WO2024029670A1 - 체지방 감소 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 bcc-lh-04 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

체지방 감소 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 bcc-lh-04 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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culture
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lactobacillus helveticus
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신금주
이종서
이동완
정의천
임혜지
이나래
권태준
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(주)헥토헬스케어
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel Lactobacillus genus strain, a culture thereof, and a body fat reduction composition containing the same, and specifically to a novel Lactobacillus helveticus strain, a culture thereof, and a pharmaceutical composition containing the same with body fat reduction activity, health It relates to functional food compositions and quasi-drug compositions.
  • Obesity refers to a condition in which energy intake and consumption are unbalanced, causing excess energy to accumulate as fat, resulting in an abnormal increase in body fat and various metabolic abnormalities. Obesity caused by excessively accumulated body fat can lead to diabetes, cardiovascular diseases, etc. It is a major cause that increases the risk of developing diseases and certain cancers.
  • the main cause of obesity is the accumulation of fat due to excessive calorie intake, and in this process, fat cells increase through various mechanisms.
  • fat ingested in the body is broken down and absorbed by an enzyme called lipase, and carbohydrates consumed in excess are broken down into sugar, which increases blood sugar levels or promotes differentiation into adipocytes, leading to the creation of adipocytes.
  • lipase an enzyme that causes fat ingested in the body to break down into sugar, which increases blood sugar levels or promotes differentiation into adipocytes, leading to the creation of adipocytes.
  • Body fat reduction mechanisms can be broadly divided into two types: a method to suppress fat digestion and absorption by inhibiting the action of enzymes such as lipase, and a body fat synthesis inhibition mechanism that directly inhibits the synthesis of fat cells. Therefore, 3T3L-1, a preadipocyte, is being studied in vitro as a study on cells that produce fat in vivo ( Applied Biological Chemistry volume 63, Article number: 9 (2020)).
  • probiotics are being studied extensively, and research results have shown that probiotics help prevent weight gain in rats that consume high-fat food and significantly reduce fat and biochemical indicators related to obesity. It has been done. Therefore, there is a need to develop safe and effective probiotic strains that are effective in inhibiting fat absorption and cell differentiation.
  • the purpose of the present invention is to recognize the problems of the prior art mentioned above and to provide a new Lactobacillus helveticus strain or culture thereof.
  • the purpose of the present invention is to provide a body fat reduction effect composition containing the above strain or its culture.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity containing the above strain or its culture.
  • the purpose of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving obesity containing the above strain or its culture.
  • the purpose of the present invention is to provide a quasi-drug for preventing or improving obesity containing the above strain or its culture.
  • One aspect of the present invention provides Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or a culture thereof with accession number KCTC 14810BP.
  • One aspect of the present invention provides a body fat reduction effect composition comprising the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or a culture thereof with the accession number KCTC 14810BP.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity containing the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or a culture thereof with the accession number KCTC 14810BP.
  • a method for preventing or treating obesity comprising administering the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or a culture thereof of the accession number KCTC 14810BP to an individual.
  • the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or its culture of the accession number KCTC 14810BP is provided for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity.
  • One aspect of the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving obesity containing the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or a culture thereof with the accession number KCTC 14810BP.
  • One aspect of the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or improving obesity containing the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or a culture thereof with the accession number KCTC 14810BP.
  • Figure 1 shows the 16S rRNA gene base sequence of the new Lactobacillus helveticus BCC-LH-04.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of the new Lactobacillus helveticus BCC-LH-04.
  • Figure 3 is a graph showing the fatty acid absorption ability of the new Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain.
  • Figure 4 is a photograph of a mucoid colony confirming the EPS production ability of the new Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain on sucrose agar.
  • Figure 5 is a graph showing the lipase inhibitory activity effect of the new Lactobacillus helveticus BCC-LH-04.
  • Figure 6 is a graph showing the ability of the new Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 to inhibit adipocyte differentiation in 3T3-L1, a pre-adipogenic differentiated cell.
  • Figure 7 is a graph showing the decrease in body weight gain after oral administration of Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 to mice for 9 weeks.
  • Figure 8 is a graph showing the decrease in subcutaneous fat and abdominal fat (mesenteric fat and epididymal fat) after oral administration of Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 to mice for 9 weeks and autopsy.
  • the present invention provides the following new strain or culture thereof: Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain or culture thereof with accession number KCTC 14810BP.
  • the strains according to the present invention were each entrusted to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on December 6, 2021.
  • the Lactobacillus helveticus strain with accession number KCTC 14810BP is described as BCC-LH-04.
  • Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain with accession number KCTC 14810BP contains the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the BCC-LH-04 strain can be characterized as having excellent acid resistance and bile resistance, as well as no hemolysis and antibiotic resistance.
  • the BCC-LH-04 strain may be characterized as exhibiting one or more characteristics selected from the group consisting of:
  • EPS extracellular polysaccharide
  • the BCC-LH-04 strain may be characterized as showing a body fat reduction effect by reducing fatty acid concentration, producing extracellular polysaccharides, inhibiting lipase enzyme inhibition activity, or inhibiting the differentiation activity of preadipocytes.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising the BCC-LH-04 strain or a culture thereof.
  • Prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of obesity or obesity-related diseases by administering the composition according to the present invention. “Treatment or improvement” means any action that improves or beneficially changes the symptoms of obesity or obesity-related diseases.
  • the obesity-related diseases may be various metabolic diseases such as diabetes, hyperlipidemia, heart disease, stroke, arteriosclerosis, fatty liver, etc., but are not limited thereto.
  • the composition When administered to an individual, the composition can reduce the rate of weight gain or reduce subcutaneous fat and abdominal fat (epididymal fat, perirenal fat).
  • the composition may have the effect of inhibiting the absorption of fat components, inhibiting carbohydrate absorption, and/or inhibiting fat differentiation in small intestine cells or the digestive tract.
  • the pharmaceutical composition is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the present invention pertains. It can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, capsule, or gel (e.g., hydrogel), and may additionally contain a dispersant or stabilizer. there is.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include lactose, glucose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrolidone, It may include, but is not limited to, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. may be additionally included.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally and can be used in the form of a general pharmaceutical preparation. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in various oral and parenteral dosage forms during actual clinical administration.
  • diluents such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants are used. Or it is prepared using excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include herbal extracts or herbal medicinal ferments with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose. It is prepared by mixing gelatin, etc.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • wethepsol, macrogol, Tween 61, cacao, laurel, glycerol, gelatin, etc. can be used as a base for suppositories.
  • the concentration of the active ingredient included in the composition can be determined considering the purpose of treatment, patient condition, required period, etc., and is not limited to a specific concentration range.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • 'pharmaceutically effective amount' refers to an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity of the patient's disease, the activity of the drug, and the drug. It can be determined based on factors including sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual treatment, or in combination with a treatment for diseases caused by other pollutants or a treatment for improving skin aging, and may be administered simultaneously, separately, or sequentially with conventional treatments. It can be administered, and can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective dose may vary depending on the patient's age, gender, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate, excretion rate, type of disease, and concomitant drugs, route of administration, severity of obesity, gender, weight, and age. It may increase or decrease depending on etc.
  • the present invention relates to a health functional food composition for preventing or improving obesity comprising the BCC-LH-04 strain or a culture thereof.
  • Health functional foods refer to foods with high medical effects that have been processed to efficiently exhibit bioregulatory functions in addition to supplying nutrients.
  • Health functional foods are tablets, capsules, powders, and granules to obtain useful effects in preventing or improving obesity. It can be manufactured in various forms such as liquid, pills, etc.
  • Health functional food compositions can be manufactured into foods, especially functional foods.
  • the functional food of the present invention includes ingredients commonly added during food production and may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • ingredients commonly added during food production may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • natural carbohydrates or flavoring agents may be included as additional ingredients in addition to the active ingredient.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides (e.g., glucose, fructose, etc.), disaccharides (e.g., maltose, sucrose, etc.), oligosaccharides, polysaccharides (e.g., dextrins, cyclodextrins, etc.), or sugar alcohols (e.g., , xylitol, sorbitol, erythritol, etc.) are preferred.
  • the flavoring agent may be a natural flavoring agent (e.g., thaumatin, stevia extract, etc.) or a synthetic flavoring agent (e.g., saccharin, aspartame, etc.).
  • the present invention relates to a quasi-drug composition for preventing or improving obesity comprising the BCC-LH-04 strain or a culture thereof.
  • Quasi-drugs are preparations used for the purpose of preventing or improving obesity, other than preparations used for the purpose of pharmacologically affecting the structure or function of humans or animals.
  • the BCC-LH-04 strain or its culture When used as a quasi-drug, the BCC-LH-04 strain or its culture may be used, or it may be used together with other quasi-drug ingredients, and may be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • Raw milk was used as a sample to select new probiotic strains. 1 mL of sample was serially diluted 10 times in sterile saline solution, and then 0.1 mL of the dilution was spread on MRS solid medium and cultured for 3 days under anaerobic conditions. The resulting single colony was pure cultured in MRS liquid medium at 37°C for 18 hours.
  • API 50 CH kit BioMerieux, Lyon, France.
  • a suspension was prepared by adjusting the colony of the strain cultured on MRS solid medium to a turbidity of 2 MacFarland. 120 ⁇ L of API 50 CHL medium with adjusted turbidity was dispensed into API 50CH strip tubes, 2 drops of mineral oil were added to the cupules, and cultured at 37°C for 24 and 48 hours to confirm the sugar utilization pattern. Identification results were confirmed using the API web program (https://apiweb.biomerieux.com).
  • Lactobacillus acidophilus 3 was found to be 63.2%.
  • 16S rRNA gene sequencing was requested from Solgent (Daejeon, Korea). DNA was extracted from 1 mL of pure culture of the strain using the Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA), and using the extracted DNA as a template, PCR was performed on the 16S rRNA region with 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) and 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) primers. DNA sequencing (Solgent) was performed. Based on the base sequence analysis results, homology was compared with other standard strains registered in the Genebank database on NCBI's BLAST.
  • Acid resistance tests in artificial gastric juice and bile resistance tests in artificial bile were processed separately.
  • Artificial gastric fluid was prepared by adding pepsin to 250 units/mL in MRS liquid medium whose pH was adjusted to 2.5 with HCL and then sterilized.
  • the supernatant and artificial bile solution containing the same amount of 0.3% oxgall were mixed with the collected bacteria after culturing so that the bacteria were well mixed with the artificial bile solution. After mixing, the mixture was cultured for 5 hours under anaerobic conditions at 37°C and the number of viable bacteria was measured.
  • the total number of bacteria was determined by taking 1 mL of the culture medium and spreading it on MRS plate medium using the decimal dilution method. After culturing at 37°C for 48 hours, the number of colonies was counted to determine the number of viable bacteria.
  • the hemolytic test is to confirm that lactic acid bacteria do not have hemolytic toxicity in the human body, and was tested for hemolysis, which is a phenomenon in which red blood cells are destroyed or decomposed.
  • the test strain was grown on Columbia blood agar and cultured at 37°C for 48 hours under anaerobic conditions. Hemolysis was judged by whether a transparent ring was formed around the bacterial cells.
  • the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain has ⁇ -hemolysis (reduces methemoglobin in red blood cell hemoglobin to form green colonies) and is not hemolytic in blood and is not harmful to the human body. It was confirmed to be harmless.
  • the MIC was confirmed using E-TEST.
  • the test strain was prepared by culturing it in MRS broth and diluting it to a concentration of 0.5 ⁇ 1.0 McFarland (1.5 ⁇ 3X10 8 CFU/mL). After sterilizing the strain titration agar medium (1.8%), solidify it at room temperature, soak the sterilized cotton swab in the liquid medium containing the strain, take it out, and streak it to form a lawn on the agar plate. Leave the inoculated strain at room temperature for 10 to 20 minutes under anaerobic conditions to allow it to penetrate well into the agar medium.
  • the antibiotic strip to be tested was placed at an appropriate distance on the agar medium and cultured anaerobically at 37°C for 48 hours. The result was determined as the MIC at the bottom of the strip where bacteria did not grow.
  • the identified antibiotics were ampicillin (AM), clindamycin (CM), chloramphenicol (CL), erythromycin (EM), streptomycin (SM), tetracycline (TC), vancomycin (VA), kanamycin (KM), and gentamicin (GM). ), and compared to the EFSA (European Food Safety Authority) standard cut-off standard, it was determined that there was no tolerance if the value was lower.
  • EFSA European Food Safety Authority
  • lactic acid bacteria were cultured in MRS medium for 18 hours, centrifuged at 3600 rpm for more than 15 minutes to obtain bacterial cells, and the supernatant was removed and washed once with an equal amount of 1xPBS.
  • the washed bacterial cells were concentrated by adding 1xPBS equivalent to 1/10 of the volume of the culture medium, and then indirectly sterilized using a high-pressure sterilizer at 121°C for 15 minutes.
  • the sterilized dead lactic acid bacteria cells were frozen in an ultra-low temperature freezer at -80°C for 24 hours and then freeze-dried in a freeze dryer for 48 hours.
  • the freeze-dried powder was collected, stored in refrigeration, and used during experiments.
  • strains that reduce fatty acids in the medium When strains that reduce fatty acids in the medium are absorbed into the body, they can inhibit fat production by reducing the amount of fatty acids absorbed into the body by reducing the concentration of fatty acids (FA) dissolved in the gut fluid content. Based on this principle, the fatty acid absorption ability of the BCC-LH-04 strain was confirmed.
  • Strains isolated and preserved from the intestinal environment were inoculated onto MRS agar or MRS (+0.05% cysteine) agar and then cultured anaerobically at 37°C in an anaerobic chamber (WHITLEY A35 Workstation, Labconsult). After culturing for 48 hours, a single colony was inoculated (using an E-tube) into 1mL MRS or MRS (+0.05% cysteine) broth and cultured anaerobically at 37°C for 18 to 20 h.
  • 100 ⁇ L of the cultured strain was inoculated into an E-tube containing 900 ⁇ L of MRS broth containing 0.5% (w/v) Brij58 and 0.25 mM sodium palmitate, and cultured anaerobically at 37°C for 24 h.
  • the culture medium was centrifuged (13,000 rpm, 1 min, 4°C), the supernatant was collected, and the residual fatty acid (FA) concentration remaining in 10 ⁇ L of the supernatant was measured.
  • the amount of fatty acid in the supernatant was calculated by measuring the absorbance at 570 nm using the EnzyChromTM Free Fatty Acid Assay Kit (Bio-Assay Systems, USA).
  • the amount of fatty acid in the strain culture was calculated using the quantitative curve of the standard material, and the fatty acid concentration reduction ability of the strain was calculated compared to the non-inoculated control (negative control, NC), and is shown in Figure 3.
  • the BCC-LH-04 strain showed a significantly higher fatty acid absorption capacity of 56.1% compared to the uninoculated control. This was the best among other strains of the same species tested together and was higher than the 52.9% fatty acid absorption capacity of Lactobacillus complex (LCP), a commercially available functional strain for reducing body fat.
  • LCP Lactobacillus complex
  • Exopolysaccharide is a polysaccharide that is secreted and accumulated by microorganisms during metabolism. It is a primary or secondary metabolite that forms a membrane around the cell wall or exists in the form of a slime on the outside of the cell wall.
  • EPS produced by lactic acid bacteria has proven to be effective as a natural stabilizer in fermented milk products, and has recently been studied as a variety of physiologically functional materials. Representative immune-related functionality has been reported, and in addition, effects such as body fat reduction and cholesterol lowering have also been reported.
  • lactic acid bacteria consume sugar and produce EPS, it is converted into polysaccharide that is not easily absorbed by the body and is excreted, so it can act competitively with existing sugar, which can be expected to have a positive effect in reducing calorie absorption.
  • additional functionality related to body fat reduction was confirmed by verifying the EPS production ability of strains with excellent fatty acids. To confirm EPS production ability, selected strains were streaked on sucrose agar (1% trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% dipotassium phosphate, 0.5% diammonium citrate, 5% sucrose, 15% agar, pH 7.0) at 37°C under anaerobic conditions.
  • Pancreatic lipase is a lipolytic enzyme that decomposes triglyceride into 2-monoacylglycerol (2- and fatty acid), and is an enzyme that decomposes about 50% to 70% of ingested fat.
  • lipase activity increases, the ingested fat in the body is reduced. It absorbs more and increases the accumulation of fat cells in the body.
  • Inhibiting the activity of pancreatic lipase reduces the decomposition of fat absorbed from food and reduces fat absorption in the body, which ultimately reduces calorie intake and reduces body weight. Diet is effective.
  • Lipase inhibitory ability was measured by measuring the concentration of fatty acid (FA) that was finally decomposed after reacting the selected strain for a certain period of time with a mixture of lipase treated with lipid (tryclyceride) to evaluate the degree to which lipase activity was inhibited when treated with the strain.
  • FA fatty acid
  • the specific test method is as follows. Triolein (80mg), Lecithin (10mg), and Taurocholic acid (5mg) were added to 9 mL of TES buffer (0.1M TES, 0.1M NaCl, pH7.0, Biosaesang, South Korea) to prepare a lipid solution and 10 units/mL. Prepare a diluted Pancreatic Lipase (500 unit/mg) solution. Mix 100 ⁇ L of heat-treated dead cell solution with 100uL of lipid solution and 50uL of Lipase solution (10 units) and react in a heat block at 37°C for 30 minutes. Fatty acids (FA) decomposed after the reaction were measured using the FFA Assay kit. The lipase inhibitory activity of the four selected strains was compared with the amount of fatty acid (FA) liberated from the mixture (control group) in which the strain was not treated ( Figure 5).
  • the BCC-LH-04 strain showed excellent lipase activity inhibition ability at 34.3%, and the LF-01 strain did not show lipase activity inhibition ability.
  • the inhibitory ability of the LG strain known as a lactic acid bacterium with body fat reduction efficacy, it was confirmed that the value was significantly higher.
  • 3T3-L1 cells mouse embryonic fibroblasts purchased from the American Type Culture Collection (ATCC), were cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA). Cultured using DMEM (ATCC, USA) medium in a 5% CO 2 incubator at 37°C.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the process of differentiating 3T3-L1 mouse embryonic fibroblasts into adipocytes is as follows. Use cells at 120% confluence 2 days later (day 2) from the time when 3T3-L1 cells show 100% confluence (day 0). After removing the existing medium of the cultured 3T3-L1 cells, 10% FBS, 1% P/S, 1 ⁇ g/mL insulin (Sigma, USA), 0.5mM 3-isobutyl-1-methlxanthine (IBMX, Sigma, USA) and Cultured in DMEM (differentiation medium, MDI) containing 1 ⁇ M dexamethasone (Sigma, USA).
  • DMEM differentiation medium, MDI
  • DMEM insulin medium
  • stabilization medium existing DMEM medium
  • the maturing 3T3-L1 pre-adipocyte culture medium in which fat spheres were generated, was washed twice with 1xPBS to remove the culture medium, and 10% formalin (Biosesang, South Korea) was added for 30 minutes.
  • the cells were fixed. After formalin is removed, cells are additionally fixed for 5 minutes by treatment with 60% isopropanol. After isopropanol was removed, the fixed cells were treated with a staining reagent containing 0.5% Oil-Red O (Sigma, USA) and DW diluted in a 3:2 ratio and stained for 20 minutes. After removing the staining reagent, the cells were washed twice with 1xPBS and the stained fat spheres were observed under a microscope.
  • stained cells were treated with Isopropanol 100% (Duksan, South Korea) to release the staining reagent, and then the absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader.
  • Figure 6 is a diagram showing the degree of adipocyte differentiation. As shown in Figure 6, compared to the control group, the group treated with BCC-LH-04 dead cells showed a higher ability to inhibit adipocyte differentiation at 72.4%, and had a better inhibitory ability than Lactobacillus complex (LCP), a commercially available body fat functional strain. showed.
  • LCP Lactobacillus complex
  • mice were acclimatized for 1 week and then divided into 3 groups for an experiment.
  • Group 1 was administered a normal diet (ND)
  • Group 2 was a group administered a high-fat diet (HFD, 60 Kcal% fat diet, D12492)
  • Group 3 was a group administered a high-fat diet (HFD) and lactobacillus.
  • the group administered Bacillus helveticus BCC-LH-04 (10 9 CFU/mouse) was administered orally 5 times a week. Body weight and food intake were checked twice a week, and an autopsy was performed after 9 weeks of administration to measure the weight and size of adipose tissue.
  • the body weight at week 0 was set as 100%, and the weight gain rates at different times were measured and shown in Figure 6.
  • the 3rd group (HFD+BCC-LH-04) measured the weight increase rate over time, taking the weight at week 0 as 100% from 1 week later. It is shown in 6.
  • group 3 (HFD+BCC-LH-04) showed a difference in weight gain rate after 1 week compared to group 2 (HFD).
  • the weight gain rate of group 3 was 165.94%, and the increase rate of group 2 was 176.51%, and the weight gain rate of group 3 decreased by 10.6% compared to group 2.
  • Table 4 the weight gain of Group 3 over 9 weeks was 15.35, and the weight gain of Group 2 over 9 weeks was 17.98, representing a difference of approximately 15%.
  • composition containing the Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 strain of the present invention or its culture promotes adipocyte differentiation and intracellular fat accumulation through reduced fatty acid concentration and lipase enzyme inhibitory activity. It has an excellent body fat reduction effect.

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Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 속 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 체지방 감소 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 신규 락토바실러스 헬베티쿠스 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 체지방 감소 활성을 갖는 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.

Description

체지방 감소 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 신규 락토바실러스 속 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 체지방 감소 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 신규 락토바실러스 헬베티쿠스 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 체지방 감소 활성을 갖는 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
비만은 에너지 섭취와 소비가 균형을 이루지 못하여 과잉의 에너지가 지방으로 축적되어 체지방이 비정상적으로 많아지고, 다양한 대사 이상이 유발되는 상태를 의미하며, 과도하게 축적된 체지방으로 인한 비만은 당뇨병, 심혈관계 질환과 특정 암의 발병위험을 증가시키는 주요 원인이다.
이러한 비만을 야기시키는 주요 원인으로서는 과도한 칼로리의 섭취로 인한 지방의 축적이며, 이 과정에서 다양한 기전을 통해 지방세포가 증가하게 된다. 먼저 체 내 섭취 된 지방은 리파아제(lipase)라는 효소에 의해 분해 되어 흡수 되고, 또한 과 섭취 된 탄수화물은 당으로 분해되어 혈당을 높이거나 지방세포로의 분화를 촉진 시켜 지방세포 생성을 유도한다. 이러한 과정에서 지방이 축적되면 비만이 발생하게 된다.
체지방 감소 기전으로는 크게 두 가지로 나눌 수 있으며, lipase 등 효소의 작용을 억제하여 지방 소화흡수를 억제하는 방법과 지방세포의 합성을 직접적으로 억제하는 체지방 합성 억제 기전이 있다. 따라서 생체 내 지방을 생성하는 세포에 대한 연구로 지방전구세포인 3T3L-1이 in vitro 상에서 연구되고 있다(Applied Biological Chemistry volume 63, Article number: 9 (2020)).
비만으로부터 야기되는 다양한 합병증이 증가하면서 국내뿐만 아니라 전 세계 적으로 위에서 언급한 비만 발생의 과정을 억제하는 치료제에 대한 연구가 증가하고 있으나, 그 효과가 미미하며 부작용이 큰 실정이다. 대부분 식욕을 억제하는 약물들이 다수 존재하며 이는 간 손상, 호르몬의 변화 등을 나타내며 약제 복용 중단 시 체중의 재 증가 발생하는 경우가 많기 때문에 장기간 복용하는 경우도 발생한다. 투여 기간이 길어지고 투여 증례가 많아지는 만큼 문제가 발생할 확률도 높아지므로 발생 빈도가 적은 부작용이라도 심각한 부작용들은 간과할 수 없기때문에, 이러한 약물을 대체할 수 있는 무해한 자연 친화성이 높은 소재의 개발이 요구되고 있다.
체지방 감소 효과 소재의 후보군들 중 프로바이오틱스가 다수 연구 되고 있으며, 프로바이오틱스는 고지방 음식을 섭취하는 쥐들의 체중 증가를 예방하는데 도움을 주며 지방의 감소 및 비만관련 생화학적 지표를 유의하게 감소시킨다는 연구결과가 보고되었다. 따라서 지방 흡수의 억제 및 세포의 분화 억제에 효능을 갖는 안전하고 효과적인 프로바이오틱스 균주에 대한 개발이 필요한 실정이다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 신규 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주 또는 이의 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 체지방 감소 효과 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 체지방 감소 효과 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
도 1은 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 균주의 지방산 (fatty acid) 흡수능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 균주의 sucrose agar에서 EPS 생성능을 확인한 mucoid colony 사진이다.
도 5는 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 리파아제(Lipase) 억제 활성 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 전지방분화세포인 3T3-L1에서 지방세포 분화억제능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 9주간 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04을 마우스에 경구투여 후 체중 증가율 감소를 나타낸 그래프이다.
도 8은 9주간 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04을 마우스에 경구투여 및 부검 후 피하지방 및 복부지방(장간막지방 및 부고환지방) 감소를 나타낸 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서 다음의 신규 균주 또는 이의 배양물을 제공한다 : 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물.
본 발명에 따른 균주는 각각 한국생명공학연구원에 2021. 12. 06.로 수탁하였다. 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스 균주는 BCC-LH-04 로 기재되어 있다.
수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함한다.
[서열번호 1]
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000001
상기 BCC-LH-04 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 용혈성 및 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 BCC-LH-04 균주는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다:
지방산(FA) 농도 감소;
세포외다당류(EPS) 생성;
리파아제(lipase) 효소 억제 활성; 및
지방전구세포 분화 억제 활성.
구체적으로, 상기 BCC-LH-04 균주는 지방산 농도 감소, 세포외다당류 생성, 리파아제 효소 억제 활성 또는 지방전구세포의 분화 활성 억제에 의해 체지방 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. "치료 또는 개선"은 비만 또는 비만 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 비만 관련 질환은 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 개체에 투여되는 경우 체중 증가율 감소 또는 피하지방 및 복부지방(부고환지방, 신장주위지방)을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 소장세포 또는 소화관에서 지방 성분 흡수 억제, 탄수화물 흡수 저해 및/또는 지방 분화 억제 효과를 가질 수 있다. 상기 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 오염물질에 의해 유발되는 질환의 치료제 또는 피부 노화 개선을 위한 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
건강기능식품은 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하고, 건강기능식품은 비만의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 낙농제품, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
의약외품은 비만의 예방 또는 개선 목적으로 사용되는 제제로, 인간 또는 동물의 구조 또는 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 제제 이외의 제제를 의한다.
의약외품으로 사용하는 경우 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 사용하거나, 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 분리
프로바이오틱스 신규 균주를 선발하기 위해 원유(raw milk)을 시료로 사용하였다. 시료 1 mL을 멸균 식염수에 10배 연속 희석한 후 희석액 0.1 mL를 MRS 고체배지에 도말하여 혐기조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 MRS 액체배지에 37℃, 18시간 동안 순수 배양하였다.
실시예 2. 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 당 이용성
선별된 균주의 당 이용성을 분석하기 위해 API 50 CH kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 확인하였다. MRS 고체배지에서 배양된 균주의 콜로니를 2 MacFarland의 탁도로 조절하여 현탁액을 제조하였다. 탁도를 맞춘 API 50 CHL medium을 API 50CH 스트립 튜브에 120 μL씩 분주하고 큐플에 미네랄 오일(mineral oil)을 2 방울씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 및 48 시간 동안 배양하여 당 이용 패턴을 확인하였다. 동정 결과는 API web 프로그램(https://apiweb.biomerieux.com)을 사용하여 확인하였다.
동정 결과, 표 1에 표시된 바와 같이 락토바실러스 엑시도필루스 3 63.2%를 나타내었다.
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000002
실시예 3. 균주의 동정: 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석
균주의 동정을 위해 Solgent(Daejeon, Korea)에 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 의뢰하였다. 균주의 순수 배양액 1 mL에서 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 주형으로 16S rRNA 영역을 27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) primer로 PCR을 수행하여 DNA sequencing (Solgent)을 진행하였다. 염기서열 분석 결과를 토대로 NCBI의 BLAST 상의 Genebank 데이터베이스에 등록된 다른 표준균주와 상동성을 비교하였다.
염기서열 분석 결과 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지며(도 1), 본 발명자들은 위 유산균을 BCC-LH-04로 명하였고, 이 유산균은 Lactobacillus helveticus NBRC 15019T 와 99.7%의 상동성을 나타내었다. Mega 7 program을 이용하여 상동성을 분석하고 계통도를 얻었다(도 2). 이에 본 발명자는 상기 균주를 신규한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주로 동정하였고, Lactobacillus helveticus BCC-LH-04으로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 12월 06일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 14810BP). 또한, 상기 균주 염기서열은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) GenBank 에 등록하여 accession No. OL988623(BCC-LH-04)을 받았다.
실시예 4. 신규 미생물의 생리 활성 및 안전성 확인
1) 내산성 및 내담즙성 측정
인공 위액에서의 내산성 실험 및 인공담즙에서의 내담즙 실험은 개별적으로 처리 되었다. 인공위액은 HCL로 pH를 2.5로 조절한 MRS 액체배지에 펩신을 250 unit/mL가 되도록 첨가한 다음 멸균하여 제조하였다.
구체적으로 실험은 위에서 분리하여 선별한 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 내산성 및 내담즙성을 시험하기 위하여 MRS 액체배지에 접종하여 2회 이상 계대배양을 통해 활성을 확인하였다. 배양은 37℃의 혐기적인 조건에서 24시간 동안 진행되었으며 3600 rpm에서 15분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 회수 후 멸균 식염수 (0.85% NaCl)로 2회 세척한 후 상등액을 제거 한 뒤, pH가 2.5로 조절된 인공위액을 상등액과 동량으로 첨가한 뒤 혼합하여 균체가 인공위액에 잘 섞이도록 하였다. 혼합 후 37℃의 혐기적인 조건에서 배양하면서 0시간 및 2시간 후에 생존 균수를 측정하였다.
내산성 실험과 동일하게 배양 후 수거된 균체에 상등액과 동량의 0.3% oxgall이 첨가된 인공담즙액을 혼합하여 균체가 인공담즙액에 잘 섞이도록 하였다. 혼합 후 37℃ 혐기적인 조건에서 5시간동안 배양한 뒤 생존 균수를 측정하였다.
총균수는 배양액에서 1 mL을 취하여 10진 희석법을 통해 MRS 평판배지에 도말한 다음 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니의 수를 계수하여 생존 생균 수를 측정하였다.
내산성 및 내담즙성 확인 결과(표 2) 무처리 군에 비하여 각각 47.1% 및 20.8%의 높은 생존율을 보여서 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주는 우수한 내산성 및 내담즙성을 동시에 갖는 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000003
2) 용혈성 테스트(hemolysis test)
용혈성 테스트는 유산균이 인체 내에서 용혈성 독성이 없음을 확인하기 위한 것으로, 적혈구의 파괴 또는 분해되는 현상인 용혈성 여부를 검사하였다. Baumgartner 등의 방법에 의해서, 시험 균주를 Columbia blood agar에서 성장시키고 혐기성 조건 하에서 37℃ 에서 48시간 동안 배양 하였다. 균체 주위에 투명 환의 생성여부로 용혈성을 판단하였다. 본 발명의 균주의 용혈성 여부를 검사한 결과, 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04균주는 α-hemolysis(적혈구 헤모글로빈의 methemoglobin을 감소시켜서 녹색 colony을 형성함)로 혈액에 대해서 용혈성이 없이 인체에 무해한 것으로 확인되었다.
3) 항생제 내성 시험
원유(raw milk)에서 분리된 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 에 대한 항생제 내성 여부를 확인하기 위해 E-TEST을 이용한 MIC를 확인하였다. 자세히, 시험 균주는 MRS broth에 배양한 후 0.5~1.0 McFarland (1.5~3X108 CFU/mL) 농도로 희석 후 준비하였다. 균주 적정 한천배지(1.8%) 멸균 후, 실온에서 고형화하고 멸균된 면봉을 균주가 담긴 액체배지에 적신 후 꺼내서 한천배지에 lawn이 형성되도록 streaking을 한다. 접종한 균주가 한천배지에 잘 스며들도록 혐기조건에서 10~20분간 상온 방치 한다. 시험하고자 하는 항생제 strip을 한천배지 위에 적절한 거리를 유지하여 위치 시키고 37°C에서 48시간 혐기배양 하였다. 결과 판독은 균이 자라지 않는 strip 부위의 가장 밑 부분을 MIC로 확정하였다. 확인한 항생제는 암피실린(AM), 클린다마이신(CM), 클로람페니콜(CL), 에리트로마이신(EM), 스트렙토마이신(SM), 테트라사이클린(TC), 반코마이신(VA), 카나마이신(KM) 및 젠타마이신(GM)과 같은 9가지 이며, EFSA(European Food Safety Authority) 기준 cut-off 기준과 비교하여 수치가 미달일 경우 내성이 없음을 판정 하였다.
선발된 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 항생제 내성 양상을 조사한 결과, 표 3 에서 나타낸 바와 같이 테스트된 9가지(AM, CM, CL, EM, SM, TC, VA, KM) 모든 항생제에 대해 EFSA 기준으로 내성이 없음을 보였고, 다른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주들과 유사한 결과를 나타내어서 인체에 적용 가능함을 확인하였다.
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000004
실시예 5. 선발유산균의 사균 및 동결건조 분말 제조
선발 유산균의 in vitro 실험 수행을 위해, 유산균을 MRS 배지에 18 시간 배양한 뒤, 3600 rpm에서 15분 이상 원심분리하여 균체를 획득하여 상등액 제거 후 배양액 동량의 1xPBS로 1회 세척하였다. 세척한 균체에 배양 시 배지 용량의 1/10에 해당하는1xPBS를 첨가하여 농축한 뒤, 121°C에서 15분간 고압 멸균기를 이용하여 간접 멸균하였다.
멸균된 유산균 사균체는 -80°C의 초저온냉동고에서 24시간 냉동을 거친 뒤, 동결건조기로 48시간 동안 동결건조 하였다. 동결건조 된 분말은 수거하여 냉장 보관하며 실험 시 사용하였다.
실시예 6. 균주에 의한 지방산(FA) 흡수능 in vitro 평가 및 Exopolysaccharide 생성능 확인
시료내에 존재하는 지방산이 CoA 유도체로 전환되고, 산화되면서 probe에 발색을 유도하는 중간물질(H2O2)를 생성하는 원리를 이용하여 흡광도(OD 570nm)로 쉽게 측정할 수 있다.
배지 내 지방산을 감소시키는 균주가 체내에 흡수 되었을 때, 소장 내용액(gut fluid content) 에 녹아 있는 지방산(fatty acid, FA) 농도를 감소시켜서 체내로 흡수되는 지방산의 양을 줄여서 지방 생성을 저해할 수 있는 원리를 바탕으로 BCC-LH-04 균주의 지방산 흡수능을 확인 하였다.
장 환경으로부터 분리 보존된 균주들을 MRS agar 혹은 MRS(+0.05% cysteine) agar에 접종한 후 anaerobic chamber(WHITLEY A35 Workstation, Labconsult)에서 37°C 혐기배양 하였다. 48시간 배양한 후 single colony를 1mL MRS 혹은 MRS(+0.05% cysteine) broth에 접종(E-tube 사용)하여 37°C 에서 18~20h 동안 혐기배양 하였다. 0.5%(w/v) Brij58 및 0.25mM sodium palmitate이 들어있는 MRS broth 900μL 가 담긴 E-tube에 상기 배양된 균주 배양액 100μL 접종하여 37°C 에서 24h 동안 혐기배양 하였다. 배양액은 원심분리(13,000 rpm, 1 min, 4°C) 후 상등액을 회수하여 상등액 10μL에 남아있는 잔여 지방산(FA)농도를 측정하였다. 상등액의 지방산 양은 EnzyChrom™ Free Fatty Acid Assay Kit (Bio-Assay Systems, USA)를 이용하여 570nm의 흡광도를 측정하고 계산하였다. 표준물질의 정량곡선으로 균주 배양액 안의 지방산 양을 계산하고 접종하지 않은 대조군(negative control, NC) 대비하여 균주의 지방산 농도 감소능을 계산하고, 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, BCC-LH-04 균주는 접종되지 않은 대조구에 대비하여 유의하게 높은 56.1% 지방산 흡수능을 보였다. 이는 함께 시험된 같은 종의 다른 균주중에서 가장 우수하였고 상용화된 체지방 감소 기능성 균주인 Lactobacillus 복합물 (LCP)의 52.9% 지방산 흡수능 보다도 높은 결과를 나타내었다.
Exopolysaccharide(EPS)는 미생물이 대사 시 분비하여 축적되는 다당류로, 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로서 존재하는 1차 또는 2차 대사 산물이다. 유산균이 생성하는 EPS는 발효유제품에서 천연 안정제로 효능이 입증되었고, 최근에는 다양한 생리적인 기능성 소재로 연구되어왔다. 대표적으로 면역 관련 기능성이 보고 되었고 이 외에도 체지방 감소 및 콜레스테롤 저하 등의 효능도 보고되고있다. 유산균이 당을 섭취하여 EPS를 생성하면 체내에 잘 흡수 되지 않는 다당류로 변환되어 배출됨으로 기존 당과 경쟁적으로 작용될 수 있으며, 이는 칼로리 흡수를 저하시키는 긍정적인 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서 지방산이 우수한 균주들의 EPS 생성능 검증을 통해 추가적인 체지방 감소 관련 기능성을 확인하였다. EPS 생성능 확인을 위해 sucrose agar 1% trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% dipotassium phosphate, 0.5% diammonium citrate, 5% sucrose, 15% agar, pH 7.0)에 선발 균주들을 스트리킹 도말하여 37°C, 혐기 조건에서 48시간 배양한 뒤 콜로니의 점성 여부를 확인하였으며, 또한 sucrose broth에 배양하여 crude EPS 생성량을 확인 하였다. 도 4와 같이 BCC-LH-04 균주는 점성을 띠는 mucoid colony를 생성하였고, crude EPS는 0.95±0.09 g/L 정도 생산하였다.
실시예 7. 리파아제(Lipase) 효소 억제 활성
췌장 리파아제는 트리글리세라이드를 2-모노아실글리세롤(2- 과 지방산으로 분해하는 지방분해효소로, 섭취된 지방을 50% 내지 70% 정도 분해하는 효소이다. 리파아제 활성이 증가하게 되면 체내 섭취되는 지방을 더욱 흡수하여 체내 지방세포의 축적을 증가시킨다. 이러한 췌장 리파아제의 활성을 억제하면 음식물로부터 흡수된 지방의 분해가 감소하게 되며, 체내 지방 흡수가 감소하게 되어 결과적으로 칼로리 섭취량을 감소시켜 몸무게를 줄여주는 다이어트 효과가 있다.
리파아제 억제능은 Lipid(tryclyceride)에 리파아제를 처리한 혼합물에 선발 균주 일정 시간 반응 후 최종적으로 분해되어 나오는 지방산(FA, fatty acid) 농도를 측정하여, 균주 처리 시 리파아제 활성을 얼마나 억제하는지를 평가하였다.
구체적인 시험방법은 다음과 같다. Triolein(80mg), Lecithin(10mg) 및 Taurocholic acid(5mg)을 9 mL의 TES buffer(0.1M TES, 0.1M NaCl, pH7.0, Biosaesang, South Korea)에 첨가하여 lipid solution을 제조하고 10unit/mL로 희석된 Pancreatic Lipase(500unit/mg) 용액을 준비한다. 100μL의 열처리 사균체 용액과 lipid solution 100uL 및 50uL의 Lipase 용액(10unit)을 혼합하여 37℃의 heat-block에 30분간 반응시킨다. 반응 후 분해된 지방산(FA)의 측정은 FFA Assay kit을 이용하여 측정하였다. 선발된 4균주들의 리파아제 억제 활성은 균주가 처리되지 않은 혼합물(대조군)에서 유리된 지방산(FA)의 양과 비교하였다(도 5).
BCC-LH-04 균주가 34.3%로 우수한 리파아제 활성 억제능을 보였으며, LF-01균주는 리파아제 활성 억제능을 보이지 않았다. 체지방 감소 효능을 지닌 유산균으로 알려진 LG균주의 억제능과 비교하였을 때, 유의하게 더 높은 수치인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 지방전구세포 분화 억제 활성
1) 3T3-L1 지방세포 분화 유도
미국표준균주은행(ATCC, American Type Culture Collection)에서 구입한 생쥐 유래 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)인 3T3-L1 cell을 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum, Gibco, USA)이 포함된 DMEM(ATCC, USA)배지를 이용하여 5% CO2 incubator, 37°C 조건에서 배양하였다.
3T3-L1 mouse embryonic fibroblast를 지방 세포로 분화시키는 과정은 다음과 같다. 3T3-L1 세포가 100% confluence를 나타내는 시점(day 0)으로부터 2일 후(day 2)에 120% confluence의 세포를 사용한다. 배양된 3T3-L1 세포의 기존 배지를 제거한 후, 10% FBS, 1% P/S, 1μg/mL insulin(Sigma, USA), 0.5mM 3-isobutyl-1-methlxanthine(IBMX, Sigma, USA) 및 1μM dexamethasone(Sigma, USA)이 포함된 DMEM(분화 배지, MDI)로 배양한다. 분화 배지 처리 2일 후 (day 4)에 10% FBS와 1μg/mL insulin이 포함된 DMEM(인슐린 배지)로 교환하여 배양하였다. 이로부터 2일 후 (day 6)에 10% FBS만 포함된 기존 DMEM 배지(안정화 배지)로 교환하여 배양하였다. 안정화 배지 교체 4일 후(day 10) 3T3-L1 세포의 90% 이상이 지방세포로 분화되어 지방구를 형성하면 완전히 분화되었다고 본다.
2) 3T3-L1 지방세포 내 지방축적 억제능 평가
배양한 3T3-L1 지방세포에 분화 배지를 첨가하는 시점(day 0)에 각각의 시험 균주 열처리/동결건조 분말을 1 mg/mL(0.1%)로 함께 첨가하였다. 분화 배지 처리 2일 뒤 균주 및 분화 배지를 제거 한 후, 위에서 설명 한 분화 유도 방법으로 인슐린 배지 및 안정화 배지 교체의 과정을 거쳐 총 10일간 분화 시킨다.
분화 완료 후 지방구가 생성된 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte) 배양액을 1xPBS로 2번 세척하여 배양액을 제거하고, 10% 포르말린(Biosesang, South Korea)으로 30분 동안 첨가하여 세포를 고정시켰다. 포르말린 제거 후, 60% isopropanol을 처리하여 5분간 세포를 추가 고정한다. Isopropanol을 제거 한 뒤, 0.5% Oil-Red O(Sigma, USA)와 DW가 3:2 비율로 희석된 염색 시약을 고정된 세포에 처리하여 20분 동안 염색시켰다. 염색 시약을 제거한 뒤, 1xPBS 로 2회 세척하여 염색된 지방구를 현미경으로 관찰하였다.
분화도의 측정은 Isopropanol 100%(Duksan, South Korea)를 염색된 세포에 처리하여 염색 시약을 유리시킨 뒤, Microplate reader를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과(도 6) 지방세포 분화 정도를 나타낸 도면이다. 도 6에 나 타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 BCC-LH-04 사균체를 처리한 군이 72.4%로 높은 지방세포 분화 억제능을 보였으며, 상용화 된 체지 기능성 균주인 Lactobacillus 복합물(LCP) 보다도 더 우수한 억제능을 보였다.
실시예 9. 실험동물에서의 체지방 감소 효과 실험
마우스에서의 체지방 감소 효과를 확인하기 위하여, 5주령 C57BL/6J(Charles River Japan) 마우스를 1주간 순치 후, 3그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 제1군은 보통식이(ND)를 투여한 군, 제2군은 고지방식이 (HFD, 60 Kcal% fat diet, D12492)를 투여한 군, 제3군은 고지방식이(HFD)와 함께 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04(109 CFU/mouse)을 투여한 군으로, 주 5회 경구투여 하였다. 매주 2회 체중(body weight)과 식이 섭취량(food intake)을 확인하고 9주 투여 후에 부검하여 지방 조직의 무게 및 크기를 측정하였다.
1) 마우스 체중 증가율의 감소
0주차 체중을 100%로 하여 시간에 다른 체중 증가율을 측정하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 제3군(HFD+BCC-LH-04)은 제2군(HFD)과 비교하여, 1주 후부터 0 주차 체중을 100%로 하여 시간에 따른 체중 증가율을 측정하여 도 6에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 제3군(HFD+BCC-LH-04)은 제2군(HFD)과 비교하여, 1주 후부터 체중 증가율에 차이를 나타내었다. 9주차에서 제3군의 체중 증가율이 165.94%이고, 제2군의 증가율은 176.51%로, 제3군은 제2군보다 체중 증가율이 10.6% 감소하였다. 하기 표 4에서 보는 바와 같이, 제3군의 9주간 체중 증가량은 15.35이고, 제2군의 9주간 체중 증가량은 17.98로, 약 15%의 차이를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 고지방식이를 한 제2군과 고지방식이를 하면서 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04을 동시 투여한 제3군을 비교한 결과, 1주 후부터 체증 증가율에 차이를 나타내기 시작하면서 시간이 갈수록 체중 증가율이 차이가 현저히 커지는 것을 알 수 있다.
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000005
2) 피하지방, 장간막지방 및 부고환지방의 감소
9주간 투여 및 부검 후에 피하지방, 장간막지방 및 부고환지방의 양을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000006
상기 표 5 및 도 8에서 보는 바와 같이, 제3군의 체지방은 제2군의 체지방의 양과 비교하여 피하지방은 37.2%, 장간막지방은 30.0%, 부고환지방은 20.6% 감소한 것을 확인하였다. 따라서, 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04이 마우스 체지방 감소 개선에 있어 현저한 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC 14810BP(BCC-LH-04)
수탁일자 : 2021. 12. 06.
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04인 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물은 지방산 (fatty acid) 농도 감소와 리파아제(Lipase) 효소 억제 활성을 통해 지방 세포 분화 및 세포 내 지방 축적을 억제하여, 우수한 체지방 감소 효과를 갖는다.
또한, 소장세포 또는 소화관에서 지방 분화 억제 효과로 인해, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
더욱이, 체중 증가량의 감소 및 체지방량의 감소로 시킴으로써, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.
Figure PCTKR2022021339-appb-img-000007

Claims (9)

  1. 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열을 포함하는 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 균주 또는 이의 배양물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 용혈성 및 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 하는 균주 또는 이의 배양물.
  4. 제1항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주 또는 이의 배양물:
    지방산(FA) 농도 감소;
    세포외다당류(EPS) 생성;
    리파아제(lipase) 효소 억제 활성; 및
    지방전구세포 분화 억제 활성.
  5. 제4항에 있어서, 지방산 농도 감소, 세포외다당류 생성, 리파아제 효소 억제 활성 또는 지방전구세포의 분화 활성 억제에 의해 체지방 감소 효과를 나타내는 균주 또는 이의 배양물.
  6. 제1항에 있어서, 개체에 투여되는 경우 체중 증가율 감소, 또는 피하지방 및 복부지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
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