 상대적으로 나타내었다. 모든 차이는 통계적으로 높게 유의(p<0.01) 내지 매우 유의하다(p<0.005).
도 11: 케라틴세포 표피 등가물 내에 넣은 외모낭초 멜라닌세포 (HM ORS)은표피 기저층에 등가인 이식체의 맨 아래층에 남으며, 멜라닌세포 마커를 발현한다. 티로시나제 및 핵의 DAPI 신호를 볼 수 있다. A: 표피 멜라닌세포, 정상광; B: 표피 멜라닌세포, 형광.
스케일 바는 200 ㎛에 상응한다.
도 12: 대조군의 면역세포화학적 성질 결정: 정상 인간 상피 멜라닌세포 (NHEM)의 NKI-beteb 발현 (a), 표피 멜라닌세포에서의 티로시나제 (b), 순수 진피 섬유아세포 배양물에서의 CD-90 발현 (c), HM 배양물에서의 CD-90 발현의 결여 (d), L-DOPA 추가하지 않은 배양물 내의 HM (e), L-DOPA 없이, HM 형태에서의 IBMX-매개 변화 및 증가된 멜라닌 함량 (f), HM에 L-DOPA 추가시의 멜라닌 함량 (g) 및 IBMX-선처리된 HM에 L-DOPA 추가시 멜라닌 함량의 증가 (h). 스케일 바 (a-d)는 50 ㎛에 상응, 스케일 바 (e-f)는 100 ㎛에 상응한다.
도 13. 외모낭초 표면적의 변화 비교
본 방법(◆) 및 Dieckmann et al. (loc. cit.)의 방법(■)은 모두 ORS 표면적의 증가를 포함하였다. 7일 및 14일에 측정된 바에 따르면, 표면적의 증가는 Dieckmann 방법 (loc. cit.)과 비교하여 본 프로토콜에 따라 배양된 모낭의 ORS에서 유의하게 더 높다.
도 14. ORS 표면적 변화의 영상 표시 비교
(a) 본 방법, 0일 (b) Dieckmann 방법 (loc. cit.), 0일 (c) 본 방법, 7일 (d) Dieckmann 방법 (loc. cit.), 7일 (e) 본 방법, 14일 (f) Dieckmann 방법(loc. cit.), 14일.
본 방법에 따라 배지-공기-인터페이스에서 배양된 모낭(a,c,e)은 Dieckmann (loc. cit.) 방법에 따라 배양된 모낭 (b,d,e)에 비해 ORS 표면적에서의 더 높은 증가를 나타내었다. 0일에서, 모낭은 촘촘하다(a,b). 14일(e,f)에서 뿐만 아니라, 7일에서, 자라남(outgrowth)과 세포의 이주가 눈에 띄었다(c,d). 본 방법에 따라 배양된 모낭의 더 강력한 자라남을 볼 수 있다.
도 15. 부착 배양에서의 세포 성장 비교.
본 방법(▲), Dieckmann (loc. cit.) 방법(●), 제넥티신이 보충된 Dieckmann (loc. cit.) 방법(*)에 따라 부착 배양의 첫번째 6 계대 동안 배양된 ORS 세포의 성장 곡선. 그래프의 아랫 부분은 선형적으로, 윗부분은 대수적으로 나타내었다. 여기에서 기술된 방법으로 배양된 세포는 부착 배양의 두번째 계대까지 1.000.000 개의 세포 수에 도달하였다.
도 16. 모낭 당, 부착 배양에서의 성장 비교.
본 방법(▲), Dieckmann (loc. cit.) 방법(●), 제넥티신이 보충된 Dieckmann (loc. cit.) 방법(*)에 따라 부착 배양의 첫번째 6 계대 동안 배양된 시료 모낭 당 ORS 세포의 성장 곡선. 그래프는 대수적으로 나타내었다.
도 17. NHEM 및 HM에서의 세포의 세포체의 크기 및 덴드라이트 길이 차이
(a) 전방산란 플롯(x-축)에 의해 측정된 NHEM 및 HM의 상대적인 세포 크기
(b) NHEM 및 HM의 세포 크기(㎛2)
(c) NHEM 및 HM의 덴드라이트 길이(㎛)
실시예
실시예 1
실험적 디자인 및 방법
배양, 확장, 분화, 순수한 멜라닌세포 배양물의 선택
모발 생검
모근으로부터 멜라닌세포를 추출하는 과정을 시작하기 위하여, 30 내지 80개의 성장기 모발을 두피의 측두부에서 뽑을 필요가 있다. 생검은 암픔과 흉터가 없고 매일 자발적으로 상실하는 것에 비해 더 적은 모발을 필요로 한다. 측두부의 5개까지의 모발을 소독된 겸자로 잡고 모발 성장의 방향으로 잡아당겼다. 모발은 제조시까지 포스페이트 완충 식염수(PBS, 칼슘 무첨가)에 저장하였다.
ORS 중간부의 선택, 제조
모간의 긴 부분을 잘라내고 모간의 짧은 부분을 핸들링 목적을 위해 남겨두었다. 모발 모구를 제거함으로써 모근은 근위부 말단으로부터 짧아졌다(도 1). 우리의 관찰에서 모구는 대개 90%를 넘는 섬유아세포가 있기 때문에 이 부분을 제거함으로써 세포 오염의 주요부를 피할 수 있게 된다.
모발은 연속적으로 1분 동안, 5회 젠타마이신 (Ratiopharm) 및 10 ㎍/ml 암포테리신 (Amimed)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle 배지 (DMEM)과 계속적으로 PBS로 각각 씻어내었다.
세포외기질을 느슨하게 함
37℃에서 10분 동안 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중의 5 mg/ml 5 mg/ml의 콜라게나제 V (Sigma-Aldrich) 용액으로 소화시켜 세포외기질을 느슨하게 하였다.
배지
모낭 및 ORS 세포를 더마라이프 멜라닌세포 배지에서 배양하였다(Life Line Cell Technology, Walkersville, MD, USA)(제조사의 설명서에 따르면 낮은 소 혈청 함량(0.5 %)의 DLM 배지 베이스, L-글루타민 (6 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), StiMel 인자 칵테일 (1 %) 및 젠타마이신 (50 ㎍/ml)). 상기 배지는 콜레라 독소나 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA, TPA)와 같은 어떠한 종양 프로모터도 포함하지 않는다.
배지-공기 인터페이트 배양 조건
0.4 μm 기공 폴리에스테르 멤브레인 인서트(Corning)를 구비한 24 mm Transwell® 나일론-메쉬 상에 짧아진 모근을 두고 배지-공기-인터페이스 조건에서 키웠다. 밑으로부터 메쉬와 세포와 접촉할 수 있도록 충분한 양으로, 그에 따라 필요한 영양분이 공급될 수 있도록 1 ml DLM 배지 (더마라이프)로 영양을 보충하였다. 모낭의 윗 부분은 저산소성 가스 혼합물 5 % O2, 5 % CO2 및 90 % N2에 노출시켰다. 모근을 2주 동안 확대시켰으며 DLM 배지를 덮었다. 이 기간은 대개 메쉬 상에 40% 컨플루언스에 도덜하기에 충분하다(도 1 e).
부착 배양
세포가 90% 컨플루언스에 도달할 때까지 세포들을 추가로 DLM 배지에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 트립신처리하고, 수확하고, 일차 배양으로 옮겨갔다. 얻어진 외모낭초 세포를 10 ㎠ 웰의 배양 접시의 부착 표면에 씨딩하여 3주(18일±2일) 동안 배양하였다. 부착 표면에서의 배양의 시작은 시작 계대(p0)로 표시되었다.
분별적 트립신처리
비코팅된 부착 표면에서 80% 컨플루언스에 도달하였을 때 세포들을 추가로 분별저거 트립신처리를 하였다. 실온에서 0,04 % 트립신/ 0,03 % EDTA 인큐베이션 4분 후, 탈착된 멜라닌세포를 모으고 T25 세포 배양 플라스트에서 계대배양하였다. 나머지 세포들인, 케라틴세포 및 섬유아세포는 부착되어 남아있고 그들은 배양의 다음 계대로 옮겨가지 않았다. 분별적 트립신화는 배양 유지의 통상적 척도로서 매 계대에서 수행하였다.
제넥티신 처리
분화의 후기 단계에서의 케라틴세포 및 섬유아세포의 성장은 22±2일에서 48시간 동안 제넥티신 (50 ㎍/ml)으로 전체 배양액을 처리함으로써 중요하게는 예방된다. 제넥티신의 효과는 모든 세포에서의 번역을 차단하는 것으로써, 일차적으로는 빠르게 분열하는 세포, 예컨대 케라틴세포 및 섬유아세포에 영향을 미친다. 배양물 중의 멜라닌세포의 대사 및 분열은 느리므로 그들은 제넥티신의 짧은 처리에 영향을 받지 않고 남아있다 (도 2, F-H).
ORS 세포의 점진된 일차 배양은 더마라이프 멜라닌세포 배지 (Life Line Cell Technology, Walkersville, MD, USA)(낮은 소 혈청 함량 (0.5 %)의 DLM 배지 베이스, L-글루타민 (6 mM), 인슐린 (5 ㎍/ml), 비타민 C (50 ㎍/ml), 에피네프린 (1μM), StiMel 인자 칵테일 (1 %) 및 젠타마이신 (50㎍/ml))에서 유지되었다. 배지는 콜레라 독소나 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA, TPA)와 같은 종양 프로모터를 포함하지 않는다.
대조군 세포
상피 멜라닌세포 (정상 인간 상피 멜라닌세포, NHEM, PromoCell)를 M2 서플먼트 믹스(Promocell)가 보충된 멜라닌세포 M2 기초 배지에서 제조사의 가이드라인에 따라 37℃, 정상산소 조건에서 배양하였다. 상기 세포들을 완전히 분화된 대조군 세포로서 사용하였다.
비-멜라닌성 대조군으로 사용되는 섬유아세포는 10% 소 혈청, 2mM L-글루타민, 및 100 U/ml 페니실린과 0.1 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다.
생체적합성 담체 ( PCL 스캐폴드 )의 생산
생체적합성 담체 (PCL로 이루어진 스캐폴드의 경우; PCL 스캐폴드로 언급함)를Loth, T., Electrospinning als Methode zur Herstellung von fibrillaren Zelltragern aus bioabbaubaren Polymeren. 2009에서 밝혀진 것과 같은 표준 전기방사 과정에 의해 생산하였다.
폴리카프로락톤 (PCL)-섬유 메쉬는 폴리카프로락톤 용액의 사출물(jet)을 고전압하에 두어 섬유의 네크워크를 형성하는 전기방사 과정에서 유래한다. 폴리머 용액은 PCL 분말을 클로로포름 (CHCl3): 메탄올 (MetOH) (7:1) 중에 1시간 동안 교반하여 용해시킨 것으로부터 제조하였다. 상기 용액을 뭉툭한 말단의 니들을 갖는 실린지에 위치시키고 실린지 펌프(KD Scientific Inc., USA) 상에 올렸다. DC 전류를 실린지 니들과 바닥의 콜렉터 유리판(collector glass plate) 양쪽에 연결하여, 닫힌 회로를 형성하였다. 이는 PCL 폴리머 용액과 콜렉터 유리판 사이에 전기장을 형성하고 니들의 꼭대기에서 유지된 액적과 콜렉터 유리판 간에 연속적인 사출물의 형성을 이끈다. 사출물이 유리판을 치면 앞으로의 네트워크 형성이 예상된다. 클로로포름 및 메탄올의 용액이 빠르게 증발되고, PCL 섬유가 메쉬에 남게 된다. 100 % 에탄올로 메쉬를 유리판으로부터 떼어내었다. 최종적으로, 멤브레인 진공 펌프(VP 820; VWR International GmbH, Deutschland)와 결합된 건조기를 이용하여 섬유 메쉬를 건조하였다.
전기방사 과정의 파라미터를 조합함으로써, 다양한 섬유 두께, 섬유 방향 및 메쉬 두께를 얻을 수 있다. 이러한 적용에서는, 두 개의 파라미터 세트를 이용하여 '가늘고', '두꺼운' 섬유로 짜여진 100㎛ 두께의 메쉬를 형성하였다. '가는' 섬유 메쉬(2-3 ㎛ 직경)는 14% PCL을 이용하여 유속 2 ml/h에서 콜렉터 전극으로부터 18,5 cm 떨어진 전극으로 22 게이지 니들을 이용하여 0,4-0,5 ml의 액적으로부터 사출물을 형성하여 얻었다. '두꺼운' 섬유 메쉬(8-10 ㎛ 직경)는 20% PCL을 이용하여 유속 10 ml/h에서 콜렉터 전극으로부터 30 cm 떨어진 전극으로 14 게이지 니들을 이용하여 0,4 내지 0,5 ml의 액적으로부터 사출물을 형성하여 얻었다.
광현미경(Nikon Eclipse TE 2000-S; Nikon Corporation / Instruments, Deutschland), 및 전자 현미경(Raster electron microscope CS 44; CamScan; Obducat CamScan Ltd, UK)에 의해 구조, 섬유 방향성 및 섬유 두께를 분석하고 정량하였다.
스캐폴드는 살균된 할로우 펀치로 8 mm 직경의 원모양을 만들어 캘리브레이트 조건(calibrated condition)에서 10.7 mm 너비의 바닥의 96월 플레이트을 덮도록 하였다. 그들을 75 % 에탄올로 30분 동안 살균하고 PBS로 5회 세척하였다. 세포를 스캐폴드 상에 씨딩하기 전에 물질들을 DLM 배지 또는 PC-1 배지 내에서 24시간 동안 캘리브레이트하였다(calibrated). 200 ㎕ 배지 내에 현탁된 세포들을 스캐폴드 상에 씨딩하였다, 스캐폴드당 10.000 세포.
세포 타입의 특정( Characterization )
세포를 그들의 형태, 마커 단백질 티로시나제, gp100 단백질의 변이체(멜라노좀 마커)NKI-beteb 및 HMB45, DOPA-토토머라제의 활성, 및 IBMX에 대한 반응 및 멜라닌 함량에 의해 특정하였다.
문헌 데이터와 일치하게, 여러 세포 타입을 형태에 근거하여 결정하였다: 작고 둥근 세포, 작은 스핀들 유사 세포, 특징적인 섬유아세포 형태를 갖는 세포 및 자갈-유사 케라틴세포 형태를 갖는 세포, 멜라닌세포 형태를 갖는 트리- 또는 멀티덴트라이트성 세포(Tobin D J, Colen S R, Bystryn J C. J Invest Dermatol 1995: 104: 86-89; Dieckmann C, Milkova L, Hunziker T, Emmendorffer A, Simon JC. Human melanocytes can be isolated, propagated and expanded from plucked anagen hair follicles. Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5; Zhu WY, Zhang RZ, Ma HJ, Wang DG. Pigment Cell Res. 2004 Dec;17(6):668-73. Isolation and culture of amelanotic melanocytes from human hair follicles; Bosserhoff AK, Ellmann L, Kuphal S. Melanoblasts in culture as an in vitro system to determine molecular changes in melanoma. Exp Dermatol. 2011 May;20(5):435-40).
멜라닌세포는 Bosserhoff et al에 의해 보고된 멜라닌세포에 대한 형태적 판단기준에 근거하여 특정된다. 멜라노성 특성, 증식 및 부착과 관련하여 본 연구에서 사용된 판단기준의 세트는 멜라닌세포 전구체로부터의 모낭-유래 멜라닌세포, 축약하여, 유도된 인간 멜라닌세포 HM 세포를 식별할 수 있게 도와준다. 마지막 배양에서 얻어진 세포는 Bosserhoff에서 보고된 빠르게 분열하고 강하게 부착한 전구체와는 달리, 멜라닌성이었으며 NHEM 상피 멜라닌세포와 같은 비교할만한 속도로 증식하였고, 세포 배양 용기의 표면에 약하게 부착되어 있었다.
멜라닌세포에 대한 형태적 판단기준은 마커 단백질의 발현과 조합되었다: 티로시나제 (Fig 3e) 및 gp100 단백질의 변이체 (멜라노좀 마커) - NKI-beteb (도 3d) 및 HMB45 (도 3f). 추가로, L-DOPA 변환 시험에서 DHIC-옥시다아제/티로시나제-연관 단백질 1 활성(TRP-1) (도 12 e, 12 g) 뿐만 아니라 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (IBMX) (도 12 f, 12 h)에 대한 반응성, 티로시나제의 활성, 도파크롬-토토머라제/티로시나제-연관 단백질 2 (DCT/TRP-2)가 시험되었다. 또한, 멜라닌 함량은 비자극된 HM 세포에서 13,7pg/cell 및 L-DOPA에서 멜라닌으로의 전환 후 22,6 pg/cell로 측정되었다.
CD90의 발현은 미분화된 세포, 규정대로 섬유아세포 (양성 CD90 신호, 도 12c)에 대한 판단기준으로서 그리고 분화된 멜라닌세포 (CD-90 신호의 부재, 도 12d)에 대한 배지 인자로서 사용되었다.
면역형광법( Immunfluorescence )
멜라닌세포
젤라틴으로 코팅된 챔버 슬라이드에서 키운 세포들을 PBS로 세척하고 빙냉 파라 포름알데하이드(PFA, 4　%)로 8분 동안 고정한 후, 다시 PBS로 세척하였다. 세포들을 0,5 ml의 2% 소 혈청 알부민으로 블로킹하고, 0,1　% 트리톤-PBS 용액으로 1시간 동안 침투가능하도록 하였다. NKI\beteb 티로시나제 및 HMB-45에 대한 1차 마우스-생성 항체 (Abcam) 의 용액을 2　% BSA/0,1　% 트리톤을 갖는 PBS 중에서 2　%로 맞추고, 스캐폴드 상의 세포들과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2　% BSA/0,1　% 트리톤 용액으로 세척한 후, 비오틴화된 항-마우스 2차 항체를 세포에 가하고 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 2% BSA-PBS/0,1　% 트리톤/0,25　% IGG의 용액으로 세포와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척하였다. 마지막으로, 2% BSA/0,1% 트립톤 중의 스트렙타비딘-결합 Alexa594® 및 Alexa 488® 형광색소 0,25% 용액을 1/1000 DAPI 핵 염료와 함께 세포와 1시간 동안 인큐베이션하고 2　% BSA/0,1　% 트리톤 용액으로 2회 세척하였다. Fluoromount® 실링액으로 세포를 글라스 상에 고정하고 글라스 슬립으로 덮었다.
형광 현미경(Nikon Eclipse Ti-S; Nikon Corporation, Deutschland)으로 마커 신호를 분석하였다. 세포성 및 핵성 신호를 ImageJ 1.42q NIH 공용 소프트웨어에 의해 카운팅하였다.
이식체
스캐폴드 상의 세포들을 PBS로 세척하고 빙냉 파라포름알데하이드(PFA, 4　%)로 8분 동안 고정한 후, 다시 PBS로 세척하였다. 세포들을 0,5 ml의 2　% 소 혈청 알부민 2% BSA-PBS로 블로킹하고 0,1　% 트리톤-PBS 용액으로 1시간 동안 침투가능하게 하였다. NKI\beteb 및 티로시나제에 대한 1차 마우스-생성 항체 용액을 2　% BSA/0,1　% 트리톤을 갖는 PBS 중에서 2　%로 맞추고, 스캐폴드 상의 세포들과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2　% BSA/0,1　% 트리톤 용액으로 세척한 후, 비오틴화된 항-마우스 2차 항체를 세포에 가하고 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 2% BSA-PBS/0,1　% 트리톤/0,25　% IGG의 용액으로 세포와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척하였다. 마지막으로, 2% BSA/0,1% 트립톤 중의 스트렙타비딘-결합 Alexa594®(적색)및 Alexa 488®(녹색) 형광색소 0,25% 용액을 1/1000 DAPI 핵 염료와 함께 세포와 1시간 동안 인큐베이션하고 2　% BSA/0,1　% 트리톤 용액으로 2회 세척하였다. Fluoromount® 실링액으로 세포를 글라스 상에 고정하고 글라스 슬립으로 덮었다.
형광 현미경(Nikon Eclipse Ti-S; Nikon Corporation, Deutschland) 및 레이저-스캐닝 현미경(LSM 510 Meta, Carl Zeiss Jena GmbH, Deutschland)으로 마커 신호를 분석하였다.
L- DOPA 토토머라제 활성
L-DOPA 토토머화(tautomerization) 상의 멜라닌의 증가에 기인한 색상의 변화와 계속적인 산화가 가시적으로 기록되었다. 세포 막의 붕괴를 위해 스캐폴드와 함께 세포를 드라이 아이스/37℃ 수조 상에서 5번의 동결 융해 과정을 거쳤다. 용해물을 4℃에서 14000 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 이용하여 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 효소 활성을 시험하였다. 용해물(100　㎕)을 200　㎕의 L-DOPA 용액(10　mg/ml)과 함께 6시간 동안 인큐베이션하였다. 생산된 멜라닌의 정확한 양을 측정하기 위하여 Multiscan® Spectrum (Thermo Fisher Scientific Germany Ltd. & Co. KG, Deutschland) 엘리자 플레이트 리더에 의해 475 nm에서의 소광을 측정하였다. L-DOPA 기질로부터 합성된 멜라닌의 존재는 티로시나제, DOPA-토토머라제/티로시나제-연관 단백질 2 (TRP-2) 및 DHIC-옥시다아제/티로시나제-연관 단백질 1 (TRP-1)의 활성을 확인해 주었다.
IBMX 유도
HM 세포를 20 mg/ml의 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (IBMX)과 함께 7일 동안 인큐베이션 한 후, 본 명세서에서 앞서 기술한 대로 비처리된 HMs에 대한 멜라닌 함량에 대해 분석하였다.
멜라닌 함량
세포
세포를 트립신처리하고, 계수 또는 총 10000개의 세포로 조정하고, 150 ㎕의 1M NaOH으로 처리하고 피펫으로 여러번 세척한 다음, 14000 rpm으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 .37℃ 에서 6시간 동안 1M NaOH 중에서 인큐베이션하였다. 150 ㎕의 양의 생성되니 세포 용해물을 평평한 바닥의 96웰 플레이트로 옮기고 1M NaOH 용해 용액을 300 ㎕ 최종 부피로 채우고, 멜라닌 농도 및 계속적으로 측정되는 샘플 내 그의 총량을 정량하기 위하여 플레이트 리더에 의해 475 nm에서의 소광을 측정하였다.
합성 멜라닌을 표준 곡선에 대한 용액으로서 사용하였다. 100 ㎍/ml의 멜라닌 용액을 1M NaOH 중에서 5시간 동안 60℃에서 인큐베이션하고, 연속 희석액을 제조하여 (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 ㎍/ml), 475 nm에서의 소광을 측정하고 농도 비교에 사용하였다.
이식체
PCL 스캐폴드와 함께 세포를 150 ㎕의 1M NaOH로 처리하고 피펫으로 여러번 세척하였다. 뒤이어 스케폴드를 제거했다. 세포 펠렛을 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 150 ㎕의 세포 용해물을 평평한 바닥의 96웰 플레이트로 옮기고 300 ㎕의 용해물 용액으로 채우고, 멜라닌 함량을 정량하기 위하여 플레이트 리더로 475 nm에서의 소광을 측정하였다
합성 멜라닌을 표준 곡선에 대한 용액으로서 사용하였다. 100 ㎍/ml의 멜라닌 용액을 1M NaOH 중에서 5시간 동안 60℃에서 인큐베이션하고, 연속 희석액을 제조하여(100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 ㎍/ml), 475 nm에서의 소광을 측정하고 농도 비교에 사용하였다..
상피 등가물에의 도입
멜라닌세포 및 케라틴세포을 모낭의 ORS로부터 배양하였다(본 명세서에 기술된 바와 같은 멜라닌세포 및 Cells Tissues Organs 2002;172:79-85에 기술된 바와 같은 케라틴세포). 0.4㎛ 기공 폴리에스테르 멤브레인 인서트(Corning)를 갖는 24mm 트랜스웰® 나일론-메쉬 상에 멜라닌세포를 씨딩하였다. 4 시간의 부착 시, 케라틴세포 현탁액을 9배로 가하고 10　% 인간 혈청, 20 ng/ml 상피세포성장인자, 하이드로코르티손, 콜레라 독소 10 ng/ml, 아데닌 및 트리요오드사이로닌이 보충된 더마라이프 케라틴세포 배지 (Life Line Cell Technology, Walkersville, MD, USA), 또는 DMEM/F12 (3:1) 중에서 11일에 걸처 층상화되도록 하였다. 층상화된 구조물은 상피의 해부학적 구조를 모방한 상피 등가물을 나타내었다. 멜라닌세포는 기저층 내에 존재하고 케라틴세포는 상부층의 구성요소였다. 12일째에, 상부 케라틴세포층은 보충된평탄화된 세포로 형태적으로 확인가능한각질층에 등가적이어야 했다.
상피 등가물은 크리요톰(cryotome)으로 200 ㎛ 슬라이스로 절단되어, 상기 기술된 면역형광법 과정을 이용하여 고정시키고, 염색하여, 형광 현미경에 의해 분석하였다. 추가로, 세포 및 그들의 서브섹션을 멜라닌 함량으로 표지하기 위하여 슬라이스를 나일 블루(Nile Blue)로 염색하기 위하여.
데이터 검증
모든 실험은 4명의 기증자의 물질을 이용하여 5개의 생물학적 실험으로 3번의 기술적 반복으로 수행되었다. two-tailed Student's t-test에 의해 처리간 차이(intertreatment differences)의 통계학적 유의성에 대해 데이터를 검증하였다.
비교 데이터
유사한 실험적 플랫폼을 이용하여 모발 시료로부터 HM 멜라닌세포를 배양하여 본 발명에 따른 방법에 대해 Dieckmann et al. (Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5. Epub 2010 Mar 30)의 방법을 추가로 비교하였다. 배양 및 분화 과정 둘다 동시적으로 진행하였다. 제넥티신 선별의 시점에서, 우리는 그 단계에서의 모든 제조물의 섬유아세포 및 케라틴세포 함량을 조사하기 위해 모든 세포에 동시적으로 처리하였다.
결과
배양, 확장, 분화, 순수한 벨라닌세포 배양물의 선별
본 과정은 초대 배양의 p3 또는 p4 만큼 일찍, 생검 후 3 내지 4주 이내에 멜라닌성 단계에 도달한 95-100%의 순수한, 거의 완전히 분화된 인간 멜라닌세포의 매우 많이 확장된 배양물을 수득하였다(도 1-5). 특히, 60개의 모낭으로부터 배양 및 분화 과정은 부착 배양의 3 내지 5 계대에서, 탈모 후 3-4주 이내에 멜라닌성 단계에 도달하는 106 개의 순수한, 분화된 인간 멜라닌세포를 수득하였다.
Dieckman et al.에서의 결과와 비교하여, 여기에서 제시된 방법은 절반의 시간 내에 106 개의 HM의 결과물에 도달한다. 그에 더하여, 부착 배양으로 세포들을 가지고 오기 위해 트랜스웰 나일론 메쉬로부터 세포들을 수확하는 시점에서 이미 방법들 간의 차이가 자명하며; 수확된 세포들의 수는 2,46배 만큼 Dieckmann 방법(loc. cit.)의 수를 초과하였다. 그에 더하여, Dieckmann method (loc. cit.) 방법에 따르면 수확된 물질 내 섬유아세포와 케라틴세포의 비율이 더 높았는데, 이는 그들의 대부분이 제넥티신 선별 동안 죽었고 제네티신 처리 후 매우 적은 수의 세포들만 남아있기 때문이다. Dieckmann method (loc. cit.)에 따라 배양된 세포의 제넥티신 선별의 결과와 대조적으로, 여기에서 기술된 방법으로 배양된 세포의 많은ㅇ 수가 이 선별 단계에서 생존하였고 4주 내에 106 개의 HM로 상승할 수 있었다.
DLM 배지, 현미해부(microdissection)(모낭의 근위부(모구)의 절단), 콜라게나제에 의한 분해, 제넥티신 및 분별적 트립신처리에 의한 선별의 동시적 조합에 의해 최상의 순도에 도달하여, 96%의 멜라닌세포-마커-발현 세포(도 4)와 무시할만한 기타 함량 (2,39-4,2%)의 CD-90-발현 세포 (도 5)를 얻었다.
현미해부, 콜라게나제 및 제넥티신 처리의 조합은 무처리 배양과 비교하여 HM 배양물의 순도를 87,65%까지 증가시켰으며(도 4) HM 배양물 내의 섬유아세포 함량을 82,12%까지 낮췄다 (도 5). 제넥티신 처리는 HM 배양물 순도를 67,7%까지 증가시켰고 (도 2d) 섬유아세포 함량을 68%까지 감소시켰다 (도 5).
콜라게나제 처리는 제넥티신-처리된 HM 배양물의 순도를 12,72%까지 증가시켰다(도 5).
모낭 근위부의 제거(현미해부)는 뒤이은 콜라게나제 및 제넥티신 처리와 함께 조합될 때 HM 함량을 20%까지 증가시켰으며(도 4), 섬유아세포 존재율을 14,15%까지 낮췄다 (도 5). DLM/-Col/-HF/+G 군(DLM 중에서 키운 비분해된 짧은 모낭, 제넥티신으로 선별) 및 다른 처리군 간의 차이를 제외하고는, 처리군 간의 모든 차이는 Student's t-test에 따르면 통계적으로 유의(p<0.05) 내지 매우 유의(p<0.005)하였다. 부착된 세포 배양물을 트립신/EDTA 용액에 실온에서 4분 동안 노출시키고 상층액 내에 탈착된 멜라닌세포를 추가 배양에 이용하는 분별적 트립신처리를 이용함으로써 HM의 배양 순도를 세포 계대들까지 유지하였다(In Vitro. 1984 May;20(5):447-50, Exp Cell Res. 1982 Dec;142(2):309-15에 근거).
부착 배양의 3번째 계대 후, HM 세포는 분화된 멜라닌세포의 특성을 완전히 나타내었다. 세포는 전형적으로 큰 트리-내지-멀티 덴트라이트성 세포체를 가졌으며(도 1d 및 2h), NKI-beteb, HMB45 및 티로시나제 (도2a-c)를 발현하였고, L-DOPA를 전환시켜 멜라닌을 합성하였다(도 12e 및 g). IBMX 처리는 모든 세포에서 덴드라이트 성장 및 멜라닌 합성을 유도하였다(도 12 f 및 h).
결론
본 발명은 발모된 모발의 현미해부, 콜라게나제로의 처리 및 항생제로의 처리, 앞서 정의한 바와 같은 분화 배지 내에서의 분화를 포함하는 멜라닌세포 생성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 추가의 개선은 분별적 트립신처리에 의해 얻어진 배양 순도를 유지함에 의해 얻어진다. 이 방법은 Dieckmann et al. (Dieckmann C, Milkova L, Hunziker T, Emmendorffer A, Simon JC. Human melanocytes can be isolated, propagated and expanded from plucked anagen hair follicles. Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5. Epub 2010 Mar 30)에서 개시한 방법과 비교할 때 더 높은 수율, 멜라닌 세포의 더 신속한 분화 및 HM 배양의 향상된 순도를 이끈다. 더 빠른 성장, 더 높은 수율, 충분한 분화 및 경쟁하는 세포의 선별적 탈락의 시너지는 Dieckmann (loc. cit.)의 방법과 비교하여 106 개의 HM을 배양하는데 필요한 시간을 50%까지 감소시켰다.
본 발명에 따른 방법에서 모낭의 근위부의 섬유아세포-풍부 부분은 절단되었다. 섬유아세포는 빠르게 분열하여, 느리게 분열하는 멜라닌세포를 경쟁적으로 선별되게 하였다. 배양물 내의 초기 섬유아세포 함량을 감소시킴으로써, 영양 및 공강적 경쟁도 감소되었다.
콜라게나제 V에 의한 모낭 콜라겐의 부분적 분해는 세포외기질을 느슨하게하고 ORS 풀(pool)로부터의 세포 이주를 가속화시켰다.
제넥티신의 단일의 단기간 처리는 배양물로부터 케라틴세포 및 섬유아세포를 효율적으로 제거하고, 해하지 않고 멜라닌 세포를 남겼다.
분별적 트립신처리는 HM 순도를 증가시키고 유지시켰다. 멜라닌세포는 약한 부착성이고 짧은 트립신처리시 덴드라이트를 재빨리 오므려 결국 현탁액 내로 일찍 들어가게 되고, 부착성의 섬유아세포 및 케라틴세포는 뒤에 남아있게 된다. 무시할만한 잔여 부착성 멜라닌세포의 손실은 높은 HM 수율(3-4주 내에 106 개의 세포)에 의해 보완된다.
ORS 세포 풀은 최소의, 비침습적으로 얻은 재료로부터 신속하고, 사실상 발달된 멜라닌세포로 증폭시킨다.
상기 모든 것들은 순수하고, 뚜렷한 멸균된 HM 배양물을 제공하며 이식체 기반의 치료의 목적을 위한 비침습적 HM 배양에서 바람직한 개선된 방법을 제공한다.
상기 기술된 조합된 처리에 의해 세포 확장이 가속화되고 세포 순도가 증가된다. 상기 처리의 완전하나 조합에 의해 얻어진 배양물은 가장 빠르게 성장하여 96　%의 멜라닌세포-마커-발현 세포를 수득하는 가장 높은 순도에 도달하였고(도 2), 그에 따라 오염물인 CD-90-발현 세포의 무시할만한 기타 함량으로, 오염된 세포의 존재는 가장 낮춤을 보여주었다 (도 5).
세포 수율(4주 내에 적어도 1백만 개의 세포)과 순도의 측면에서 유사한 결과가 모든 발단자(proband)로부터의 재료와 생물학적 실험으로 얻어졌다. 순도/오염의 측면에서 발단자들과 실험들 간의 유의한 차이는 발생하지 않았다. 수율에 대하여, 적어도 1백막개의 분화된 멜라닌세포를 얻기 위해 필요한 시간에서의 개별적 차이가 관찰되었다. 그러나, 모든 발단자, 생물학적 실험 및 반복실험에서, 백만개의 분화된 멜라닌세포의 최소 수율은 항상 4주 이하에 도달하였다.
성질결정( Characterization )
성질결정 판단기준은 3번째 계대 또는 그 이후에 충족되었다. p3 전에는, 세포들은 여전히 멜라닌세포에 대한 특정 성질결정 파라미터에 대해 음성적이었다.
세포들은 전형적으로 큰 세포체와 적어도 3개의 덴드라이트를 가졌으며(도 1 D), 그들은 티로시나제, NKI-beteb 및 HMB45를 발현하고(도 3, 7, 9), 성공적으로 L-DOPA를 전환시키고 멜라닌을 합성하였다(도 10). 모든 세포가 멜라닌 합성과 덴드라이트 성장을 성공적으로 유도하는, IBMX 시험에 대해 반응하였다.
PCL 섬유 메쉬 내로의 통합( integration )
PCL 스캐폴드 상에서 자라난 세포들은 3차원적 조직 맥락에서 적절히 내포되어 있고(nested) 전형적인 형태의 멜라닌세포로 추정된다. 그들은 다중적인 방향으로 덴드라이트를 확장시키고 스캐폴드의 섬유를 접속시킨다(도 7A 및 7B). 세포들은 스캐폴드로 이주하고 네트워크의 전체 깊이로 거주하게 된다(도 7C). 티로시나제의 분산된 패턴과 gp100 변이체의 국지화된 패턴 또한 멜라닌세포에서 전형적이다(도 7, 9). gp100 변이체는 덴드라이트 인터페이스 근처의 멜라노좀 소포 내에 위치한다(도 9). 세포들, NHEM 및 HM 모두에서 동일하게 높은 퍼센테이지가 PCL 스캐폴드 및 폴리스티렌 표면 상의 gp100 변이체 및 티로시나제를 나타낸다(도 8).
나아가, 스캐폴드 상의 세포의 L-DOPA 활성 및 멜라닌 함량은 평평한 부착성의 폴리스티렌 표면 상에서의 세포에 비해 몇 배 더 높았다 - 대략적으로 상피성 멜라닌세포에서 6-7배 및 ORS 멜라닌세포에서 2 배 (도 10).
케라틴세포 -기반의 표피 등가물내로의 도입
표피의 NHEM은 성공적으로 케라틴세포-기반의 표피 등가물 내로 도입되었다. 그들은 인간 피부 표피의 기저층에 상응하는 가장 낮은 층을 향해 배향되어 남아있었다. 멜라닌세포들은 그들의 특성을 유지하였으며 여기에서 기술된 바와 같은 멜라닌세포에 대한 성질결정 파라미터를 완전히 나타내었다(도 11).
실시예 2. 여기에서 제공된 방법은 Dieckmann ( loc . cit .)의 방법과 비교하여 멜라닌세포 생산에 있어서 보다 효율적이다
재료 및 방법
모발 시료로부터 HM 멜라닌세포를 배양하기 위한 이 유사한 실험적 플랫폼을 이용하여, Dieckmann et al. (Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5. Epub 2010 Mar 30)의 방법을 본 발명에 따른 방법과 비교하였다. 우리는 모든 과정을 동시적으로 진행하였다. 여기에서 기술된 방법에 따른 준비, 배양, 분화 및 성질결정의 과정은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 실시되었다. 상기 기술된 바와 같이, 여기에서 기술된 방법은, 그 중에서도, 모발의 모구를 제거하고, 콜라겐 분해제와 함께 발모된 모발을 인큐베이션하는 발모된 모발의 사용에 의해 Dieckmann의 방법과 차별화된다. 추가로, 본 발명의 방법은 제넥티신 처리를 포함할 수 있다. Dieckmann et al (loc. cit.)의 과정은 주어진 레퍼런스에 따라 수행된다. Dieckmann (loc. cit.)의 방법에서 사용된 것과 같은 M2에 대한 서플먼트는 소 뇌하수체 추출물 0.004 ml / ml, 염기성 섬유아세포 성장인자 (재조합 인간) 1 ng / ml, 인슐린 (재조합 인간) 5 ㎍ / ml, 하이드로코르티손 0.5 ㎍ / ml, 및 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 10 ng / ml를 함유한다. Dieckmann (loc. cit.)에 따른 부착 배양을 위한 배양 조건은 Promocell(Heidelberg, Germany)에 의해 생산된 SupplementMix가 보충된, 배지 멜라닌세포 성장 배지 M2를 포함한다. 이 배지의 SupplementMix는 잠재적인 종양 프로모터인 PMA를 함유하고 있기 때문에 Dieckmann (loc. cit.)의 방법에 의해 얻어진 세포들은 치료적 사용에 불리하다.
제넥티신 선별의 시점에서, 여기에서 기술된 바와 같이 부착 배양의 단계에서 제제 내 섬유아세포 및 케라틴세포 내용물을 선택적으로 버리기 위해 본 발명에 따라 배양된 모든 세포에 동시적으로 처리하였다. 그에 더하여, 분화하는 멜라닌세포에 대한 경쟁자로서의 오염원인 섬유아세포 및 케라틴세포의 역할을 명확히 하기 위해, 우리는 개별적으로 셋업된 'Dieckmann'(loc. cit.) 배양 실험을, 부착 배양의 최초 계대의 시점에서 제넥티신으로 처리하였다.
트립신 블루로 세포들을 염색하고 각 계대에서 Neubauer 챔버 내에서 계수하였다.
외모낭초 표면적 변화의 조사:
모낭 ORS의 표면적을 Nikon NIS Elements BR (Version: 3.00) 소프트웨어로 측정하였다. 형태적으로 명확하게 구별가능한 ORS는 조정가능한 다각형 프레임으로 모낭의 표면 현미경검사로 선별하였고 소프트웨어에 의해 표면적 수치를 해독하였다. 독립적으로 셋업된 4개의 배양 실험(3회 반복 실험)의 ORS 표면적의 수치를 0일, 7일 및 14일에서 비교하였다(도 13, 14).
제넥티신 첨가된 여기에서 제공된 방법과 Dieckmann ( loc . cit .) 방법의 비교:
추가로, 분화하는 멜라닌세포에 대한 경쟁자로서의 오염원인 섬유아세포 및 케라틴세포를 배제하기 위하여, 우리는 현재의 방법에서 사용된 상응하는 선별 척도로서 p0 후 50 ㎍/ml 제넥티신으로 'D ieckmann'(loc. cit.) 부착 배양물을 처리하였다.
결과 :
배양, 확장, 분화, 순수한 멜라닌세포 배양물의 선별
본 과정은 초대 배양의 p3 또는 p4 만큼 일찍, 20 생검 후 3 내지 4주 이내에 멜라닌성 단계에 도달한 95-100%의 순수한, 거의 완전히 분화된 인간 멜라닌세포의 매우 많이 확장된 배양물을 수득하였다(도 1-5). 특히, 60개의 모낭으로부터 배양 및 분화 과정은 부착 배양의 2 내지 5 계대에서, 발모 후 3-4주 이내에 멜라닌성 단계에 도달하는 106 개의 순수한, 분화된 인간 멜라닌세포를 수득하였다. Dieckman et al.에서의 결과와 비교하여, 여기에서 제시된 방법은 공개된 자료에 따른 시간의 절반 내에 106 개의 HM의 결과물에 도달하며, 우리의 발견에 따른 부착 배양의 매우 초기 계대에서 이미 Dieckmann(loc. cit.)에 의한 프로토콜의 수율을 훨씬 초과하였다.
ORS 표면적 성장:
방법들 간의 성장에서의 차이는 나일론 메쉬 상에서의 모낭 배양의 7일 및 14일째에 이미 가시적이어서, 여기에서 기술된 방법에 따라 배양된 모낭의 성장이 Dieckmann (loc. cit.) 방법과 비교하여 명확하게 더 높은 성장을 나타내었(도 14). 실시예1에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따라 콜라게나제로 분해하고 배양된 모낭의 ORS 표면적은 0일에 42.480±17.451 ㎛2에서 7일에 87.735±45.397 ㎛2, 14일에 125.838 ±58.446 ㎛2 로 증가한 반면, Dieckmann (loc. cit.) 방법에 따라 배양된 모낭은 0일에 43.302±9.226㎛2에서 7일에 50.039±10.753 ㎛2 , 14일에 77.488±29.569 ㎛2로 증가하였다. Dieckmann (loc. cit.) 방법과 본 방법 간의 표면적의 비율은 0일에 0,94 , 7일에 0,69 (p=0,01*) 그리고 14일에 0,72 (p=0,018*)로 감소하여 (도 13) , 콜라겐처리된 모낭으로부터의 세포의 성장과 이동이 더 빠름을 나타내었다. 세포들을 부착 배양으로 옮겨가기 위하여 트랜스웰 나일론 메쉬로부터 세포들을 수확하는 시점에서, 모든 시료의 모낭을 감안하였을 때 수확된 세포의 수는 Dieckmann (loc. cit.) 방법의 세포수를 1,84 배 초과하였다(도 16).
부착 배양에서의 비교 성장:
여기에서 기술된 방법에 따라 배양된, 부착 배양물 내의 세포들은 계속 분열하여 부착 배양 11일, 2 계대에서 1.000.000개의 수에, 6 계대에서 80.875.000개에 도달하였다. 우리의 방법과 대조적으로, Dieckmann et al. (loc. cit.) 프로토콜에 따라 배양된 부착 배양물 내의 세포는 부착 배양의 1계대에서 최고 세포수인 710.000개 세포, 부착 배양의 11일, 2계대까지 650.000개의 세포에 도달하였다. 여기에서 기술된 방법에서의 배양된 세포와는 달리, Dieckmann (loc. cit.) 방법에 따라 배양된 세포는 추가 계대에서 세포수가 감소하였다(도 15,16).
제넥티신 처리.
Dieckmann (loc. cit.)에 의한 부착 배양물에 우리의 본 방볍에서 사용된 상응하는 선별 척도로서의 50 ㎍/ml 제넥티신의 추가적 처리는 생존 세포의 극도로 낮은 수를 나타내었다(<2% 컨플루언스) (도 15,16).
본 발명에 따라 배양된 세포는 Dieckmann 방법 (loc. cit.)에 따라 배양된 세포 보다 더 많은 수에 도달하였다.
결론
ORS 표면적 변화.
콜라겐 단백질분해를 통해 세포외기질을 느슨하게 하는 콜라게나제는 ORS 중의 세포의 이동을 확실히 더 용이하게 만들었다. 이 효과는 ORS의 더 커진 표면적과 ORS로부터 나일론 메쉬로의 세포의 더 강력한 이동으로 알아볼 수 있었다(도 14). 본 발명에 따라 콜라게나제 V로 분해된 모낭에서의 ORS의 초기 성장은 0일 후의 부착 배양의 모든 날에서 Dieckmann (loc. cit.) 방법에 따라 비-분해된 모낭의 ORS의 초기 성장을 초과하였다. 본 발명에 따른 방법이 배지-공기-인터페이스 모낭 배양으로부터 더 많은 세포를 수확하고 함께 시작한 부착 배양의 셋업에 더 많은 세포를 갖게 하는 이점을 주었다. 본 방법에 의해 배양된 모낭으로부터 수확된 세포의 수는 부착 배양 0일에 Dieckmann (loc. cit.) 방법의 세포수를 1,84배 초과하였다 (도 15).
부착 배양에서의 비교 성장 .
여기에서 기술된 방법에 따fms 배양 실섬에서, 부착 배양물 내의 세포들은 계속 분열하여 부착 배양의 2 계대에서(Dieckmann et al. (loc. cit.)에 의한 동일 수에 필요한 시간의 절반) 1.000.000개의 세포에, 6계대에는 80.875.000개에 도달하였다. Dieckmann (loc. cit.) 방법에 따라 배양된 세포는 이러한 수에 결코 도달하지 못했으며, 사실 부착 배양의 2계대 후에는 세포수가 꾸준히 감소하였다.
제넥티신 처리 .
명확하게, 배지-공기 인터페이스 모낭 배양으로부터 수확된 재료 내 섬유아세포 및 케라틴세포의 비율은 Dieckmann (loc. cit.) 방법에 따른 제조물에서 훨씬 더 높았는데, 이는 그들 대부분이 제넥티신 선별 동안 죽었고 극히 적은 수의 세포만이 제넥티신 처리에서 생존하였기 때문이며, 이는 Dieckmann (loc. cit.) 방법이 충분한 줄기세포 및 전구세포를 제공하지 못해 부착 배양에서 멜라닌세포를 신속하게 배양하지 못함을 나타낸다(도 15). Dieckmann et al. (loc. cit.)에 따라 배양된 세포의 제넥티신 선별의 결과와 대조적으로, 여기에서 기술된 대로 배양된 세포의 많은 수가 이 선별 단계에서 생존하였고 매우 높은 세포수에 도달할 수 있었다(도 15).
줄기세포 및 전구체의 더 많은 시작 숫자와 본 방법에서 주어진 보다 유리한 부착 배양 조건의 시너지는 HM의 수율을 유의하게 증진시켰다(도 15).
실시예 3. 여기에서 제공된 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 공지의 멜라닌세포와 구별된다
본 발명에 따라 얻어진 멜라닌세포 (HM)는 성체 피부 멜라닌세포와 형태적으로 그리고 기능적으로 상응하지만, 그들은 세포 표면 마커 (표 1-5) 및 정량적인 형태적 파라미터(도 17)에 의해 볼 수 있는 바와 같이 구별되는 신규한 세포 실체이다.
재료 및 방법
형태적 특성
세포의 표면적 및 덴드라이트 길이를 Nikon NIS Elements BR (Version: 3.00) 소프트웨어에 의해 측정하였다. 실시예 1에서 기술된 바와 같이 3번의 배양 실험에서 실험당 총 5개의 세포를 평가하였다. 세포의 표면적은 조정가능한 다각형의 프레임에 의해 선택되었고 표면적 수치는 소프트웨어에 의해 구하였다. 덴드라이트 길이는 멀티포인트 선 길이 측정 툴에 의해 측정하였다.
Lyoplate 에 의한 표면 마커 분석, FACS 측정
표면 마커의 발현을 BD Lyoplate 인간 세포 표면 마커 스크리닝 패널에 의해 ㅂ부분석하였다. 인간 세포 표면 마커에 대한 242개의 항체의 이 패널을 정상 인간 상피 멜라닌세포 (NHEM) 및 ORS-유래 멜라닌세포 (HM)를 표지하는데 사용하였다. 실시예 1의 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 세포를 배양하고 특성화하였으며, 계대 10 내지 11에서 수확하여 제조사가 제공한 염색 완충액(Stain Buffer)에 재현탁하였다. 200.000 세포/웰의 앨리퀘트(Aliquots)를 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 각 웰 내 세포는 마우스-생성된 또는 랫트-생성된 일차 항체로 단일 표면 마커에 대해 표지하고, 계속적으로 Alexa 647 형광물질로 표지된 마우스 또는 랫트에 대한 상응하는 2차 항체로 표지하였다. 40-분의 인큐베이션 단계 간에, 세포를 염색 완충액으로 세척하고 300g으로 4분 동안 원심분리하였다. 염색 후, 표지된 세포를 4% 파라포름알데하이드로 10분 동안 고정하고, 세척하고, Becton Dickinson FACS 어레이 시스템으로 측정하였다. 측정값은 BD DIVA 소프트웨어로 분석하였다. 음성 대조군(비표지된 세포)을 사용하여 형광 신호의 문턱값을 정하였다. 2x103의 형광 강도를 마커 발현 형광 강도의 문턱값으로서 정하고 적어도 하나의 발단자에서의 문턱값을 넘어서는 형광 강도를 양성 발현 (+)로 표시하였다.
결과:
형태적 특성
NHEM 세포는 377±135㎛2의 평균 표면적을 나타내는 반면, HM은 290±74㎛2의 평균 표면적을 나타내며, 그에 따라, 표면적에 있어서 NHEM 세포체가 HM 세포체에 비해 23% 더 크다 (p=0,0451). NHEM의 덴드라이트는 평균 35,73±15 ㎛ 길이였으며, 이는 HM 세포의 21,57±10 ㎛ 길이의 덴드라이트에 비해 39% 더 길었다. NHEM이 HM (2,47±0,64)에 비해 약간 더 많은 수의 덴드라이트(3,13±1,19)를 가졌다 (p=0,065, 유의적이지 않음) (도 17).
표면 마커
242개의 시험된 세포 표면 마커 중, 229개가 HM에서 발현되었고, 이 중 13개의 마커가 HM에서 독점적으로 발현되었다 (세포 마커의 총 수의 5,37%). 229개의 마커가 NHEM에서 발현되었고, 13개의 마커가 NHEM에서 독점적으로 발현되었다 (5,37%). NHEM 및 HM 모두 모든 시험된 마커 중 84개의 세포 표면 마커를 발현하였다. NHEM 및 HM 간의 세포 표면 마커 발현에서의 차이는 모든 시험된 마커의 10,74% 및 발현된 마커의 34,7%였다(표 1-5).
NHEM 및 HM 간에 상이하게 발현된 마커의 대부분은 면역원성의 조절과 연관되어 있으며(HM 내의 CD195 CD108 CD40 CD36 CD15s CD282 CD173, CD274, NHEM 내의 CD1, CD28, CD79b, CD137, CD282, HLA-A2(A2), HLA-DQ) 발달에 중요한 역할을 하지 않는다. 특정 마커는 일반적으로 기능적이거나 멜라닌세포성 이외의 다른 계통에서 발현된다(HM 내 중간엽 세포 미토겐에 대한 CD40a, CD40b 수용체, NHEM 내 뉴런성으로 발현되는 부착 분자 CD57). 멜라닌세포에서 통상 발현되는 마커, CD117 및 CD221는 NHEM에서는 발현되었으나 HM에서는 발현되지 않았다.
표 2 및 3은 NHEM 세포 및 여기에서 제공되는 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포(HM)에서 상이하게 발현되는 표면 마커를 보여준다. 표 4 및 5는 NHEM 세포 및 여기에서 제공되는 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포(HM)에서 발현되는 표면 마커의 종합적인 목록을 보여준다.
NHEM 및 HM에 대한 각각의 특징적인 마커는 NCBI 단백질 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)의 NP 번호로 지정하였다. 그러한 단백질 데이터 베이스의 사용은 알려져 있으며, 그러므로 여기에서 사용된 마커의 상응하는 아미노산 및 핵산 서열은 당업자가 쉽게 입수가능하다.
결론:
형태학적 파라미터
HM 및 NHEM은 공통적인 형태를 공유하는데, 둘 다 돌출된 덴드라이트를 갖는 커다른 세포체를 갖는다. HM는 더 작은 세포 표면, NHEM에 비해 다소 작은 수의 더 짧은 덴드라이트를 나타낸다.
표면 마커
본 발명에 따라 얻어진 멜라닌세포과 NHEM는 표면 마커 발현(242개의 시험된 마커 중 10,74%) 및 전체적인 마커 발현(모든 발현된 마커 중 34,7%)에서 상이하다. 마커 발현에서의 차이는 HM 및 NHEM에서의 세포 정체성의 차이를 반영한다.
다른 계통에 대해 전형적인 마커의 발현은 HM과 NHEM의 본질에 따른다. 뉴런의 부착 분자인 CD57의 발현은 멜라닌세포와 뉴런성 세포의 공통적인 발달 기원을 따른다. CD40a, CD40b는 중간엽 세포에서의 미토겐에 대한 수용체로, HM이 중간엽 신호전달 신호에 대해 민감하도록 하나; 그럼에도 불구하고 중간엽 니쉐(niche)에 HM을 두는 것이 본 출원의 목표 내에 있는 것은 아니다.
CD40a, CD40b, CD104 및 CD106는 세포 성장 및 부착과 연관되어 있으며, HM에서 발현한다. CD117 발현 부재와 함께, 이는 HM의 줄기세포 기원을 반영하고, HM 세포의 기원의 흔적(residual naivity)을 가리키며, 이 세포들은 완전한 성체 멜라닌성 멜라닌세포 단계 직전에 부분적 점진된 멜라닌성 멜라닌아세포 단계에 위치한다.
CD221 (인슐린-유사 성장인자 1 티로신 키나아제 수용체)는 대부분의 인간 세포에서 발현된다. CD221은 세포 배양에 대한 중요한 특징인 세포 성장에 영향을 미치는 인슐린-유사 성장인자 IGF-1 및 IGF-2 시그날링을 매개한다. HM에서의 CD221 발현의 부재는 HM 세포의 이 수용체를 통한 IGF-1 및 IGF-2 시그날링을 허용하지 않으며 인슐린 수용체의 경쟁적 결합에 대해 IGF-1 및 IGF-2 인자를 제공한다. 배지 내 인슐린 서플먼트는 인슐린 수용체에 대한 100배 높은 친화성을 가져 이러한 경쟁적 결합을 제거하고 정상 세포 성자을 가능하게 하므로 이는 우리의 배양 시스템을 방해하지 않는다.
여기에서 얻어진 멜라닌세포는 상기 여기에서 기술된 바와 같이 정량될 수 있는 정성적 형태적 특성과 발현된 마커에서 차이가 있다. 이러한 차이로 인해, 여기에서 제공된 그리고 얻어진 멜라닌세포는 신규한 세포 실체(cellular entity)이다.
성질결정(characterization)의 다른 수준에서의 일련의 유사성은 ORS-분화된 HM이 표피 피부-유래의 NHEM에 대해 형태적으로 그리고 기능적으로 동등함을 보여준다. 이들 특성은 정성적으로 그리고 정량적으로 HM이 NHEM에 대한 우수한 대체물이며, 이는 그들이 비침범적으로 얻어지는 점에서 훌륭한 딜을 의미한다.
ORS 멜라닌세포는 동일한 세포내 마커 (티로시나제, gp100 변이체)를 발현하고, L-DOPA 기질을 멜라닌으로 전환하는 멜라닌형성에 대한 활성 효소 세트(티로시나제, TRP-1 및 TRP-2)를 지속시켜, 자발적 뿐만 아니라 보충된 기질로부터의 멜라닌을 생산하는 능력을 나타낸다. 나아가, HM은 이주할 수 있고 새로운 니쉐를 이동시킨다. 우리가 보인 바와 같이, 세포 표면 및 덴드라이트 길이와 같은 정량적인 형태적 파라미터 뿐만 아니라 FACS 분석의 전방 산란에 의해 측정된 HM은 더 작은 세포체와 더 짧은 덴드라이트 외에는 형태학적으로 NHEM과 꽤 유사하다. 또한, 세포 표면 마커 발현은 NHEM과 HM 간에 차이가 있다. 이들 차이로 인해 여기에서 제공된 멜라닌세포 (HM)는 상피성 NHEM와 비교할 때 새로운 세포 실체이다. 따라서 여기에서 제공된 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포는 신규하다.
표 1. 표피 멜라닌세포(NHEM) 및 본 발명에 따라 얻은 ORS-유래 멜라닌세포(HM) 간의 표면 마커 발현에서의 차이 표.
Figure 112014050284570-pct00002
표 2. NHEM에서 발현하는 마커의 표:
Figure 112014050284570-pct00003
표 3. 본 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포(여기에서 또한 "HM"로 지칭함)에서 발현되는 표면 마커의 표
Figure 112014050284570-pct00004
표 4. NHEM 멜라닌세포에서의 마커 성질결정
Figure 112014050284570-pct00005
Figure 112014050284570-pct00006
Figure 112014050284570-pct00007
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Figure 112014050284570-pct00010
Figure 112014050284570-pct00011
Figure 112014050284570-pct00012
표 5. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 멜라닌세포(HM)에 대한 마커 성질결정
Figure 112014050284570-pct00013
Figure 112014050284570-pct00014
Figure 112014050284570-pct00015
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Figure 112014050284570-pct00019
Figure 112014050284570-pct00020

Claims (21)

  1. (i) 발모된 인간 모발의 모구를 제거하는 단계;
    (ii) 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션하여 외모낭초로부터 줄기세포를 분리하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)로부터 분리된 줄기세포를, 멜라닌성 멜라닌세포로의 분화를 위한 하나 이상의 성장인자를 포함하는 분화 배지 중에서 배양하는 단계
    를 포함하는 줄기세포로부터의 멜라닌세포의 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 단계 (ii)과 단계 (iii) 사이에 발모된 모발의 남은 부분을 콜라겐분해제와 함께 인큐베이션 후 세척액으로 세척하는 추가의 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (iv) 배양액 중에서 분화된 멜라닌성 멜라닌세포를 선별 또는 분리해 내는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 멜라닌세포는 모근 소부의 해부학적 선별 또는 분별적 트립신처리를 이용하여 단계 (iv)에서 분리되는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 선별 단계는 제네티신 처리를 포함하는 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 선별 또는 분리는 분별적 트립신 처리 및 계속적으로 제네티신 처리를 이용하여 멜라닌세포를 분리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐분해제는 세포 표면, 세포 기저막의 기초, 피부 및 모발을 커버하는 콜라게나제 I, IV 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 β-아드레날린성 수용체 리간드, Ca2+, L-글루타민, 인슐린, 송아지 태아 혈청, 인간 혈청, 및 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 성장인자 및 배양 시약은 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 하이드로코르티손, 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF), 디부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (dbcAMP), 멜라닌세포 성장인자 (MeGF), 카포시 육종 유래 FGF-유사 인자(hst/K-FGF), 간세포 성장인자 (HGF), 줄기세포 성장인자 (SCF), 엔도텔린 1, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 천연인자의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되고, 상기 천연인자는 인간 케라틴세포가 배양된 배양배지, 소 뇌하수체 추출물, 소 뇌 추출물 및 인간 혈청로부터 유래하는 것인, 방법.
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