KR20220060546A - 건강한 장 오가노이드를 수득하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 증식 및 이로부터 장 오가노이드의 형성에 적합한 생체기능성 3차원 하이드로겔에 관한 것으로서, 이는 마트리겔과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용을 피하고 임상 적용에 적합하며 상업적으로 실현가능한 방식으로 생성된 장 오가노이드를 제공한다. 본 발명은 또한 적합한 배양 배지와 조합된 상기 하이드로겔을 포함하는 부품 키트, 및 상기 부품 키트를 이용하여 갓 단리되거나 동결된 장 세포로부터 오가노이드를 제조하고 세포를 증식시키는 방법에 관한 것이다.

Description

건강한 장 오가노이드를 수득하기 위한 방법
본 발명은 재생 의학 및 정밀 의학 분야, 및 특히 환자 유래의 건강한 장 오가노이드(PDO)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
염증성 장 질환(IBD)에 의해 영향을 받는 사람들의 수가 전 세계적으로 계속 증가하고 있다. 점막 치유 및 장 장벽 기능의 재확립은 수술 및 결장직장암의 위험 감소뿐만 아니라 실질적으로 더 유리한 예후, 더 낮은 재발 및 입원율과 관련된 핵심적인 치료 목표이다. 그러나, 현재의 의학적 치료는 모든 IBD 환자에게 효율적인 것은 아니며, 약 16-47%의 환자들은 진단 10년 후에 수술을 필요로 한다(Frolkis et al., Risk of surgery for inflammatory bowel diseases has decreased over time: a systematic review and meta-analysis of population-based studies; Gastroenterology 2013; 145:996-1006). 이것은 줄기 세포가 풍부한 장 오가노이드(intestinal organoids)가 이식 및 장 장벽 기능의 재확립을 위한 재생 물질의 공급원으로서 대단한 장래성을 갖는 새로운 치료법에 대한 충족되지 않은 요구를 분명히 강조한다.
세포 스페로이드 또는 클러스터를 포함하는 오가노이드는 줄기 세포에서 발달하여 생체내 상황과 유사한 방식의 세포 분류 및 공간적으로 제한된 계통 보존(lineage commitment)을 통해 자가 조직화(또는 자가 패턴화)하는 줄기 세포 또는 장기 특이적 세포 유형의 3차원 구조이다. 따라서, 오가노이드는 세포의 고유한 생리학을 나타내며 고유한 상황을 모방하는 세포 조성(상이한 분화 단계에 있는 남아있는 줄기 세포 및/또는 전문화된 세포 유형 포함) 및 해부학적 구조를 갖는다. 줄기 세포는 조직 또는 오가노이드 단편으로부터 단리될 수 있다. 오가노이드가 생성되는 세포는 생체내 장기와 매우 유사한 구조를 형성하기 위해 자가 조직화되는 여러 세포 유형을 나타내는 장기 유사 조직을 형성하도록 분화될 수 있다(즉, 세포 분화). 따라서, 오가노이드는 생체내 발달과 매우 유사한 시스템에서 인간 장기 및 인간 장기 발달을 연구하기 위한 우수한 모델이다. 오가노이드는 또한 임상 적용을 위해 세포를 성장시키고 증식하는 데 사용된다. 단리된 장 선와(crypt) 또는 줄기 세포로부터 성장한 오가노이드는 해당 분야에서 "엔테로이드(enteroid)" 또는 "콜로노이드(colonoid)"로 지칭될 수 있다.
장 오가노이드는 실험적 대장염이 있는 마우스에게 성공적으로 전달되었고, 이는 세포가 상피에 부착되어 상피의 통합된 부분이 된다는 것을 입증하였다(Yui et al., Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5+ stem cell, Nature medicine Vol. 18, no. 4 2012, 618-624; Fordham et al., Transplantation of Expanded Fetal Intestinal Progenitors Contributes to Colon Regeneration after Injury, Cell Stem Cell 13, 734-744, December 5, 2013; 및 Sugimoto et al., Reconstruction of the Human Colon Epithelium In Vivo, Cell Stem Cell 22, 1-6, February 1, 2018 (https://doi.org/ 10.1016/j.stem.2017.11.012)). 이러한 연구에서, 성공적인 장 오가노이드 성장 및 이식은 PDO 확립 및 증식을 위한 동물 유래의 매트릭스(예컨대, 마트리겔(Matrigel))의 사용에 의존하였다.
마트리겔에서 장 오가노이드를 성장시키기 위한 3D 배양 시스템은 줄기 세포 턴오버(turnover)를 갖는 기본적인 선와-융모 생리학을 유지하는 것으로 기술되었다(Sato et al., Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche, Nature, Vol 459, 14 May 2009, 262-266; Sato et al., Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts, Nature, Vol 469, 20 January 2011, 415-419; Sato et al., Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium, GASTROENTEROLOGY 2011;141:1762-1772; WO 2009/022907 A2; WO 2010/090513 A2; WO 2012/168930 A2; WO 2013/093812 A2). 이들 연구에서, 마트리겔에서 성장한 세포에게 공급하는 데 사용되는 세포 배양 배지에 적합한 구성요소를 확인하는 것이 주요 이슈였다.
그러나, 마트리겔과 같은 동물 유래의 매트릭스의 배치간(batch-to-batch) 차이 및 정의되지 않은 조성은 이들을 인간에서 사용하기 위한 규제 승인을 금지한다. 이와 같이, 장 오가노이드 이식 요법을 인간 환자에게 옮기기 위해서는, 장 오가노이드 배양의 여러 측면이 임상 사용을 위해 변형될 필요가 있다. 이것은 인간 사용을 위해 정의 및 승인되고, 증식가능하며, 바람직하게는 제노-프리(xeno-free)(즉, 동물 기원 성분이 없음)인 지지 매트릭스 및 배양 배지의 개발을 포함한다.
문헌[Broguiere et al., Growth of Epithelial Organoids in a Defined Hydrogel, Adv. Mater. 2018, 1801621]에서, 라미닌-111이 보충된, 정의되었지만 합성되지 않은(즉, 알로-프리(allo-free) 또는 제노-프리가 아닌) 피브린 하이드로겔이 장 오가노이드의 성장을 지지하는 것으로 나타났다. 피브린에서 RGD 도메인의 자연적 존재는 오가노이드 성장에 필수적인 것으로 나타났다.
Gjorevski(Gjorevski et al., Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture, Nature, Vol 539, 24 November 2016, 560-56; Gjorevski et al., Synthesis and characterization of well-defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture, Nature protocols, Vol. 12, no.11, 2017, 2263-2274; WO 2017/036533 A1 및 WO 2017/037295 Al)는 일차 마우스 및 인간 소장 오가노이드 및 인간 결장직장암 오가노이드의 성장을 위해 기능화된 RGD 펩타이드 및 특이적 효소 분해를 포함하는 상이한 분해 동역학뿐만 아니라 제어된 자가 분해 동역학(PEG-아크릴레이트의 가수분해)을 갖는 효소적으로(인자 XIII) 가교된 8-암(arm) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 하이드로겔을 개발하였다. 오가노이드 분화를 지지하기 위해 마우스 조직으로부터 정제된 라미닌-111(전체 단백질)의 첨가가 필요하였다.
이 접근법의 일부 성공이 마우스 세포로부터의 증식 및 오가노이드 형성에 대해 나타났지만, 상기 시스템은 인간의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포로부터의 증식 및 오가노이드 형성에 적합하지 않은 것으로 나타났다(오히려 Gjorevski 2017, p. 2265에서 의문시됨). 또한, 인자 XIII와의 효소적 가교 반응을 기반으로 하는 유일하게 시험된 시스템은 비용이 많이 들고, 상업적 목적으로 규모 증식 및/또는 자동화하기 어려우며, 또한 재현하기 어려운 것으로 입증되었다.
Cruz-Acuna(Cruz-Acuna et al., Synthetic hydrogels for human intestinal organoid generation and colonic wound repair, Nature cell biology, advanced online publication published online 23 October 2017; DOI: 10.1038/ncb3632, 1-23; Cruz-Acuna et al., PEG-4MAL hydrogels for human organoid generation, culture, and in vivo delivery, Nature protocols, Vol. 13, september 2018, 2102 - 2119; 및 WO 2018/165565 A1)에 의해 기술된 작업은 인간 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 장 오가노이드를 성장시키기 위해 RGD로 기능화되고 프로테아제 분해가능한 펩타이드 GPQ-W로 가교된 완전 합성 4-암 PEG-말레이미드 하이드로겔을 기반으로 한다. 이후, 이러한 합성 겔에서 증식된 오가노이드는 개념 증명 연구로서 마우스 결장 손상 모델에 주입되어 장 오가노이드 이식의 치료 잠재성을 입증하였다.
이 시스템을 이용하여, 환자의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포는 증식되어 오가노이드를 형성할 수 없는 것으로 나타났다. 이 시스템의 경우, 가교제 성분이 효소적으로 분해될 필요가 있다.
현재, 생체외 오가노이드 배양의 확립을 위한 표준은 먼저 "최적 표준(gold standard" 마트리겔(마트리겔®은 기저막 추출물(BME)의 상업적으로 이용가능한 제품 중 하나임)에서 갓 단리된 세포(조직으로부터)를 캡슐화하고 여러 계대 동안 세포를 성장시켜 이를 증식시키는 것(즉, 세포 수를 증가시키는 것)을 포함한다. BME(예컨대, 마트리겔)는 마우스 육종 추출물로부터 유래된 겔로서, 이미 언급한 바와 같이 배치간 일관성이 불량하고, 정의되지 않은 조성을 가지므로 임상 중개 적용(clinical translational application)에 사용될 수 없어서, 규제 승인을 얻는 것은 까다롭거나 불가능할 수 있다(Madl et al., Nature 557(2018), 335-342).
오가노이드의 확립을 위해 정의되지 않은 제노 구성요소 또는 인간 구성요소를 갖는 겔의 사용을 제거하는 것은 재생 의학, 정밀 의학, 약물 시험, 또는 환자 계층화와 같은 임상 적용에서 오가노이드를 사용하는 주요 장애 중 하나를 극복할 것이다.
완전 규정된(완전 합성은 아님) 매트릭스에서 배양된 생검으로부터 갓 단리된 세포의 개념 증명이 문헌[Mazzocchi et al., In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening, Scientific reports (2018) 8:2886; Votanopoulos et al., Appendiceal Cancer Patient-Specic Tumor Organoid Model for Predicting Chemotherapy Efcacy Prior to Initiation of Treatment: A Feasibility Study, Ann Surg Oncol (2019) 26:139-147; 및 WO 2018/027023 A1]에 의해 제공되었다. 간략히, 약물 반응 예측을 위한 플랫폼을 개발하기 위해 중피종 및 충수암 환자로부터 유래된 세포가 히알루론산/콜라겐 기반의 하이드로겔에서 배양되었다. 그러나, 마트리겔과 마찬가지로 콜라겐도 천연 유래 매트릭스이며 유사한 문제를 겪고 있다.
지금까지, 생검 또는 조직 절제로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포(즉, 인간으로부터 직접 수득되었고 다른 시스템에서 사전 배양되거나 사전 확립되지 않은 세포)의 성공적인 증식 및 이로부터 마트리겔 또는 콜라겐과 같은 천연 유래 매트릭스가 아닌 완전 규정된 및/또는 완전 합성 하이드로겔 매트릭스에서 후속적인 오가노이드의 형성에 대한 보고는 없었다. 상기 논의된 선행 기술에서 언급된 바와 같이, 이러한 접근법이 분명히 필요함에도 불구하고, 지금까지 최적 표준은 여전히 마트리겔을 세포 증식의 적어도 첫 번째 단계에 사용하는 것이다. 이것은 반합성 또는 완전 합성 3차원 하이드로겔 시스템이 작동하게 만드는 것과 관련된 어려움에 대한 증거이다.
본 발명의 근본적인 문제는 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포의 증식 및 이로부터 후속적인 장 오가노이드의 형성을 위한 방법을 제공하는 것이었으며, 상기 방법은 마트리겔과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용을 완전히 피하고 임상 적용에 적합하고 상업적으로 실현가능한 방식으로, 즉, 비용 효과적이고, 신뢰할 수 있으며, 재현가능하고, 자동화가능하고 증식가능한 방식으로 생성된 장 오가노이드를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 문제는 독립항에 정의된 바와 같은 하이드로겔, 부품 키트 및 방법에 의해 해결된다.
특히, 본 발명은 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식과 이로부터의 장 오가노이드의 형성에 적합한 생체기능성 3차원 하이드로겔에 관한 것으로서, 상기 하이드로겔은
- 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암(arm) PEG인 적어도 하나의 전구체 분자,
- 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자, 및
- 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드
의 반응 생성물이며,
가교제 분자는 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하고, 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 것으로 알려져 있지 않는 것을 특징으로 한다.
문헌[Gjorevski 2016 & 2017, WO 2017/036533 A1 및 WO 2017/037295 Al]의 선행 기술 하이드로겔과 비교하여, 본 발명의 하이드로겔은 더 저렴하다. 본 발명의 하이드로겔은 가교를 위한 효소 및 활성화 인자의 존재를 필요로 하지 않기 때문에, 상업적 목적을 위해 쉽게 규모 증식될 수 있다. 그리고, 이것은 또한 본 발명의 상기 기재된 겔 전구체(즉, 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG, 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자, 및 적어도 하나의 생체기능성 리간드)가 문헌[Gjorevski 2016 & 2017, WO 2017/036533 A1 및 WO 2017/037295 Al]의 선행 기술 겔에서 요구되는 겔 전구체의 제조를 위한 추가 단계를 필요로 하지 않기 때문이다.
특히, 그것은 제조 규모 증식 및 이들의 사용의 자동화에, 즉 피펫팅 로봇 등을 사용한 방법의 적용에 매우 적합하다. 본 발명의 하이드로겔은 매우 신뢰성 있게 재현가능하다. 더욱이, 문헌[Gjorevski et al]의 효소적으로 가교된 겔과 대조적으로, 본 발명의 하이드로겔은 상업적으로 이용가능한 배양 배지, 예컨대, STEMCELL Technologies로부터의 IntestiCultTM 오가노이드 성장 배지와 양립가능하며, 즉 조기에 분해되지 않는다.
문헌[Cruz-Acuna 2017 & 2018 및 WO 2018/165565 A1]의 선행 기술 하이드로겔과 비교하여, 본 발명의 하이드로겔은 자동화에, 즉, 피펫팅 로봇 등을 사용한 방법의 적용에 더 적합한 상이한 화학을 기반으로 하며, 더 쉽게 규모 증식될 수 있다. 이는 제조 공정 동안 본 발명의 모든 겔 전구체 물질(즉, 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG, 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자, 및 적어도 하나의 생체기능성 리간드)이 조기에 반응하지 않으면서 사전 혼합 및 동결건조될 수 있기 때문이며, 이는 문헌[Cruz-Acuna et al]에 의해 기술된 시스템으로 불가능한데, 이들의 전구체는 이러한 조건에서 반응할 것이기 때문이다.
본 발명의 하이드로겔의 중요한 측면은 가교된 하이드로겔에 부착된("매달린(dangling)" 방식으로) 리간드에 RGD 모티프가 제공되는 선행 기술 하이드로겔과 비교하여 적어도 하나의 RGD 모티프가 가교제 분자 내에 제공된다는 사실이다. 본 발명의 접근법은 하이드로겔에서 RGD 모티프의 양을 상당한 정도로 증가시킨다. 놀랍게도 이것은 본 발명의 목적을 위한 하이드로겔 특징을 상당히 개선하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 놀랍게도 본원에서 논의된 하이드로겔은 인간 생검 또는 조직 절제로부터 갓 단리되거나 동결된 장 세포(단일 세포 및/또는 클러스터)로부터 오가노이드의 드 노보 형성, 이들 세포의 성장, 계대 및 증식 및 선택적으로 적합한 배양 배지와 조합되는 경우 이로부터 후속적인 오가노이드의 분화에 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따르면, 마트리겔과 같은 천연 유래 매트릭스를 사용해야 하는 필요성을 완전히 피한다.
본 발명에 따르면, 용어 "생검 또는 조직 절제로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포"는 언급된 절차 중 어느 하나에 의해 인간으로부터 직접 수득되고 오가노이드를 형성하는 방법에 사용되기 전에 다른 시스템에서 사전 배양되거나 사전 확립되지 않은 세포를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 신선한 세포는 즉시 또는 최대 3 내지 4일의 기간 내에 수집되어 본 발명의 방법에 사용된다. 세포가 수집 후에 즉시 사용되지 않은 경우, 이들은 통상적으로 사용되는 조건 하에 보관 목적으로 동결될 수 있다. 수집된 세포는 분리된 세포, 선와 및 조직 조각을 포함하는 단일 세포 및/또는 세포의 "클러스터"일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상피 세포가 사용된다.
본 발명에 따르면, 용어 "오가노이드의 드 노보 형성"은 생체외에서(즉, 원래의 유기체 외부에서) 처음으로 성장한 갓 단리되거나 동결된 인간 세포(예컨대, 인간 생검 또는 조직 절제)를 지칭한다. 용어 "첫 번째 생체외 세포 성장" 또는 "계대 제로(P0)"는 동의어로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "사전 확립된 오가노이드"는 본 발명의 하이드로겔에 적용되기 전에 다른 시스템(예컨대, 마트리겔, 2D 또는 3D 시스템, 생체내에서 환자 유래 이종이식편(PDX)으로서)에서 성장한 세포, 단일 세포 및/또는 세포 클러스터(예컨대, 세포 응집체, 오가노이드 등)를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 성장"은 사전 확립된 오가노이드 또는 드 노보 형성된 오가노이드로부터 세포의 성공적인 성장을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 계대" 또는 "계대" 또는 "세포 분할"은 하나의 겔로부터 세포를 추출하고 이러한 세포를 이전 겔과 동일하거나 상이한 특징을 갖는 다른 겔에 시딩(seeding) 및 성장시키는 단계를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 증식"은 세포 성장 및 세포 수 증가(예컨대, 동일한 계대 내에서 또는 하나의 계대로부터 다음 계대까지)의 단계를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "오가노이드 분화"는 오가노이드에서의 세포 분화의 성공적인 유도를 지칭한다.
본 발명은 또한
- 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG인 적어도 하나의 전구체 분자,
- 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자로서, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 것인 가교제 분자 및
- 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드,
및 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 R-스폰딘 1, 바람직하게는 R-스폰딘 1 조절 배지, 및 Wnt3a, 바람직하게는 Wnt3a 조절 배지를 포함하는 것인 배양 배지
를 포함하는, 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식과 이로부터의 장 오가노이드의 형성을 위한 부품 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한
a) 상기 키트의 하이드로겔을 상기 키트의 배양 배지의 존재 하에 상기 갓 단리되거나 동결된 장 세포와 함께 인큐베이션함으로써, 본원에 기재된 바와 같은 부품 키트를 사용하여, 갓 단리되거나 동결된 인간 장 세포로부터 오가노이드를 드 노보 형성하는 단계,
b) 본원에 기재된 바와 같은 상기 부품 키트를 사용하여 단계 a)의 장 오가노이드로부터 세포를 성장, 선택적으로 계대, 및 증식시키는 단계,
c) 선택적으로, 세포 분화를 유도하는 변형된 배양 배지의 존재 하에, 단계 a)의 오가노이드를 분화시키는 단계
를 포함하는, 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식 방법으로서,
상기 방법에서 완전 합성의, 또는 완전 규정된 반합성의 하이드로겔만이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "완전 합성 하이드로겔"은 합성 전구체로부터 독점적으로, 즉, 천연 라미닌-111과 같은 천연 유래 전구체의 부재 하에, 형성된 하이드로겔을 지칭한다 .
본 발명에 따르면, 용어 "완전 규정된 반합성 하이드로겔"은 천연 라미닌-111과 같은 적어도 하나의 천연 유래 전구체를 포함하지만, 그의 합성에 사용된 전구체 분자의 공지된 성질로 인해 완전 규정된 구조 및/또는 조성을 갖는 하이드로겔을 지칭한다. 따라서, 완전 규정된 반합성 하이드로겔은 알려지지 않은 구조 및/또는 조성을 갖는 마트리겔과 같은 천연 유래 하이드로겔과 상이하다.
본 발명의 하이드로겔은 전구체 분자로서 비닐설폰 또는 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG(폴리(에틸렌 글리콜))를 기반으로 한다.
하이드로겔(겔)은 친수성 중합체 사슬의 네트워크를 포함하는 매트릭스이다. 생체기능성 하이드로겔은 생체접착성(또는 생물활성) 분자, 및/또는 살아있는 세포와 상호작용하여 세포 생존력 및 원하는 세포 표현형을 촉진하는 세포 신호전달 분자를 함유하는 하이드로겔이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다중 암 PEG는 2 내지 12개의 팔, 바람직하게는 4-암 또는 8-암을 갖는 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되며, 즉, 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG이다. PEG는 1,000-1,000,000, 1,000-500,000, 1,000-250,000, 1,000-150,000, 1,000-100,000, 1,000-50,000, 5,000-100,000, 5,000-50,000, 10,000-100,000, 10,000-50,000, 20,000-100,000, 20,000-80,000, 20,000-60,000, 20,000-40,000, 또는 40,000-60,000의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량은 예컨대, GPC 또는 MALDI와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, Da의 평균 분자량이다.
이러한 PEG는 당업계에 알려져 있으며 상업적으로 이용가능하다. 이들은 4-암 PEG의 경우 펜타에리트리톨일 수 있고 8-암 PEG의 경우 트리펜타에리트리톨 또는 헥사글리세롤일 수 있는 코어로 구성된다:
Figure pct00001
4-암 PEG-VS 또는 8-암 PEG-VS에서, 상기 4-암 PEG 또는 8-암 PEG의 말단의 유리 OH 기는 당업계에 공지된 조건 하에서 비닐설폰 기로 전환되어, 상기 식에서 R은 예를 들어 하기가 된다.
Figure pct00002
4-암 PEG-Acr 또는 8-암 PEG-Acr에서, 상기 4-암 PEG 또는 8-암 PEG의 말단의 유리 OH 기는 당업계에 공지된 조건 하에서 아크릴레이트 기로 전환되어 상기 식에서 R은 예를 들어 하기가 된다.
Figure pct00003
바람직하게는, 상기 4-암 PEG 또는 8-암 PEG의 모든 말단의 유리 OH 기는 비닐설폰 또는 아크릴레이트 모이어티로 전환된다.
비닐설폰 또는 아크릴레이트 모이어티는 마이클 첨가 반응을 통해 PEG 전구체 분자를 가교하는 데 적합한 에틸렌계 불포화 기이다. 마이클 첨가 반응은 적합한 친핵성 모이어티와 적합한 친전자성 모이어티와의 반응을 포함하는 잘 알려진 화학 반응이다. 예를 들어, 아크릴레이트 또는 비닐설폰 모이어티는 적합한 마이클 공여체(즉, 친핵체)로서 예컨대, 티올 모이어티와 반응하는 적합한 마이클 수용체(즉, 친전자체)이다.
따라서, 본 발명에 따른 하이드로겔을 수득하기 위해, 상기 PEG 전구체 분자는 마이클 첨가 반응에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자와 반응한다.
가교제 분자는 상기 PEG 전구체 분자 중 적어도 2개를 서로 연결하는 분자이다. 상기 목적을 위해, 가교제 분자는 하나의 친핵성 기가 제1 PEG 전구체 분자와 반응하고 다른 친핵성 기가 제2 PEG 전구체 분자와 반응하도록 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 상기 친핵성 기를 보유해야 한다.
대체로 본 발명에서 사용되는 가교제 분자는 2개 초과의 상기 친핵성 기를 포함할 수 있지만, 이것은 3차원 네트워크의 형성에 필요하지 않은데, PEG 전구체 분자 각각이 1개를 초과하는 상기 가교제 분자와 반응할 수 있기 때문이다.
본 발명의 하이드로겔의 중요한 측면은 가교된 하이드로겔에 부착된("매달린" 방식으로) 리간드에 RGD 모티프가 제공되는 선행 기술 하이드로겔과 비교하여 적어도 하나의 RGD 모티프가 가교제 분자 내에 제공된다는 사실이다. 본 발명의 접근법은 하이드로겔에서 RGD 모티프의 양을 상당한 정도로 증가시킨다. 놀랍게도 이것은 본 발명의 목적을 위한 하이드로겔 특징을 상당히 개선하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 하이드로겔의 경우, 하이드로겔에 상당한 양의 RGD 모티프의 존재가 필요하다. 라미닌-111 리간드가 하이드로겔에 제공되는 경우 RGD 모티프가 불필요할 것이라는 WO 제2017/037295호 A1에 기재된 결과는 본 발명의 하이드로겔에 대해서는 확인될 수 없었다.
따라서, 본 발명에 사용되는 가교제 분자는 적어도 하나의 RGD 모티프, 바람직하게는 적어도 2개의 RGD 모티프, 보다 바람직하게는 2 내지 8개의 RGD 모티프, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5개의 RGD 모티프, 및 특히 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드이다.
용어 RGD 또는 RGD 서열은 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 서열인 최소 생물활성 RGD 서열을 지칭하며, 이는 피브로넥틴에 대한 세포 결합을 모방하고/하거나 고정 의존성(anchorage-dependent) 세포의 접착을 촉진하는 데 충분한 가장 작은(최소) 피브로넥틴 유래 아미노산 서열이다. 더욱이, RGD와 같은 리신 또는 아르기닌 함유 아미노산 서열은 예컨대, 겔 해리에 사용되는 트립신 유사 효소와 같은 프로테아제에 적합한 기질이다.
적합한 RGD 모티프의 예는 RGD, RGDS, RGDSP, RGDSPG, RGDSPK, RGDTP 또는 RGDSPASSKP이지만, 하이드로겔 및 세포 배양 분야에서 주로 임의의 공지되고 성공적으로 사용된 RGD 서열이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가교제 분자는 적어도 2개의 RGD 모티프 및 적어도 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩타이드이다. 시스테인은 티올 기, 즉, 마이클 공여체 모이어티를 포함하는 아미노산이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가교제 분자는 Ac-GCREGRGDSPGGRGDSPGERCG-NH2이다.
본 발명에 따르면, 하이드로겔 내의 RGD 모티프의 양은 상기 논의된 선행 기술 하이드로겔에서보다 더 많다(WO 제2017/037295호 A1, p. 31, 실시예 5에서, 하이드로겔 내의 RGD의 양을 0,5 mM 넘게 높이는 것은 어떠한 개선으로도 이어지지 않을 것임이 논의되었고; Cruz-Acuna 겔(Cruz-Acuna 2017)에서, 2 mM RGD의 양이 일관되게 사용되었음). 본 발명에 따르면, 하이드로겔 내의 RGD 모티프의 양은 1 내지 15 mM, 바람직하게는 2.5 내지 5.5 mM 및 특히 바람직하게는 2.5 내지 5 mM의 범위이다.
하이드로겔 전구체 분자의 가교는 일반적으로 분리된 세포, 선와 및 조직 조각을 포함하는 단일 세포 및/또는 세포의 "클러스터"가 하이드로겔 매트릭스를 형성함으로써 캡슐화되는 방식으로, 즉 별개의 세포 배양 미세환경에서 상주하는 방식으로, 하이드로겔 내에서 배양될 세포 유형의 존재 하에 수행된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔은
- 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 티올 기 및 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드로 가교된 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰의 반응 생성물이거나, 또는
- 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 티올 기 및 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드로 가교된 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰의 반응 생성물, 및/또는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 티올 기 및 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드로 가교된 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트의 반응 생성물을 포함한다.
각각의 구현예에서, 추가로 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체기능성 리간드가 하이드로겔에 존재한다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511, 또는 라미닌-521이며, 라미닌-511이 바람직하다.
따라서, 이들 구현예 중 첫 번째는 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰만을 전구체 분자로서 사용한다. 상기 구현예에 따른 하이드로겔은 기계적으로 안정하며, 즉, 그것은 그의 전단 계수(shear modulus)의 어떠한 감소도 겪지 않으므로 시간이 지남에 따라 연화되지 않는다.
따라서, 이들 구현예 중 두 번째는 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰 및 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트 모두, 또는 대안적으로 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트 단독을 전구체 분자로서 사용한다. 하기에 논의되는 바와 같이, 하이드로겔에서 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트의 존재는 하이드로겔을 기계적으로 동적이도록 만들며, 즉, 그것은 그의 전단 계수의 감소를 겪으므로 시간이 지남에 따라 연화된다. 하이드로겔의 연화 정도는 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰 및 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트가 하이드로겔에 존재하는 비율에 의해 조절될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰 및 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트가 하이드로겔에 존재하는 비율은 5:1 내지 1:5, 바람직하게는 3:1 내지 1:3, 특히 바람직하게는 1:1이다.
바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG 비닐설폰 및 4-암 또는 8-암 PEG 아크릴레이트가 하이드로겔에 존재하는 비율 1:1을 갖는 기계적으로 동적인 하이드로겔의 구현예가 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 증식 및 계대(다른 유사한 구조를 갖는 비분해가능한 겔과 비교하여 더 효율적인 겔 해리 및 감소된 세포 손실)에 대한 그의 적합성에 대해 바람직한 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 놀랍게도 본 발명의 하이드로겔은 매우 유리한 동적 분해 거동을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 적합한 배양 조건 하에(즉, 본 발명의 가장 바람직한 배양 배지의 존재 하에) 조기에 분해되므로 세포 계대 및 증식에 적합하지 않은 선행 기술로부터의 하이드로겔(Gjorevski 2016 & 2017, WO 2017/036533 A1 및 WO 2017/037295 Al)과 대조적으로, 본 발명의 하이드로겔은 일반적으로 요구되는 8-11일의 기간 후에도 여전히 존재하고(즉, 분해되지 않고) 특히 이후에 세포 계대 및 추가적인 세포 증식에 최적인 상태인 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 따른 하이드로겔은 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드를 필수 성분으로 포함한다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511, 또는 라미닌-521이다.
바람직하게는, 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드는 0.01 g/l-3 g/l, 보다 바람직하게는 0.05 g/l-0.5 g/l의 농도로 하이드로겔에 존재한다.
라미닌은 α, β 및 γ 사슬로 구성된 이종삼량체 구조를 갖는 세포외 매트릭스 당단백질의 계열이다. 예를 들어, "111"은 α1β1γ1의 이소형의 사슬 조성을 식별한다. 라미닌-111은 라미닌-1과 동의어이다. 세포 접착에서, 라미닌-111 및 다른 이소형은 세포를 세포외 매트릭스(ECM)에 고정시키는 중요한 단백질이다. 세포 및 ECM 사이의 연결은 세포 표면 수용체를 라미닌 α 사슬의 한 쪽 끝에 결합시키고 ECM 성분을 라미닌의 또 다른 영역에 결합시킴으로써 형성된다. α 사슬의 구형 도메인(G-도메인)은 인테그린, 당단백질, 황산화 당지질 및 디스트로글리칸의 결합을 허용하는 라미닌-111 상의 영역이다. 세포를 ECM에 고정시키는 것 외에도, 라미닌은 또한 세포 및 ECM의 다른 성분의 신호전달에 관여한다.
일 구현예에 따르면, 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 바람직하게는 마우스 라미닌-111이 사용된다. 상기 경우, 천연 라미닌-111이 생물학적 기원이기 때문에 본 발명의 하이드로겔은 반합성이다. 그러나, 천연 라미닌-111, 바람직하게는 마우스 라미닌-111의 구조는 알려져 있으므로, 본 발명의 하이드로겔은 완전히 정의되고 따라서 신뢰성 있게 재현가능하다.
또 다른 구현예에 따르면, 재조합 라미닌 이소형이 사용된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511, 또는 라미닌-521, 바람직하게는 라미닌-511이다. 상기 경우, 라미닌 이소형이 합성 기원이기 때문에 본 발명의 하이드로겔은 완전 합성이다. 재조합 라미닌 이소형을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 여기서 논의할 필요가 없다.
또 다른 구현예에 따르면, 라미닌-511의 생체기능성 단편이 사용된다. 라미닌-511의 생체기능성 단편은 필요한 생물학적 기능을 제공하는 전체 라미닌-511의 일부를 포함하는 분자이다. 다시 말해서, 상기 단편은 다른 분자 성분(예컨대, 인테그린, 세포 표면 수용체 단백질, ECM의 성분)과 상호작용할 수 있는 전체 라미닌-511의 부분 중 하나를 포함해야 한다.
천연 라미닌-111의 사용을 피하는 구현예가 바람직한데, 이들은 완전 합성 3차원 매트릭스를 제공하고 따라서 임상 적용에서 이들의 사용을 위한 규제 승인과 관련하여 이점을 제공하기 때문이다.
또 다른 구현예에 따르면, 천연 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체기능성 리간드 이외에도, 본 발명의 하이드로겔은 추가로 적어도 하나의 다른 생체기능성 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 리간드는 하이드로겔에 부착될 수 있다.
적어도 하나의 생체기능성 리간드는 본원에 공지된 방법에 의해, 본원에서 바람직하게는 생체기능성 리간드에서 시스테인의 티올 기와 하이드로겔 중합체에서 마이클 수용체 기(비닐설폰 또는 아크릴레이트)와의 반응에 의해 가교된 하이드로겔에 부착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 3차원 하이드로겔을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 이 방법은
a1) 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG인 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자를 기판 상에, 또는 기판, 바람직하게는 다중 웰 플레이트의 개별 부피 내로 분배하고, 상기 하이드로겔 전구체 분자에
- 마이클 첨가 반응에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 하나 이상의 가교제 분자로서, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 것인 가교제 분자, 및
- 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드
를 첨가하는 단계; 또는
a2) 재현탁된 미반응 분말, 바람직하게는 동결건조된 미반응 분말을 기판 상에, 또는 기판, 바람직하게는 다중 웰 플레이트의 개별 부피 내로 분배하는 단계로서, 상기 미반응 분말은
- 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG인 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자
- 마이클 첨가 반응에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 하나 이상의 가교제 분자로서, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 것인 가교제 분자, 및
- 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드
를 포함하는 것인 단계
b) 세포, 바람직하게는 인간의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 장 세포를 기판 상에 또는 기판의 상기 개별 부피 내로 첨가하거나, 또는 기판 상에 또는 기판의 상기 개별 부피 내로 첨가하기 전에 a1) 또는 a2)의 하이드로겔 전구체 제제 내로 첨가하는 단계; 및
c) 상기 하이드로겔 전구체 분자 및 상기 가교제 분자를 가교시켜 하이드로겔을 형성하는 단계
를 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 미반응 분말 형태의 하이드로겔 전구체 제제는 기판 상에, 또는 기판, 바람직하게는 다중 웰 플레이트의 개별 부피 내로 재현탁 및 분배된다. 상기 하이드로겔 전구체 제제는 본 발명에 따른 하이드로겔의 형성에 필요한 모든 구성요소, 즉, 상기 논의된 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자, 하나 이상의 가교제 분자, 및 적어도 하나의 생체기능성 리간드, 및 바람직하게는 또한 세포, 바람직하게는 인간의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 장 세포를 포함한다.
상기 하이드로겔 전구체 제제의 상기 미반응 분말의 제공은 당업계에, 예컨대, WO 제2011/131642호 A1로부터 공지되어 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 또한 이와 같은, 즉 사전 동결건조 및 재현탁 없는, 하이드로겔 전구체 제제는 기판 상에, 또는 기판의 개별 부피 내로 분배될 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 소위 연질 하이드로겔이며, 즉, 본 발명의 3차원 하이드로겔은 전형적으로 50 내지 1000 Pa, 바람직하게는 200 내지 500 Pa의 전단 계수(강성)를 갖는다. 원하는 강성 범위는 그에 따라 하이드로겔 내의 중합체(PEG) 함량 및 가교제 함량의 합을, 바람직하게는 1.0-10% w/v로 고정시킴으로써 달성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 하이드로겔은 자가분해가능하다. 이것은 하이드로겔 전구체 분자에서 아크릴레이트 모이어티의 존재에 의해 달성되는데, 이러한 모이어티는 당업계에 알려진 바와 같이(Gjorevski 2016, p. 563, 도 4a) 가수분해를 겪기 때문이다(즉, 이들의 결합은 물의 존재 하에 파괴됨). 따라서, 상기 구현예에서, 본 발명의 3차원 하이드로겔은 50 내지 1000 Pa, 바람직하게는 200 내지 500 Pa의 초기 전단 계수(강성), 및 0-50 Pa, 바람직하게는 0 Pa의 최종 전단 계수(강성)를 갖는다. 상기 최종 전단 계수(강성)는 전형적으로 하이드로겔의 형성 후 7-18일에 도달된다.
하이드로겔의 전단 계수는 하이드로겔의 강성 계수, G, 탄성 계수 또는 탄성과 동등하다. 전단 계수는 전단 응력 대 전단 변형률의 비율로서 정의된다. 하이드로겔의 전단 계수는 레오미터(rheometer)를 사용하여 측정될 수 있다. 간략하게, 두께가 1-1.4 mm인 미리 형성된 하이드로겔 디스크를 완전한 세포 배양 배지에서 적어도 3시간 동안 팽윤시킨 다음, 레오미터의 평행한 플레이트 사이에 끼운다. 겔의 기계적 반응은 실온에서 일정한 변형률(0.05) 모드에서 주파수 스위프(0.1-10 Hz) 측정을 수행함으로써 기록된다. 전단 계수(G')는 겔 기계적 특성의 척도로서 보고된다.
3D 하이드로겔의 기술적 특성은 하이드로겔에서 친수성 중합체 함량뿐만 아니라 중합체성 하이드로겔 전구체의 분자량 및/또는 기능성(가교에 이용가능한 부위의 수)을 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
완충액에서 평형까지 팽윤된 하이드로겔의 중합체(즉, PEG 분자) 함량 및 가교제 함량의 합은 0.3 내지 10% w/v 범위일 수 있고, 바람직한 범위는 1.1 내지 4.0% w/v 및 1.5 내지 3.5% w/v이다.
문헌[Cruz-Acuna 2017 & 2018 및 WO 제2018/165565호 A1]의 교시와 달리, 본 발명에 따르면, 하이드로겔에 효소적으로 분해가능한 부위를 제공하는 것은 본 발명의 목적을 위한 하이드로겔의 효능과 관련하여 바람직하지 않다. 따라서, 본 발명의 하이드로겔은 바람직하게는 MMP 또는 카텝신 분해와 같은 특정한 효소적으로 절단가능한 펩타이드 서열을 필요로 하는 효소 분해에 둔감하며, 즉, 이들은 세포 분비된 프로테아제에 의한 효소적 절단에 민감한 임의의 모이어티를 함유하지 않는다.
본 발명의 하이드로겔에 의해 제공된 미세환경은 인간의 갓 단리되거나 동결된 세포 또는 조직으로부터 오가노이드 형성에 필요한 생화학적, 생물물리학적 및 생물학적 복잡성을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 하이드로겔은 적절한 배양 배지와 조합하여 사용될 때 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 증식 및 이로부터 장 오가노이드의 형성에 적합한 것으로 밝혀졌다.
갓 단리되거나 동결된 장 세포를 증식하고 이로부터 장 오가노이드를 형성하기 위해, 필수 성분으로서 R-스폰딘1과 같은 Wnt 작용제를 포함하는 배양 배지, 바람직하게는 R-스폰딘1 조절 배지, 및 Wnt3a를 포함하는 배양 배지, 바람직하게는 Wnt3a 조절 배지가 사용되어야 한다.
R-스폰딘1은 조절 배지, 예컨대, R-스폰딘1을 분비하도록 안정적으로 형질감염된 세포의 상층액의 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 R-스폰딘1, 바람직하게는 정제된 재조합 R-스폰딘1이 사용될 수 있다.
Wnt3a는 바람직하게는 조절 배지, 예컨대, Wnt3a를 분비하도록 안정적으로 형질감염된 세포의 상층액의 형태로 사용된다. 그러나, 아파민은 Wnt 단백질을 안정화시키는 것으로 나타났다(Mihara et al. Active and water-soluble form of lipidated Wnt protein is maintained by a serum glycoprotein afamin/a-albumin eLife 2016; 5:e11621). 복합체 아파민/재조합 Wnt3a 또는 Wnt 단백질의 안정화를 허용하는 다른 유사한 복합체가 또한 조절 배지 대신에 사용될 수 있다(Holmberg et al., Culturing human intestinal stem cells for regenerative applications in the treatment of inflammatory bowel disease. EMBO Mol Med 2017 9: 558-57). 또한 문헌[Janda, Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt/β-catenin signaling, Nature 2017 May 11; 545(7653): 234-237; 및 WO 2016/040895 A1]에 기재된 바와 같은 Wnt 대리 단백질이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배양 배지는 FBS(fetal bovine serum)를 추가로 포함한다.
선택적으로, 다음 성분 중 하나 이상이 배양 배지에 존재할 수 있다: 기본 배지 성분, 예컨대 adDMEM/F12, 아미노산, 예컨대 글루타민, 단백질, 예컨대 트랜스페린, 노긴, 예를 들어 재조합 쥣과 노긴, 및 상피 성장 인자(EGF), 예를 들어 재조합 쥣과 EGF, 항생제, 예컨대 페니실린-스트렙토마이신, 항산화제, 예컨대 글루타티온, N-아세틸-l-시스테인(NAC), 카탈라제, 및 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 비타민, 예컨대 바이오틴, L-카르니틴, 비타민 E, 비타민 A, 니코틴아미드, 호르몬, 예컨대 트리아이오도-L-티로닌(Triiodo-L-thyronine, T3), 코르티코스테론, 프로게스테론 및 인슐린, 지방산, 예컨대 리놀레산 또는 리놀렌산, 당, 예컨대 D-갈락토스, 억제제, 예컨대 A83-01(ALK 억제제), SB202190(p38 억제제), 또는 Y-27632(ROCK 억제제), 및 추가 성분, 예컨대 푸트레신(Putrescine), 에탄올아민 HCl, HEPES 또는 나트륨 셀레나이트(Sodium selenite).
하기 표 1에는, 본 발명에 적합한 배양 배지(표준 배양 배지(SCM) 및 분화 배지(DM) 조성)의 바람직한 구현예가 기재되어 있다:
표 1
Figure pct00004
본 발명에 적합한 상업적으로 이용가능한 배양 배지는 IntestiCultTM(STEMCELL Technologies로부터 이용가능함)이다.
본 발명에 따르면, 상기 기재된 상업적으로 이용가능한 배양 배지(IntestiCultTM)는 선행 기술로부터의, 예컨대, 문헌[Gjorevski 2016 & 2017, WO 2017/036533 A1 및 WO 2017/037295 Al]으로부터의 하이드로겔과 함께 사용되지 않을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 선행 기술로부터의 하이드로겔은 전형적으로 하루 이내에, 상기 배양 배지 내에서 조기에 분해된다. 선행 기술의 하이드로겔은 세포 성장 및 증식에 충분한 기간 동안 이러한 배양 배지에서 유지될 수 없다.
본 발명은 또한
a) 상기 키트의 하이드로겔을 상기 키트의 배양 배지의 존재 하에 상기 갓 단리되거나 동결된 장 세포와 함께 인큐베이션함으로써, 본원에 기재된 바와 같은 부품 키트를 사용하여, 갓 단리되거나 동결된 인간 장 세포로부터 오가노이드를 드 노보 형성하는 단계,
b) 본원에 기재된 바와 같은 상기 부품 키트를 사용하여 단계 a)의 장 오가노이드로부터 세포를 성장, 선택적으로 계대, 및 증식시키는 단계,
c) 선택적으로, 세포 분화를 유도하는 변형된 배양 배지의 존재 하에, 단계 a)의 오가노이드를 분화시키는 단계
를 포함하는, 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식 방법으로서,
상기 방법에서 완전 합성의, 또는 완전 규정된 반합성의 하이드로겔만이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 마트리겔과 같은 천연 유래 매트릭스를 사용해야 할 필요성을 완전히 피한다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포는 적합한 방법에 의해, 예컨대, 표준 구불결장내시경검사(sigmoidoscopy)에 의해 수득될 수 있고, 여기서 1 내지 몇 개, 예를 들어 5개의 표준 펀치 생검이 수득된다.
이렇게 수득된 세포는 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예컨대, 킬레이트화에 의해(EDTA와 같은 킬레이트화제를 사용하여) 단리되고 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예컨대, 트립신 유사 효소 노출에 의해, 분리된 세포, 선와 및 조직 조각을 포함하는 단일 세포 또는 세포의 "클러스터"로 제조될 수 있다.
분리된 세포, 선와 및 조직 조각을 포함하는 이렇게 수득된 단일 세포 또는 세포의 "클러스터"는 후속적으로 몇 계대(예컨대, 2 계대) 동안 시험관내에서 증식되어 본 발명의 부품 키트를 사용하여, 즉, 상기 정의된 배양 배지와 조합된 본 발명의 하이드로겔에서, 원하는 임상 적용을 위한 충분한 세포를 얻는다. 세포 증식 동안, 배양 배지는 이에 의해 예를 들어 2 내지 4일마다 정기적으로 교환된다.
이렇게 수득된 오가노이드는 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어 표준 결장경검사 카테터를 사용하여, 환자 내로 이식될 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 a) 본 발명의 3차원 하이드로겔에서 인간 생검으로부터의 갓 단리되거나 동결된 장 세포를 캡슐화하고 증식시키고, 그 안에서 오가노이드를 형성하는 단계, 및 b) 형성된 오가노이드 또는 세포를 환자에게 이식하는 단계를 포함하는, 장 조직 재생 방법을 제공한다.
본 발명의 방법으로, 마트리겔과 유사한 오가노이드 형성 능력뿐만 아니라 마트리겔에서와 같이 유사한 수의 증식된 세포로 적어도 10 계대 동안 갓 단리되거나 동결된 장 세포를 유지하는 것이 가능하다. 본 발명은 인간 및/또는 임상 적용에 사용하기 위한 관련 규제 요건을 준수하는 오가노이드 생산을 허용한다.
실시예
본 발명은 이제 비제한적인 도면 및 구현예를 참조하여 더 상세히 설명될 것이다.
도 1은 상업적인 배양 배지 IntestiCultTM을 사용하여, 실시예 1에 따른 하이드로겔(완전 규정된 반합성), 실시예 2에 따른 하이드로겔(합성), 선행 기술 겔(PEG RGD 및 PEG RGD LAM) 또는 마트리겔에서 배양된, 상이한 배양 계대(P, 괄호에 표시된 일자)에서 인간 생검으로부터 갓 단리된 장 세포로부터의 오가노이드 형성을 나타낸다. 축척 막대 = 500 μm.
도 2는 신선한 인간 생검으로부터 형성되고 5 계대(P) 동안 시험관내에서 배양된 인간 장 오가노이드의 오가노이드 형성 효율(3차원 매트릭스에 세포를 시딩한 후 괄호로 표시된 일자에 계산됨)을 보여준다.
도 3은 마트리겔에서 사전 배양되고 상업적인 배양 배지 IntestiCultTM을 사용하여, 실시예 1에 따른 하이드로겔(완전 규정된 반합성), 선행 기술 겔(PEG RGD 및 PEG RGD LAM) 또는 마트리겔에서 18일 동안 성장한 장 세포로부터의 오가노이드 형성을 보여준다. 축척 막대 = 500 μm.
물질 및 방법
a) 인간 결장 생검으로부터 세포의 단리 및 제1 캡슐화
결장 펀치 생검을 환자가 동의서에 서명한 후 건강한 대조군 대상체로부터 획득하였다. 장 세포를 킬레이트화에 의해(EDTA 사용) 단리하고, TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific)를 사용한 효소적 분리에 의해 단일 세포로 만들었다. 갓 분리된 생검으로부터의 단일 세포를 적합한 부피의 기본 배지(DMEM/F12, GlutaMAX(1x), Pen-Strep(100 U/ml)(Thermo Fisher Scientific) 및 HEPES(10 mM)(Thermo Fisher Scientific))에 재현탁하여 2500 세포/μl(5x 최종 농도)를 얻고 마트리겔, 완전 규정된 반합성(실시예 1) 또는 합성(실시예 2) 하이드로겔 및 선행 기술 겔(PEG RGD 및 PEG RGD LAM)에서 첫 번째 캡슐화(계대 0)를 준비하였다.
선행 기술 하이드로겔 PEG RGD 및 PEG RGD LAM을 문헌[Gjorevski et al., Synthesis and characterization of well-defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture, Nature protocols, Vol. 12, no.11, 2017, 2263-2274]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, 하이드로겔 전구체를 생성하기 위해, 8-암 PEG-VS 및 8-암 PEG-Acr 매크로머(macromer)를 활성화된 트랜스글루타미나제 인자 XIII(FXIIIa)을 위한 기질 역할을 하는 리신 및 글루타민 제시 펩타이드로 말단 기능화하였다. 매크로머의 가교 및 생성된 겔 형성은 2개의 펩타이드 기질 사이의 ε-(α-글루타밀)리신 이소펩타이드 측쇄 다리의 FXIIIa 매개 형성을 통해 발생하였다. 동일한 가교 메커니즘을 사용하여, RGD 함유 펩타이드 서열을 하이드로겔 백본에 접합시켰다. PEG RGD LAM의 경우, 추가로 천연 마우스 라미닌-111을 하이드로겔에 첨가하였다.
실시예 1에 사용된 하이드로겔은 전구체 분자로서 8-암 PEG-VS 및 8-암 PEG-Acr의 1:1 비율, 2개의 시스테인 모이어티 및 2개의 RGD 모티프를 포함하고 효소적으로 분해가능하지 않은 펩타이드 가교제 분자, 및 생체기능성 분자로서 천연 마우스 라미닌-111로부터 유래되었다.
실시예 2에 사용된 하이드로겔은 전구체 분자로서 8-암 PEG-VS 및 8-암 PEG-Acr의 1:1 비율, 2개의 시스테인 모이어티 및 2개의 RGD 모티프를 포함하고 효소적으로 분해가능하지 않은 펩타이드 가교제 분자, 및 생체기능성 분자로서 재조합 라미닌-511로부터 유래되었다.
겔 및 세포(대략 10000개의 세포) 혼합물을 48-웰 플레이트에 20 μl 액적으로 넣고, 37℃에 두었다. 세포 침강을 피하기 위해 겔화가 일어날 때까지 분석 플레이트를 2분마다 뒤집었다. 20분 후, ROCK 억제제(10 μmol/l)가 보충된 300-330 μl의 IntestiCultTM 배지를 겔 액적의 상단에 첨가하였다. 배양 배지를 2-4일마다 교체하였고, ROCK 억제제를 7일까지 배양 배지에 유지시켰다.
b) 오가노이드의 계대 및 세포 증식
세포 성장에 따라, 마트리겔 및 본 발명의 하이드로겔에 매립된 오가노이드를 단일 세포로 효소적(TrypLE) 및 기계적으로 분리하여 8-11일마다 오가노이드 계대를 수행하였다. 겔 및 오가노이드 분리 후, 세포를 계수하고, 20 μl 액적당 대략 10000개 세포의 세포 밀도로 본 발명의 하이드로겔 또는 마트리겔에 재시딩하였다.
c) 사전 확립된 오가노이드를 사용한 실험
사전 확립된 오가노이드를 사용하여 수행된 실험의 경우, 몇 번의 계대 동안 마트리겔에서 증식된 오가노이드를 분리하고 b)에 기재된 바와 같은 선행 기술 겔, 본 발명의 하이드로겔 및 마트리겔에 재시딩하였다.
d) 오가노이드 형성 효율 및 예상된 총 세포 수
콜로니 또는 오가노이드 형성 효율(OFE)을 이미지 분석에 의해 평가하였다. OFE는 형성된 오가노이드 및 특정 시점에 각 이미지에서 검출된 개체의 총 수(즉, 단일 세포 및 오가노이드의 합) 사이의 비율로서 정의되었다.
도 1 내지 3에서, 본 발명에 따른 하이드로겔이 마트리겔의 오가노이드 형성 효율(OFE)과 대등한 오가노이드 형성 효율(OFE)을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 하이드로겔은 이전에 사용된 표준 마트리겔과 적어도 동등하게 오가노이드 형성에 적합하지만, 상기 논의된 이점, 특히 완전 규정된 및 특히 완전 합성 조성물을 가지므로 규제 승인에 대한 명확한 이점을 초래한다.
도 1 내지 3에서, a) 또는 b)의 상기 기재된 조건 하에서, 본 발명의 하이드로겔은 안정하였고 매우 양호한 오가노이드 형성 효율(OFE)을 제공한 반면, 문헌[Gjorevski 2017]으로부터의 하이드로겔(여기서 "PEG-RGD" 및 "PEG RGD LAM"으로 지정됨)은 조기에 분해되어 결과적으로 어떠한 적합한 오가노이드 형성 효율(OFE)도 제공하지 못했음을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식과 이로부터의 장 오가노이드의 형성에 적합한 생체기능성 3차원 하이드로겔로서, 상기 하이드로겔은
    - 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암(arm) PEG인 적어도 하나의 전구체 분자,
    - 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자, 및
    - 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드
    의 반응 생성물이며, 가교제 분자는 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체기능성 3차원 하이드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다중 암 PEG는 4-암 및 8-암 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 하이드로겔.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔은 50 내지 1000 Pa 범위의 전단 계수(shear modulus)를 갖는 것인 하이드로겔.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔은
    i) 적어도 2개의 티올 기 및 적어도 2개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드로 가교된 8-암 PEG 비닐설폰의 반응 생성물이거나, 또는
    ii) 적어도 2개의 티올 기 및 적어도 2개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드로 가교된 8-암 PEG 비닐설폰의 반응 생성물, 및/또는 적어도 2개의 티올 기 및 적어도 2개의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드로 가교된 8-암 PEG 아크릴레이트의 반응 생성물을 포함하는 것인 하이드로겔.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 전단 계수는 시간이 지남에 따라 저하되는 것인 하이드로겔.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 효소 분해에 둔감한 것인 하이드로겔.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교제 분자는, 적어도 2개의 RGD 모티프 및 적어도 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩타이드인 하이드로겔.
  8. 제7항에 있어서, 상기 가교제 분자는 Ac-GCREGRGDSPGGRGDSPGERCG-NH2인 하이드로겔.
  9. 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식과 이로부터의 장 오가노이드의 형성을 위한 부품 키트로서,
    - 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG인 적어도 하나의 전구체 분자,
    - 마이클 첨가 반응에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교제 분자로서, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 가교제 분자,
    - 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드, 및
    - R-스폰딘 1, 바람직하게는 R-스폰딘 1 조절 배지, 및 Wnt3a, 바람직하게는 Wnt3a 조절 배지를 포함하는 배양 배지
    를 포함하는, 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식과 이로부터의 장 오가노이드의 형성을 위한 부품 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 가교제 분자는 적어도 2개의 RGD 모티프 및 적어도 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩타이드인 부품 키트.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 전구체 분자는 8-암 PEG 비닐설폰이거나, 또는 8-암 PEG 비닐설폰과 8-암 PEG 아크릴레이트의 조합인 부품 키트.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 3차원 하이드로겔을 제조하는 방법으로서,
    a1) 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG인 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자를 기판 상에, 또는 기판, 바람직하게는 다중 웰 플레이트의 개별 부피 내로 분배하고, 상기 하이드로겔 전구체 분자에
    - 마이클 첨가 반응에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 하나 이상의 가교제 분자로서, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 가교제 분자, 및
    - 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드
    를 첨가하는 단계; 또는
    a2) 재현탁된 미반응 분말, 바람직하게는 동결건조된 미반응 분말을 기판 상에, 또는 기판, 바람직하게는 다중 웰 플레이트의 개별 부피 내로 분배하는 단계로서, 상기 미반응 분말은
    - 비닐설폰 및 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중 암 PEG인 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자,
    - 마이클 첨가 반응에서 상기 다중 암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 하나 이상의 가교제 분자로서, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 것인 가교제 분자, 및
    - 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 바람직하게는 라미닌-511, 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체기능성 리간드
    를 포함하는 것인 단계,
    b) 세포, 바람직하게는 인간의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 장 세포를, 기판 상에 또는 기판의 상기 개별 부피 내로 첨가하거나, 또는 기판 상에 또는 기판의 상기 개별 부피 내로 첨가하기 전에 a1) 또는 a2)의 하이드로겔 전구체 제제 내로 첨가하는 단계; 및
    c) 상기 하이드로겔 전구체 분자 및 상기 가교제 분자를 가교시켜 하이드로겔을 형성하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 3차원 하이드로겔을 제조하는 방법.
  13. 갓 단리되거나 동결된 장 세포의 성장 및 증식 방법으로서,
    a) 상기 키트의 하이드로겔을 상기 키트의 배양 배지의 존재 하에 상기 갓 단리되거나 동결된 장 세포와 함께 인큐베이션함으로써, 본원에 기재된 부품 키트를 사용하여, 갓 단리되거나 동결된 인간 장 세포로부터 오가노이드를 드 노보 형성하는 단계,
    b) 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 부품 키트를 사용하여 단계 a)의 장 오가노이드로부터 세포를 성장, 선택적으로 계대, 및 증식시키는 단계,
    c) 선택적으로, 세포 분화를 유도하는 변형된 배양 배지의 존재 하에, 단계 a)의 오가노이드를 분화시키는 단계
    를 포함하며, 상기 방법에서 완전 합성의, 또는 완전 규정된 반합성의 하이드로겔만이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법에서 자가분해 가능한 완전 규정된 반합성 하이드로겔만이 사용되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 방법에서 자가분해 가능한 완전 합성 하이드로겔만이 사용되는 것인 방법.
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