WO2024034919A1 - 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

알팔파 씨앗에서 추출된 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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polysaccharide
alfalfa
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김영화
신희정
김준오
김민기
방원정
전현준
전동원
김수연
김지영
주영협
이성현
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주식회사 신세계인터내셔날
주식회사 두래
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition containing polysaccharides extracted from alfalfa seeds as an active ingredient.
  • Skin has the function of protecting internal organs from changes in temperature and humidity, ultraviolet rays, and other physical and chemical stimuli from the external environment.
  • the skin is largely composed of three parts, the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue, and mainly serves as a barrier to protect the human body.
  • alfalfa is a perennial angiosperm belonging to the legume family and looks very similar to clover. It is an important fodder crop in many countries, including the United States, Canada, Argentina, France, Australia, the Middle East, and South Africa, and has been cultivated since the 4th century BC. It is mainly provided as a major protein source for livestock, but some is also used for medicinal purposes.
  • Alfalfa has the effect of lowering cholesterol and is rich in dietary fiber, so it absorbs putrefactive products such as carcinogens in the intestines and improves bowel movements, making it useful for improving constipation. It is known that because decaying substances are easily excreted, the burden on the liver is reduced and it is also effective in skin care.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-1757469 discloses a hair growth promoting and anti-inflammatory composition containing alfalfa extract
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-1721685 also discloses dandruff removal and hair loss prevention improvement and composition containing alfalfa extract.
  • a composition for promoting hair growth is disclosed.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition and a skin external application composition that simultaneously have skin barrier strengthening, skin whitening, skin anti-inflammatory and anti-aging effects using an active ingredient containing polysaccharides extracted from alfalfa.
  • the present inventors made efforts to find ingredients that can prevent skin aging and improve skin condition by protecting the skin from external harmful environments or stimulation.
  • polysaccharides extracted from alfalfa parts, especially seeds have a skin barrier strengthening effect
  • the present invention was completed after discovering that it had excellent whitening improvement, skin anti-inflammatory effect, and anti-aging effect.
  • the present invention can provide a cosmetic composition containing a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds as an active ingredient.
  • the polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds may be included in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition.
  • the polysaccharide shows a first peak at a retention time of 10 to 11 minutes and a second peak at 13 to 14 minutes in HPLC with a column flow rate of 1.0 mL/min and a mobile phase concentration of 18 mM NaOH. It may have a peak.
  • the height ratio of the first peak and the second peak may be 1.5:1 to 6:1.
  • the polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds includes the steps of (S10) adding an extraction solvent to pulverized alfalfa seeds to obtain an extract; (S20) filtering the extract to obtain a filtrate; (S30) adding alcohol to the filtrate to obtain a precipitate; and (S40) separating the precipitate and drying it to obtain a polysaccharide-containing extract; It may be manufactured by an extraction method including.
  • the step (S20) may include filtering using activated carbon.
  • the composition may be a cosmetic composition for strengthening the skin barrier.
  • the composition may have one or more skin improvement effects from the group consisting of anti-aging, anti-inflammatory, and whitening.
  • the cosmetic composition includes solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing products, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays. It may have a dosage form selected from the group consisting of.
  • the present invention can provide a composition for topical skin application containing a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds as an active ingredient.
  • the composition for topical skin application may be used to strengthen the skin barrier.
  • the present invention can provide a cosmetic composition and a skin external application composition containing polysaccharides extracted from alfalfa seeds.
  • the composition according to the present invention has the effect of strengthening the skin barrier by inducing differentiation of skin keratinocytes by polysaccharides extracted from alfalfa seeds, and has excellent skin whitening effects by suppressing melanin production.
  • Figure 1 is a graph showing the results showing that MMP-1 increased by UV decreases depending on the concentration of alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 shows the results showing the effect of inhibiting elastase activity depending on the concentration of alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 3 shows the results showing the NO production inhibition effect according to the concentration of the alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 4 shows the results showing the effect of inhibiting IL-8 production depending on the concentration of alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of keratinocyte formation according to the concentration of alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 6 is a result showing the effect of suppressing melanin production depending on the concentration of the alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 7 shows the HPLC results of alfalfa seed extract prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 8 shows the HPLC results of the alfalfa sprout extract prepared according to Comparative Example 1 of the present invention.
  • Figure 9 shows the HPLC results of the alfalfa stem extract prepared according to Comparative Example 2 of the present invention.
  • units used without special mention in the specification of the present invention are based on weight, and as an example, units of % or ratio mean weight % or weight ratio.
  • the expression “comprises” is an open description that has the same meaning as expressions such as “comprises,” “contains,” “has,” or “features,” and is not additionally listed. does not exclude elements, materials or processes that are not In addition, the expression “consisting substantially of" means that other elements, materials or processes not listed together with the specified element, material or process are inadmissible for at least one basic and novel technical idea of the invention. This means that it can be present in an amount that does not have a significant effect. Additionally, the expression “consists of” means that only the elements, materials, or processes described are present.
  • first, second, A, B (a), and (b) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, sequence, or order of the component is not limited by the term.
  • sample refers to an object for analysis and is used with the same meaning throughout the specification.
  • the cosmetic composition according to the present invention contains a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds as an active ingredient.
  • Alfalfa extract has been studied as an active ingredient in cosmetic compositions, and most studies have reported that extracts obtained from alfalfa sprouts have beneficial effects on skin improvement.
  • the present inventor tried to find ingredients that could prevent skin aging and improve skin condition by protecting the skin from external harmful environments or irritations, and as a result, polysaccharides extracted from alfalfa parts, especially seeds, had a skin barrier strengthening effect and skin whitening effect. It was found that it had a significant effect on skin improvement, anti-inflammatory effect, and anti-aging effect. Extracts extracted from alfalfa seeds have a different composition from the polysaccharides present in sprout extracts or stem extracts, and can provide significant skin improvement effects, especially in strengthening the skin barrier.
  • the cosmetic composition may include 0.0001 to 30% by weight of a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds, based on the total weight. Specifically, it may contain 0.0005 to 20% by weight, more specifically 0.001 to 10% by weight. When applying the cosmetic composition to the skin within the above range, it is preferable because it has good effects of strengthening the skin barrier, anti-aging, anti-inflammatory, and improving skin whitening.
  • the polysaccharide-containing extract includes (S10) adding an extraction solvent to pulverized alfalfa seeds to obtain an extract; (S20) filtering the extract to obtain a filtrate; (S30) adding alcohol to the filtrate to obtain a precipitate; and (S40) separating the precipitate and drying it to obtain a polysaccharide-containing extract.
  • the extract obtained in step (S10) may use purified water to extract the water-soluble active ingredient, and is preferably obtained through hot water extraction, but is not limited thereto.
  • Hot water extraction may be performed at a temperature of 40 to 80 °C, specifically 45 to 80 °C, and more specifically 50 to 70 °C. Additionally, the hot water extraction time may be 1 to 8 hours, specifically 1 to 6 hours, and more specifically 1 to 4 hours. The above temperature and time are most desirable for the high extraction yield and skin improvement effect.
  • step (S10) After the step of obtaining the extract (S10), filtration and ethanol precipitation reactions can be performed to separate only the polysaccharide.
  • step (S20) may include filtration using activated carbon.
  • the extract may be initially filtered through a filter cloth and then filtered using a filter paper with a pore size of 4 ⁇ m. Afterwards, additional filtration can be performed by adding activated carbon. Additionally, an additional filtration step of filtration using filter paper with a 0.5 ⁇ m pore size may be further included, but is not limited thereto.
  • the obtained filtrate can be treated with an organic solvent to precipitate the polysaccharide.
  • the organic solvent is preferably a lower alcohol.
  • the lower alcohol may be an alcohol with 5 or less carbon atoms such as methanol, ethanol, propanol, butanol, and pentanol, and most preferably, ethanol may be used.
  • a polysaccharide-containing extract in powder form from the precipitate obtained using the alcohol it can be dried with hot air at 50 to 75 ° C. for 24 to 48 hours. Specifically, it can be dried with hot air at 55 to 65°C for 28 to 36 hours. When drying with hot air within the above range, it is good to minimize the loss of active ingredients and prevent oxidation due to moisture.
  • the polysaccharide shows a first peak at a retention time of 10 to 11 minutes and a peak at 13 minutes to 13 minutes, according to HPLC analysis with a column flow rate of 1.0 mL/min and a mobile phase concentration of 18 mM NaOH. It can have a second peak at 14 minutes.
  • the first peak may be 50% or more, more specifically 60% or more, of the total peak area.
  • the second peak may be 20% or more, more specifically 30% or more, of the total peak area.
  • the areas of the first and second peaks may be 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more and less than 100% of the total peak area.
  • the height ratio of the first peak and the second peak is 1.5:1 to 6:1, 2:1 to 5.5:1, or 3:1 to 5:1. It is good to be able to provide a composition of polysaccharides that can achieve the skin improvement effect.
  • the molecular weight of the polysaccharide may be 200,000 to 600,000 g/mol, 350,000 to 500,000 g/mol, or 400,000 to 470,000 g/mol.
  • the cosmetic composition may be used to strengthen the skin barrier.
  • the skin barrier is the stratum corneum, which is the outermost layer of the skin, and serves to prevent skin damage from external harmful elements and to suppress moisture evaporation from the skin.
  • the polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds of the present invention has an excellent effect of strengthening the skin barrier by inducing the formation of skin keratinocytes, and the polysaccharide of the present invention can achieve the same skin barrier strengthening effect even when manufactured as a cosmetic composition. .
  • the cosmetic composition according to the present invention may be a cosmetic composition that has one or more skin improvement effects from the group consisting of anti-aging, anti-inflammatory, and whitening.
  • Skin aging can mean that the lipids, proteins, polysaccharides, and nucleic acids that make up the skin are oxidized, leading to the destruction of skin cells and tissues. Accordingly, “anti-aging” can mean suppressing the causes or factors that cause aging on the skin.
  • Anti-inflammatory can mean suppressing inflammation on the skin or relieving or improving inflammation that has already occurred.
  • Skin inflammation may refer to a skin disease or condition that may be caused by inflammation caused by excessive nitric oxide (NO) production in macrophages.
  • NO nitric oxide
  • Non-limiting examples of skin diseases or symptoms related to the inflammation include, but are not limited to, skin rash, acne, pimples, atopic dermatitis, psoriasis, erythematous disease, skin itching, seborrheic eczema, etc.
  • Skin whitening can include not only brightening skin tone by inhibiting the synthesis of melanin pigment, but also improving skin hyperpigmentation such as spots and freckles caused by ultraviolet rays, hormones, stress, or genetic factors.
  • the cosmetic composition may be a formulation selected from the group consisting of solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray. You can have it, but it is not limited to this.
  • the present invention can provide a composition for topical skin application containing a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds as an active ingredient.
  • composition for external application to the skin is not particularly limited in its formulation, and may be, for example, a composition for external application in the form of a body lotion, ointment, gel, cream, patch, or spray.
  • ingredients other than the polysaccharide extracted from the alfalfa seeds can be appropriately selected and mixed by a person skilled in the art depending on the dosage form or purpose of use of the other external preparation.
  • the composition for topical skin application may contain 0.0001 to 30% by weight of a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds, based on the total weight. More preferably, it may contain 0.0005 to 20% by weight, and most preferably 0.001 to 10% by weight.
  • a polysaccharide-containing extract extracted from alfalfa seeds More preferably, it may contain 0.0005 to 20% by weight, and most preferably 0.001 to 10% by weight.
  • a 70% ethanol aqueous solution equivalent to 20 times the mass of the dried alfalfa leaf was added to 200 g, extracted at room temperature for 3 days, and then filtered under reduced pressure.
  • the filtered extract was concentrated and dried using a rotary evaporator (Buchi, Switzerland) to finally prepare an alfalfa leaf extract.
  • An alfalfa stem extract was prepared in the same manner as in Comparative Example 1, except that dried alfalfa stems were used.
  • Alfalfa leaf extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1 kg of alfalfa leaf dried material was used.
  • Example 1 Comparative Example 1, and Comparative Example 2.
  • the polysaccharide contained in the alfalfa extract prepared according to Comparative Example 2 was subjected to acid hydrolysis after preparing a 0.2% (w/v) test solution using 2M trifluoroacetic acid. The final sample concentration was set to 2 mg/ml. After HPLC analysis according to the analysis equipment and conditions in Table 1 below, the results are shown in Tables 2 to 4 and Figures 7 to 9.
  • Table 6 shows alfalfa seed extract sample 1 of Example 1, alfalfa seed extract samples 2 to 4 (Examples 2 to 4) prepared according to the same method as Example 1, and Comparative Examples 1 to 3. As a result of HPLC analysis, the height ratio between main peaks is measured.
  • Peak number according to residence time Peak No. Residence time (min) One 4 ⁇ 5 2 7.0 ⁇ 7.5 3 7.7 ⁇ 8.3 4 10.0 ⁇ 11.0 5 11.1 ⁇ 12.0 6 12.2 ⁇ 13.4
  • the height ratio of the peak obtained from the alfalfa seed extract according to Examples 1 to 4 was 4 to 5 for H 4 /H 6 .
  • Comparative Examples 1 to 3 show a significant difference from Examples 1 to 4, and it can be confirmed that the peak characteristics are significantly different.
  • the peak height ratio of H 3 /H 4 was measured, it was in the range of 0.01 to 0.03 in the Examples, while the Comparative Example showed a value greater than 1, allowing for confirmation of the difference in peak characteristics.
  • H 5 /H 6 is in the range of 0.3 to 0.4 in the Examples, but in the Comparative Examples, it has a much larger value of 12 or more, confirming a significant difference in peak characteristics.
  • Matrix metalloprotease-1 is an enzyme that decomposes collagen present in the skin. When collagen is broken down by MMP-1, it causes wrinkles.
  • human skin fibroblasts Hs68
  • Hs68 human skin fibroblasts
  • EGCG Epigallocatechin gallate
  • RA Retinoic acid
  • Elastin is a component that makes up the matrix within the dermis of the skin. As the skin ages, elastin decomposes, the matrix within the dermis breaks down, and wrinkles form. Using this principle, the activity of elastase, an enzyme that decomposes elastin, was measured to evaluate whether it had the effect of suppressing and improving skin wrinkles.
  • the total volume of all tubes was adjusted to 750 ⁇ l using 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8), 50 ⁇ l of 4.4 mM SucAla3-pNA as a substrate solution was added, mixed gently, and placed in a water bath at 25°C for 3 minutes. After reaction, 75 ⁇ l of elastase (0.4 units/ml) was added to the control group and sample, and Example 1 was added to the sample only at concentrations of 50, 100, 200, and 400 ⁇ g/ml. Afterwards, the absorbance value was measured at 410 nm for 5 min, increasing once per min. Elastase inhibition activity (% Elastase inhibition activity) was calculated according to Equation 1 below.
  • Example 1 In order to confirm the anti-inflammatory effect of the composition prepared in Example 1, the NO production inhibition effect was measured using Raw 264.7 cells. As a positive control, 10 ⁇ m indomethacin (Indo) was used. Example 1 was prepared at concentrations of 50, 100, 200, and 400 ⁇ g/ml and treated with cells. After 30 minutes, 1 ⁇ g/ml LPS (Lipo -polysaccharide) and cultured for 24 hours, the ability to inhibit NO production was evaluated using a NO quantification kit (ThermoFisher scientific, Waltham, MA, USA).
  • a NO quantification kit ThermoFisher scientific, Waltham, MA, USA.
  • IL-8 (interlukin-8) is a factor that amplifies the inflammatory response. To determine whether the alfalfa seed extract according to Example 1 had an anti-inflammatory effect, the effect of inhibiting IL-8 production was evaluated.
  • Human fibroblast cells (PromoCell, Germany) were seeded in a 6-well culture plate at a density of 1 ⁇ 10 5 cells and cultured in a 5% CO2 incubator at 37°C for 24 hours. After 500 ⁇ m of hydrogen peroxide (H2O2) was applied to the wells and stimulated for 24 hours, the alfalfa seed extract prepared according to Example 1 was treated at different concentrations and reacted for 48 hours. After completion of the reaction, the culture medium was collected and ELISA analysis was performed. For IL-8, a kit from Endogen (MA, USA) was used, and the experiment was conducted according to the method specified in each company's manual. The inhibition effect was calculated according to Equation 2 below, and the measurement results are shown in FIG. 4.
  • H2O2 hydrogen peroxide
  • Example 1 As can be seen from the results, it was confirmed that the production of NO and IL-8, which cause inflammation, was significantly reduced by Example 1 according to the present invention, and the anti-inflammatory effect was significantly excellent.
  • HaCaT Keratinocytes
  • kojic acid known as a melanin production inhibitor
  • alpha-MSH as a melanin production stimulator
  • B16F10 (ATCC, CCL-6475) cells which are melanoma cells, were planted at 3x10 4 cells in each well of a 24-well plate, and the next day, melanin production was induced in each well with Alpha-melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH).
  • ⁇ -MSH Alpha-melanocyte stimulating hormone
  • 100 ⁇ g/ml of kojic acid as a positive control and Example 1 were added at concentrations of 25, 50, 100, and 200 ⁇ g/ml.
  • Example 1 inhibits melanin production as the concentration increases, and it can be seen that the melanin production inhibitory effect is significantly superior to the positive control at all concentrations.

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Abstract

본 발명은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 상기 다당체를 함유함으로써 엘라스타제의 생성을 억제하여 주름을 개선하고 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 각질 형성 세포 분화를 촉진하여 피부장벽을 강화하고 항염증 효과가 우수한 화장료 조성물 및 피부 외용제를 제공할 수 있다.

Description

알팔파 씨앗에서 추출된 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
본 발명은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 체내 기관을 기온 및 습도 변화, 자외선 및 기타 물리적, 화학적 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능이 있다. 피부는 크게 3가지 즉, 표피(epidermids), 진피(dermis) 및 피하조직(hgypodermis)으로 구성되어 있으며, 주로 인체를 보호하는 장벽 역할을 한다.
현대에 들어서 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부장벽 강화용 또는 피부 보습용 등의 피부개선용 조성물의 필요가 증가하고 있다.
한편, 알팔파(alfalfa)는 콩과에 속하는 여러해살이 속씨식물이며, 토끼풀과 매우 비슷하게 생겼다. 미국, 캐나다, 아르헨티나, 프랑스, 오스트레일리아, 중동, 남아프리카 등 많은 나라에서 중요한 여물 작물로서 기원전 4세기부터 경작해 왔다. 주로 가축의 주요 단백질 공급원으로서 제공되나, 일부는 약용으로 사용되고 있다.
알팔파는 콜레스테롤을 낮추는 작용이 있으며, 식이섬유가 많아 장의 발암물질 등 부패성 생성물을 흡수하고 배변을 좋게 하여 변비 개선에도 유용하다. 부패물질이 잘 배설되므로 간장의 부담이 줄고, 피부미용에도 효과가 있다고 알려져 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1757469호에는 알팔파 추출물을 포함하는 모발 성장 촉진용 및 항염증 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-1721685호에도 알팔파 추출물을 포함하는 비듬제거와 탈모방지 개선 및 모발성장 촉진을 위한 조성물에 대해서 개시되어 있다.
본 발명은 알팔파로부터 추출된 다당체를 함유하는 유효성분을 이용하여 피부장벽 강화, 피부 미백, 피부 항염 및 항노화 효과를 동시에 가지는 조성물 및 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에 본 발명자들은 외부의 유해 환경이나 자극으로부터 피부를 보호하여 피부 노화를 방지하고 피부 상태를 개선시킬 수 있는 성분을 찾기 위해 노력한 결과, 알팔파의 부위 중 특히 씨앗에서 추출한 다당체가 피부장벽강화 효과, 피부 미백개선, 피부 항염 효과 및 항노화 효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 다당체는 컬럼 유동속도가 1.0 ㎖/min이고, 이동상이 농도 18 mM NaOH인 HPLC에서 체류시간 10분~11분에서 제1피크 및 13분~14분에서 제2피크를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제1피크 및 제2피크의 높이비는 1.5:1 내지 6:1일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물은 (S10) 알팔파 씨앗 분쇄물에 추출용매를 가하여 추출물을 얻는 단계; (S20) 상기 추출물을 여과하여 여과물을 얻는 단계; (S30) 상기 여과물에 알코올을 가하여 침전물을 얻는 단계; 및 (S40) 상기 침전물을 분리하고, 건조하여 다당체 함유 추출물을 얻는 단계; 를 포함하는 추출방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 (S20) 단계는 활성탄을 이용하여 여과하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 조성물은 피부장벽 강화용 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 조성물은 항노화, 항염 및 미백으로 이루어지는 군에서 하나 또는 둘 이상의 피부 개선효과를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기　화장료　조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부장벽 강화용일 수 있다.
본 발명은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체를 함유하는 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체에 의해, 피부 각질형성세포의 분화가 유도되어 피부장벽을 강화하는 효과가 있으며, 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백에도 우수한 효능이 있다.
또한, 염증에 관련된 인자들의 생성을 억제하여 피부 항염 효능이 뛰어나며, 피부의 주름을 유발하는 인자들의 생성을 억제하여 피부 노화개선 및 예방 효과가 현저히 우수하다.
도 1은 UV에 증가된 MMP-1이 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 농도에 따라 감소되는 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 농도에 따른 엘라스타제 활성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 농도에 따른 NO 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 농도에 따른 IL-8의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 농도에 따른 각질세포형성 결과를 나타낸 결과이다.
도 6는 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 농도에 따른 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 결과이다.
도 7은 본 발명 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명 비교예 1에 따라 제조된 알팔파 새싹 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명 비교예 2에 따라 제조된 알팔파 줄기 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위한 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다” “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로···로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
또한 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유한다. 알팔파 추출물은 화장료 조성물의 유효성분으로 연구가 진행되어 왔으며, 대부분의 연구들은 알팔파의 새싹으로부터 추출물을 수득하여, 상기 추출물이 피부 개선에 유리한 효과를 가진다는 점을 보고하고 있다.
본 발명자는 외부의 유해 환경이나 자극으로부터 피부를 보호하여 피부 노화를 방지하고 피부 상태를 개선시킬 수 있는 성분을 찾기 위해 노력한 결과, 알팔파의 부위 중 특히 씨앗에서 추출한 다당체가 피부장벽 강화 효과, 피부 미백 개선, 피부 항염 효과 및 항노화에 현저한 효과가 있음을 발견하였다. 알팔파 씨앗에서 추출된 추출물은 새싹 추출물 또는 줄기 추출물에 존재하는 다당체와 다른 구성을 가지며, 피부 개선 효과 중 특히 피부장벽 강화에 현저한 효과를 제공할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 전체 중량에 대하여, 상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 0.0001 내지 30 중량% 포함할 수 있다. 구체적으로 0.0005 내지 20 중량%, 보다 구체적으로 0.001 내지 10 중량% 포함할 수 있다. 상기 범위에서 화장료 조성물을 피부에 적용시 피부장벽 강화, 항노화, 항염 및 피부 미백 개선 효과가 좋아 바람직하다.
상기 다당체 함유 추출물은 (S10) 알팔파 씨앗 분쇄물에 추출용매를 가하여 추출물을 얻는 단계; (S20) 상기 추출물을 여과하여 여과물을 얻는 단계; (S30) 상기 여과물에 알코올을 가하여 침전물을 얻는 단계; 및 (S40) 상기 침전물을 분리하고, 건조하여 다당체 함유 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 추출방법으로 제조된 것일 수 있다.
(S10) 단계에서 얻어지는 추출물은 수용성 활성성분을 추출하기 위해 정제수를 사용할 수 있고, 구체적으로 열수 추출하여 수득된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 열수 추출은 40~80 ℃의 온도에서 수행하는 것일 수 있으며, 구체적으로 45~80 ℃, 더욱 구체적으로 50~70 ℃에서 수행되는 것일 수 있다. 또한, 열수 추출 시간은 1~8시간일 수 있으며, 구체적으로 1~6시간, 더욱 구체적으로 1~4시간일 수 있다. 상기 온도 및 시간에서 추출 수율이 높고 피부 개선 효과에 있어서 가장 바람직하다.
상기 (S10) 추출물을 얻는 단계 이후, 다당체만을 분리하기 위해서 여과 및 에탄올 침전 반응을 수행할 수 있다. 구체적으로 (S20) 단계는 활성탄을 이용하여 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로 예를 들면, 1차적으로 추출물을 여과포로 거르고, 4 ㎛ pore size의 여과지를 이용하여 여과할 수 있다. 이후, 활성탄을 가하여 추가로 여과를 수행할 수 있다. 또한 0.5 ㎛ pore size의 여과지를 사용하여 여과하는 추가 여과 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
수득된 여과물에서 다당체를 침전시키기 위해 유기용매를 처리할 수 있다. 이때 유기용매는 저급 알코올이 좋다. 구체적으로 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 등 탄소수 5개 이하의 알코올이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올이 사용될 수 있다.
상기 알코올을 이용하여 얻어진 침전물에서 파우더 형태의 다당체 함유 추출물을 수득하기 위해, 50~75 ℃에서 24~48시간 열풍 건조할 수 있다. 구체적으로, 55~65 ℃에서 28~36시간 열풍 건조할 수 있다. 상기 범위에서 열풍 건조하는 경우, 유효성분의 손실을 최소화하고, 습기에 의해 산화되는 것을 방지할 수 있어 좋다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 다당체는 컬럼 유동속도가 1.0 ㎖/min이고 이동상이 농도 18 mM NaOH인 HPLC 분석에 의할 때, 체류시간 10분~11분에서 제1피크 및 13분~14분에서 제2피크를 가질 수 있다. 구체적으로 제1피크는 총 피크 면적 대비 50% 이상, 보다 구체적으로 60% 이상일 수 있다. 제2피크는 총 피크 면적 대비 20% 이상, 보다 구체적으로 30% 이상일 수 있다. 또한 제1피크 및 제2피크의 면적은 총 피크 면적 대비 80% 이상, 좋게는 90%이상, 보다 좋게는 95% 이상 100% 미만일 수 있다.
본 발명의 비제한적인 일 실시예에 따라, 상기 제1피크 및 제2피크의 높이비가 1.5:1 내지 6:1, 2:1 내지 5.5:1, 또는 3:1 내지 5:1인 경우 목적하는 피부개선의 효과를 달성할 수 있는 다당체의 구성을 제공할 수 있어 좋다.
또한 본 발명에 있어서, 다당체의 분자량은 200,000 내지 600,000 g/mol, 350,000 내지 500,000 g/mol, 또는 400,000 내지 470,000 g/mol일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 화장료 조성물은 피부장벽 강화용일 수 있다.
피부장벽은 피부 가장 바깥층에 해당하는 각질층으로, 외부 유해요소로부터 피부 손상을 막아주고, 피부의 수분 증발을 억제하는 역할을 한다. 본 발명의 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물은 피부각질세포 형성을 유도하여 피부장벽 강화 효과가 우수하며, 이러한 본 발명의 다당체는 화장료 조성물로 제조될 때도 상기와 같은 피부장벽 강화효과를 얻을 수 있다.
다른 일 예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 항노화, 항염 및 미백으로 이루어지는 군에서 하나 또는 둘 이상의 피부 개선효과를 가지는, 화장료 조성물일 수 있다.
피부 노화는 피부를 구성하는 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되는 것을 의미할 수 있다. 이에 따라 “항노화”는 이러한 피부 상의 노화를 유발하는 원인이나 인자를 억제하는 것을 의미할 수 있다.
“항염”은 피부 상의 염증 생성을 억제하거나 이미 생성된 염증을 완화, 개선시키는 것을 의미할 수 있다. 피부 염증은 대식세포에서의 과도한 일산화질소(NO) 생성으로 유발된 염증에 의해 발생할 수 있는 피부질환 또는 증상을 의미할 수 있다. 상기 염증과 관련된 피부질환 또는 증상의 비제한적인 예로는 피부발진, 여드름, 뾰루지, 아토피 피부염, 건선, 홍반성 질환, 피부 소양증, 지루성 습진 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
"피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할뿐만 아니라, 자외선, 호르몬, 스트레스 또는 유전적 요인 등에 기인한 기미나 주근깨 등 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 모두 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다.
피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어 바디 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제의 제형을 갖는 외용제 조성물일 수 있다. 이때 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있다.
상기 피부 외용제 조성물은 전체 중량에 대하여, 상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 0.0001 내지 30 중량% 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 0.0005내지 20 중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 10 중량% 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에서 피부 외용제 조성물을 피부에 적용시 피부장벽강화, 항노화, 항염 및 피부 미백 개선 효과가 좋아 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알팔파 씨앗 추출물 제조
알팔파 씨앗 분쇄물 1 kg에 정제수 10 ℓ를 가하고, 60 ℃에서 2시간 동안 열수 추출하여 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 여과포로 거르고, pore size가 4㎛인 HA-040 여과지(HYUNDAI MICRO, Seoul, Korea)로 여과한 후, 여과물에 활성탄을 500 g 가하여 추가로 여과 과정을 거쳤다. pore size가 0.5 ㎛인 HU-005여과지(HYUNDAI MICRO, Seoul, Korea)로 마지막 여과를 진행하고, 총 중량대비 2배의 에탄올을 가하여 다당체를 침전시켜 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 분리하고, 에탄올로 세척한 후, 60 ℃에서 30시간 열풍 건조하여 알팔파 다당체를 포함하는 알팔파 씨앗 추출물을 제조하였다.
비교예 1. 알팔파 잎 추출물 제조
알팔파 잎 건조물 200 g에 질량의 20배에 해당하는 70% 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 3일간 추출한 후 감압 여과하였다. 여과한 추출물을 회전 증발기 (rotary evaporator)(Buchi, Switzerland)로 농축, 건조하여 최종적으로 알팔파 잎 추출물을 제조하였다.
비교예 2. 알팔파 줄기 추출물 제조
알팔파 줄기 건조물을 사용한 것을 제외하면, 상기 비교예 1과 동일한 방법을 수행하여 알팔파 줄기 추출물을 제조하였다.
비교예 3. 알팔파 잎 추출물 제조
알팔파 잎 건조물 1 kg을 사용한 것을 제외하면, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 알팔파 잎 추출물을 제조하였다.
실험예 1. 알팔파 추출물의 HPLC 분석시험
실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에 따라 제조된 알팔파 추출물에 함유된 다당체를 2M 삼불화아세트산(Trifluoroacetic acid)를 이용하여 0.2%(w/v)의 시험용액을 제조 후 산가수분해 처리하여 최종 시료 농도를 2 mg/㎖로 하였다. 하기 표 1의 분석기기 및 조건에 따라 HPLC 분석한 후 그 결과를 표 2 내지 표 4 및 도 7 내지 도 9에 나타내었다.
HPLC 분석기기 및 분석조건
System HPAEC-PAD system, Dionex, USA
Eluent 18 mM NaOH / 200 mM NaOH
Column CarboPacTM PA1
유량(Flow Rate) 1.0 ㎕/min
주입 부피(injection volume) 20 ㎕
실시예 1에 따른 알팔파 씨앗 추출물의 다당체 분석결과
No. 체류시간
(min)		 피크명 높이
(nC)		 면적
(nC*min)		 상대적 면적비율(%) 함량
(mg/mg)
1 4.02 Fucose 0.890 0.167 0.20 Not determined
2 7.11 Rhamnose 0.146 0.077 0.09 0.001
3 8.21 Arabinose 1.696 0.670 0.79 0.001
4 10.69 Galactose 94.481 53.519 63.21 0.200
5 11.42 Glucose 7.067 1.892 2.23 0.001
6 13.25 Mannose 19.119 28.346 33.48 0.250
비교예 1에 따른 알팔파 잎 추출물의 다당체 분석결과
No. 체류시간
(min)		 피크명 높이
(nC)		 면적
(nC*min)		 상대적 면적비율(%) 함량
(mg/mg)
1 4.04 Fucose 0.865 0.200 0.24 Not determined
2 7.09 Rhamnose 5.134 3.592 4.35 0.039
3 7.88 Arabinose 43.547 18.537 22.45 0.081
4 10.38 Galactose 17.096 7.569 9.17 0.023
5 11.14 Glucose 105.718 51.371 62.23 0.185
6 12.34 Mannose 2.751 1.286 1.56 0.015
비교예 2에 따른 알팔파 줄기 추출물의 다당체 분석결과
No. 체류시간
(min)		 피크명 높이
(nC)		 면적
(nC*min)		 상대적 면적비율(%) 함량
(mg/mg)
1 4.15 Fucose 2.178 0.558 0.85 Not determined
2 7.13 Rhamnose 2.494 1.868 2.85 0.039
3 8.15 Arabinose 44.411 18.131 27.69 0.081
4 10.74 Galactose 40.070 18.786 28.69 0.023
5 11.55 Glucose 48.050 23.829 36.39 0.185
6 12.82 Mannose 3.816 2.306 3.52 0.015
하기 표 6은 실시예 1의 알팔파 씨앗 추출물 샘플 1, 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 알팔파 씨앗 추출물 샘플 2 내지 4 (실시예 2 내지 실시예 4), 및 비교예 1 내지 비교예 3에 대한 HPLC 분석 결과, 주요 피크간 높이비를 측정한 값을 나타낸 것이다.
체류시간에 따른 피크 넘버
피크 No. 체류시간(min)
1 4~5
2 7.0~7.5
3 7.7~8.3
4 10.0~11.0
5 11.1~12.0
6 12.2~13.4
실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 피크높이비
H4/H6 H3/H4 H5/H6
Standard 1.15 0.93 1.15
실시예 1 4.94 0.018 0.37
실시예 2 4.12 0.021 0.33
실시예 3 4.53 0.016 0.38
실시예 4 4.66 0.023 0.31
비교예 1 6.21 2.55 38.43
비교예 2 10.5 1.11 12.59
비교예 3 5.74 3.12 40.9
상기 표 6에 기재된 바와 같이, 실시예 1 내지 4에 따른 알팔파 씨앗 추출물로부터 얻어지는 피크의 높이비는 H4/H6의 경우 4~5에 해당하는 값을 나타내었다. 그러나 비교예 1 내지 비교예 3은 실시예 1 내지 4와 큰 차이를 보여, 피크 특성이 현저히 차이남을 확인할 수 있다. 또한, H3/H4의 피크높이비를 측정한 경우에도 실시예의 경우 0.01 내지 0.03의 범위에 있는 반면, 비교예는 1보다 큰 값을 보여, 피크 특성의 차이를 확인할 수 있다. 아울러 H5/H6의 경우에도 실시예는 0.3 내지 0.4의 범위에 있으나, 비교예의 경우 이보다 훨씬 큰 12 이상의 값을 가져, 피크 특성의 현저한 차이를 확인할 수 있다.
실험예 2. UV에 의한 MMP-1 및 Elastase의 활성 억제 효능 평가
2-1. MMP-1 활성 억제 효능 평가
매트릭스 메탈로프로테아제-1(Matrix metalloprotease-1, MMP-1)은 피부내에 존재하는 콜라겐을 분해하는 효소이다. MMP-1에 의해 콜라겐이 분해되면 주름을 유발하게 된다. 자외선에 의해 증가되는 MMP-1 발현의 억제 효과를 확인하기 위하여, 인간 피부 섬유아세포(Hs68)를 12웰 플레이트의 각 웰에 0.75x105 개씩 심고 24시간 동안 기아상태(starvation)로 한 후에, 인산염 완충 식염수로 세척하고 UV(40mJ)를 조사하였다. 이어서, 양성대조군으로 10 ㎛ 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG) 및 10 ㎛ 레티노산(Retinoic acid, RA)을 처리하고, 실시예 1을 50, 100, 200, 400 μg/㎖ 농도로 처리하였다. 48시간 배양 후 배지 중에 유리된 MMP-1의 양은 키트(Amersham, RPN2610)를 사용하여 측정하였다. 각 데이터 값은 대조군으로 보정하였고, 그 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 알팔파 씨앗 다당체는 농도가 증가함에 따라 MMP-1의 발현을 억제하였다.
2-2. Elastase의 활성 억제 효능 평가
엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스를 구성하는 성분으로 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스가 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴 (elastin)을 분해하는 효소인 엘라스타제의 활성을 측정하여 피부 주름 억제 및 개선 효과를 갖는지 평가하였다.
100 mM Tris-HCl buffer (pH 8)을 사용하여 모든 튜브의 전체 부피를 750 ㎕로 맞추었으며, 기질 용액(substrate solution) 4.4 mM SucAla₃-pNA 50 ㎕를 넣고 약하게 섞은 후 25 ℃ 수조에서 3 분 동안 반응시킨 후 대조군과 시료에는 엘라스타제 (0.4 units/㎖) 75 ㎕를 넣고 시료에만 50, 100, 200, 400 μg/㎖ 농도에 맞게 실시예 1을 넣어 주었다. 그 후 410 nm에서 5 min동안 1 min에 한번씩 증가하는 흡광도 값을 측정하였다. 엘라스타제 저해 활성도 (% Elastase inhibition activity)는 하기 수학식 1 과 같이 계산하였다.
[수학식 1]
엘라스타제의 저해 활성도 (%) = {1-(S-B)/C} × 100
(S: 시료의 흡광도, B: blank의 흡광도, C: control의 흡광도)
결과는 도 2에 도시하였다. 결과에서 보는 바와 같이 실시예 1의 농도에 따라 엘라스타제의 활성이 현저히 감소하는 것을 확인 하였다. 본 발명에 따른 다당체가 MMP-1의 활성과 엘라스타제의 활성을 억제함으로써 항노화 효능이 있음을 확인 하였다.
실험예 3. NO 및 IL-8 억제 효능 평가
3-1. NO 생성 억제 효능 평가
상기 실시예 1에서 제조된 조성물의 항염 효과를 확인하기 위해, Raw 264.7 cell을 이용하여 NO 생성 억제 효과를 측정하였다. 양성 대조군으로는 10 ㎛ 인도메타신(Indomethacin, Indo)를 사용하였으며, 실시예 1을 50, 100, 200, 400 μg/㎖ 농도로 제조하여 세포에 처리하고 30분 후 1 μg/㎖ LPS(Lipo-polysaccharide)를 처리하여 24시간 배양한 후, NO 정량 Kit(ThermoFisher scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 NO 생성 억제능을 평가하였다.
결과는 도 3에 도시하였다. 실시예 1의 농도에 따라 NO의 생성이 현저히 감소됨을 확인하였다.
3-2. IL-8 억제 효능 평가
IL-8(interlukin-8)은 염증반응을 증폭시키는 인자이다. 상기 실시예 1에 따른 알팔파 씨앗 추출물이 항염 효과를 갖는지 확인하고자 IL-8의 생성 억제 효과를 평가하였다.
인간 섬유아세포인 fibroblast(PromoCell, Germany) 세포를 6웰 배양판에 1×105 세포의 농도로 접종하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 과산화수소(H₂O₂) 500 ㎛을 웰에 처리하여 24시간 동안 자극을 준 후, 실시예 1에 따라 제조된 알팔파 씨앗 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 배양액을 수거하여 ELISA 분석을 수행하였다. IL-8은 엔도젠(Endogen, MA, USA)의 키트를 사용하였으며, 각 회사의 매뉴얼에 명기된 방법에 따라 실험을 진행하였다. 억제 효과는 하기 수학식 2에 따라 계산하였으며, 측정 결과는 도 4에 도시하였다.
[수학식 2]
억제 효과 (%) = {1-(시험 시료-대조군)/(H₂O₂-대조군)} × 100
결과에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 염증을 유발하는 NO 및 IL-8의 생성이 현저히 감소되는 것을 확인하였고, 항염 효과가 현저히 우수함을 알 수 있다.
실험예 4. 피부장벽 강화 효과 평가
각질세포 외막 형성 평가(Cornified Envelope Formation Assay)를 통하여 피부장벽 강화 효과를 확인하였다. 인간 피부 각질세포인 HaCaT(한국세포주은행, Seoul, Korea)세포를 24-well plate에 1 × 105 cells/㎖로 접종하고 37 ℃, 5% CO₂ incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청을 포함하지 않은 배지를 이용하여, 양성대조군으로 칼슘 1.2 mM을 사용하였고, 실시예 1을 25, 50, 100, 200 μg/㎖, 비교예 1은 200 μg/㎖ 처리하고, 세포가 바닥 면적의 70 ~ 80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이 세포를 수확하여 PBS로 세척한 뒤 2% Sodium dodecyl Sulfate(SDS)(Sigma, USA)와 20 mM Dithiothreitol (DTT) (Sigma, USA)를 포함한 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)를 1 ㎖ 넣고 3 min 동안 sonication을 수행한 후 10 분간 100 ℃에서 끓여 주었다. 일부를 취해 단백질 정량하여 평가 시 기준으로 잡는데 이용하고 나머지를 원심분리 (1,200 rpm, 30분, 4 ℃) 하였다. 분리한 침전물은 다시 PBS에 현탁 시켜 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 5에 도시하였다. 실시예 1의 농도에 따라 각질세포형성이 현저히 증가하는 것을 확인하였으며, 이에 피부장벽을 강화하는 효과가 우수함을 확인하였다.
실험예 5. 멜라닌의 생성 억제 효과 평가
세포 내에서 멜라닌 합성 억제 효능을 비교하기 위하여 멜라닌 생성 억제물질로 알려진 코지산(kojic acid)과 멜라닌 생성 자극인자로 alpha-MSH를 사용하였다. 먼저, 멜라노마 세포인, B16F10(ATCC, CCL-6475)세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 3x104 개씩 심고, 다음날 각각의 웰에 Alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)로 멜라닌 생성을 유도하고, 양성대조군인 코지산 100 μg/㎖과 실시예 1을 25, 50, 100, 200 μg/㎖ 농도로 가하였다. 48시간 후에 세포를 인산염 완충 식염수로 세척한 후, 1N NaOH용액으로 생성된 멜라닌을 녹이고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 도시하였다. 결과에서 알 수 있듯이, 실시예 1은 농도 증가에 따라 멜라닌 생성을 억제하며, 모든 농도에서 양성 대조군과 대비하여 멜라닌 생성 억제 효과가 현저히 뛰어난 것을 확인할 수 있다.

Claims (11)

  1. 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%로 포함되는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다당체는 컬럼 유동속도가 1.0 ㎖/min이고, 이동상이 농도 18 mM NaOH인 HPLC에서 체류시간 10분~11분에서 제1피크 및 13분~14분에서 제2피크를 가지는, 화장료 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1피크 및 제2피크의 높이비는 1.5:1 내지 6:1인, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물은,
    (S10) 알팔파 씨앗 분쇄물에 추출용매를 가하여 추출물을 얻는 단계;
    (S20) 상기 추출물을 여과하여 여과물을 얻는 단계;
    (S30) 상기 여과물에 알코올을 가하여 침전물을 얻는 단계; 및
    (S40) 상기 (S30) 단계에서 얻은 침전물을 분리하고, 건조하여 다당체 함유 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 추출방법으로 제조된 것인, 화장료 조성물
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (S20) 단계는 활성탄을 이용하여 여과하는 단계;를 포함하는, 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 피부장벽 강화용인, 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 항노화, 항염 및 미백으로 이루어지는 군에서 하나 또는 둘 이상의 피부 개선효과를 가지는, 화장료 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기　화장료　조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는, 화장료　조성물.
  10. 알팔파 씨앗에서 추출된 다당체 함유 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 피부장벽 강화용인, 피부 외용제 조성물.
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