JP2021048834A - 細胞浸潤性評価方法、それを用いた抗浸潤性化合物スクリーニング方法、ならびにそれらの方法に用いられる架橋ゼラチン粉末および評価キット - Google Patents

Abstract

【課題】がん細胞の浸潤能力を正確に評価する。【解決手段】細胞の浸潤性を評価する細胞浸潤性評価方法は、第１細胞、第２細胞、第１容器、第２容器、隔膜、薬剤および架橋ゼラチン粉末を準備する工程と、前記第１細胞を前記第１容器に収容する工程と、前記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、前記第２細胞および前記薬剤を含む細胞凝集体を前記第２容器に収容する工程と、前記第１容器および前記第２容器を前記隔膜を介して連結することにより、前記第１細胞および前記細胞凝集体中の前記第２細胞を共培養する工程と、前記第１細胞が前記隔膜を通過して前記第１容器から前記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、前記第１細胞の浸潤性を評価する工程とを含み、前記第１細胞と前記第２細胞とは、相互作用し、前記薬剤は、前記第２細胞を活性化する作用を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞浸潤性評価方法、それを用いた抗浸潤性化合物スクリーニング方法、ならびにそれらの方法に用いられる架橋ゼラチン粉末および評価キットに関する。

がん患者の予後を改善する目的の下、がん細胞の原発性組織における浸潤、および二次性臓器への転移を防止する治療法の開発が切望されて久しい。このような状況の下、特表２０１７−５０６０６６号公報（特許文献１）は、上記治療法の開発に対して有効な手段を提供するため、原発性組織と二次性臓器との間のｉｎ ｖｉｖｏ微小環境を模倣するように設計された細胞培養基材を開示している。上記特許文献１によれば、上記細胞培養基材を用いることによって、がん細胞の浸潤能力および転移能力の評価、ならびにがん治療薬の評価を行うことができるとされている。

特表２０１７−５０６０６６号公報

ところが上記特許文献１に開示された細胞培養基材に対し、上述したｉｎ ｖｉｖｏ微小環境を、生体内の実環境により近づけるための更なる改良が求められている。なぜなら上記細胞培養基材においては、がん細胞の浸潤能力および転移能力が過小評価される傾向にあり、その原因が上記細胞培養基材において生体内の実環境を再現できていないことにあると推定されるからである。したがって、生体内の実環境を適切に再現することにより、がん細胞の浸潤能力および転移能力を正確に評価することができる技術は未だ実現されておらず、その開発が切望されている。

上記実情に鑑み、本発明は、がん細胞の浸潤能力を正確に評価することができる細胞浸潤性評価方法、それを用いた抗浸潤性化合物スクリーニング方法、ならびにそれらの方法に用いられる架橋ゼラチン粉末および評価キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。具体的には、生体内においてがん細胞は、その周囲に存在する間質細胞と相互作用しながら原発性組織において浸潤することにより血管またはリンパ管に到達し、その後、血液またはリンパ液の流れに乗って二次性臓器への転移に至るという知見に注目した。この知見に基づき、原発性組織におけるがん細胞と間質細胞との相互作用を試験管内で再現することにより、がん細胞の浸潤能力を正確に評価できることを想到した。さらに架橋ゼラチン粉末と水とで形成されるゼラチンハイドロゲルに間質細胞と、間質細胞を活性化する作用を有する薬剤とを内包させることによって間質細胞の活性を高めることが、試験管内でがん細胞と間質細胞との相互作用を再現するのに有効であることを知見し、本発明に到達した。

すなわち本発明は、以下のとおりの特徴を有する。
本発明に係る細胞浸潤性評価方法は、細胞の浸潤性を評価する細胞浸潤性評価方法であって、第１細胞、第２細胞、第１容器、第２容器、隔膜、薬剤および架橋ゼラチン粉末を準備する工程と、上記第１細胞を上記第１容器に収容する工程と、上記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、上記第２細胞および上記薬剤を含む細胞凝集体を上記第２容器に収容する工程と、上記第１容器および上記第２容器を上記隔膜を介して連結することにより、上記第１細胞および上記細胞凝集体中の上記第２細胞を共培養する工程と、上記第１細胞が上記隔膜を通過して上記第１容器から上記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、上記第１細胞の浸潤性を評価する工程とを含み、上記第１細胞と上記第２細胞とは、相互作用し、上記薬剤は、上記第２細胞を活性化する作用を有する。

上記隔膜は、上記第１容器または上記第２容器に備えられ、上記隔膜は、基材と上記基材上に形成される被膜とを含み、上記被膜は、基底膜を構成する成分を含むことが好ましい。

上記基底膜を構成する成分は、ＩＶ型コラーゲンであることが好ましい。
上記第１細胞は、がん細胞であることが好ましい。

上記第２細胞は、間質細胞であることが好ましい。
上記第２細胞は、がん関連線維芽細胞およびｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅの両方またはいずれか一方であることが好ましい。

上記薬剤は、上記第１細胞から分泌される分子、上記分子の誘導体、上記分子の前駆体および上記分子の塩からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上を含むことが好ましい。

上記細胞凝集体は、上記第２細胞として上記がん関連線維芽細胞を含み、上記薬剤としてｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上を含むことが好ましい。

上記細胞凝集体は、上記第２細胞として上記ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅを含み、上記薬剤としてアデノシンおよびＩＬ−６からなる群より選ばれるいずれか１種または２種を含むことが好ましい。

上記ゼラチンハイドロゲルは、粒子状であって、平均粒径が１０〜２００μｍであることが好ましい。

上記細胞凝集体は、１種または２種以上含むことが好ましい。
上記細胞凝集体は、第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含み、上記第１細胞凝集体は、上記ゼラチンハイドロゲルと、上記がん関連線維芽細胞と、上記ｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上とを含み、上記第２細胞凝集体は、上記ゼラチンハイドロゲルと、上記ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅと、上記アデノシンおよびインターロイキン６からなる群より選ばれるいずれか１種または２種とを含むことが好ましい。

本発明に係る抗浸潤性化合物スクリーニング方法は、上記細胞浸潤性評価方法を用いることにより、化合物が抗浸潤作用を有するか否かを評価する抗浸潤性化合物スクリーニング方法であって、上記第１細胞、上記第２細胞、上記第１容器、上記第２容器、上記隔膜、上記薬剤および上記架橋ゼラチン粉末を準備する工程と、上記第１細胞を上記第１容器に収容する工程と、上記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、上記第２細胞および上記薬剤を含む細胞凝集体を上記第２容器に収容する工程と、上記第１容器および上記第２容器を上記隔膜を介して連結することにより、上記第１細胞および上記細胞凝集体中の上記第２細胞を共培養する工程と、上記第１細胞が上記隔膜を通過して上記第１容器から上記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、上記第１細胞の浸潤性を評価する工程と、上記第１容器または上記第２容器に上記化合物を添加する工程とを含み、上記化合物を添加する工程を実行した後に、上記第１細胞の浸潤性を評価する工程を実行することによって上記化合物が抗浸潤作用を有するか否かを評価する。

上記化合物は、抗がん剤候補化合物であることが好ましい。
本発明に係る架橋ゼラチン粉末は、上記細胞浸潤性評価方法、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法に用いられる架橋ゼラチン粉末であって、上記架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、上記ゼラチンハイドロゲルを形成する。

本発明に係る評価キットは、上記細胞浸潤性評価方法、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法に用いられる評価キットであって、上記評価キットは、上記第１容器と、上記第２容器と、上記隔膜と、上記薬剤と、上記架橋ゼラチン粉末とを少なくとも備える。

上記評価キットは、上記第１細胞および上記第２細胞のいずれか一方を少なくとも備えることが好ましい。

上記架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、上記ゼラチンハイドロゲルを形成し、上記ゼラチンハイドロゲルは、粒子状であって、平均粒径が１０〜２００μｍであることが好ましい。

本発明によれば、がん細胞の浸潤能力を正確に評価することができる細胞浸潤性評価方法、それを用いた抗浸潤性化合物スクリーニング方法、ならびにそれらの方法に用いられる架橋ゼラチン粉末および評価キットを提供することができる。

図１は、本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法を実行するために用いられる評価キットに基づいて構築された組立体の一例を示す模式図である。 図２は、図１に示した組立体を用いて行う細胞浸潤性評価方法の一例を説明する説明図であって、（ａ）は、第１細胞および細胞凝集体中の第２細胞の共培養が進行中の組立体を示す説明図であり、（ｂ）は、共培養を終了した時点の組立体を示す説明図であり、（ｃ）は、（ｂ）に示す組立体から第１容器を除去した第２容器を示す説明図である。 図３は、本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法を実行するために用いられる評価キットに基づいて構築された組立体の他の一例を示す模式図である。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る実施形態（以下、「本実施形態」とも記す）について詳細に説明する。ここで本明細書において「Ａ〜Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＢの単位とは同じである。さらに本明細書において「浸潤」とは、がん細胞などの細胞が原発性組織において広がり、血管またはリンパ管に至ることを意味する。さらに「浸潤性」とは、上述した「浸潤」により定義される性質を意味する。「転移」とは、上記細胞が上記浸潤によって血管またはリンパ管に至り、次いで血管内またはリンパ管内に侵入した後、血液またはリンパ液を通じて原発性組織とは異なる他の組織または臓器に移動することにより、当該他の組織または臓器において定着することを意味する。以下の実施形態の説明に用いられる図面において、同一の参照符号は、同一部分又は相当部分を表わす。図面においては、各構成要素を理解しやすくするために縮尺を適宜調整して示しており、図面に示される各構成要素の縮尺と実際の構成要素の縮尺とは必ずしも一致しない。

〔細胞浸潤性評価方法〕
本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法は、細胞の浸潤性を評価する細胞浸潤性評価方法である。上記細胞浸潤性評価方法は、第１細胞、第２細胞、第１容器、第２容器、隔膜、薬剤および架橋ゼラチン粉末を準備する工程（第１工程）と、上記第１細胞を上記第１容器に収容する工程（第２工程）と、上記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、上記第２細胞および上記薬剤を含む細胞凝集体を上記第２容器に収容する工程（第３工程）と、上記第１容器および上記第２容器を上記隔膜を介して連結することにより、上記第１細胞および上記細胞凝集体中の上記第２細胞を共培養する工程（第４工程）と、上記第１細胞が上記隔膜を通過して上記第１容器から上記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、上記第１細胞の浸潤性を評価する工程（第５工程）とを含む。さらに上記細胞浸潤性評価方法において、上記第１細胞と上記第２細胞とは、相互作用し、上記薬剤は、第２細胞を活性化する作用を有する。

このような特徴を備える細胞浸潤性評価方法は、たとえば第１細胞としてがん細胞を適用し、第２細胞として上記がん細胞と相互作用する間質細胞を適用した場合、第１細胞としてのがん細胞の浸潤能力（換言すれば、「浸潤性の強さ」とも称することができる）を正確に評価することができる。すなわち本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法において、浸潤性の強さを評価する対象となる細胞は、第１細胞である。

ここで第１細胞と第２細胞とが「相互作用」するとは、第１細胞と第２細胞とが後述する液性因子を相互に交換すること等に基づいて互いを認識することにより、当該認識に基づいた特異的な反応を第１細胞または第２細胞のいずれかが起こすことをいう。さらに第２細胞が「活性化」するとは、第２細胞が有する機能のうち少なくとも１つを奏功させること、または上記機能のうち少なくとも１つを向上させることをいう。以下、本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法における各工程（第１工程〜第５工程）を具体的に説明する。

＜第１工程＞
第１工程は、第１細胞、第２細胞、第１容器、第２容器、隔膜、薬剤および架橋ゼラチン粉末を準備する工程である。第１工程により、細胞浸潤性評価方法を実行するために必要な材料を準備することができる。本明細書において「第１細胞」とは、上述のように浸潤性の強さを評価する対象となる細胞を意味する。第１細胞の種類は、特に制限されない。しかしながら本発明の効果を医薬分野などで有効に活用する観点から、第１細胞は、がん細胞であることが好ましい。上記がん細胞は、一般に上皮性腫瘍細胞として分類される上皮細胞に由来するがん細胞であることがより好ましい。第１細胞は、浸潤性を有するとされる白血球、リンパ球などの炎症性細胞であることも好ましい。

「第２細胞」とは、生体内において第１細胞と相互作用することが知られる細胞を意味する。第２細胞の種類としては、第１細胞と相互作用することが知られる細胞であれば、特に制限されない。しかしながら本発明の効果を医薬分野などで有効に活用する観点から、第２細胞は、間質細胞であることが好ましい。ここで「間質細胞」とは、生体組織の支持構造を構成する細胞をいい、たとえば間質細胞としてマクロファージなどの免疫細胞、線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞などに分類される各細胞を例示することができる。第１細胞ががん細胞である場合、第２細胞は、がん関連線維芽細胞（以下、「ＣＡＦ」とも記す）であることがより好ましい。最近の研究によってＣＡＦは、がん細胞と相互作用することによりがん細胞の原発性組織における浸潤を促進することが知見されたため、第２細胞としてＣＡＦを用いた場合、がん細胞の浸潤性の強さをより正確に評価することができる。

さらに第１細胞ががん細胞である場合、第２細胞としてはＣＡＦ以外に、がん組織血管内皮細胞、組織間葉系幹細胞、ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ（ＴＡＭ）、調節性Ｔ細胞、筋線維芽細胞などを用いることが可能である。

第２細胞は、上記がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）および上記ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ（ＴＡＭ）の両方またはいずれか一方であることがより好ましい。ＴＡＭは、がん細胞と相互作用することによって、Ｔ細胞等の標的からがん細胞を除外するようにする効果を奏し、もってがん細胞の原発性組織における浸潤を促進させることが知られている。したがって、第２細胞としてＣＡＦおよびＴＡＭの両方またはいずれか一方を用いた場合、がん細胞の浸潤性の強さをより正確に評価することができる。さらに第２細胞としては、上述した各種の細胞（ＣＡＦ、がん組織血管内皮細胞、組織間葉系幹細胞、ＴＡＭ、調節性Ｔ細胞、筋線維芽細胞）からなる群より選ばれる１種または２種以上を用いることができる。

「第１容器」とは、後述する第２工程において第１細胞が収容される容器を意味する。さらに「第１容器」とは、後述する第４工程において第２容器と隔膜を介して連結可能な容器であり、かつ上記第４工程において第２容器に収容された第２細胞と、当該第１容器に収容された第１細胞とを共培養することができる容器を意味する。第１容器の大きさおよび形状は、第１細胞が所定量（たとえば、細胞数が１００００〜１０００００個程度）収容可能な大きさおよび形状を有する限り制限されない。たとえば第１容器の大きさおよび形状は、直径４〜１００ｍｍの平皿（ペトリ皿）形状であることができる。第１容器の材質は、第１細胞および上記第１細胞とともに収容される培養液と反応しないことにより、これらに悪影響を与えない材質であれば制限されない。たとえば第１容器は、ポリスチレン、ポリメチルペンテン、フッ素樹脂などの樹脂製の容器、ガラス製の容器などを適用することができる。

「第２容器」とは、後述する第３工程において第２細胞を含む細胞凝集体が収容される容器を意味する。さらに「第２容器」とは、後述する第４工程において第１容器と隔膜を介して連結可能な容器であり、かつ上記第４工程において第１容器に収容された第１細胞と、当該第２容器に収容された第２細胞とを共培養することができる容器を意味する。第２容器の大きさおよび形状は、細胞凝集体が所定量（たとえば１０００〜１００００個程度）収容可能な大きさを有していればよい。たとえば第２容器の大きさおよび形状は、直径４〜１００ｍｍの平皿（ペトリ皿）形状であることができる。第２容器の材質は、細胞凝集体および上記細胞凝集体とともに収容される培養液と反応しないことにより、これらに悪影響を与えない材質であれば制限されない。たとえば第２容器は、上記第１容器と同様にポリスチレン、ポリメチルペンテン、フッ素樹脂などの樹脂製の容器、ガラス製の容器などを適用することができる。たとえば第１容器が樹脂製の容器である場合、第２容器は同じ樹脂製の容器であってもよく、異なる樹脂製の容器であってもよく、ガラス製の容器であってもよい。

「隔膜」とは、後述する第４工程において第１容器および第２容器とが連結される位置に配置される膜（メンブレン）状の構造体を意味する。隔膜は、これを介して第１容器および第２容器が連結されることにより、後述する第４工程において第１容器に収容された第１細胞、および第２容器に収容された細胞凝集体中の第２細胞を、共通する培養液によって共培養することができる。第１細胞および第２細胞は、培養液を共有することによって相互に液性因子を交換することが可能となり、もって第１細胞および第２細胞は、相互作用することができる。「液性因子」とは、ごく近傍の細胞間で受け渡されることにより、上記細胞間の情報伝達を担う因子として機能する分子量５０００〜２００００Ｄａ程度のタンパク質（単純タンパク質である場合と糖タンパク質である場合とがある）を意味する。隔膜が上述した位置に配置されることにより、上記細胞浸潤性評価方法は後述する第５工程において、第１細胞が当該隔膜を通過して第１容器から第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、第１細胞の浸潤性の強さを評価することが可能となる。

ここで第１細胞および第２細胞の共培養を容易に行う観点から、隔膜は、第１容器または第２容器に備えられることが好ましい。たとえば第１容器および第２容器が上下方向に重なるように配置されることにより、第１容器の底部において第１容器と第２容器とが連結される場合、第１容器の底部に上記隔膜を備えることができる。さらにたとえば、第１容器および第２容器が左右方向に並べて配置されることにより、第１容器の側部と、当該側部に対面する第２容器の側部とが連結される場合、第１容器の側部、第２容器の側部、または第１容器の側部と第２容器の側部との連結部のいずれかに上記隔膜を備えることができる。

さらに第１細胞の浸潤性の強さを正確に評価する観点から、隔膜は、基材と上記基材上に形成される被膜とを含むことが好ましい。隔膜によって、共培養中の第１容器および第２容器の間を、第１細胞および第２細胞が通過不能となり、かつ第１細胞および第２細胞から分泌される液性因子が通過可能となる。

基材は、薄板状であって、第１細胞が通過可能となる大きさの孔（ポア）を複数有することが好ましい。さらに基材は、表面に被膜を形成することが可能であり、かつ第１細胞、細胞凝集体、ならびにこれらとともに第１容器および第２容器に収容される培養液と反応しないことにより、これらに悪影響を与えない材質からなることが好ましい。たとえば基材の大きさおよび形状としては、ポア径０．４〜１０μｍ、ポア密度１×１０⁵〜１×１０⁸個／ｃｍ²であって直径３．５〜１００ｍｍの円盤形状とすることができる。基材の材質としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレートなどのポリエステル、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレンなどの樹脂、またはステンレス、チタンなどの金属を適用することができる。

被膜は、基材上に形成されることが好ましい。被膜は、基材の表面全体を被覆するように形成されることが好ましい。さらに被膜は、基底膜を構成する成分を含むことが好ましい。なかでも上記基底膜を構成する成分は、ＩＶ型コラーゲンであることが好ましい。ここで「ＩＶ型コラーゲン」は、生体内において基底膜を構成する主要な構成成分の一つとして公知である。さらに「基底膜」とは、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）、エンタクチン／ニドゲン、サイトカイン、成長因子などを含み、生体において上皮細胞の基底側に形成される組織を意味する。本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法は、隔膜を上述した基材と上記基材上に形成される被膜とを含む構造体とした場合、生体内において起こる「がん細胞の原発性組織における浸潤」を、第１細胞が上記隔膜において被膜を破壊し、かつ基材中のポアを通過する（すなわち第１細胞が隔膜を通過する）ことによって再現することができる。これにより第１細胞の浸潤性の強さをより正確に評価することができる。

隔膜は、基材上に上述した被膜を従来公知の方法により形成することにより製造することができる。たとえば上述したポリカーボネート製の基材に対し、レーザあるいは中性子線を用いて物理的に穴を開け、次に上述の基底膜を構成する成分をコーティングすることにより上記基材上に上述した被膜を形成し、もって隔膜を製造することができる。さらに隔膜は、市販品（たとえばニュークレオポア社製）により準備することができる。

「薬剤」とは、第２細胞を活性化する作用を有する化合物を意味する。具体的には、薬剤は、後述する第３工程において細胞凝集体中に第２細胞とともに含有されることにより、第２細胞を活性化することができる。薬剤は、第２細胞を活性化する作用を有する化合物であれば特に制限されず、無機化合物を含む薬剤であってもよく、有機合成反応によって製造可能な化合物を含む薬剤であってもよく、天然物などから抽出される化合物を含む薬剤でもよい。薬剤は、第２細胞を活性化する作用を有する化合物であれば、分子量が５００Ｄａ未満の合成低分子製剤、分子量が５００〜５０００Ｄａ程度の核酸製剤またはペプチド製剤、分子量が数万Ｄａ以上のタンパク質製剤をいずれも適用することができる。たとえば細胞凝集体が第２細胞としてＣＡＦを含み、上記薬剤としてｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング増殖因子−β１）、ＳＤＦ−１（ｓｔｒｏｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１）およびＰＧＥ２（プロスタグランディンＥ２）からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上を含むことが好ましい。この場合において、ｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる１種の薬剤を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

さらに、たとえば細胞凝集体が第２細胞としてＴＡＭを含み、上記薬剤としてアデノシンおよびＩＬ−６（インターロイキン６）からなる群より選ばれるいずれか１種または２種を含むことが好ましい。この場合において、アデノシンおよびＩＬ−６からなる群より選ばれるいずれか１種の薬剤を単独で用いてもよく、２種を併用してもよい。

さらに薬剤は、上記第１細胞から分泌される分子、上記分子の誘導体、上記分子の前駆体および上記分子の塩からなる群より選ばれるいずれかを少なくとも含むことが好ましい。これにより生体内において上記第１細胞と第２細胞との相互作用によって起こる「がん細胞の原発性組織における浸潤」を、本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法において再現することができる。ここで本明細書において分子の「誘導体」とは、分子に官能基を導入したり、分子に対して酸化還元反応を実行したりすることによって、分子の分子内の一部の構造を改変して形成される物質を意味する。分子の「前駆体」とは、分子が生合成または合成によって生成される前の段階にある物質を意味する。分子の「塩」とは、分子自身が有する活性を維持したまま、酸または塩基により処理されることにより形成される塩を意味する。

薬剤による第２細胞の「活性化」の有無およびその程度は、たとえば第２細胞がＣＡＦである場合、当該細胞内で産生されたα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することにより測定することができる。具体的には、ゼラチンハイドロゲル、ＣＡＦおよび薬剤を含む細胞凝集体を所定日数（たとえば、５日、１０日、１５日など）培養した後に、上記細胞凝集体から抽出したＣＡＦに対してＥＬＩＳＡ法を適用することによってαＳＭＡ量を定量する。これにより、薬剤によるＣＡＦの「活性化」の有無およびその程度を測定することができる。この場合において、定量されたαＳＭＡ量が多いほど、ＣＡＦが活性化されていると評価することができる。さらに薬剤によるＣＡＦの「活性化」は、ゼラチンハイドロゲル、ＣＡＦおよび薬剤を含む細胞凝集体と、ゼラチンハイドロゲルおよびＣＡＦを含み、薬剤を含まない細胞凝集体とを準備し、これらにおいて上述したＥＬＩＳＡ法を適用して得られたαＳＭＡ量を比較することにより、定性的に求めることもできる。

また薬剤による第２細胞の「活性化」の有無およびその程度は、たとえば第２細胞がＴＡＭである場合、当該細胞内で産生された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することにより測定することができる。具体的には、ゼラチンハイドロゲル、ＴＡＭおよび薬剤を含む細胞凝集体を所定日数（たとえば、５日、１０日、１５日など）培養した後に、上記細胞凝集体から抽出したＴＡＭに対してＥＬＩＳＡ法を適用することによってＶＥＧＦ量を定量する。これにより、薬剤によるＴＡＭの「活性化」の有無およびその程度を測定することができる。この場合において、定量されたＶＥＧＦ量が多いほど、ＴＡＭが活性化されていると評価することができる。さらに薬剤によるＴＡＭの「活性化」は、ゼラチンハイドロゲル、ＴＡＭおよび薬剤を含む細胞凝集体と、ゼラチンハイドロゲルおよびＴＡＭを含み、薬剤を含まない細胞凝集体とを準備し、これらにおいて上述したＥＬＩＳＡ法を適用して得られたＶＥＧＦ量を比較することにより、定性的に求めることもできる。

「架橋ゼラチン粉末」とは、後述する架橋ゼラチンの乾燥物を粉砕することにより得られる粉末を意味する。架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、ゼラチンハイドロゲルを形成することができる。ここで架橋ゼラチン粉末における「ゼラチン」とは、コラーゲンの三重らせん構造が酸変性、アルカリ変性および熱変性の少なくともいずれかによってほどけたポリペプチド、その化学修飾体、その誘導体およびその薬学上許容される塩を意味する。上記「コラーゲン」とは、脊椎動物の真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などの細胞外基質を由来とするタンパク質を意味する。コラーゲンは、３本のペプチド鎖からなる右巻きのらせん構造を有し、そのペプチド鎖を構成するアミノ酸残基は、グリシン残基が３残基ごとに繰り返される一次構造（所謂コラーゲン様配列）を有している。

上記ゼラチンは、ヒト、ブタ、ウシなどの哺乳類のほか、ダチョウなどの鳥類、サケ、タイ、サメなどの魚類などを含む種々の動物由来の上記コラーゲンに対し、アルカリ加水分解、酸加水分解または酵素分解などの処理を行なうことによって上記コラーゲンを変性させ、かつ温水を用いて抽出することにより得ることができる。ゼラチンは、微生物を用いた発酵法、化学合成または遺伝子組換え操作により得ることもできる。

ここで上記ポリペプチド（ゼラチン）の「化学修飾体」とは、ゼラチンを構成するアミノ酸残基におけるアミノ基、カルボキシル基またはヒドロキシ基が化学修飾されたポリペプチドを意味する。化学修飾を受けたゼラチンは、水に対する溶解性、等電点等を変化させることができる。具体的には、ゼラチンにおけるヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ基に対しては、Ｏ−アセチル化などの化学修飾を実行することができる。ゼラチンにおけるグリシン残基のα−カルボキシル基に対しては、エステル化、アミド化などの化学修飾を実行することができる。ゼラチンにおけるプロリン残基のα−アミノ基に対しては、ポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化などの化学修飾を実行することができる。

ゼラチンの化学修飾の具体的手段および処理条件は、従来公知の化学修飾方法を適用することができる。ヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ基の化学修飾については、水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどにより、たとえばＯ−アセチル化を行うことができる。グリシン残基のα−カルボキシル基の化学修飾については、メタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどにより、たとえばエステル化を行うことができる。グリシン残基のα−カルボキシル基の化学修飾については、カルボジイミドなどを作用させることによりアミド化を行うことができる。

さらに上記ポリペプチド（ゼラチン）の「誘導体」には、ゼラチンに官能基を導入したゼラチン誘導体、およびゼラチンと乳酸、グリコール酸などとの共重合体、ゼラチンとポリエチレングリコール、プロピレングリコールとの共重合体などが含まれる場合がある。ゼラチン誘導体としては、ゼラチンに対してアニジル基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基、アルキル基、アシル基、フェニル基、ベンジル基などの官能基を導入したものなどを挙げることができる。

上記ポリペプチド（ゼラチン）の「薬学上許容される塩」とは、薬学上許容され、かつ元となるゼラチンの所望の活性（たとえば、ゲル化能）を有する塩を意味する。薬学上許容される塩としては、たとえば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩およびマレイン酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられる。常法に従ってゼラチン中の特定のペプチドを薬学上許容される塩にすることができる。

上記ゼラチンは、２０００〜３０００００Ｄａの重量平均分子量を有することが好ましく、１００００〜２０００００Ｄａであることがより好ましい。上記重量平均分子量は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めることが可能である。具体的には、以下の条件のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を実行することにより、ゼラチンの重量平均分子量を求めることが可能である。
移動相 ：０．１％トリフルオロ酢酸含有４５％アセトニトリル（５５％水）固定相 ：ＴＳＫ−Ｇｅｌ−２０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ製）
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ：４０℃
分析時間 ：１５分
インジェクション量：１０μＬ
検出波長 ：２１４ｎｍ。

架橋ゼラチン粉末の原料となるゼラチンとしては、コラーゲンのアルカリ処理によって得られ、等電点が４．５〜５．５となる所謂酸性ゼラチンを用いることが好ましい。後述するゼラチンハイドロゲルにおいて、ゼラチンの等電点が４．５〜５．５である場合、静電相互作用によって薬剤および第２細胞を保持する保持能力を高く維持することができる。ただし、架橋ゼラチン粉末の原料となるゼラチンとしては、コラーゲンの酸処理によって得られる所謂アルカリ性ゼラチンを用いることも好ましい。すなわちゼラチンハイドロゲルは、等電点が８．５〜９．５のゼラチンからなる場合であっても好適に使用することができる。

架橋ゼラチン粉末の原料となるゼラチンとしては、市販品のゼラチンを用いてもよい。たとえば豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ−Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）を用いることができる。あるいは、架橋ゼラチン粉末として、既成の架橋ゼラチン粉末（商品名：「メドジェル（登録商標）粒子ＩＩ（ＰＩ５）」、新田ゼラチン株式会社製）を用いてもよい。

架橋ゼラチン粉末は、上述のように水と接触した場合、ゼラチンハイドロゲルを形成することができる。このような架橋ゼラチン粉末は、原料となる上記ゼラチンを水に溶解することによりゼラチン水溶液を得、このゼラチン水溶液に対し従来公知の架橋剤を添加し、ゼラチンの分子間および分子内を架橋処理することにより架橋ゼラチンを得た後、上記架橋ゼラチンを凍結乾燥すること等によって製造することができる。ゼラチン水溶液に添加する架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ＥＤＣなどの水溶性カルボジイミド、あるいは水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基などの間に化学結合を作る縮合剤などを用いることができる。さらに上記ゼラチン水溶液をゲル状とした後に、熱脱水処理、紫外線、ガンマ線、電子線照射などを行うことによってもゼラチンの分子間および分子内を架橋処理することができる。さらに上記ゼラチン水溶液をゲル状とした後に、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などの物理的な処理によってゼラチンの分子間および分子内を架橋処理することもできる。

架橋ゼラチン粉末を製造する場合、上記ゼラチン水溶液中のゼラチンおよび架橋剤の濃度は、ゼラチンが１〜２０質量％、架橋剤が０．０１〜１質量％であることが好ましい。架橋反応の条件は特に制限すべきではないが、たとえば０〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃とし、１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間とすることができる。ゼラチンの架橋度は、製造しようとするゼラチンハイドロゲルの含水率によって規定することができる。たとえば後述する第３工程に用いるゼラチンハイドロゲルの含水率は、８０〜９８質量％であることが好ましい。ここでゼラチンハイドロゲルの「含水率」とは、ゼラチンハイドロゲルの全体質量に対するゼラチンハイドロゲル中の水の質量比率（質量％）をいう。

上記架橋ゼラチン粉末の具体的な形成方法は、複数存在するが、たとえば以下の形成方法とすることができる。まず等電点５の豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ−Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）を超純水に溶解し、３７℃で加温しながら撹拌することにより５質量％または１０質量％のゼラチン水溶液を調製する。このゼラチン水溶液に対し、２５質量％のグルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液を所定量添加し、４℃、１２時間の条件で架橋反応を進ませる。このとき、グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液の添加量を調整することにより、水と接触することにより形成されるゼラチンハイドロゲルの含水率を調製することができる。たとえば５質量％のゼラチン水溶液１０ｍＬに対し、２５質量％のグルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液を２０μＬ添加することによって、含水率９８質量％のゼラチンハイドロゲルを製造することができる。

上記の架橋反応により、水に不溶の架橋ゼラチンが製造される。この架橋ゼラチンを、室温（２５℃）、１時間の条件下で１００ｍＭのグリシン溶液に浸漬することにより、架橋ゼラチンに残存しているアルデヒド基およびグルタルアルデヒドを不活化する。続いて、架橋ゼラチンを室温で１時間、超純水中で洗浄することを複数回行い、その後、従来公知の凍結乾燥を行うことにより、粒径が２０〜１００μｍとなる架橋ゼラチン粉末を製造することができる。凍結乾燥の期間としては、凍結物から水分を除去できる時間であれば特に制限はなく、たとえば１日〜１か月である。好ましい凍結乾燥の期間は、２日〜２週間である。

＜第２工程＞
第２工程は、上記第１細胞を上記第１容器に収容する工程である。本工程では、従来公知の細胞生物学的手法を用いることにより、第１細胞を必要量の培養液とともに第１容器に収容することができる。第１容器に対する第１細胞の収容量（播種量）は、１容器当たり細胞数が１００００〜１０００００個程度とすることが好ましい。ここで上記培養液としては、この種の細胞を培養するのに通常用いられる基本培地に、必要な血清および抗生物質などを添加することにより調製することができる。たとえばイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）と呼ばれる基本培地に対し、ウシ胎児血清を１０質量％濃度となるように添加し、かつ抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を１質量％濃度となるように添加することにより調製することができる。１容器当たりの細胞数は、細胞播種数により求めることができる。

＜第３工程＞
第３工程は、上記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、上記第２細胞および上記薬剤を含む細胞凝集体を上記第２容器に収容する工程である。本工程では、上記架橋ゼラチン粉末を水と接触させることにより形成したゼラチンハイドロゲルと、第２細胞と、薬剤とを混合することにより、薬剤がゼラチンハイドロゲルに担持され、かつ上記ゼラチンハイドロゲルに第２細胞が付着することにより第２細胞が立体的に集約した細胞凝集体を形成する。さらに上記細胞凝集体を、従来公知の細胞生物学的手法を用いることにより、必要量の培養液とともに第２容器に収容する。第２容器に対する細胞凝集体の収容量は、上述のように１容器当たり細胞凝集体数が１０００〜１００００個程度とすることが好ましい。第２容器に第２細胞とともに収容する培養液は、後述する第４工程の共培養において第１容器と共有されるため、第１容器に収容する培養液と同一であることが好ましい。ゼラチンハイドロゲルの形成方法および細胞凝集体の形成方法については、それぞれ後述する。１容器当たりの細胞凝集体数は、細胞播種数に基づいて求めることができる。

（ゼラチンハイドロゲル）
ゼラチンハイドロゲルは、粒子状であって、平均粒径が１０〜２００μｍであることが好ましい。本明細書において「ゼラチンハイドロゲル」とは、架橋ゼラチン粉末から形成され、水に対して不溶性の三次元の網目構造を有することにより、内部に水を含んで膨潤した状態を呈するゲル状構造体を意味する。

ゼラチンハイドロゲルは、薬剤を確実に担持するため、薬剤との親和性および安定性の向上などの目的に応じてゼラチン以外の添加物を含むことができる。ゼラチン以外の添加物としては、たとえばアミノ糖またはその高分子量体、塩基性アミノ酸またはそのオリゴマー、もしくはその高分子量体、ポリアリルアミン、ポリジエチルアミノエチルアクリルアミド、ポリエチレンイミンなどの塩基性高分子などを挙げることができる。

ゼラチンハイドロゲルは、上述のように架橋ゼラチン粉末を水と接触させることにより、形成することができる。たとえば架橋ゼラチン粉末１ｇを、０．１〜１０ｍＬの水に添加することによって上記第３工程に用いるゼラチンハイドロゲルを形成することができる。上記第３工程に用いるゼラチンハイドロゲルの「含水率」は、８０〜９８質量％であることが好ましい。

ゼラチンハイドロゲルは、上述した「含水率」が高い程分解されやすいとされる。ゼラチンハイドロゲルの含水率は、８０質量％未満となると、培養液中での分解速度が著しく低下することにより、第２細胞から分泌される液性因子の放出が抑制され、もって第１細胞および第２細胞間の相互作用が十分に行われない傾向がある。上記含水率が９８質量％を超えると、培養液中で直ちに溶解するため、薬剤および第２細胞を保持することができない傾向がある。ゼラチンハイドロゲルの含水率の測定には、従来公知の測定方法を用いることができる。

ゼラチンハイドロゲルの平均粒径の測定方法は、次のとおりである。すなわち上述した方法によりゼラチンハイドロゲルを形成する。次いで、このゼラチンハイドロゲルの顕微鏡写真を撮り、顕微鏡写真中に現れる粒子の直径を目視で測定することによってゼラチンハイドロゲルの粒径を求めることができる。上述の測定を１００個のゼラチンハイドロゲルに対して行い、これらすべてのゼラチンハイドロゲルの粒径を平均値化することにより、ゼラチンハイドロゲルの平均粒径を求めることができる。

（細胞凝集体）
細胞凝集体は、上述のように薬剤がゼラチンハイドロゲルに担持され、かつ上記ゼラチンハイドロゲルに第２細胞が付着することにより第２細胞が立体的に集約した形状を有することができる。このような細胞凝集体は、たとえば次のようにして形成することができる。まず所定の容器を準備し、１質量％濃度のポリビニルアルコールを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液を上記容器に添加し、その状態において３７℃、かつ１５分間放置することにより、上記容器の内壁に第２細胞が付着しないように前処理する。この前処理した容器に対し、上述した培養液と同一成分の培養液とともにゼラチンハイドロゲル、第２細胞および薬剤をそれぞれ必要量添加し、次いで混合する。ゼラチンハイドロゲル、第２細胞および薬剤の添加量としては、たとえばゼラチンハイドロゲル１個に対し、第２細胞が１０個の比率とし、薬剤は、上記培養液中で１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ濃度とすることができる。さらにゼラチンハイドロゲル、第２細胞および薬剤が添加された上記容器を３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で５〜１５日間培養することにより、細胞凝集体を形成することができる。あるいは、細胞凝集体を調製する目的のために、細胞凝集体を調製できる「スフェロイドマイクロプレート」（コーニング社製）などのマイクロプレートを使用してもよい。細胞凝集体を調製する際の薬剤の添加量としては、上記培養液中で２００〜６００μｇ／ｍＬ濃度とすることが好ましい。

細胞凝集体は、それ自身の安定性維持および成長因子の活性維持などの目的に応じ、薬学上許容し得る安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤などの各種の添加剤を含むことができる。

ここで細胞凝集体は、１種または２種以上含むことが好ましい。たとえば細胞凝集体は、２種である場合、第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含むことが好ましい。この場合において第１細胞凝集体は、上記ゼラチンハイドロゲルと、ＣＡＦと、ｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる１種または２種以上とを含み、第２細胞凝集体は、上記ゼラチンハイドロゲルと、ＴＡＭと、アデノシンおよびＩＬ−６からなる群より選ばれるいずれか１種または２種とを含むことが好ましい。これにより第１細胞の浸潤性の強さをより正確に評価することができる。特に、細胞凝集体が第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の２種を含む場合、第２容器に収容する上記第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率を、浸潤性の強さを評価しようとする第１細胞のがん細胞の種別（胃、大腸、膵臓などの消化器系がん細胞、肺がん細胞、乳がん細胞、肝がん細胞、前立腺がん細胞、腎がん細胞、甲状腺がん細胞等）に応じて適宜選択することにより、上記第１細胞の浸潤性の強さをより高精度に評価することが可能となる。

さらに細胞凝集体は、上記ゼラチンハイドロゲルと、ＣＡＦと、ＴＡＭと、ｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる１種または２種以上と、アデノシンおよびＩＬ−６からなる群より選ばれるいずれか１種または２種とを含むこともできる。細胞凝集体がこのような態様である場合も、第１細胞の浸潤性の強さを評価することができる。

＜第４工程＞
第４工程は、上記第１容器および上記第２容器を上記隔膜を介して連結することにより、上記第１細胞および上記細胞凝集体中の上記第２細胞を共培養する工程である。以下、本工程について図１を参照することにより具体的に説明する。図１は、本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法を実行するために用いられる評価キットに基づいて構築された組立体の一例を示す模式図である。

図１に示すように本工程では、まず第２工程により準備された第１細胞２１が収容された第１容器１１、および第３工程により準備された第２細胞２２、薬剤４およびゼラチンハイドロゲル５を含む第１細胞凝集体Ａが収容された第２容器１２を、隔膜３を介して連結する。ここで図１において隔膜３は、第１容器１１の底部に配置されている。すなわち図１に示す組立体の例では、第１容器１１および第２容器１２が上下方向に重なるように配置されることにより、第１容器１１の底部において第１容器１１と第２容器１２とが連結される。図１に示す第１容器１１の大きさは、第２容器１２の大きさよりも小さい。この場合においては、たとえばアダプター１１ａを、第１容器１１に適宜備えさせることにより、第１容器１１と第２容器１２とを、第１容器１１の底部の隔膜３を介して容易に連結させることができる。第１容器１１および第２容器１２には、第２工程および第３工程においてそれぞれ共通する培養液Ｍが収容されている。

次いで、上記組立体において、第１細胞２１および第１細胞凝集体Ａ中の第２細胞２２を第１容器１１および第２容器１２に共通する培養液Ｍを用いて共培養する。共培養の条件は、第１細胞２１ががん細胞であり、第２細胞がＣＡＦである場合、これらを培養するための公知の条件を用いることができる。たとえば共培養の条件は、以下のとおりとすることができる。共培養中の上記組立体においては、隔膜３によって、第１容器１１および第２容器１２の間を第１細胞２１および第２細胞２２を含む第１細胞凝集体Ａが通過不能である一方、第１細胞２１および第２細胞２２から分泌される液性因子は通過可能となり、もって第１細胞２１および第２細胞２２が相互作用することができる。

（共培養条件）
培養時間：２４時間
温度：３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下
培養液Ｍの組成：
基本培地 Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）
ウシ胎児血清 １０質量％
抗生物質（ペニシリンまたはストレプトマイシン １質量％）。

さらに本工程に関し、細胞凝集体が第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含む場合の態様について、図３を参照することにより具体的に説明する。図３は、本実施形態に係る細胞浸潤性評価方法を実行するために用いられる評価キットに基づいて構築された組立体の他の一例を示す模式図である。

細胞凝集体が第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含む場合、図３に示すように本工程では、図１と対比すれば、第２容器１２に第１細胞凝集体Ａに加えて第２細胞凝集体Ｂが収容されている点において異なり、その他の態様は同一である。この場合においては、第１細胞２１、第１細胞凝集体Ａ中の第２細胞（ＣＡＦ）および第２細胞凝集体Ｂ中の第２細胞（ＴＡＭ）を、第１容器１１および第２容器１２に共通する培養液Ｍを用いて共培養する。共培養の条件は、これらを培養するための公知の条件を用いることができ、たとえば共培養の条件は、上述したがん細胞と第２細胞としてＣＡＦとを用いた共培養条件と同じとすることができる。

＜第５工程＞
第５工程は、上記第１細胞が上記隔膜を通過して上記第１容器から上記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、上記第１細胞の浸潤性を評価する工程である。以下、本工程については図２を参照することにより具体的に説明する。図２は、図１に示した組立体を用いて行う細胞浸潤性評価方法の一例を説明する説明図であって、（ａ）は、第１細胞および細胞凝集体中の第２細胞の共培養が進行中の組立体を示す説明図であり、（ｂ）は、共培養を終了した時点の組立体を示す説明図であり、（ｃ）は、（ｂ）に示す組立体から第１容器を除去した第２容器を示す説明図である。

まず上述した第４工程において、図２（ａ）に示すように隔膜３を介して連結された第１容器１１および第２容器１２に共通する培養液Ｍを用いて所定時間（たとえば２４時間）共培養されることにより、第１細胞２１および第１細胞凝集体Ａ中の第２細胞２２が相互作用する。次いで第１細胞２１が浸潤性を有していた場合、上記共培養のための所定時間（たとえば２４時間）が経過した時点で、図２（ｂ）に示すように第１細胞２１の一部または全部は、隔膜３において被膜（図示省略）を破壊し、かつ基材３１中のポアを通過することによって第１容器１１から第２容器１２に移動することとなる。

この場合において第５工程では、図２（ｃ）に示すように組立体から第１容器１１を除去することにより、自身の浸潤性によって第１容器から移動してきた第１細胞のみを第２容器１２に収容することができる。次いで第１細胞の浸潤率（％）として、第１容器１１に収容（播種）した第１細胞２１の細胞数に対する、第１容器１１から隔膜３を通過することによって第２容器１２に収容された第１細胞２１の細胞数の割合を求めることができる。さらに上記第１細胞の浸潤率（％）の値が高いほど、第１細胞２１は浸潤性が強いと評価することができる。

第１容器１１から隔膜３を通過することによって第２容器１２に移動した第１細胞２１の細胞数は、第２容器１２に対して比色定量法などを実行することにより求めることができる。具体的には、トリパンブルー染色された細胞を目視で計測することにより求めることができる。以上により、第１細胞２１が隔膜３を通過するか否かを指標とすることにより、第１細胞２１の浸潤性の強さを評価することができる。

ここで本工程に関し、細胞凝集体が第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含む図３に示すような組立体の態様である場合を説明する。この場合であっても、細胞凝集体として第１細胞凝集体Ａのみを収容した図１に示すような組立体の態様により実行する上述の第５工程と同じ要領により、第１細胞２１が隔膜３を通過するか否かを指標として第１細胞２１の浸潤性の強さを評価することができる。

〔抗浸潤性化合物スクリーニング方法〕
本実施形態に係る抗浸潤性化合物スクリーニング方法は、上記細胞浸潤性評価方法を用いることにより、化合物が抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングする抗浸潤性化合物スクリーニング方法である。すなわち抗浸潤性化合物スクリーニング方法は、上記第１細胞、上記第２細胞、上記第１容器、上記第２容器、上記隔膜、上記薬剤および上記架橋ゼラチン粉末を準備する工程（Ａ工程）と、上記第１細胞を上記第１容器に収容する工程（Ｂ工程）と、上記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、上記第２細胞および上記薬剤を含む細胞凝集体を上記第２容器に収容する工程（Ｃ工程）と、上記第１容器および上記第２容器を上記隔膜を介して連結することにより、上記第１細胞および上記細胞凝集体中の上記第２細胞を共培養する工程（Ｄ工程）と、上記第１細胞が上記隔膜を通過して上記第１容器から上記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、上記第１細胞の浸潤性を評価する（Ｅ工程）工程と、上記第１容器または上記第２容器に上記化合物を添加する工程（Ｘ工程）とを含む。特に抗浸潤性化合物スクリーニング方法は、上記化合物を添加する工程（Ｘ工程）を実行した後に、上記第１細胞の浸潤性を評価する工程（Ｅ工程）を実行することによって、上記化合物が抗浸潤作用を有するか否かを評価することができる。

上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法によれば、上記化合物が上記第１細胞の浸潤性を減弱させるかどうかを評価することにより、上記化合物が抗浸潤作用を有するか否かを確認することができる。これにより化合物の相違に基づく第１細胞の浸潤性の増強または減弱を評価することができ、もって化合物が抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングすることができる。したがって、たとえば上記第１細胞ががん細胞であって、上記第２細胞が上記がん細胞と相互作用する間質細胞である場合、上記化合物は、抗がん剤候補化合物であることが好ましい。この場合、第１細胞（がん細胞）に対して抗がん剤候補化合物が、抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングすることが可能となる。

ここで抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングする「化合物」は、無機化合物、有機合成反応によって製造可能な化合物（有機化合物）、天然物などから抽出される化合物（天然物由来有機化合物）、およびこれらの組合せなどである。さらに、分子量が５００Ｄａ未満の無機化合物または合成低分子製剤、分子量が５００〜５０００Ｄａ程度の無機化合物、核酸製剤またはペプチド製剤、分子量が数万Ｄａ以上のタンパク質製剤を、いずれも抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングする「化合物」に含むことができる。換言すれば、抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングする「化合物」は、所謂リード化合物、および上記リード化合物が有する官能基に対して化学反応を起こすことにより形成される誘導体を含むことができる。

本実施形態に係る抗浸潤性化合物スクリーニング方法は、上述のように上記細胞浸潤性評価方法における第１工程〜第５工程に相当するＡ工程〜Ｅ工程、およびＸ工程を含む。以下、各工程（Ａ工程〜Ｅ工程およびＸ工程）について説明する。

＜Ａ工程〜Ｄ工程＞
Ａ工程、Ｂ工程、Ｃ工程およびＤ工程は、それぞれ上述した〔細胞浸潤性評価方法〕における＜第１工程＞、＜第２工程＞、＜第３工程＞および＜第４工程＞と同じ工程である。したがって、上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法におけるＡ工程〜Ｄ工程の説明については、上述した細胞浸潤性評価方法における第１工程〜第４工程に関する説明と同じとなるので繰り返さない。

＜Ｘ工程＞
Ｘ工程は、上記第１容器または上記第２容器に上記化合物を添加する工程である。本工程は、上記Ｄ工程とともに実行される。本工程では、具体的には第１細胞および細胞凝集体中の第２細胞を共培養している第１容器または第２容器の培養液中に、上記化合物を添加する。第１容器および第２容器においては、第１細胞および細胞凝集体中の第２細胞が共培養されているため、上記化合物は、上記第１容器および第２容器のいずれか一方のみに添加すればよい。

上記第１容器または上記第２容器に添加する上記化合物の濃度は、添加する化合物によって異なるが、第１容器または第２容器の培養液中でおおむね０．０１〜１０質量％濃度とすることができる。さらに上記化合物を上記第１容器または第２容器に添加する方法としては、化合物を水などの適宜の溶媒に溶解することによって溶液とし、当該溶液をスポイト、ピペットおよび注射器などの適宜の器具を用いて添加する方法を例示することができる。

＜Ｅ工程＞
Ｅ工程は、上記Ｘ工程を実行した後に、上述した〔細胞浸潤性評価方法〕における＜第５工程＞を実行することにより、第１細胞の浸潤性を評価する工程である。本工程における第１細胞の浸潤性を評価する具体的な方法については、上述した細胞浸潤性評価方法における第５工程と同じである。これにより第１細胞の浸潤率（％）として、第１容器に収容（播種）した第１細胞の細胞数に対する、第１容器から隔膜を通過することによって第２容器に収容された第１細胞の細胞数の割合を求めることができ、もってＸ工程において添加した化合物が、第１細胞の浸潤性を減弱させるかどうかを評価することができる。すなわち複数の化合物ごとに上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法を実行することによって、化合物の相違に基づく第１細胞の浸潤性の増強または減弱を評価することができ、もって上記化合物が抗浸潤作用を有するか否かをスクリーニングすることができる。

ここでＥ工程に関しては、細胞凝集体が第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含む図３に示すような組立体の態様である場合も、上述した細胞浸潤性評価方法における第５工程と同じ要領により、第１細胞の浸潤率（％）を求めることができる。これにより上記図３に示すような組立体の態様である場合も、Ｘ工程において添加した化合物が、第１細胞の浸潤性を減弱させるかどうかを評価することができる。

〔架橋ゼラチン粉末〕
本実施形態に係る架橋ゼラチン粉末は、上記細胞浸潤性評価方法、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法に用いられる架橋ゼラチン粉末である。上記架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、上記ゼラチンハイドロゲルを形成する。上記架橋ゼラチン粉末は、上述した〔細胞浸潤性評価方法〕における＜第１工程＞の項目で説明した「架橋ゼラチン粉末」と同一である。したがって、上記架橋ゼラチン粉末の具体的な説明については、上述した第１工程における架橋ゼラチン粉末と同じとなるので繰り返さない。

ここで上記架橋ゼラチン粉末は、架橋剤等によって架橋処理されているため、上述のように水と接触した場合、水に対して不溶性の三次元の網目構造を有し、内部に水を含んで膨潤した状態を呈する。これにより平均粒径が１０〜２００μｍの粒子状の形状を有するゼラチンハイドロゲルを形成することができる。上記架橋ゼラチン粉末からゼラチンハイドロゲルを形成する方法等の説明については、上述した〔細胞浸潤性評価方法〕における＜第３工程＞の項目において説明した「ゼラチンハイドロゲル」の形成方法と同一となるので繰り返さない。さらに上記ゼラチンハイドロゲルと第２細胞と薬剤とから細胞凝集体を形成する方法の説明についても、上述した〔細胞浸潤性評価方法〕における＜第３工程＞の項目において説明した細胞凝集体の形成方法と同一となるので繰り返さない。

〔評価キット〕
本実施形態に係る評価キットは、上記細胞浸潤性評価方法、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法に用いられる評価キットである。上記評価キットは、上記第１容器と、上記第２容器と、上記隔膜と、上記薬剤と、上記架橋ゼラチン粉末とを少なくとも備える。上記評価キットは、上記第１細胞および上記第２細胞のいずれか一方を少なくとも備えることが好ましい。

このような特徴を備える評価キットは、たとえば第１細胞としてがん細胞を適用し、第２細胞として上記がん細胞と相互作用する間質細胞を適用した場合、第１細胞としてのがん細胞の浸潤性の強さを正確に評価するキットとして提供することができる。すなわち本実施形態に係る評価キットは、第１細胞として所望の細胞を準備することにより、当該第１細胞の浸潤性の強さを評価することが可能となる。

ここで上記評価キットに備えることができる「第１容器」、「第２容器」、「薬剤」、「隔膜」、「架橋ゼラチン粉末」、「第１細胞」および「第２細胞」は、それぞれ上述した〔細胞浸潤性評価方法〕における＜第１工程＞の項目で説明した「第１容器」、「第２容器」、「薬剤」、「隔膜」、「架橋ゼラチン粉末」、「第１細胞」および「第２細胞」と同一である。したがって、これら用語の具体的な説明については、上述した〔細胞浸潤性評価方法〕の第１工程における各用語に関する説明と同じとなるので繰り返さない。

上記評価キットは、これに備わる「第１容器」、「第２容器」、「薬剤」、「隔膜」、「架橋ゼラチン粉末」、「第１細胞」および「第２細胞」を用いて図１に示すような組立体を準備することにより、上述した細胞浸潤性評価方法、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法に適用することができる。上記組立体を用いた細胞浸潤性評価方法、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法の説明については、上述した〔細胞浸潤性評価方法〕および〔抗浸潤性化合物スクリーニング方法〕の項目における各種の説明と同じとなるので繰り返さない。

上記評価キットにおいて上記架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、ゼラチンハイドロゲルを形成する。上記ゼラチンハイドロゲルは、粒子状であって、平均粒径が１０〜２００μｍであることが好ましい。すなわち上記評価キットにおいて架橋ゼラチン粉末は、水と接触させることにより、内部に水を含んで平均粒径が１０〜２００μｍの粒子状の形状を有するゼラチンハイドロゲルの態様とし、この態様により上述した細胞浸潤性評価方法における第３工程、あるいは上記抗浸潤性化合物スクリーニング方法におけるＣ工程に適用することができる。

以下、いくつかの実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
本実施例では、上述した評価キットを用いた細胞浸潤性評価方法を実行することにより、後述する第１細胞（小細胞肺がん細胞株）の浸潤性を評価する浸潤性評価試験を行った。さらに上記浸潤性評価試験では併せて、抗浸潤作用を有するか否かを評価する化合物としてマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（ＭＭＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、商品名：「マリマスタット」、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製。以下、「ＭＭＰｉ」とも記す）を用いることにより、上述した評価キットを用いた抗浸潤性化合物スクリーニング方法を実行した。これにより上記化合物（ＭＭＰｉ）が第１細胞に対して抗浸潤作用を有するか否かについても評価した。なお上記ＭＭＰｉは、後述する小細胞肺がん細胞株に対し、抗浸潤作用を有することが既知の化合物である。

＜試料１〜試料３＞
（第１工程（Ａ工程））
「第１細胞」、「第２細胞」、「第１容器」、「第２容器」、「隔膜」、「薬剤」および「架橋ゼラチン粉末」を以下のとおり準備した。本実施例ではＥ工程（第５工程）において、上述のように抗浸潤作用を有するか否かを評価する化合物を添加する場合、および第１細胞の浸潤性を評価する場合（上記化合物を添加しない場合）の２通りにおいて浸潤性評価試験を行う。このため「第１容器」、「第２容器」および「隔膜」については２つずつ準備し、「第１細胞」、「第２細胞」、「架橋ゼラチン粉末」および「薬剤」については必要量準備した。

第１容器、第２容器および隔膜として、市販の細胞培養プレート（商品名：「ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（ＴＭ) ９６−ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ（ｂ
ａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｆｏｒｍａｔ）」、Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂ．ｉｎｃ製）を入手することにより準備した。上記細胞培養プレートにおいて隔膜は、第１容器の底部に備えられている。また隔膜は、ポア径８μｍのポリカーボネートからなる基材と、この基材上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む被膜とを含む。

第１細胞として、小細胞肺がん細胞株（細胞名：「ＷＡ−ｈＴ」、独立行政法人理化学研究所製）を入手することにより準備した。さらに第２細胞として、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ、細胞名：「ヒト肺癌間質線維芽細胞」、コスモ・バイオ株式会社製）を入手することにより準備した。

薬剤として、ｐ５３阻害剤（商品名：「ピスフィリン−α」、富士フィルム和光純薬株式会社製）を入手することにより準備した。

豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ−Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）を入手するとともに、上記豚皮由来アルカリ処理ゼラチンに対し、上述したグルタルアルデヒドを用いた方法によって架橋処理を行うことにより架橋ゼラチン粉末を準備した。以上により、第１細胞、第２細胞、第１容器、第２容器、隔膜、薬剤および架橋ゼラチン粉末を準備した。

（第２工程（Ｂ工程））
上述した培養液を添加した第１容器に対し、上記第１細胞を５００００個播種することにより収容した。

（第３工程（Ｃ工程））
上述した方法により、上記架橋ゼラチン粉末２ｍｇと水２０μＬとを接触させることによりゼラチンハイドロゲル（平均粒径１００μｍ、含水率８８％）を形成した。さらに２００００個の上記ゼラチンハイドロゲル、２０００００個の上記第２細胞、および上記薬剤（５００μｇ／ｍＬ濃度）を用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって細胞凝集体（第１細胞凝集体）（１０００個）を形成した。この細胞凝集体（第１細胞凝集体）（１０００個）を、上述した培養液を添加した第２容器に収容した。第３工程においては、上記第１細胞凝集体をさらに複数個作製した上で１０日間培養し、この第１細胞凝集体に対して上述したＥＬＩＳＡ法を適用することにより、ｐ５３阻害剤がＣＡＦを活性化することも確認した。

（第４工程（Ｄ工程））
上述した第１細胞を収容した第１容器、および第２細胞を含む細胞凝集体（第１細胞凝集体）を収容した第２容器を隔膜を介して連結することにより図１および図２（ａ）に示す組立体を構築した。さらに上述した共培養条件により上記組立体中の第１細胞２１および第２細胞２２を２４時間、共培養した。

（Ｘ工程）
ここで試料１〜試料３に対し、試料ごとに組立体が２つずつ構築されている。このため第４工程（Ｄ工程）を実行するとともに、各試料において一方の組立体における第２容器１２の培養液中へ、注射器を用いて培養液中の最終濃度が７．５μＭとなる量の上記化合物を添加した。一方、他方の組立体における第２容器１２の培養液中へは、上記化合物を添加しなかった。

（第５工程（Ｅ工程））
図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すように上記共培養のための２４時間が経過した時点で、上記化合物を添加した組立体および上記化合物を添加しなかった組立体からそれぞれ第１容器１１を除去した。次いで、第１容器１１に収容（播種）した第１細胞２１の細胞数に対する、隔膜３を通過することによって第１容器１１から第２容器１２に移動した第１細胞２１の細胞数の割合を、第１細胞の浸潤率（％）として求めた。評価結果を表１に示す。表１においては、上記化合物を添加しなかった組立体における隔膜を通過した第１細胞の数および浸潤率（％）を「ＭＭＰｉ（−）」を表記した欄に示した。上記化合物を添加した組立体における隔膜を通過した第１細胞の数および浸潤率（％）を「ＭＭＰｉ（＋）」を表記した欄に示した。さらに試料１〜試料３の平均値も示した。試料１〜試料３は、実施例である。

＜試料１１〜試料１３＞
第３工程（Ｃ工程）において細胞凝集体（第１細胞凝集体）を形成することなく、第２細胞のみを第２容器に収容したこと以外、試料１〜試料３と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表１に示す。試料１１〜試料１３は、比較例である。

＜試料１４〜試料１６＞
第３工程（Ｃ工程）において、上記薬剤を用いることなく、第２細胞およびゼラチンハイドロゲルのみから細胞凝集体を形成したこと以外、試料１〜試料３と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表１に示す。試料１４〜試料１６は、比較例である。

ここで本浸潤性評価試験では、第１細胞として小細胞肺がん細胞株を用い、第２細胞としてＣＡＦを用いた。上記小細胞肺がん細胞株と上記ＣＡＦとは、生体内において相互作用することが既知である。さらに第１細胞に対し抗浸潤性を有するか否かを評価する化合物としては、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（ＭＭＰｉ）を用いた。上記ＭＭＰｉは、上記のとおり小細胞肺がん細胞株に対して抗浸潤性を有することが既知である。また薬剤としてはｐ５３阻害剤を用いた。このｐ５３阻害剤に対しては、上述の方法を用いることにより上記ＣＡＦを活性化させることを確認した。したがって、本浸潤性評価試験において生体内の実環境を再現できている場合、ＭＭＰｉを添加しなかった組立体においては、小細胞肺がん細胞株とＣＡＦとが相互作用することにより、小細胞肺がん細胞株の浸潤性が増強され、かつ小細胞肺がん細胞株の浸潤性が阻害されない。このため、小細胞肺がん細胞株が有する浸潤性によって「第１細胞の浸潤率（％）」が高くなると考えられる（表１の「ＭＭＰｉ（−）」の欄参照）。

さらに、本浸潤性評価試験において生体内の実環境を再現できている場合、ＭＭＰｉを添加した組立体においては、小細胞肺がん細胞株とＣＡＦとが相互作用することにより、小細胞肺がん細胞株の浸潤性が増強されるものの、小細胞肺がん細胞株の浸潤性がＭＭＰｉによって阻害される。このため上記第１細胞の浸潤率（％）は、ＭＭＰｉを添加しなかった場合に比べて低くなると考えられる（表１の「ＭＭＰｉ（＋）」の欄参照）。

一方、本浸潤性評価試験において生体内の実環境を再現できていない場合、小細胞肺がん細胞株とＣＡＦとが十分に相互作用することができず、小細胞肺がん細胞株の浸潤性が増強されない。このためＭＭＰｉを添加した組立体、ＭＭＰｉを添加しなかった組立体の両者において、「第１細胞の浸潤率（％）」は低くなると考えられる（表１の「ＭＭＰｉ（−）」および「ＭＭＰｉ（＋）」の欄参照）。

〔考察〕
表１によれば、以下のことが推察される。
（１） 試料１１〜試料１３は、ＭＭＰｉ（＋）およびＭＭＰｉ（−）の欄に示した結果において第１細胞の浸潤率（％）が低く、生体内の実環境を再現できていないことが示唆された。その原因は、第２細胞が細胞凝集体を形成しておらず、第２細胞が共培養中にダメージを受け、その一部または全部が細胞死したためであると推察された。
（２） 試料１４〜試料１６も、ＭＭＰｉ（＋）およびＭＭＰｉ（−）の欄に示した結果において第１細胞の浸潤率（％）が低く、生体内の実環境を再現できていないことが示唆された。その原因は、細胞凝集体中のゼラチンハイドロゲルによって第２細胞の生存は維持されるが、第２細胞の活性が薬剤によって高まらないため、液性因子を通じて第１細胞と相互作用することが不十分であったためであると推察された。
（３） 試料１〜試料３は、ＭＭＰｉ（−）の欄に示した結果において第１細胞の浸潤率（％）が高く、ＭＭＰｉ（＋）の欄に示した結果において第１細胞の浸潤率（％）が低くなり、生体内の実環境を忠実に再現できることが示唆された。
（４） 試料１〜試料３と試料１１〜試料１６との対比から、細胞凝集体（第１細胞凝集体）中に薬剤（ｐ５３阻害剤）が含まれることにより、第２細胞であるＣＡＦは、上記薬剤の作用によって活性化され、もって第１細胞である小細胞肺がん細胞株と相互作用することが可能となることが推察された。

〔実施例２〕
本実施例では、上述した評価キットを用いた細胞浸潤性評価方法を実行することにより、後述する第１細胞（肝がん細胞株：ＨｅｐＧ２）の浸潤性を評価する浸潤性評価試験を行った。さらに後述する第１細胞凝集体および第２細胞凝集体に関し、上記評価キット中の組立体（第２容器）に収容する第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率を変えることにより、第１細胞（肝がん細胞株：ＨｅｐＧ２）の浸潤性が変化するか否かについても評価した。なお、以下の試料２１〜試料２５は、いずれも実施例である。

＜試料２１＞
（第１工程）
「第１細胞」、「第２細胞」、「第１容器」、「第２容器」、「隔膜」、「薬剤」および「架橋ゼラチン粉末」を以下のとおり準備した。本実施例では「第１容器」、「第２容器」および「隔膜」についてはそれぞれ１つ準備し、「第１細胞」、「第２細胞」、「架橋ゼラチン粉末」および「薬剤」については必要量準備した。

第１容器、第２容器および隔膜として、上記〔実施例１〕と同じ市販の細胞培養プレートを準備した。

第１細胞として、肝がん細胞株（細胞名：「ＨｅｐＧ２」、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ製）を入手することにより準備した。第２細胞として、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ、細胞名：「ヒト肺癌間質線維芽細胞」、コスモ・バイオ株式会社製）を入手することにより準備した。さらに他の第２細胞として、ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ（ＴＡＭ、細胞名：「ヒト単球由来細胞株（ＴＨＰ−１）由来」、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ製）を入手することにより準備した。

薬剤として、ＴＧＦ−β１（商品名：「Recombinant human ＴＧＦ−β１」、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ株式会社製）を入手することにより準備した。さらに他の薬剤として、アデノシン（商品名：「アデノシン」、富士フィルム和光純薬株式会社製）を入手することにより準備した。

架橋ゼラチン粉末については、上記〔実施例１〕と同じように、豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ−Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）から調製することにより準備した。

（第２工程）
上記〔実施例１〕と同じように、上述した培養液を添加した第１容器に対し、上記第１細胞を５００００個播種することにより収容した。

（第３工程）
上記〔実施例１〕と同じように、上記架橋ゼラチン粉末２ｍｇと水２０μＬとを接触させることによりゼラチンハイドロゲル（平均粒径１００μｍ、含水率８８％）を形成した。さらに２００００個のゼラチンハイドロゲル、２０００００個のＴＡＭ（第２細胞）、およびアデノシン（５μＭ濃度）を用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（１０００個）を形成した。この第２細胞凝集体（１０００個）を、上述した培養液を添加した第２容器に収容した。なお試料２１においては、ゼラチンハイドロゲル、ＣＡＦ（第２細胞）およびＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）から第１細胞凝集体を形成しなかった。さらに第３工程においては、第２細胞凝集体をさらに複数個作製した上で１０日間培養し、上記第２細胞凝集体に対し上述したＥＬＩＳＡ法を適用することにより、アデノシンがＴＡＭを活性化することも確認した。

（第４工程）
上記〔実施例１〕と同じ要領により、第１細胞を収容した第１容器、および第２細胞を含む第２細胞凝集体を収容した第２容器を隔膜を介して連結することによって組立体を構築した。さらに上述した共培養条件により上記組立体中の第１細胞および第２細胞凝集体中の第２細胞を２４時間、共培養した。

（第５工程）
上記共培養のための２４時間が経過した時点で、組立体から第１容器を除去した。次いで、第１容器に収容（播種）した第１細胞の細胞数に対する、隔膜を通過することによって第１容器から第２容器に移動した第１細胞の細胞数の割合を、第１細胞の浸潤率（％）として求めた。さらに第２容器の培養液を抽出し、当該培養液中のマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）量を第１細胞が産生したＭＭＰ２産生量（単位は、ｎｇ）として定量することにより、第１細胞が浸潤性を有していることを生化学的に確認した。評価結果を表２に示す。表２中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料２１に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料２２＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを５０００個と、１５０００個とに配分した。次いで５０００個のゼラチンハイドロゲルと、５００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（２５０個）を形成した。さらに１５０００個のゼラチンハイドロゲルと、１５００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（７５０個）を形成した。さらに第３工程においては、第１細胞凝集体をさらに複数個作製した上で１０日間培養し、この第１細胞凝集体に対して上述したＥＬＩＳＡ法を適用することにより、ＴＧＦ−β１がＣＡＦを活性化することも確認した。それ以外については、試料２１と同じ要領により、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表２に示す。表２中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料２２に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料２３＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを１００００個と、１００００個とに配分した。次いで１００００個のゼラチンハイドロゲルと、１０００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（５００個）を形成した。さらに１００００個のゼラチンハイドロゲルと、１０００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（５００個）を形成した。それ以外については、試料２１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表２に示す。表２中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料２３に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料２４＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを５０００個と、１５０００個とに配分した。次いで１５０００個のゼラチンハイドロゲルと、１５００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（７５０個）を形成した。さらに５０００個のゼラチンハイドロゲルと、５００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（２５０個）を形成した。それ以外については、試料２１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表２に示す。表２中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料２４に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料２５＞
第３工程において、２００００個の上記ゼラチンハイドロゲルと、２０００００個の上記ＣＡＦ（第２細胞）と、上記ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（１０００個）を形成した。なお試料２５においては、上記ゼラチンハイドロゲル、ＴＡＭ（第２細胞）およびアデノシン（５μＭ濃度）から第２細胞凝集体を形成しなかった。それ以外については、試料２１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表２に示す。表２中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料２５に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

ここで本浸潤性評価試験では、第１細胞として肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を用い、第２細胞としてＣＡＦおよびＴＡＭを用いた。肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２）とＣＡＦおよびＴＡＭとは、生体内において相互作用することが既知である。また薬剤としてはＴＧＦ−β１およびアデノシンを用いた。ＴＧＦ−β１に対しては、上述の方法を用いることによりＣＡＦを活性化させることを確認した。アデノシンに対しては、上述の方法を用いることによりＴＡＭを活性化させることを確認した。したがって、本浸潤性評価試験において生体内の実環境を再現できている場合、肝がん細胞株とＣＡＦおよびＴＡＭとが相互作用し、第１細胞の浸潤率（％）が高い数値で示されることにより、肝がん細胞株の浸潤性が認められるようになると考えられる。第１細胞の浸潤率（％）が１０％以上である場合、肝がん細胞株が浸潤性を有すると評価することができる。さらに第１細胞の浸潤率（％）が１５％以上である場合、肝がん細胞株が好ましい浸潤性を有すると評価することができる。

さらに、肝がん細胞株を活性化するために最適なＣＡＦの量と、肝がん細胞株を活性化するために最適なＴＡＭの量とは異なると推定される。この推定に基づき、組立体（第２容器）に収容するＣＡＦおよびＴＡＭの比率（第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率）を変化させて本浸潤性評価試験を実行することにより、本評価キットを用いた肝がん細胞株の浸潤性評価方法に最適なＣＡＦおよびＴＡＭの比率を見出すことができる可能性がある。

〔考察〕
表２によれば、以下のことが推察される。
（１） 試料２１〜試料２５は、第１細胞の浸潤率（％）が１０％以上と高く、もって生体内の実環境を忠実に再現できることが示唆された。
（２） 特に試料２２と、試料２１および試料２３〜２５との対比から、ＴＡＭ：ＣＡＦが３：１の比率で組立体（第２容器）に収容された場合に、第１細胞の浸潤率（％）が２１％以上となり、より高くなることが示された。このことから肝がん細胞株に対して細胞浸潤性評価方法を実行する場合、ＴＡＭ：ＣＡＦの比率を３：１とすることが好ましいことが示唆された。

〔実施例３〕
本実施例では、上述した評価キットを用いた細胞浸潤性評価方法を実行することにより、後述する第１細胞（乳がん細胞株：ＭＣＦ−７）の浸潤性を評価する浸潤性評価試験を行った。さらに後述する第１細胞凝集体および第２細胞凝集体に関し、上記評価キット中の組立体（第２容器）に収容する第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率を変えることにより、第１細胞（乳がん細胞株：ＭＣＦ−７）の浸潤性が変化するか否かについても評価した。なお、以下の試料３１〜試料３５は、いずれも実施例である。

＜試料３１＞
（第１工程）
「第１細胞」、「第２細胞」、「第１容器」、「第２容器」、「隔膜」、「薬剤」および「架橋ゼラチン粉末」を以下のとおり準備した。本実施例では「第１容器」、「第２容器」および「隔膜」についてはそれぞれ１つ準備し、「第１細胞」、「第２細胞」、「架橋ゼラチン粉末」および「薬剤」については必要量準備した。

第１容器、第２容器および隔膜として、上記〔実施例１〕と同じ市販の細胞培養プレートを準備した。

第１細胞として、乳がん細胞株（細胞名：「ＭＣＦ−７」、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ製）を入手することにより準備した。第２細胞として、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ、細胞名：「ヒト肺癌間質線維芽細胞」、コスモ・バイオ株式会社製）を入手することにより準備した。さらに他の第２細胞として、ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ（ＴＡＭ、細胞名：「ヒト単球由来細胞株（ＴＨＰ−１）由来」、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ製）を入手することにより準備した。

薬剤としては、上記〔実施例２〕と同じように、ＴＧＦ−β１（商品名：「Recombinant human ＴＧＦ−β１」、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ株式会社製）およびアデノシン（商品名：「アデノシン」、富士フィルム和光純薬株式会社製）を入手することにより準備した。

架橋ゼラチン粉末については、上記〔実施例１〕と同じように、豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ−Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）から調製することにより準備した。

（第２工程）
上記〔実施例１〕と同じように、上述した培養液を添加した第１容器に対し、上記第１細胞を５００００個播種することにより収容した。

（第３工程）
上記〔実施例１〕と同じように、上記架橋ゼラチン粉末２ｍｇと水２０μＬとを接触させることによりゼラチンハイドロゲル（平均粒径１００μｍ、含水率８８％）を形成した。さらに２００００個のゼラチンハイドロゲル、２０００００個のＴＡＭ（第２細胞）、およびアデノシン（５μＭ濃度）を用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（１０００個）を形成した。この第２細胞凝集体（１０００個）を、上述した培養液を添加した第２容器に収容した。なお試料３１においては、ゼラチンハイドロゲル、ＣＡＦ（第２細胞）およびＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）から第１細胞凝集体を形成しなかった。

（第４工程）
上記〔実施例１〕と同じ要領により、第１細胞を収容した第１容器、および第２細胞を含む第２細胞凝集体を収容した第２容器を隔膜を介して連結することによって組立体を構築した。さらに上述した共培養条件により上記組立体中の第１細胞および第２細胞凝集体中の第２細胞を２４時間、共培養した。

（第５工程）
上記共培養のための２４時間が経過した時点で、組立体から第１容器を除去した。次いで、第１容器に収容（播種）した第１細胞の細胞数に対する、隔膜を通過することによって第１容器から第２容器に移動した第１細胞の細胞数の割合を、第１細胞の浸潤率（％）として求めた。さらに第２容器の培養液を抽出し、当該培養液中のマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）量を第１細胞が産生したＭＭＰ２産生量（単位は、ｎｇ）として定量することにより、第１細胞が浸潤性を有していることを生化学的に確認した。評価結果を表３に示す。表３中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料３１に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料３２＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを５０００個と、１５０００個とに配分した。次いで５０００個のゼラチンハイドロゲルと、５００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（２５０個）を形成した。さらに１５０００個のゼラチンハイドロゲルと、１５００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（７５０個）を形成した。それ以外については、試料３１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表３に示す。表３中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料３２に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料３３＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを１００００個と、１００００個とに配分した。次いで１００００個のゼラチンハイドロゲルと、１０００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（５００個）を形成した。さらに１００００個のゼラチンハイドロゲルと、１０００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（５００個）を形成した。それ以外については、試料３１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表３に示す。表３中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料３３に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料３４＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを５０００個と、１５０００個とに配分した。次いで１５０００個のゼラチンハイドロゲルと、１５００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（７５０個）を形成した。さらに５０００個のゼラチンハイドロゲルと、５００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（２５０個）を形成した。それ以外については、試料３１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表３に示す。表３中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料３４に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料３５＞
第３工程において、２００００個の上記ゼラチンハイドロゲルと、２０００００個の上記ＣＡＦ（第２細胞）と、上記ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（１０００個）を形成した。なお試料３５においては、上記ゼラチンハイドロゲル、ＴＡＭ（第２細胞）およびアデノシン（５μＭ濃度）から第２細胞凝集体を形成しなかった。それ以外については、試料３１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表３に示す。表３中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料３５に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

ここで本浸潤性評価試験では、第１細胞として乳がん細胞株（ＭＣＦ−７）を用い、第２細胞としてＣＡＦおよびＴＡＭを用いた。乳がん細胞株（ＭＣＦ−７）とＣＡＦおよびＴＡＭとは、生体内において相互作用することが既知である。また薬剤としてはＴＧＦ−β１およびアデノシンを用いた。上述のとおりＴＧＦ−β１は、ＣＡＦを活性化し、アデノシンは、ＴＡＭを活性化する。したがって、本浸潤性評価試験において生体内の実環境を再現できている場合、乳がん細胞株とＣＡＦおよびＴＡＭとが相互作用し、第１細胞の浸潤率（％）が高い数値で示されることにより、乳がん細胞株の浸潤性が認められるようになると考えられる。第１細胞の浸潤率（％）が９％以上である場合、乳がん細胞株が浸潤性を有すると評価することができる。さらに第１細胞の浸潤率（％）が１１％以上である場合、乳がん細胞株が好ましい浸潤性を有すると評価することができる。

さらに、乳がん細胞株を活性化するために最適なＣＡＦの量と、乳がん細胞株を活性化するために最適なＴＡＭの量とは異なると推定される。この推定に基づき、組立体（第２容器）に収容するＣＡＦおよびＴＡＭの比率（第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率）を変化させて本浸潤性評価試験を実行することにより、本評価キットを用いた乳がん細胞株の浸潤性評価方法に最適なＣＡＦおよびＴＡＭの比率を見出すことができる可能性がある。

〔考察〕
表３によれば、以下のことが推察される。
（１） 試料３１〜試料３５は、第１細胞の浸潤率（％）が９％以上と高く、もって生体内の実環境を忠実に再現できることが示唆された。
（２） 特に試料３３と、試料３１〜試料３２および試料３４〜３５との対比から、ＴＡＭ：ＣＡＦが２：２の比率で組立体（第２容器）に収容された場合に、第１細胞の浸潤率（％）が１６％以上となり、より高くなることが示された。このことから乳がん細胞株に対して細胞浸潤性評価方法を実行する場合、ＴＡＭ：ＣＡＦの比率を２：２とすることが好ましいことが示唆された。

〔実施例４〕
本実施例では、上述した評価キットを用いた細胞浸潤性評価方法を実行することにより、後述する第１細胞（肺がん細胞株：ＷＡ−ｈＴ）の浸潤性を評価する浸潤性評価試験を行った。さらに後述する第１細胞凝集体および第２細胞凝集体に関し、上記評価キット中の組立体（第２容器）に収容する第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率を変えることにより、第１細胞（肺がん細胞株：ＷＡ−ｈＴ）の浸潤性が変化するか否かについても評価した。なお、以下の試料４１〜試料４５は、いずれも実施例である。

＜試料４１＞
（第１工程）
「第１細胞」、「第２細胞」、「第１容器」、「第２容器」、「隔膜」、「薬剤」および「架橋ゼラチン粉末」を以下のとおり準備した。本実施例では「第１容器」、「第２容器」および「隔膜」についてはそれぞれ１つ準備し、「第１細胞」、「第２細胞」、「架橋ゼラチン粉末」および「薬剤」については必要量準備した。

第１容器、第２容器および隔膜として、上記〔実施例１〕と同じ市販の細胞培養プレートを準備した。

第１細胞として、小細胞肺がん細胞株（細胞名：「ＷＡ−ｈＴ」、独立行政法人理化学研究所製）を入手することにより準備した。第２細胞として、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ、細胞名：「ヒト肺癌間質線維芽細胞」、コスモ・バイオ株式会社製）を入手することにより準備した。さらに他の第２細胞として、ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ（ＴＡＭ、細胞名：「ヒト単球由来細胞株（ＴＨＰ−１）由来」、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ製）を入手することにより準備した。

薬剤としては、上記〔実施例２〕と同じように、ＴＧＦ−β１（商品名：「Recombinant human ＴＧＦ−β１」、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ株式会社製）およびアデノシン（商品名：「アデノシン」、富士フィルム和光純薬株式会社製）を入手することにより準備した。

架橋ゼラチン粉末については、上記〔実施例１〕と同じように、豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ−Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）から調製することにより準備した。

（第２工程）
上記〔実施例１〕と同じように、上述した培養液を添加した第１容器に対し、上記第１細胞を５００００個播種することにより収容した。

（第３工程）
上記〔実施例１〕と同じように上記架橋ゼラチン粉末２ｍｇと水２０μＬとを接触させることによりゼラチンハイドロゲル（平均粒径１００μｍ、含水率８８％）を形成した。さらに２００００個のゼラチンハイドロゲル、２０００００個のＴＡＭ（第２細胞）、およびアデノシン（５μＭ濃度）を用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（１０００個）を形成した。この第２細胞凝集体（１０００個）を、上述した培養液を添加した第２容器に収容した。なお試料４１においては、ゼラチンハイドロゲル、ＣＡＦ（第２細胞）およびＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）から第１細胞凝集体を形成しなかった。

（第４工程）
上記〔実施例１〕と同じ要領により、第１細胞を収容した第１容器、および第２細胞を含む第２細胞凝集体を収容した第２容器を隔膜を介して連結することによって組立体を構築した。さらに上述した共培養条件により上記組立体中の第１細胞および第２細胞凝集体中の第２細胞を２４時間、共培養した。

（第５工程）
上記共培養のための２４時間が経過した時点で、組立体から第１容器を除去した。次いで、第１容器に収容（播種）した第１細胞の細胞数に対する、隔膜を通過することによって第１容器から第２容器に移動した第１細胞の細胞数の割合を、第１細胞の浸潤率（％）として求めた。さらに第２容器の培養液を抽出し、当該培養液中のマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）量を第１細胞が産生したＭＭＰ２産生量（単位は、ｎｇ）として定量することにより、第１細胞が浸潤性を有していることを生化学的に確認した。評価結果を表４に示す。表４中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料４１に対し上記方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料４２＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを５０００個と、１５０００個とに配分した。次いで５０００個のゼラチンハイドロゲルと、５００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（２５０個）を形成した。さらに１５０００個のゼラチンハイドロゲルと、１５００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（７５０個）を形成した。それ以外については、試料４１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表４に示す。表４中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料４２に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料４３＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを１００００個と、１００００個とに配分した。次いで１００００個のゼラチンハイドロゲルと、１０００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（５００個）を形成した。さらに１００００個のゼラチンハイドロゲルと、１０００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（５００個）を形成した。それ以外については、試料４１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表４に示す。表４中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料４３に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料４４＞
第３工程において、まず２００００個のゼラチンハイドロゲルを５０００個と、１５０００個とに配分した。次いで１５０００個のゼラチンハイドロゲルと、１５００００個のＣＡＦ（第２細胞）と、ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（７５０個）を形成した。さらに５０００個のゼラチンハイドロゲルと、５００００個のＴＡＭ（第２細胞）と、アデノシン（５μＭ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第２細胞凝集体（２５０個）を形成した。それ以外については、試料４１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表４に示す。表４中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料４４に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

＜試料４５＞
第３工程において、２００００個の上記ゼラチンハイドロゲルと、２０００００個の上記ＣＡＦ（第２細胞）と、上記ＴＧＦ−β１（５０００μｇ／ｍＬ濃度）とを用い、公知のシャーレで３７℃、５体積％ＣＯ₂条件下で１０日間培養することによって第１細胞凝集体（１０００個）を形成した。なお試料４５においては、上記ゼラチンハイドロゲル、ＴＡＭ（第２細胞）およびアデノシン（５μＭ濃度）から第２細胞凝集体を形成しなかった。それ以外については、試料４１と同じとすることにより、浸潤性評価試験を実行した。評価結果を表４に示す。表４中に示す第１細胞の浸潤率（％）およびＭＭＰ２産生量の各値は、試料４５に対し上記評価方法を３回実行することにより得られた値の平均値である。

ここで本浸潤性評価試験では、第１細胞として小細胞肺がん細胞株（ＷＡ−ｈＴ）を用い、第２細胞としてＣＡＦおよびＴＡＭを用いた。小細胞肺がん細胞株（ＷＡ−ｈＴ）とＣＡＦおよびＴＡＭとは、生体内において相互作用することが既知である。また薬剤としてはＴＧＦ−β１およびアデノシンを用いた。上述のとおりＴＧＦ−β１は、ＣＡＦを活性化し、アデノシンは、ＴＡＭを活性化する。したがって、本浸潤性評価試験において生体内の実環境を再現できている場合、小細胞肺がん細胞株とＣＡＦおよびＴＡＭとが相互作用し、第１細胞の浸潤率（％）が高い数値で示されることにより、小細胞肺がん細胞株の浸潤性が認められるようになると考えられる。第１細胞の浸潤率（％）が８％以上である場合、小細胞肺がん細胞株が浸潤性を有すると評価することができる。さらに第１細胞の浸潤率（％）が１３％以上である場合、小細胞肺がん細胞株が好ましい浸潤性を有すると評価することができる。

さらに、小細胞肺がん細胞株を活性化するために最適なＣＡＦの量と、小細胞肺がん細胞株を活性化するために最適なＴＡＭの量とは異なると推定される。この推定に基づき、組立体（第２容器）に収容するＣＡＦおよびＴＡＭの比率（第１細胞凝集体および第２細胞凝集体の比率）を変化させて本浸潤性評価試験を実行することにより、本評価キットを用いた小細胞肺がん細胞株の浸潤性評価方法に最適なＣＡＦおよびＴＡＭの比率を見出すことができる可能性がある。

〔考察〕
表４によれば、以下のことが推察される。
（１） 試料４１〜試料４５は、第１細胞の浸潤率（％）が８％以上と高く、もって生体内の実環境を忠実に再現できることが示唆された。
（２） 特に試料４４および試料４５と、試料４１〜試料４３との対比から、ＴＡＭ：ＣＡＦが１：３および０：４の比率で組立体（第２容器）に収容された場合に、第１細胞の浸潤率（％）が１９％以上となり、より高くなることが示された。このことから小細胞肺がん細胞株に対して細胞浸潤性評価方法を実行する場合、ＴＡＭ：ＣＡＦの比率を１：３または０：４とすることが好ましいことが示唆された。

以上のように本発明の実施の形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施の形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。

今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

１１ 第１容器、１１ａ アダプター、１２ 第２容器、２１ 第１細胞、２２ 第２細胞、３ 隔膜、３１ 基材、４ 薬剤、５ ゼラチンハイドロゲル、Ａ 第１細胞凝集体、Ｂ 第２細胞凝集体、Ｍ 培養液。

Claims (18)

1. 細胞の浸潤性を評価する細胞浸潤性評価方法であって、
   第１細胞、第２細胞、第１容器、第２容器、隔膜、薬剤および架橋ゼラチン粉末を準備する工程と、
   前記第１細胞を前記第１容器に収容する工程と、
   前記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、前記第２細胞および前記薬剤を含む細胞凝集体を前記第２容器に収容する工程と、
   前記第１容器および前記第２容器を前記隔膜を介して連結することにより、前記第１細胞および前記細胞凝集体中の前記第２細胞を共培養する工程と、
   前記第１細胞が前記隔膜を通過して前記第１容器から前記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、前記第１細胞の浸潤性を評価する工程とを含み、
   前記第１細胞と前記第２細胞とは、相互作用し、
   前記薬剤は、前記第２細胞を活性化する作用を有する、細胞浸潤性評価方法。
2. 前記隔膜は、前記第１容器または前記第２容器に備えられ、
   前記隔膜は、基材と前記基材上に形成される被膜とを含み、
   前記被膜は、基底膜を構成する成分を含む、請求項１に記載の細胞浸潤性評価方法。
3. 前記基底膜を構成する成分は、ＩＶ型コラーゲンである、請求項２に記載の細胞浸潤性評価方法。
4. 前記第１細胞は、がん細胞である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
5. 前記第２細胞は、間質細胞である、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
6. 前記第２細胞は、がん関連線維芽細胞およびｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅの両方またはいずれか一方である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
7. 前記薬剤は、前記第１細胞から分泌される分子、前記分子の誘導体、前記分子の前駆体および前記分子の塩からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上を含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
8. 前記細胞凝集体は、前記第２細胞として前記がん関連線維芽細胞を含み、前記薬剤としてｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上を含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
9. 前記細胞凝集体は、前記第２細胞として前記ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅを含み、前記薬剤としてアデノシンおよびＩＬ−６からなる群より選ばれるいずれか１種または２種を含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
10. 前記ゼラチンハイドロゲルは、粒子状であって、平均粒径が１０〜２００μｍである、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
11. 前記細胞凝集体は、１種または２種以上含む、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
12. 前記細胞凝集体は、第１細胞凝集体および第２細胞凝集体を含み、
    前記第１細胞凝集体は、前記ゼラチンハイドロゲルと、前記がん関連線維芽細胞と、前記ｐ５３阻害剤、ＴＧＦ−β１、ＳＤＦ−１およびＰＧＥ２からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上とを含み、
    前記第２細胞凝集体は、前記ゼラチンハイドロゲルと、前記ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅと、前記アデノシンおよびＩＬ−６からなる群より選ばれるいずれか１種または２種とを含む、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法。
13. 請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法を用いることにより、化合物が抗浸潤作用を有するか否かを評価する抗浸潤性化合物スクリーニング方法であって、
    前記第１細胞、前記第２細胞、前記第１容器、前記第２容器、前記隔膜、前記薬剤および前記架橋ゼラチン粉末を準備する工程と、
    前記第１細胞を前記第１容器に収容する工程と、
    前記架橋ゼラチン粉末を用いて形成されるゼラチンハイドロゲル、前記第２細胞および前記薬剤を含む細胞凝集体を前記第２容器に収容する工程と、
    前記第１容器および前記第２容器を前記隔膜を介して連結することにより、前記第１細胞および前記細胞凝集体中の前記第２細胞を共培養する工程と、
    前記第１細胞が前記隔膜を通過して前記第１容器から前記第２容器へ移動するか否かを指標とすることにより、前記第１細胞の浸潤性を評価する工程と、
    前記第１容器または前記第２容器に前記化合物を添加する工程とを含み、
    前記化合物を添加する工程を実行した後に、前記第１細胞の浸潤性を評価する工程を実行することによって前記化合物が抗浸潤作用を有するか否かを評価する、抗浸潤性化合物スクリーニング方法。
14. 前記化合物は、抗がん剤候補化合物である、請求項１３に記載の抗浸潤性化合物スクリーニング方法。
15. 請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法、あるいは請求項１３または請求項１４に記載の抗浸潤性化合物スクリーニング方法に用いられる架橋ゼラチン粉末であって、
    前記架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、前記ゼラチンハイドロゲルを形成する、架橋ゼラチン粉末。
16. 請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の細胞浸潤性評価方法、あるいは請求項１３または請求項１４に記載の抗浸潤性化合物スクリーニング方法に用いられる評価キットであって、
    前記評価キットは、前記第１容器と、前記第２容器と、前記隔膜と、前記薬剤と、前記架橋ゼラチン粉末とを少なくとも備える、評価キット。
17. 前記評価キットは、前記第１細胞および前記第２細胞の少なくとも一方を備える、請求項１６に記載の評価キット。
18. 前記架橋ゼラチン粉末は、水と接触した場合、前記ゼラチンハイドロゲルを形成し、
    前記ゼラチンハイドロゲルは、粒子状であって、平均粒径が１０〜２００μｍである、請求項１６または請求項１７に記載の評価キット。
    

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