KR20240037477A - 멜라닌 모방 나노입자, 이의 제조방법, 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 멜라닌 유사 나노입자의 제조방법 및 이의 약리학적 용도 등에 관한 것으로서, 피오멜라닌의 생합성 과정을 모방한 화학적 방법을 통해 피오멜라닌을 효율적으로 합성할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명에 따른 제조방법은 효소나 미생물 등을 이용한 생물학적 방법에 의존하지 않으므로 균일한 품질의 피오멜라닌을 효율적으로 합성할 수 있으며, 세포나 촉매를 사용하지 않으므로 정제 과정이 비교적 간편하고 수율 또한 우수하다. 특히, 본 발명의 제조방법은 중금속 촉매를 사용하지 않으므로 친환경적이며, 전체 과정을 하나의 용기에서 수행할 수 있는 원-팟 (one-pot) 공정이므로 신속한 피오멜라닌 합성이 가능하다. 나아가, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 피오멜라닌은 우수한 항산화 효과 및 항염 효과를 발휘하며, 대표적인 자가면역질환인 염증성 장질환의 증상을 개선하고, 과잉의 면역반응을 억제할 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 피오멜라닌은 면역 과활성화로 인한 다양한 염증성 질환 및 자가면역질환의 치료제로 유용히 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

멜라닌 모방 나노입자, 이의 제조방법, 및 이의 용도 {Melanin mimicking nanoparticles, the method of preparing the same, and the use thereof}

본 발명은 멜라닌의 구조 및 기능을 모방한 나노입자, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.

멜라닌 (melanin)은 생명체에서 합성 되는 갈색 또는 흑색의 고분자 중합체를 총칭하는 용어로, 동물과 식물, 박테리아와 균류를 포함하는 미생물등에서 다양한 역할을 한다. 멜라닌은 대표적으로 색소침착, 활성산소 포집 (reactive oxygen scavenging), 자외선 및 방사선에 의한 세포 손상 억제와 관련이 있고, 온도 조절 등에도 관여한다고 알려져 있다. 멜라닌의 다양한 기능은 멜라닌 특유의 물리화학적 성질로부터 기인한다. 대표적으로, 멜라닌에 존재하는 phenolic functional group은 풍부한 전자를 함유하며, 이는 홀전자를 갖고 있는 불안정한 radical compound, 특히 활성산소종 (radical oxygen species, ROS)과 쉽게 반응하며 이를 제거하는데 탁월한 능력이 있다. 따라서 멜라닌은 혐기성 환경 (hypoxia) 또는 자외선, 방사선으로부터 생성 된 ROS 등을 제거하고, 세포를 보호할 수 있으므로, 많은 박테리아들의 생존에 중요한 역할을 한다.

멜라닌의 경우 구조적인 특징을 기반으로 크게 유멜라닌 (eumelanin), 페오멜라닌 (pheomelanin), 뉴로멜라닌 (neuromelanin), 및 알로멜라닌 (allomelanin)으로 분류 할 수 있다. 알로멜라닌은 주로 미생물에서 발견되며, 미생물의 생존, 보호, 및 병원균의 병원성에 기여한다. 피오멜라닌 (pyomelanin)은 알로멜라닌의 일종으로, 티로신으로부터 합성 되며, 중간대사체인 호모젠티스산 (homogentisic acid)을 거쳐 합성되는 미생물 유래 멜라닌으로 알려져 있다.

피오멜라닌을 약리학적으로 활용하기 위해, 피오멜라닌을 다량으로 효율적으로 합성하기 위한 방법들이 개발되어 왔다. 현재까지 피오멜라닌 생산 공정은 주로 효소를 이용하거나, 세균에서 합성된 피오멜라닌을 추출 및 정제하는 방법에 의존한다. 그러나 이와 같은 생물학적인 공정을 이용하여 생산한 피오멜라닌의 경우, 불필요한 성분들이 다량 함유된 복잡한 혼합물로부터 피오멜라닌만을 정제 및 추출하는 과정을 수행해야만 한다. 특히, 생산 공정에 미생물 등의 세포를 이용하므로, 미생물 및 이로부터 유래한 물질로 인한 오염의 가능성이 있다. 미생물로 인한 오염은 질환을 유발 할 수 있는 병원성의 가능성이 있으며, 따라서 피오멜라닌을 의약품으로 활용하는데 큰 걸림돌이 되고 있다. 또한, 생물학적인 방법을 통하여 균일한 품질의 피오멜라닌을 생산하기위해서는 세균의 배양부터 분리 및 추출까지 여러가지 요소들을 정교하게 조절해야한다. 이는 피오멜라닌의 균일한 생산의 효율을 떨어트리며, 상용화 및 경제성의 큰 걸림돌이 된다.

따라서, 효소를 이용하거나, 미생물로부터 합성된 피오멜라닌을 추출하는 생물학적 방법이 아닌, 화학적인 공정을 통해 균일한 품질의 피오멜라닌을 효율적으로 생산할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

대한민국 등록특허 제10-2025636호

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 피오멜라닌의 생합성 과정을 모방한 화학적 방법을 통해 균일한 품질의 인공피오멜라닌을 효율적으로 합성할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 또한, 이를 통해 제조된 피오멜라닌은 우수한 항산화 및 항염 효과를 가지며 따라서 염증성 장질환을 포함한 다양한 자가면역질환에 대해 치료 효과를 갖는 바, 다양한 약리학적 용도로 활용 가능할 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자 (pyomelanin nanoparticles, PMNP)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 피오멜라닌 나노입자 (pyomelanin nanoparticles)의 제조방법을 제공한다:

(S1) 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 염기성 용액에 용해시킨 후 교반하는 단계; 및

(S2) 산성 용액을 첨가한 후 교반하는 단계.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one은 0.1 내지 10 mg/mL의 농도로 용해될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 (S2) 단계에서 산성 용액이 첨가된 후 전체 용액의 농도는 5 내지 10N일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단계 (S1)에서 상기 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 산화 반응을 일으키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 피오멜라닌 나노입자는 상기 단계 (S2)에서 자가중합되어 침전되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 상기 단계 (S2)에서 수득한 피오멜라닌 나노입자를 이의 pH가 중성이 되도록 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 중금속 촉매를 사용하지 않는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 원-팟 (one-pot) 공정일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 피오멜라닌 나노입자는 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 구조식을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

또한, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 개선, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 자가면역질환은 염증성 장질환이다.

또한, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자의 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 개선, 또는 치료용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 염증성 질환 또는 자가면역질환의 치료용 약제의 제조를 위한 피오멜라닌 나노입자의 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 개선, 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 피오멜라닌 나노입자는 직경이 30 내지 300 nm일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 피오멜라닌 나노입자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(a) 장 수축을 억제함;

(b) 면역세포 조직 침윤을 억제함;

(c) 장 내 염증성 싸이토카인 또는 케모카인의 수준 또는 활성을 억제함; 및

(c) 장 내 활성산소종을 포촉함.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병, 및 베체트장염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 장 내 염증을 억제하기 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 피오멜라닌 나노입자는 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 피오멜라닌 나노입자는 상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 구조식을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 염증성 장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명은 멜라닌 유사 나노입자의 제조방법 및 이의 약리학적 용도 등에 관한 것으로서, 피오멜라닌의 생합성 과정을 모방한 화학적 방법을 통해 피오멜라닌을 효율적으로 합성할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명에 따른 제조방법은 효소나 미생물 등을 이용한 생물학적 방법에 의존하지 않으므로 균일한 품질의 피오멜라닌을 효율적으로 합성할 수 있으며, 세포나 촉매를 사용하지 않으므로 정제 과정이 비교적 간편하고 수율 또한 우수하다. 특히, 본 발명의 제조방법은 중금속 촉매를 사용하지 않으므로 친환경적이며, 전체 과정을 하나의 용기에서 수행할 수 있는 원-팟 (one-pot) 공정이므로 신속한 피오멜라닌 합성이 가능하다. 나아가, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 피오멜라닌은 우수한 항산화 효과 및 항염 효과를 발휘하며, 대표적인 자가면역질환인 염증성 장질환의 증상을 개선하고, 과잉의 면역반응을 억제할 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 피오멜라닌은 면역 과활성화로 인한 다양한 염증성 질환 및 자가면역질환의 치료제로 유용히 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 세포막에 존재하는 미생물 유래 멜라닌과 본 발명의 일 구현예에 따른 피오멜라닌 나노입자 (PMNP)를 비교하여 나타낸 그림이다.
도 1b는 본 발명의 PMNP의 제조과정을 나타낸 화학반응식으로, 구체적으로는 homogentisic acid-γ-lactone (HGL) 으로부터 homogentisic acid (HGA), 및 1,4-benzoquinone acetic acid (1,4-BQA)을 거쳐 PMNP가 합성된 과정을 나타냈다.
도 2는 HGL로부터 합성한 PMNP의 수용액 상의 size 분포를 나타낸 그래프이다.
도 3은 HGL로부터 합성한 PMNP의 수용액 상의 zeta potential을 나타낸 그래프이다.
도 4는 PMNP의 세포독성을 평가하기 위해 면역세포에 PMNP를 다양한 농도로 처리한 후 MTT 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5 및 도 6은 PMNP의 활성산소종 포집 효과를 확인하기 위해 대식세포에 PMNP를 다양한 농도로 처리한 후 H2DCFDA dye를 이용하여 세포 내 활성산소종 수준을 측정한 결과를 나타낸다. 도 5는 H2DCFDA-양성 세포의 유세포분석 결과를, 도 6은 H2DCFDA 형광 신호를 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7 및 도 8은 PMNP의 염증성 장질환 치료 효과를 확인하기 위해, DSS (dextran sulfate sodium)로 염증성 장질환을 유도한 마우스 모델에 PMNP를 투여한 후 결장길이를 비교한 결과를 나타낸다 (Control, 질환을 유도하지 않은 그룹; DSS, DSS를 공급하여 염증성 장질환을 유도한 그룹; 각 농도는 투여된 음용수 내 PMNP의 농도를 나타냄).
도 9 내지 도 12는 PMNP의 항염 효과 및 자가면역질환 치료 효과를 확인하기 위해 염증성 장질환 마우스 모델에 PMNP를 다양한 농도로 투여한후 결장 조직 내 염증성 사이토카인인 interleukin (IL)-1β (도 9), tumor necrosis factor (TNF)-α (도 10), IL-6 (도 11); 및 케모카인인 monocyte chemoattractant protein (MCP)-1 (도 12)을 정량 평가한 결과를 나타낸다.

구체적으로, 본 발명은 멜라닌 유사 (모방) 나노입자, 바람직하게는 미생물 유래의 멜라닌 모방 나노입자의 제조방법 및 이의 약리학적 용도 등에 관한 것으로서, 효소, 미생물, 중금속 촉매 등에 의존하지 않고 균일한 품질의 피오멜라닌을 효율적으로 합성할 수 있는 화학적 원-팟 (one-pot) 공정을 제공한다. 또한, 상기 공정을 통해 제조된 피오멜라닌 나노입자는 우수한 항산화 및 항염 효과가 확인된 바, 다양한 자가면역질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도로 활용 가능하다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법을 제공한다:

(S1) 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 염기성 용액에 용해시킨 후 교반하는 단계; 및

(S2) 산성 용액을 첨가한 후 교반하는 단계.

본 발명에 있어서, “피오멜라닌 나노입자 (pyomelanin nanoparticles)”는 피오멜라닌 분자로 이루어진 나노입자를 지칭한다. 피오멜라닌 (pyomelanin)은 다양한 박테리아, 진균, 포유류, 및 식물에서 L-티로신 경로를 통해 합성되는 천연 고분자로, 중간대사체인 호모젠티스산 (homogentisic acid)을 거쳐 합성된다. 피오멜라닌은 멜라닌과 유사하게 암갈색을 띠며, 수용성이다. 반면, 피오멜라닌은 멜라닌과 달리 질소 원자를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 효소, 미생물 등에 의존하지 않고 화학적인 공정에 의해서 합성된 인공 피오멜라닌에 기반한 것으로서, 박테리아 등에서 합성된 천연 피오멜라닌과는 구별된다. 특히, 피오멜라닌은 합성 과정에 따라 구체적인 구조가 달라질 수 있으므로, 본 발명에 따른 피오멜라닌은 박테리아에서 합성된 천연 피오멜라닌과는 상이한 구조를 가질 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 피오멜라닌은 멜라닌 모방 유사체로서 인공적으로 합성된 것이다. 본 명세서 전반에 있어서, “피오멜라닌 나노입자”는 인공 피오멜라닌 나노입자, (미생물 유래) 멜라닌-유사 나노입자, (미생물 유래) 피오멜라닌-유사 나노입자 등으로 지칭될 수 있다.

예컨대, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 피오멜라닌 나노입자는 치환기로 하나 이상의 하이드록실기 (OH), 카복실산 (-COOH), 카르보닐기 (C=O), 1,4-벤조퀴닌 (1,4-Benzoquinone), 및 페놀기 (phenol group) 등을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 미생물 유래의 천연 피오멜라닌은 미생물의 세포벽 또는 세포막과 결합되어 있기 때문에 질소 (N)를 포함하는 아민기 또는 펩타이드기 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 반면, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 피오멜라닌 나노입자 (즉, 미생물 유래 피오멜라닌의 모방체)를 구성하는 피오멜라닌은 단량체 (monomer)로부터 합성된 것으로서 질소 원자를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 비제한적인 예시로서, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자의 피오멜라닌은 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 구조로 나타낼 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

또한, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 호모젠티스산 (homogentisic acid, HGA)의 유도체 또는 이의 염으로부터 합성되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 호모젠티스산 유도체는 하나 이상의 하이드록실기를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 호모젠티스산 유도체는 메틸기 (CH₃)를 포함하지 않는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one (혹은, homogentisic acid-γ-lactone(HGL)으로도 지칭됨)을 출발물질로 하여 합성되는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 제조방법에 의하면 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one로부터 간단한 과정을 거쳐 피오멜라닌 나노입자를 제조할 수 있으므로, 보다 신속한 합성이 가능하다. 상기 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one는 하기 화학식 5의 구조를 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[화학식 5]

본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 염기성 환경에서의 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one의 산화 및 자가중합 반응을 통해 제조된다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 (S1)은 본 발명에 따른 (인공) 피오멜라닌 (즉, 미생물 유래 멜라닌 또는 미생물 유래 피오멜라닌의 모방체)이 합성되는 단계이다. 즉, 상기 단계 (S1)은 '2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 염기성 용액에 용해시킨 후 교반하여 (인공) 피오멜라닌을 합성하는 단계'로 지칭될 수 있다. 상기 단계 (S1)에서 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one은 염기성 조건 하에서 산화 반응을 일으켜 최종적으로 피오멜라닌으로 전환된다. 구체적으로, 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one은 염기성 용액에 용해되면 호모젠티스산 (homogentisic acid, HGA)으로 전환되며, 염기성 조건에서 이를 계속하여 교반하면 자연스럽게 HGA의 산화 반응이 일어나게 된다. 산화 반응을 일으킨 HGA는 hydroquinone가 benzoquinone으로 전환되면서 1,4-benzoquinone acetic acid (1,4-BQA)이 되며, 최종적으로는 본 발명에 따른 피오멜라닌으로 전환된다. 이와 같이, 본 발명은 출발물질에 염기성 용액을 첨가하여 교반하는 과정만으로 인공 피오멜라닌을 제조할 수 있는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 인공 피오멜라닌은 염기성 환경에서의 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one의 산화 반응, 즉, 단일 단계 반응 (one-step reaction)을 통해 합성이 가능하다.

본 발명에 있어서 상기 염기성 용액은 pH 9 내지 14, pH 10 내지 14, pH 11 내지 14, pH 12 내지 14, pH 13 내지 14, pH 10 내지 13, pH 11 내지 13인 염기성 용액이면 충분하고, 구체적인 종류에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 강염기성 수용액이다. 상기 염기성 수용액은 수산화 나트륨, 수산화 소듐, 수산화 칼륨, 및 디에틸아민 수용액 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 염기성 용액의 농도는 0.1 내지 10 mM, 0.1 내지 8 mM, 0.1 내지 5 mM, 0.1 내지 4 mM, 0.1 내지 3 mM, 0.1 내지 2.5 mM, 0.5 내지 5 mM, 0.5 내지 3 mM, 0.5 내지 2.5 mM, 1 내지 5 mM, 또는 1 내지 3 mM 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 발명에 있어서 염기성 용액은 출발 물질의 산화 반응이 염기성 조건에서 이루어지도록 환경을 조성하기 위해 사용된 것으로서, 이와 같은 염기성 환경은 반드시 염기성 용액을 사용하여 조성되어야 하는 것은 아니며, 염기성 환경을 조성할 수 있는 물질이라면 제한 없이 적용 가능하다.

바람직하게는, 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one는 염기성 용액에 0.5 내지 20 mg/mL의 농도로 용해될 수 있다. 즉, 상기 화합물은 염기성 용액에 0.5 내지 20 mg/mL, 0.5 내지 15 mg/mL, 0.5 내지 10 mg/mL, 0.5 내지 8 mg/mL, 0.5 내지 5 mg/mL, 0.5 내지 3 mg/mL, 1 내지 20 mg/mL, 1 내지 15 mg/mL, 1 내지 10 mg/mL, 1 내지 8 mg/mL, 1 내지 5 mg/mL, 또는 1 내지 3 mg/mL의 농도로 용해될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기서, 상기 교반은 10 내지 35 ℃, 10 내지 30 ℃, 10 내지 27 ℃, 20 내지 35 ℃, 20 내지 30 ℃, 또는 20 내지 27 ℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 실온에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 교반은 1 내지 36 시간, 1 내지 30 시간, 1 내지 28 시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 24 시간, 5 내지 30 시간, 5 내지 25 시간, 10 내지 30 시간, 10 내지 25 시간, 20 내지 30 시간, 또는 20 내지 25 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 (S2)는 상기 단계 (S1)을 통해 합성된 피오멜라닌이 나노입자의 형태로 중합 및 정제되는 단계이다. 따라서, 상기 단계 (S2)는 '산성 용액을 첨가한 후 교반하여 피오멜라닌의 중합을 유도하는 단계' 또는 '산성 용액을 첨가한 후 교반하여 피오멜라닌 나노입자를 제조하는 단계' 등으로 지칭될 수 있다. 상기 단계 (S1)에서 제조된 피오멜라닌에 산성 용액을 첨가한 후 교반하면 피오멜라닌 분자들의 무작위적인 중합반응이 일어나며, 결과적으로 나노입자의 형태로 정제된다. 즉, 상기 단계 (S2)는 나노입자의 중합 및 정제를 유도하는 work-up 단계로서, 상기 산성 용액은 단계 (S1)의 반응을 종료하고 피오멜라닌만을 나노입자의 형태로 정제하기 위해 사용되는 것이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서 산화 반응은 출발물질을 염기성 용액에 용해시킨 후 교반함으로써 자연스럽게 일어날 수 있다. 즉, 상기 산화 반응은 합성 물질 (출발 물질)을 공기중의 산소에 노출시킴으로써 이루어질 수 있다. 그러나 상기 산화 반응은 특정 방식에 한정되는 것은 아니며, 기타 공지된 산화 방법이 제한 없이 적용될 수 있다. 예컨대, 상기 산화 반응은 염기성 용액에 용해된 물질에 산소 기체를 직접 공급하여 유도될 수도 있으며, 기타 공지된 산화제를 첨가하여 수행될 수도 있다. 상기 산화는 분자, 원자, 또는 이온이 산소를 얻거나, 수소 혹은 전자를 잃는 것을 지칭하는 것으로서, 상기 단계 (S1)에서의 산화는 호모젠티스산의 하이드록실기가 산화되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 상기 단계 (S2)를 거침으로써 하나 이상의 하이드록실기를 가질 수 있다.

여기서, 상기 단계 (S2)의 산성 용액은 pH 1 내지 5, pH 1 내지 4, pH 1 내지 3.5, pH 2 내지 5, pH 2 내지 4, pH 2 내지 3.5, pH 2.5 내지 5, pH 2.5 내지 4, pH 2.5 내지 3.5인 산성 용액이면 충분하고, 구체적인 종류에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 강산 수용액이다. 상기 산성 용액은 염산, 질산, 과염소산, 브로민화 수소산, 아이오딘화 수소산, 과염소산 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 상기 단계 (S2)의 산성 용액은 황산은 아닌 것을 특징으로 한다. 상기 단계에서 황산을 사용하는 경우, 나노입자의 형성 (중합)이 일어나지 않을 수 있다. 또한, 상기 산성 용액의 농도는 5 내지 20N, 5 내지 15N, 5 내지 10N, 7 내지 15N, 7 내지 12N, 또는 8 내지 12N일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 (S2) 단계에서 산성 용액이 첨가된 후 전체 용액의 농도는 5 내지 10N, 5 내지 10N, 6 내지 10N, 7 내지 10N, 5 내지 8N, 6 내지 8N, 또는 7 내지 8N 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기서, 상기 교반은 10 내지 35 ℃, 10 내지 30 ℃, 10 내지 27 ℃, 20 내지 35 ℃, 20 내지 30 ℃, 또는 20 내지 27 ℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 실온에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 교반은 1 내지 36 시간, 1 내지 30 시간, 1 내지 28 시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 24 시간, 5 내지 30 시간, 5 내지 25 시간, 10 내지 30 시간, 10 내지 25 시간, 20 내지 30 시간, 또는 20 내지 25 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 과정을 통해 합성된 피오멜라닌 나노입자는 원심분리를 통해 더욱 침전시킬 수 있다. 상기 원심분리는 20,000 내지 40,000g, 25,000 내지 40,000g, 20,000 내지 35,000g, 20,000 내지 30,000g, 또는 25,000 내지 30,000g에서 수행될 수 있으며, 5분 내지 60분, 5분 내지 50분, 5분 내지 40분, 5분 내지 30분 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 제조방법은 상기 단계 (S2)에서 수득한 피오멜라닌 나노입자를 이의 pH가 중성 (즉, pH 6.5 내지 7.5, 또는 pH 7)이 되도록 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척은 증류수를 이용할 수 있다.

또한, 상기 제조방법은 상기 (S2)에서 수득한 피오멜라닌 나노입자를 공극 (pore)이 있는 필터로 여과하여 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 공극은 직경이 300 내지 500 nm, 350 내지 500 nm, 또는 400 내지 450 nm일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 필터는 폴리카보네이트 필터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 제조방법은 미생물을 사용하지 않는 것을 특징으로 하며, 따라서 미생물 또는 이의 유래 성분을 제거하는 과정을 필요로 하지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법은 촉매를 사용하지 않는 것을 특징으로 하며, 특히 망간과 같은 중금속 촉매를 사용하지 않는 것을 특징으로 한다. 합성 공정에 촉매를 사용하는 경우, 목적하는 성분만을 수득하기 위해 추후 촉매를 제거해야 하는데, 이 과정에서 불필요한 시간 및 비용이 소모될 뿐만 아니라 목적하는 성분의 수율도 저하될 수 있다. 특히, 중금속 촉매의 경우 제거가 어렵기 때문에 목적하는 성분을 오염시킬 수 있다. 반면, 본 발명은 특별한 촉매를 사용하지 않으므로, 촉매를 제거하기 위한 과정을 필요로 하지 않으며, 특히 중금속 촉매를 사용하지 않으므로 보다 친환경적이며, 피오멜라닌 나노입자를 고수율로 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 원-팟 (one-pot) 공정인 것을 특징으로 한다. 상기 “원-팟 공정”은 반응물이 하나의 반응응기에서 연속적인 화학 반응을 일으켜 화학 반응의 효율을 향상시키는 과정을 말한다. 즉, 원-팟 공정은 중간 화합물의 분리 과정 및 정제를 필요로 하지 않으므로 시간 및 자원을 절약할 수 있고, 목적하는 최종 성분의 수율을 증진시킬 수 있다. 즉 본원발명은 출발물질 (예컨대, 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 염)로부터 피오멜라닌 나노입자의 침전까지의 과정이 원-팟 공정으로 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 피오멜라닌은 다양한 물질을 첨가하거나 특정 온도로 조절하는 등의 다중 단계 (multi-steps)를 거치지 않고, 출발물질에 염기성 용액을 첨가하여 교반하는 것만으로 합성이 가능하므로, “단일 단계 (one-step reaction)”를 통해 제조가 가능한 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 제조방법에 의하면 단일 단계를 통해 인공 피오멜라닌을 합성한 후 간단히 산성용액을 첨가함으로써 피오멜라닌 나노입자를 제조할 수 있으므로, 기타 알려진 멜라닌 유사 물질의 합성방법에 비해 시간적, 비용적으로 매우 효율적이며, 고도의 기술적 지식 없이도 간단히 인공 피오멜라닌 나노입자를 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법으로 합성된 피오멜라닌 나노입자는 상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 구조식을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 및 건강기능식품 조성물 등을 포함한다. 또한, 상기 치료는 자가면역질환의 진행 억제를 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서, “염증성 질환 (inflammatory dieseases)”은 염증 (inflammation)을 원인으로 하는 질환을 의미한다. 본 발명에 있어서, 염증성 질환은 염증과 관련된 질환 내지 염증을 억제함으로써 개선/치료될 수 있는 질환이라면 제한 없이 포함하고, 구체적인 종류로 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 위염, 위궤양, 십이지장궤양,　염증성　피부질환, 알레르기성 질환, 크론병 (Crohn's desease), 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염,　염증성　장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염 (테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury), 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서, “자가면역질환 (autoimmune diseases)”은 면역계가 외부 항원이 아닌 내부의 정상 세포 내지 조직을 공격하여 발생하는 질환을 의미한다. 즉, 자가면역질환은 과도한 면역반응의 활성화로 인해 발생하는 질환을 의미한다. 따라서, 본 발명에 있어서 자가면역질환은, 과잉 면역반응으로 인한 질환 내지 면역반응을 억제함으로써 개선/치료될 수 있는 질환이라면 제한 없이 포함하고, 구체적인 종류로 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염 (Juvenile rheumatoid arthritis), 성인 스틸씨병 (adult onset Still's disease), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's　syndrome), 원발성 담즙성 경변증 (primary biliary cirrhosis), 셀리악병 (celiac disease), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease), 제1형 당뇨병 (type I diabetes), 자가면역성 용혈성 빈혈증 (autoimmune hemolytic anemia), 굿파스쳐 증후군 (Goodpasture syndrome), 그레이브스 병 (Graves' disease), 하시모토 갑상선염 (Hashimotos thyroiditis), 중증근무력증 (myasthenia gravis), 천포창 (pemphigus), 및 혈관염 (vasculitis) 등으로부터 선택될 수 있다.

특히, 본 발명은 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 염증성 장질환은 장에 만성적인 염증이 발생하는 질환을 의미하며, 재발성 복통, 설사, 혈변, 체중 감소, 결장의 섬유화 (또한 이로 인한 결장의 수축) 등을 주요 증상으로 한다. 구체적으로는, 장에 생긴 염증이 6개월 이상 지속되어 만성화되는 만성 소화기 질환을 통칭한다. 따라서, 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염, 허혈성 장질환, 및 방사선성 장염 등이 이에 포함될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병, 및 베체트병으로부터 선택될 수 있다. “궤양성 대장염”은 대장에서의 만성 염증성 질환을 의미하며, 그 범위에 따라 직장염, 좌측대장염, 광범위대장염으로 더 나뉠 수 있고, 장의 점막층에 염증이 생긴 것을 특징으로 한다. “크론병”은 입에서 항문에 이르는 소화관 전체에서 염증이 발생한 질환을 의미한다. 다만, 염증 부위가 항상 연속된 것은 아니며, 여러 곳에서 분리되어 존재할 수 있다. 크론병 환자 중 약 1/3은 소장에서만 염증이 있으며, 1/3은 대장에서만 염증이 있고, 나머지 1/3은 대장 및 소장 양쪽에서 만성 염증이 발생한다. 특히, 소장의 끝과 대장이 만나는 부위에 염증이 발생한 경우가 가장 흔하다. 크론병은 점막층, 점막하층, 근육층 및 장막층 등 장벽의 전층을 침범하는 염증 반응을 특징으로 한다. “베체트병”은 만성적이고 반복적인 전신질환으로 염증이 피부, 점막, 눈, 장, 관절, 비뇨생식기, 미 신경계 등 여러 장기로 침범한 질환을 의미한다. 베체트병 환자의 3 내지 5%는 소장 또는 대장에서 염증이 발생하며, 소장의 끝부분과 대장이 연결되는 부위에서 염증이 가장 흔하게 발생한다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자가 장 내 염증을 억제하고, 염증성 장질환 모델의 임상 증상을 정상 수준에 가까운 정도로 완화시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 특히 염증성 장질환에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 장 내 염증, 더욱 바람직하게는 결장 내 염증의 예방, 개선, 및/또는 치료에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 자가중합 (self-polymerization)되어 제조된 것을 특징으로 하며, 구체적인 형태나 크기에 제한 없다. 바람직하게는, 상기 피오멜라닌 나노입자는 직경이 30 내지 500 nm, 30 내지 400 nm, 30 내지 300 nm, 30 내지 200 nm, 50 내지 500 nm, 50 내지 400 nm, 50 내지 300 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 150 nm, 50 내지 100 nm, 100 내지 200 nm, 또는 150 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 피오멜라닌 나노입자는 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 피오멜라닌 나노입자는 상기 제조방법과 관련하여 기재된 피오멜라닌 나노입자의 특성을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 항산화 효과 및 항염증 효과를 발휘함으로써 염증 내지 과도한 면역반응에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:

(a) 장 수축을 억제함;

(b) 면역세포 조직 침윤을 억제함;

(c) 장 내 염증성 싸이토카인 또는 케모카인의 수준 또는 활성을 억제함; 및

(c) 장 내 활성산소종을 포촉함.

상기 “장 (intestine)”은 위로부터 이어지는 가늘고 긴 소화기관을 지칭하며, 소장 (십이지장, 공장, 회장) 및 대장 (맹장, 결장, 직장, 항문관)을 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 장은 대장을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 결장 (colon)을 의미할 수 있다.

상기 “장 수축”은 장 내 염증 또는 섬유화 등으로 인해 장이 수축하여 길이가 감소한 것을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 생체고분자 나노입자는 장 내 염증 또는 섬유화로 인한 장 수축을 예방 또는 개선할 수 있다.

상기 “염증성 싸이토카인 (cytokines)”은 염증을 유발하는 싸이토카인이라면 제한 없이 포함될 수 있고, 구체적인 종류에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 “케모카인 (chemokines)”은 면역세포를 모집 (recruitment)하는 케모카인 또는 화학주성 (chemotactic) 싸이토카인이라면 제한 없이 포함될 수 있고, 구체적인 종류에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 MCP-1일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 조직 내 케모카인의 수준을 억제함으로써 면역세포의 조직 침윤을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 생체고분자 나노입자는 병변의 활성산소종을 포집함으로써 염증 반응을 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 생체고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 장 내 염증 억제용 약학적 조성물을 추가로 제공한다.

본 명세서에 기재된 화합물의 범위에는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 포함된다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “약학적으로 허용 가능한”이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물 또는 조성물을 의미한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 화합물의 범위에는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 상기 피오멜라닌 나노입자의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 경구투여, 정맥투여, 복강내 투여, 및/또는 피하주사용인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자를 염증성 장질환 동물모델에 경구투여 또는 정맥투여하였을 때 우수한 치료 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 증류수 또는 등장액 (isotonic solution)에 분산되어 투여되는 것을 특징으로 한다. 상기 등장액은 구체적인 종류에 제한되지 않고, 체액과 등장성 (isotonic)을 보이는 용액이라면 제한 없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 포도당 수용액 및 생리식염수 (NaCl 용액) 등으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 포도당 수용액의 농도 (w/w%)는 4 내지 6% 일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 농도가 5% 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 생리식염수 농도 (w/w%)는 0.5 내지 1% 일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 농도가 0.9% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

더욱 바람직하게는, 상기 피오멜라닌 나노입자를 경구투여하는 경우, 상기 피오멜라닌 나노입자는 증류수에 분산되어 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 생체고분자를 정맥투여하는 경우, 상기 피오멜라닌 나노입자는 포도당 수용액에 분산되어 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 피오멜라닌 나노입자를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 피오멜라닌 나노입자를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 피오멜라닌 나노입자는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자를 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역질환의 예방, 개선, 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, “키트 (kit)”는 구체적인 형태나 종류에 제한이 없으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 키트는 상기 피오멜라닌 나노입자 외에도 상기 나노입자의 보관 용액, 투여 도구, 투여용 현탁액 등을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 나노입자의 특성 등에 관한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 키트는 본 발명에 따른 제조방법이 기재된 지시서를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 피오멜라닌 나노입자 (Artificial pyomelanin nanoparticle, PMNP)의 제조

염기성 조건하에서 호모젠티스산 (homogentisic acid)의 산화 및 자가 중합반응을 통하여 피오멜라닌 나노입자를 합성하였다.

구체적으로, 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one (homogentisic acid-γ-lacotne, HGL)을 2 mM 수산화 나트륨 용액에 녹여 2 mg/mL이 되게 준비한 후, 24 시간 동안 상온 (25 ℃)에서 자기 교반하였다. 그 후, 10 N의 진한 염산을 첨가하여 전체 용액의 농도가 7.5 N이 되도록 정제하고, 24시간 동안 상온 (25 ℃)에서 자기 교반하여 나노입자를 침전 시켰다. 반응 및 추출이 종료 되면, 27,100g에서 30 분 동안 원심분리하여 흑색의 피오멜라닌 나노입자 침전물을 수집하고, 입자가 중성이 될 때까지 삼중 증류수로 세척하였다. 최종 세척된 피오멜라닌 나노입자는 450 nm 폴리카보네이트 필터에 여과하였으며, 증류수에 현탁시켜 현탁액 상태로 4 ℃에 보관하였다. 폴리도파민 나노입자의 경구투여 시에는 삼중 증류수에 분산하여 투여하였다. 본 발명의 피오멜라닌 나노입자의 제조과정은 도 1에 나타냈다.

실시예 2. 피오멜라닌 나노입자의 크기 및 제타전위 평가

상기 실시예 1에서 제조한 피오멜라닌 나노입자 (PMNP)의 물리화학적 특성을 파악하기 위해, 입자 크기 및 제타전위를 평가하였다.

구체적으로, 수용액 상의 PMNP의 크기를 동적 광산란법 (ELS8000 instrument, Photal, Osaka, Japan)을 이용하여 측정하였다. 그 결과 도 2와 같이, 본 발명의 PMNP의 직경은 68.2 내지 195.9 nm에 분포하는 것을 확인하였다. 또한, 수용액 상에서의 PMNP의 제타전위는 레이저 도플러 전기영동법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 도 3에 나타냈다.

실시예 3. 피오멜라닌 나노입자의 세포독성 유무 평가

이어서, 본 발명의 피오멜라닌 나노입자가 세포에 대해 독성이 있는지 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 PMNP를 다양한 농도로 대식세포 (RAW 264.7 cell line)로 처리한 후, 24 시간 후에 배지의 10% 농도로 MTT (3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-aldrich) 시약을 첨가하고, 2시간 더 세포를 배양하였다. 그 후, 배지 및 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 포르마잔 (formazan)을 용해시키고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, PMNP를 처리군의 세포 생존율은 미처리 대조군과 유의미한 차이가 없는 것으로 나타났으며, 특히 PMNP를 400 μg/mL의 농도로 처리해도 세포독성이 없는 것을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자가 대식세포 등을 포함한 체내 정상 세포에 독성이 없음을 보여준다.

실시예 4. 피오멜라닌 나노입자의 항산화 효과 확인

다음으로, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자가 활성산소를 포집하는 효과가 있는지 확인하였다. 이를 위해, 골수유래대식세포 (Bone-marrow derived macrophage, BMDM) 세포에 PMNP를 다양한 농도로 24시간 동안 처리한 후, 이어서 6시간 동안 1 μg/mL의 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 세포가 활성화되도록 자극하였다. 그 후, 활성화된 세포에 활성산소종의 표지자 역할을 하는 H2DCFDA dye를 10 μg/mL로 30 분간 처리하여 염색하였다. 이어서 H2DCFDA dye의 형광신호는 유세포분석 및 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 피오멜라닌 나노입자를 처리한 세포 그룹은 미처리 대조군에 비해 H2DCFDA 양성 세포의 비율이 현저히 낮았으며, PMNP의 처리 농도에 의존적으로 활성산소종의 수준이 감소하는 것으로 나타났다. 이와 같은 차이는 형광현미경 관찰시 더욱 두드러진 바, 미처리 대조군에서는 H2DCFDA의 형광신호가 뚜렷하게 검출되었으나, PMNP 처리 그룹에서는 형광신호가 감소하였으며, 200 μg/mL 이상의 처리 농도에서는 형광신호가 거의 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 이와 같은 결과는 본 발명의 피오멜라닌 나노입자가 우수한 활성산소종 포집 효과를 가지며, 따라서 항산화 효과를 발휘할 수 있음을 보여준다.

실시예 5. 피오멜라닌 나노입자의 염증성 장질환 효과 확인

상기 실시예를 통해 본 발명의 피오멜라닌 나노입자의 항산화 효과를 확인한 바, 상기 나노입자가 염증성 장질환 치료 효과를 발휘하는지 확인하였다. 이를 위해, Dextran sulfate sodium (DSS)를 지속적으로 공급하여 장 내 급성 염증반응을 유도한 염증성 장질환 (Inflammatory bowel disease, IBD) 마우스 모델을 사용하였다.

구체적으로, DSS (Alfa Aesar)를 3차 증류수에 용해시켜 3.0% (w/v) DSS 수용액을 제조했다. 실험체가 DSS 수용액을 음수로서 경구로 지속적으로 섭취할 수 있도록 사육 케이지를 준비하였으며, DSS가 수용액을 총 6일간 공급했다. 염증성 장질환이 유도된 마우스에 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자가 다양한 농도로 함유된 음용수를 5일간 지속적으로 공급하였으며, 대조군에는 나노입자가 포함되지 않은 음용수를 공급하였다. 실험이 종료된 후, 각 마우스 개체를 CO₂를 이용해 안락사 시키고, 결장 (colon)을 적출하였다.

DSS는 장 내 상피세포의 손상을 유발하여 섬유화 (fibrosis)를 일으키며, 이로 인해 장의 길이가 수축하게 된다. 따라서, 마우스 모델의 결장 길이를 측정함으로써 항산화 나노입자의 효능을 평가할 수 있다. 피오멜라닌 나노입자가 투여된 마우스들의 결장 길이 (직장에서 맹장까지의 길이)를 측정한 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, DSS 수용액을 섭취한 그룹 중 PMNP를 투여 받지 않은 대조군은 장 내 섬유화에 의해 결장의 길이가 현저히 감소하였으나, PMNP가 투여된 실험군들은 결장 길이가 대조군에 비해 확연히 길었다. 특히, PMNP가 100 μg/mL의 농도로 처리된 그룹의 결장 길이는 질환을 유도하지 않은 건강한 개체의 결장 길이에 상응하는 수준이었다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자가 항염증 효과를 발휘하여 염증성 장질환 증상을 효과적으로 억제 및 개선할 수 있음을 보여준다.

실시예 6. 피오멜라닌 나노입자의 항염증 효과 및 자가면역질환 치료 효과 확인

상기 실시예들을 통해 본 발명의 피오멜라닌 나노입자가 염증성 장질환 치료 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다. 염증성 장질환은 자가면역질환의 대표적인 질환이며, 염증을 주요 증상으로 하는 바, 본 발명의 피오멜라닌 나노입자가 항염 효과 내지 자가면역질환 치료 효과를 갖는지 확인하였다. 이를 위해, PMNP가 투여된 염증성 장질환 동물모델로부터 적출한 결장 조직 내의 다양한 싸이토카인 (cytokines) 및 캐모카인 (chemokines)의 수준을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 1-1의 방법에 따라 준비된 개체를 CO₂로 안락사 시킨 후 결장을 적출하였다. 수집된 결장은 phosphate buffer saline으로 세척한 후, protease inhibitor를 함유한 완충용액 상에서 tissue homogenizer를 가하여 조직을 균질화하였다. 조직 균질액을 10,000 g 에서 20분간 원심분리 한 후, 상층액만을 분리 하여 각종 염증성 싸이토카인 및 케모카인을 효소면역측정법 (Enzyme-linked immunospecific assay; ELISA)을 통해 확인하였다. 실험은 해당 제품 (R&D systems)의 protocol을 따라서 진행하였다.

결과는 도 9 내지 도 12에 나타냈다. 염증성 장질환이 유도된 마우스 중, 본 발명의 피오멜라닌 나노입자를 투여 받은 개체는 대조군에 비해 결장 조직에서 대표적인 염증성 싸이토카인들인 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6의 수준이 현저하게 감소한 바, PMNP의 우수한 항염 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 면역세포의 조직 내 침윤을 유발하는 케모카인인 MCP-1의 수준 역시, 대조군 (PMPN를 투여 받지 않은 염증성 장질환 모델)에 비해 PMNP가 투여된 개체에서 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 항산화 나노입자가 우수한 항염 효과 및 면역세포 침윤 억제 효과를 가진다는 것을 보여준다. 즉, 본 발명에 따른 피오멜라닌 나노입자는 과잉의 면역반응을 억제함으로써 다양한 자가면역질환을 개선 내지 치료할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 생물학적 방법이나 미생물을 이용한 공정에 의존하지 않고, 균일한 품질의 피오멜라닌 나노입자를 효율적으로 합성할 수 있는 화학 공정을 개발하였다. 또한, 상기 공정을 통해 제조된 피오멜라닌 나노입자는 면역세포에 대해 세포독성을 일으키지 않으면서 우수한 항산화 효과를 발휘할 수 있으며, 대표적인 자가면역질환인 염증성 장질환에 대해 치료효과가 있음이 확인되었다. 특히, 본 발명의 피오멜라닌 나노입자는 다양한 염증성 사이토카인 및 면역세포 침윤 유도 케모카인의 수준을 효과적으로 억제할 수 있는 바, 면역 과활성화로 인한 다양한 염증성 질환 및 자가면역질환의 치료제로 유용히 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (19)

1. 하기 단계를 포함하는, 피오멜라닌 나노입자 (pyomelanin nanoparticles)의 제조방법:
   (S1) 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 염기성 용액에 용해시킨 후 교반하는 단계; 및
   (S2) 산성 용액을 첨가한 후 교반하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one은 0.1 내지 10 mg/mL의 농도로 용해되는 것인, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (S2) 단계에서 산성 용액이 첨가된 후 전체 용액의 농도는 5 내지 10N인 것을 특징으로 하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 단계 (S1)에서 상기 2,3-dihydro-5-hydroxybenzofuran-2-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 산화 반응을 일으키는 것인, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 피오멜라닌 나노입자는 상기 단계 (S2)에서 자가중합되어 침전되는 것을 특징으로 하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 제조방법은 상기 단계 (S2)에서 수득한 피오멜라닌 나노입자를 이의 pH가 중성이 되도록 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 제조방법은 중금속 촉매를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 제조방법은 원-팟 (one-pot) 공정인 것을 특징으로 하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 피오멜라닌 나노입자는 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는, 피오멜라닌 나노입자의 제조방법:
   [화학식 1]
   
   [화학식 2]
   
   [화학식 3]
   
   [화학식 4]
   
   
10. 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 피오멜라닌 나노입자는 직경이 30 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 피오멜라닌 나노입자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것인, 약학적 조성물:
    (a) 장 수축을 억제함;
    (b) 면역세포 조직 침윤을 억제함;
    (c) 장 내 염증성 싸이토카인 또는 케모카인의 수준 또는 활성을 억제함; 및
    (c) 장 내 활성산소종을 포촉함.
    
13. 제10항에 있어서,
    상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병, 및 베체트장염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물.
    
14. 제10항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 장 내 염증을 억제하기 위한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
15. 제10항에 있어서,
    상기 피오멜라닌 나노입자는 제1항의 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
16. 제10항에 있어서,
    상기 피오멜라닌 나노입자는 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    
    [화학식 2]
    
    [화학식 3]
    
    [화학식 4]
    
    
17. 제10항의 약학적 조성물을 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 키트.
    
18. 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
19. 피오멜라닌 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.