WO2023286617A1 - ポリオキシエチレン誘導体に含まれる反応性低分子化合物の分析方法 - Google Patents

ポリオキシエチレン誘導体に含まれる反応性低分子化合物の分析方法 Download PDF

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昌樹 神谷
輝 鈴木
宏樹 吉岡
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日油株式会社
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    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the compound of formula (1) has an N-succinimidyloxycarbonylamino group and an N-succinimidyloxycarbonyl group at both ends, and these functional groups are reactive with amino groups. Therefore, application as a bifunctional linker has also been proposed (Patent Document 1, Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 3
  • the compound of formula (1) when the compound of formula (1) is contained in the polyoxyethylene derivative, the compound of formula (1) also reacts with the bio-related substance like the polyoxyethylene derivative when chemically modifying the bio-related substance such as protein. It causes impurities in the drug product. Therefore, highly sensitive analysis is required in order to control the content of the compound of formula (1) contained in a small amount in the polyoxyethylene derivative.
  • Methods for detecting low-molecular-weight compounds with high sensitivity generally include ultraviolet-visible spectroscopic detectors, fluorescence detectors, mass spectrometry detectors, and the like.
  • the compound of formula (1) cannot be detected because the fluorescence detector can only detect compounds that exhibit fluorescence.
  • mass spectrometry detectors are very expensive and have many limitations such as the inability to use non-volatile eluents and contamination of the detector when measuring high-concentration samples.
  • UV-visible spectroscopic detectors are inexpensive, can be used with many eluents regardless of whether they are volatile or non-volatile, and do not contaminate the detector with high-concentration samples, making them highly versatile detectors. It is widely used, and it is preferable to use an ultraviolet-visible spectroscopic detector as a detector also in the analysis method of the present invention.
  • the wavelength used for detection ultraviolet rays with a wavelength shorter than 200 nm are used, but ultraviolet rays with a wavelength of 190 to 200 nm are preferably used, and ultraviolet rays with a wavelength of 194 nm are particularly preferably used.
  • the separation mode used in the analysis method of the present invention is preferably reversed-phase chromatography, and silica-based particles modified with an octadecyl group (C18), an octyl group (C8), a phenyl group (Ph), a triacontyl group (C30) or similarly modified More preferred is reversed-phase chromatography using a column packed with polymer-based particles modified with modified polymer bases, and particularly preferred is reversed-phase chromatography using a column packed with silica-based particles modified with octadecyl groups.
  • a stainless steel column having a column length of 5 to 25 cm and an inner diameter of 1 to 6 mm can be used for the analysis, and a column having a length of 15 to 25 cm and an inner diameter of 2 to 5 mm is preferable.
  • the particle size of the filler is preferably 2-10 ⁇ m, particularly preferably 2-5 ⁇ m.
  • the filler is preferably a wholly porous particle or a superficially porous particle, and preferably has a pore size of 5 to 50 nm, particularly preferably 7 to 30 nm.
  • the column temperature is preferably 5 to 60°C, particularly preferably 20 to 40°C.
  • a mixture of water and an organic solvent can be used as an eluent (mobile phase for analysis) used for analysis.
  • organic solvent polar solvents miscible with water such as acetonitrile, methanol, and 2-propanol can be used, and acetonitrile is preferably used.
  • the mixing ratio of the organic solvent can be in the range of 10 to 80% by volume, preferably in the range of 20 to 50%.
  • the water and the organic solvent can be premixed or continuously mixed by gradient analysis, with premixed eluents being particularly preferred. Since the compound of formula (1) is known to react with water under neutral to basic conditions and decompose, the eluent must be under acidic conditions. Additives can be added to the eluent, preferably 0.01 to 1% of an acidic substance or a salt thereof.
  • the acidic substance to be added has a large molar extinction coefficient in ultraviolet light with a wavelength of 190 to 200 nm
  • the baseline of the chromatogram and the peak of the compound of formula (1) may overlap, resulting in a decrease in peak detection sensitivity and analytical reproducibility. cause a decrease in
  • the pKa is preferably 4 or less.
  • the acidic substance to be added is preferably an acidic substance having a maximum molar extinction coefficient of 20 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 or less and a pKa of 4 or less in ultraviolet rays with a wavelength of 190 to 200 nm, and a maximum molar extinction coefficient of 5 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 or less and pKa. is 3 or less, more preferably phosphoric acid or perchloric acid, and most preferably phosphoric acid.
  • the eluent feeding rate is preferably 0.1 to 4 mL/min, particularly preferably 0.2 to 1.5 mL/min.
  • the analytical sample of the present invention is a polyoxyethylene derivative containing the compound of formula (1).
  • the polyoxyethylene derivative is dissolved using an aprotic organic solvent, and the eluent used for analysis is It is preferable to dissolve using a solvent miscible with.
  • a solvent miscible with In general, in liquid chromatography, when the eluent and the dissolution liquid of the analysis sample are different, ghost peaks may appear that interfere with the analysis. Therefore, it is preferable to use the organic solvent used for the eluent.
  • an acidic substance can be added as an additive to the solution of the analytical sample. is preferably used, and it is particularly preferable to use trifluoroacetic acid.
  • the concentration of the polyoxyethylene derivative is preferably 50-300 mg/mL, particularly preferably 50-200 mg/mL.
  • the sample injection amount (volume) at the time of analysis is preferably 0.2% or more and 0.5% or less, particularly preferably 0.2% or more and 0.3% or less, of the column volume.
  • the sample concentration used for analysis is C (mg/mL)
  • the sample injection volume is I (mL)
  • the column volume is V (mL)
  • the sample volume per column volume is expressed as "C ⁇ I ⁇ V”.
  • C ⁇ I ⁇ V is preferably 0.1 or more and 1.5 or less, and particularly preferably 0.1 or more and 0.6 or less.
  • a and b are the average number of added moles of oxyethylene groups, each being 0 to 5000, preferably 0 to 1000, and a+b being 20 or more.
  • Compounds having 2 to 8 hydroxyl groups in the definition of Z in formula (2) and having 2 to 21 carbon atoms and optionally containing oxygen and/or nitrogen atoms include, for example, ethylene glycol and triethanol.
  • the alkoxy group in the definition of X 1 in formula (2) includes, for example, a linear or branched alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group or an isopropyloxy group.
  • a methoxy group is preferred, and a methoxy group is more preferred.
  • X2 is an N - succinimidyloxycarbonyl group.
  • Z in formula (2) is a glycerin residue.
  • Z in formula (2) is a xylitol residue.
  • Z in formula (2) is a pentaerythritol residue.
  • Z in formula (2) is a hexaglycerin residue.
  • L 1 and L 2 in formula (2) are each independently a divalent spacer, and these spacers are not particularly limited as long as they are groups capable of forming a covalent bond, but preferably ester A bond, an amide bond, an ether bond, a thioether bond, a urethane bond, a urea bond, or an alkylene group that may contain these bonds, more preferably an ester bond, an amide bond, an ether bond, a urethane bond, or these is an alkylene group which may contain a bond, and particularly preferred embodiments are those shown in the following group (I). Two to five spacers of group (I) may be combined.
  • L 1 in formula (2) is (z1), (z2), (z3), (z4), (z5), (z6), (z7), (z8), (z9) of group (I) , (z10) are preferred, and (z1), (z2), (z6) and (z9) are more preferred.
  • L 2 in formula (2) is (z2), (z3), (z4), (z5), (z6), (z7), (z8), (z9), (z10) of group (I) are preferred, and (z2), (z6) and (z9) are more preferred.
  • p in formula (2) is preferably 0.
  • the present invention is not limited to the configurations described in the above embodiments, and includes, for example, the following configurations.
  • the skeleton of the compound of formula (4) may be the skeleton of formula (11) below
  • the skeleton of the compound of formula (5) may be the skeleton of formula (12) below.
  • the compound of formula (11) and the compound of formula (12) can also exhibit the same effect as the above embodiment.
  • Example 1 10.0 mg of the compound of formula (1) ( ⁇ -Ala-NHS) was weighed into a 50 mL volumetric flask, dissolved in acetonitrile, and then diluted to 0.2 mg/mL. 0.5 mL of this solution was accurately weighed into a 100 mL volumetric flask and filled up with an acetonitrile solution containing 0.1% TFA to prepare an additive solution (0.001 mg/mL). Next, the compound of formula (8) (manufactured by NOF, SUNBRIGHT ME-200HS) is added to a 1 mL volumetric flask.
  • Example 1 100 mg of was weighed out, and 0.5 mL of the additive solution was accurately weighed and added thereto, and then diluted with 0.1% TFA-containing acetonitrile to prepare an analysis sample solution (100 mg / mL, for the compound of formula (8) ⁇ -Ala-NHS was added at 5 ppm).
  • the analysis sample solution was subjected to HPLC measurement under the following conditions. The peak height of ⁇ -Ala-NHS in the analysis sample at this time was 2325 and the S/N ratio was 56.
  • HPLC apparatus Alliance 2695 (Nippon Waters Co., Ltd.)
  • Flow rate 1.0 mL/min
  • Analysis time 20 minutes
  • Column temperature: 40°C Eluent: water/acetonitrile 7/3, containing 0.02% phosphoric acid
  • Detector UV-visible spectroscopic detector (194 nm) (Nippon Waters Co., Ltd.)
  • Example 2 When preparing the analysis sample solution, the compound of formula (8) to be weighed is changed from 100 mg to 30 mg, and the amount of the added solution is changed from 0.5 mL to 0.15 mL. 5 ppm of ⁇ -Ala-NHS added to the compound of formula (8)) to 30 mg/mL (5 ppm of ⁇ -Ala-NHS added to the compound of formula (8)) under the same conditions as in Example 1. HPLC measurements were performed at The peak height of ⁇ -Ala-NHS in the analytical sample at this time was 698 and the S/N ratio was 11.
  • sample concentration C (mg / mL) in Example 2 is 30 mg / mL
  • sample injection volume I (mL) is 0.01 mL
  • the present invention provides a highly sensitive analytical method for low-molecular-weight compounds contained in polyoxyethylene derivatives.

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Abstract

本発明は、ポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）の化合物を逆相クロマトグラフィーで分離した後、当該化合物を紫外可視分光検出器にて検出する分析方法であり、検出波長として２００ｎｍより短波長の紫外線を用い、分析用移動相への添加剤として１９０～２００ｎｍにおける最大モル吸光係数が２０Ｍ－１ｃｍ－１以下かつｐＫａが４以下の酸性物質を用いることを特徴とする分析方法を提供する。

Description

ポリオキシエチレン誘導体に含まれる反応性低分子化合物の分析方法
　本発明は、ポリオキシエチレン誘導体に含まれる低分子化合物の高感度分析方法に関する発明である。さらに詳しくは、ポリペプチド、生理活性タンパク質、酵素などへのポリオキシエチレン修飾剤に用いる活性基を末端に有するポリオキシエチレン誘導体に含まれる低分子化合物の高感度分析方法に関する。
　近年、医薬品用途を目的とした高分子化合物の開発が盛んに行われており、その一つに末端活性化ポリオキシエチレン誘導体がある。その主な用途として、ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質に化学修飾することで、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリオキシエチレン誘導体で修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることが挙げられる。生体関連物質の毒性や抗原性を低減する効果は修飾するポリオキシエチレン誘導体の分子量や修飾する量により異なり、例えば抗原性の高い生体関連物質の場合は多数のポリオキシエチレン誘導体を修飾することで生体関連物質の抗原性を低減可能である。
　ポリオキシエチレン誘導体の構造は通常、修飾するタンパク質などの生体関連物質の表面に存在するアミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、不飽和結合などの官能基と化学的に結合可能な活性基をポリオキシエチレンの末端に有する。例えば、生体関連物質のアミノ基を修飾する場合の活性基としては、ホルミル基、アセタール基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基、Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル基などがある。特に、Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル基は、温和な条件下で反応し、また、生体関連物質の表面にはＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基と反応可能なアミノ基が比較的多く存在していることから、生体関連物質の化学修飾に有用な活性基である（非特許文献１）。
　Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル基を有するポリオキシエチレン誘導体は、末端にカルボン酸を有するポリオキシエチレン誘導体とＮ－ヒドロキシスクシンイミドをジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤存在下で反応させることで合成することができる。また縮合反応時には、試薬同士が副反応を起こし、式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で示される反応性の低分子化合物（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル－β－アラニン　Ｎ－スクシンイミジルエステル、β－Ａｌａ－ＮＨＳ、ＣＡＳ登録番号：２１９９４－８９－８）が不純物として生成することが知られており（非特許文献２，３）、市販されているＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基を有するポリオキシエチレン誘導体にはおおよそ１００～１０００ｐｐｍ程度の式（１）の化合物が含まれている。
　式（１）の化合物は、両末端にＮ－スクシンイミジルオキシカルボニルアミノ基およびＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基を有しており、これらの官能基はアミノ基との反応性を有していることから、二官能性リンカーとしての応用も提案されている（特許文献１、非特許文献３）。しかしながら式（１）の化合物がポリオキシエチレン誘導体に含まれる場合、タンパク質などの生体関連物質を化学修飾する際に式（１）の化合物もポリオキシエチレン誘導体と同様に生体関連物質と反応して製剤中に不純物を生じる。そのためポリオキシエチレン誘導体に少量含まれる式（１）の化合物の含量を管理するため、高感度に分析することが要求される。
　式（１）の化合物のような低分子不純物を分析する方法として、液体クロマトグラフィーを用いる方法が一般的であり、高感度に検出する方法としては、紫外可視分光検出器、蛍光検出器、質量分析検出器などが挙げられる。しかしながらこれらの検出器を用いて式（１）の化合物を高感度に検出する分析法についてはこれまで報告されていない。
　以上のように、末端にＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基を有するポリオキシエチレン誘導体の合成時に副生する式（１）の化合物は、少量であっても生体関連物質と反応し不純物副生の原因となることから、医薬品の品質管理の観点において、ポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）の化合物を高感度に分析することが求められる。
国際公開２０１０／１０７５２０号 国際公開１９９７／００３１０６号
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　２０１３ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１９６８，　２４，　６９３５－６９３９ Ｒｅａｃｔｉｖｅ　＆　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　２００７，　６７，　５２９－５３９
　そこで本発明が解決しようとする課題は、ポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
の化合物を高感度に分析できる方法を提供することである。
　本発明は、末端に生体関連物質と化学結合するＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基を有するポリオキシエチレン誘導体に関して、逆相液体クロマトグラフィーで分析を行い、紫外可視分光検出器で得られるクロマトグラムの面積値より極少量含まれる式（１）の化合物を高感度に分析する方法であることを特徴とする。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（２）に関する。
（１）　ポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
の化合物を逆相クロマトグラフィーで分離した後、当該化合物を紫外可視分光検出器にて検出する分析方法であり、検出波長として２００ｎｍより短波長の紫外線を用い、分析用移動相への添加剤として１９０～２００ｎｍにおける最大モル吸光係数が２０Ｍ－１ｃｍ－１以下かつｐＫａが４以下の酸性物質を用いることを特徴とする分析方法。
（２）　ポリオキシエチレン誘導体が式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｚは２～８個の水酸基を持ち、２～２１個の炭素原子を有した酸素原子及び／又は窒素原子を含んでも良い化合物の残基であり、ＯＡ１およびＯＡ２はオキシエチレン基であり、ａおよびｂは、独立してそれぞれ０～５，０００でかつａ＋ｂは２０以上であり、Ｌ１およびＬ２は、独立してそれぞれエステル結合、ウレタン結合、アミド結合、ウレア結合、エーテル結合およびチオエーテル結合から選択される結合をアルキレン鎖中又は末端に有していてもよいアルキレン基であり、ｐおよびｑは、独立してそれぞれ０または１であり、ｓは、０～８であり、ｔは、１～８であり、２≦ｓ＋ｔ≦８であり、Ｘ１はアルコキシ基またはＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基であり、Ｘ２はＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基である。ａ、ｂ、ＯＡ１、ＯＡ２、ｐ、ｑ、Ｌ１、Ｌ２およびＸ１は、それぞれ一分子中に複数存在する場合、互いに同一又は異なっている。）で示される上記（１）記載の分析方法。
　本発明は、ポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）の化合物を高感度で分析することで、式（１）の化合物含量の少ないポリオキシエチレン誘導体の提供が可能となる。生体関連物質への修飾に用いられるポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）の化合物は、少量であっても医薬品製造時に不純物の生成原因となることから、本発明は医薬品の品質管理において極めて有用である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　低分子化合物を高感度に検出する方法としては、一般的に紫外可視分光検出器、蛍光検出器、質量分析検出器などが挙げられる。しかしながら蛍光検出器は蛍光を示す化合物でなければ検出できないことから式（１）の化合物は検出できない。また質量分析検出器は非常に高価であり、不揮発性の溶離液を使用できない、高濃度サンプルを測定すると検出器が汚染されるなどの制限も多い。一方で紫外可視分光検出器は安価であり、揮発性・不揮発性に関わらず多くの溶離液を使用可能であり、高濃度サンプルによる検出器の汚染もないことから、汎用性の高い検出器として広く普及しており、本発明の分析方法においても検出器は紫外可視分光検出器を用いることが好ましい。検出に用いる波長（検出波長）としては、２００ｎｍより短波長の紫外線を用いるが、１９０～２００ｎｍの紫外線を用いることが好ましく、１９４ｎｍの紫外線を用いることが特に好ましい。
　本発明の分析方法に用いる分離モードは逆相クロマトグラフィーが好ましく、オクタデシル基（Ｃ１８）、オクチル基（Ｃ８）、フェニル基（Ｐｈ）、トリアコンチル基（Ｃ３０）を修飾したシリカベース粒子または同様に修飾されたポリマーベース粒子を充填したカラムを用いた逆相クロマトグラフィーがより好ましく、オクタデシル基を修飾したシリカベース粒子を充填したカラムを用いた逆相クロマトグラフィーが特に好ましい。分析に用いるカラムはカラム長５～２５ｃｍ、内径１～６ｍｍのステンレス製のものを用いることができ、カラム長１５～２５ｃｍ、内径２～５ｍｍのものが好ましい。充填剤の粒子径は２～１０μｍが好ましく、２～５μｍが特に好ましい。充填剤は全多孔性粒子または表面多孔性粒子のものが好ましく、細孔径は５～５０ｎｍのものが好ましく、７～３０ｎｍのものが特に好ましい。カラム温度は５～６０℃が好ましく、２０～４０℃が特に好ましい。分析に用いる溶離液（分析用移動相）は、水と有機溶剤の混合液を用いることができる。有機溶剤の種類としては、アセトニトリル、メタノール、２－プロパノールなどの水と混和する極性溶剤を用いることができ、アセトニトリルを用いるのが好ましい。有機溶剤の混合割合は、１０～８０体積％の範囲で混合することができ、２０～５０％の範囲で混合することが好ましい。また、水と有機溶剤は事前に混合することができ、またグラジエント分析により連続的に混合することができ、事前に混合した溶離液を用いることが特に好ましい。式（１）の化合物は中性～塩基性条件の水と反応して分解することが知られていることから溶離液は酸性条件であることが必要である。溶離液には添加剤を加えることができ、０．０１～１％の酸性物質またはその塩を添加することが好ましい。添加する酸性物質の１９０～２００ｎｍの波長の紫外線におけるモル吸光係数が大きい場合、クロマトグラムのベースラインと式（１）の化合物のピークが重複する場合があり、ピーク検出感度の低下および分析再現性の低下の原因となる。また、式（１）の化合物の分解を抑制する観点から、ｐＫａが４以下であることが好ましい。添加する酸性物質は１９０～２００ｎｍの波長の紫外線における最大モル吸光係数が２０Ｍ－１ｃｍ－１以下かつｐＫａが４以下の酸性物質が好ましく、最大モル吸光係数が５Ｍ－１ｃｍ－１以下かつｐＫａが３以下の酸性物質がより好ましく、リン酸、過塩素酸を用いることがさらに好ましく、リン酸が最も好ましい。溶離液の送液する速度は０．１～４ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．２～１．５ｍＬ／ｍｉｎが特に好ましい。
　本発明の分析試料は式（１）の化合物を含んだポリオキシエチレン誘導体である。この分析試料サンプルの調製方法において、式（１）の化合物は前述の通り水と反応して分解することから、ポリオキシエチレン誘導体は非プロトン性有機溶剤を用いて溶解し、分析に用いる溶離液と混和する溶剤を用いて溶解するのが好ましい。また、一般的に液体クロマトグラフィーでは、溶離液と分析試料の溶解液が異なる場合に分析を妨害するゴーストピークが現れる場合があるため、溶離液に用いた有機溶剤を用いることが好ましい。さらに、式（１）の化合物の加水分解を抑制するため、分析試料の溶解液に添加剤として酸性物質を加えることができ、酸性物質としては、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡともいう）を用いることが好ましく、トリフルオロ酢酸を用いることが特に好ましい。
　ポリオキシエチレン誘導体を溶解液に溶解させたときの濃度を高くすることで含有する式（１）の化合物の濃度も増加することから分析感度は向上するものの、高すぎる場合はピーク分離が悪くなることが知られている。そのためポリオキシエチレン誘導体の濃度は５０～３００ｍｇ／ｍＬが好ましく、５０～２００ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。分析時の試料注入量を多くすることでカラムへ導入されるポリオキシエチレン誘導体および含有する式（１）の化合物の量が増加することから分析感度は向上するものの、本発明の分析試料を非プロトン性有機溶剤を用いて溶解する場合は、試料注入量を増加することでピーク分離が悪くなることが知られている。また試料注入量が少ない場合は注入量の再現性が悪くなり、分析結果の再現性も悪くなる。そのため分析時の試料注入量（体積）はカラム体積の０．２％以上０．５％以下が好ましく、０．２％以上０．３％以下が特に好ましい。
　分析に用いる試料濃度　Ｃ　（ｍｇ／ｍＬ）、試料注入量　Ｉ　（ｍＬ）、カラム体積　Ｖ　（ｍＬ）としたとき、カラム体積当たりの試料量は「Ｃ×Ｉ÷Ｖ」で表され、小さい場合は感度が悪くなり、大きい場合はピーク分離が悪くなることから、０．１以上１．５以下が好ましく、０．１以上０．６以下が特に好ましい。
　本発明の分析方法の検出感度の目安としてシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が挙げられ、５ｐｐｍ相当の式（１）の化合物を含有するポリオキシエチレン誘導体を分析した場合、式（１）の化合物に由来するピークのＳ／Ｎ比は１０以上が好ましく、３０以上がさらに好ましい。
　式（２）の定義中、ａおよびｂはオキシエチレン基の平均付加モル数であり、それぞれ０～５０００であり、好ましくは０～１０００であり、かつａ＋ｂは２０以上である。
　式（２）中のＺの定義における２～８個の水酸基を有し、２～２１個の炭素原子を有する酸素原子および／または窒素原子を含んでも良い化合物としては、例えばエチレングリコール、トリエタノールアミン、グリセリン、ジグリセリン、テトラキス（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、キシリトール、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール、ヘキサグリセリン等が挙げられ、エチレングリコール、グリセリン、ペンタエリスリトールが好ましく、エチレングリコールがより好ましい。
　式（２）中のＬ１およびＬ２の定義におけるアルキレン基としては、例えば炭素数１～６の直鎖状または分枝状のアルキレン基が挙げられ、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、ペンチレン基がより好ましい。
　式（２）中のＸ１の定義おけるアルコキシ基としては、例えば炭素数１～６の直鎖状または分枝状のアルコキシル基が挙げられ、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基またはイソプロピルオキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。Ｘ２はＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基である。
　式（２）のポリオキシエチレン誘導体の好適な様態のひとつである以下の式（３）において、式（２）中のＺはエチレングリコール残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式（２）のポリオキシエチレン誘導体の好適な様態のひとつである以下の式（４）において、式（２）中のＺはグリセリン残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式（２）のポリオキシエチレン誘導体の好適な様態のひとつである以下の式（５）において、式（２）中のＺはキシリトール残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式（２）のポリオキシエチレン誘導体の好適な様態のひとつである以下の式（６）において、式（２）中のＺはペンタエリスリトール残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式（２）のポリオキシエチレン誘導体の好適な様態のひとつである以下の式（７）において、式（２）中のＺはヘキサグリセリン残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式（２）中のＬ１及びＬ２は、それぞれ独立して、２価のスペーサーであるが、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、好ましくは、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、ウレア結合、またはこれらの結合を含んでいてもよいアルキレン基であり、より好ましくは、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、ウレタン結合、またはこれらの結合を含んでいてもよいアルキレン基であり、特に好ましい態様は、下記の群（Ｉ）に示されるものである。また、群（Ｉ）のスペーサーを２つから５つ組み合わせても良い。
群（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（ｚ１）～（ｚ１０）において、式中のｒは０～１０の整数を示し（ただし、（ｚ１）においてはｒは０ではない）、好ましくは０～６の整数を示し、更に好ましくは０～５の整数を示す。また、（ｚ２）～（ｚ１０）において、式中のそれぞれのｒは同一でも、異なっていてもよい。
　式（２）中のＬ１は、群（Ｉ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）、（ｚ１０）が好ましく、（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ６）、（ｚ９）がより好ましい。
　式（２）中のＬ２は、群（Ｉ）の（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）、（ｚ１０）が好ましく、（ｚ２）、（ｚ６）、（ｚ９）がより好ましい。
　式（２）中のｐは、０が好ましい。
変形例
　本発明は、上記実施形態で説明した構成に限らず、例えば、以下の構成も本発明に含まれる。
　例えば、式（４）の化合物の骨格を以下の式（１１）の骨格としてもよいし、式（５）の化合物の骨格を以下の式（１２）の骨格としてもよい。これら式（１１）の化合物及び式（１２）の化合物においても上記実施形態と同様の効果を奏し得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　本発明を実施例および比較例によりさらに詳しく説明する。なお、本発明は以下の実施例に限られるものではない。
（実施例１）
　５０ｍＬメスフラスコに式（１）の化合物（β－Ａｌａ－ＮＨＳ）を１０．０ｍｇはかり取り、これをアセトニトリルで溶解後メスアップした（０．２ｍｇ／ｍＬ）。この溶液を１００ｍＬメスフラスコに０．５ｍＬを正確にはかりとり、０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液でメスアップし、添加溶液を調製した（０．００１ｍｇ／ｍＬ）。次に、１ｍＬメスフラスコに式（８）の化合物（日油製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥ－２００ＨＳ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
を１００ｍｇはかり取り、そこへ添加溶液０．５ｍＬを正確にはかりとり添加した後、０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルでメスアップし分析試料溶液を調製した（１００ｍｇ／ｍＬ、式（８）の化合物に対してβ－Ａｌａ－ＮＨＳを５ｐｐｍ添加）。分析試料溶液を以下の条件でＨＰＬＣ測定を行った。この時の分析試料におけるβ－Ａｌａ－ＮＨＳのピーク高さは２３２５、Ｓ／Ｎ比は５６であった。
　なお、実施例１における試料濃度　Ｃ　（ｍｇ／ｍＬ）は１００ｍｇ／ｍＬ、試料注入量　Ｉ　（ｍＬ）は０．０１ｍＬ、カラム体積　Ｖ　（ｍＬ）は４．１５ｍＬであることからＣ×Ｉ÷Ｖ＝１００×０．０１÷４．１５＝０．２４である。
（ＨＰＬＣ測定条件）
ＨＰＬＣ装置：　　　Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５　（日本ウォーターズ株式会社）
カラム：　　　　　　Ｉｎｅｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）
流速：　　　　　　　１．０ｍＬ／分
分析時間：　　　　　２０分
カラム温度：　　　　４０℃
溶離液：　　　　　　水／アセトニトリル＝７／３、０．０２％リン酸含有
注入量：　　　　　　１０μＬ
検出器：　　　　　　紫外可視分光検出器（１９４ｎｍ）（日本ウォーターズ株式会社）
（比較例１）
　実施例１の分析試料溶液を用い、ＨＰＬＣの溶離液の添加剤を０．０２％リン酸（１９０～２００ｎｍの最大モル吸光係数ε＝１．２Ｍ－１ｃｍ－１，　ｐＫａ＝２．１）から０．１％酢酸（１９０～２００ｎｍの最大モル吸光係数ε＝３８Ｍ－１ｃｍ－１，　ｐＫａ＝４．８）へ変更し、添加剤以外は全て実施例１と同一の条件でＨＰＬＣ測定を行った。この時の分析試料溶液におけるβ－Ａｌａ－ＮＨＳのピーク高さは７６９、Ｓ／Ｎ比は２であった。
（比較例２）
　実施例１の分析試料溶液を用い、ＨＰＬＣの溶離液の添加剤を０．０２％りん酸（１９０～２００ｎｍの最大モル吸光係数ε＝１．２Ｍ－１ｃｍ－１，　ｐＫａ＝２．１）から０．１％ＴＦＡ（１９０～２００ｎｍの最大モル吸光係数ε＝２１６Ｍ－１ｃｍ－１，　ｐＫａ＝０．５）へ変更し、添加剤以外は全て実施例１と同一の条件でＨＰＬＣ測定を行った。この時の分析試料溶液におけるβ－Ａｌａ－ＮＨＳのピーク高さは５４０、Ｓ／Ｎ比は２であった。
（実施例２）
　分析試料溶液の調製時にはかりとる式（８）の化合物を１００ｍｇから３０ｍｇへ変更し、添加溶液の量を０．５ｍＬから０．１５ｍＬへ変更することで調製する試料濃度を１００ｍｇ／ｍＬ（式（８）の化合物に対してβ－Ａｌａ－ＮＨＳを５ｐｐｍ添加）から３０ｍｇ／ｍＬ（式（８）の化合物に対してβ－Ａｌａ－ＮＨＳを５ｐｐｍ添加）へ変更し、実施例１と同一の条件でＨＰＬＣ測定を行った。この時の分析試料におけるβ－Ａｌａ－ＮＨＳのピーク高さは６９８、Ｓ／Ｎ比は１１であった。
　なお、実施例２における試料濃度　Ｃ　（ｍｇ／ｍＬ）は３０ｍｇ／ｍＬ、試料注入量　Ｉ　（ｍＬ）は０．０１ｍＬ、カラム体積　Ｖ　（ｍＬ）は４．１５ｍＬであることからＣ×Ｉ÷Ｖ＝３０×０．０１÷４．１５＝０．０７である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（実施例３）
　実施例１の化合物（８）から式（９）の化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
へ変更し、ＨＰＬＣ測定を行った。このときの試料におけるβ－Ａｌａ－ＮＨＳのピーク高さは２５２０、Ｓ／Ｎ比は５７であった。
（実施例４）
　実施例１の化合物（８）から式（１０）の化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
へ変更し、ＨＰＬＣ測定を行った。このときの試料におけるβ－Ａｌａ－ＮＨＳのピーク高さは２２１０、Ｓ／Ｎ比は５４であった。
　本発明により、ポリオキシエチレン誘導体に含まれる低分子化合物の高感度分析方法が提供される。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－１１５６９３（出願日：２０２１年７月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (2)

  1. 　ポリオキシエチレン誘導体に含まれる式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     の化合物を逆相クロマトグラフィーで分離した後、当該化合物を紫外可視分光検出器にて検出する分析方法であり、検出波長として２００ｎｍより短波長の紫外線を用い、分析用移動相への添加剤として１９０～２００ｎｍにおける最大モル吸光係数が２０Ｍ－１ｃｍ－１以下かつｐＫａが４以下の酸性物質を用いることを特徴とする分析方法。
  2. 　ポリオキシエチレン誘導体が式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｚは２～８個の水酸基を持ち、２～２１個の炭素原子を有した酸素原子及び／又は窒素原子を含んでも良い化合物の残基であり、ＯＡ１およびＯＡ２はオキシエチレン基であり、ａおよびｂは、独立してそれぞれ０～５，０００でかつａ＋ｂは２０以上であり、Ｌ１およびＬ２は、独立してそれぞれエステル結合、ウレタン結合、アミド結合、ウレア結合、エーテル結合およびチオエーテル結合から選択される結合をアルキレン鎖中又は末端に有していてもよいアルキレン基であり、ｐおよびｑは、独立してそれぞれ０または１であり、ｓは、０～８であり、ｔは、１～８であり、２≦ｓ＋ｔ≦８であり、Ｘ１はアルコキシ基またはＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基であり、Ｘ２はＮ－スクシンイミジルオキシカルボニル基である。ａ、ｂ、ＯＡ１、ＯＡ２、ｐ、ｑ、Ｌ１、Ｌ２およびＸ１は、それぞれ一分子中に複数存在する場合、互いに同一又は異なっている。）で示される請求項１記載の分析方法。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005208050A (ja) * 2003-12-26 2005-08-04 Nof Corp ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率分析方法
WO2010107520A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Smartcells, Inc. Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof
JP2018172649A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体の製造方法
JP2021115693A (ja) 2020-01-23 2021-08-10 オムロン株式会社 ロボットシステムの制御装置、ロボットシステムの制御方法、コンピュータ制御プログラム、及びロボットシステム

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005208050A (ja) * 2003-12-26 2005-08-04 Nof Corp ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率分析方法
WO2010107520A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Smartcells, Inc. Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof
JP2018172649A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体の製造方法
JP2021115693A (ja) 2020-01-23 2021-08-10 オムロン株式会社 ロボットシステムの制御装置、ロボットシステムの制御方法、コンピュータ制御プログラム、及びロボットシステム

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GROSS H., BILK L.: "Zur reaktion von N-Hydroxysuccinimid mit dicyclohexylcarbodiimid", TETRAHEDRON, ELSEVIER SIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 24, no. 24, 1 January 1968 (1968-01-01), AMSTERDAM, NL , pages 6935 - 6939, XP093023922, ISSN: 0040-4020, DOI: 10.1016/S0040-4020(01)96807-3 *
REACTIVE FUNCTIONAL POLYMERS, vol. 67, 2007, pages 529 - 539
TETRAHEDRON, vol. 24, no. 21994-89-8, 1968, pages 6935 - 6939
WILCHEK MEIR, MIRON TALIA: "Limitations of A-Hydroxysuccinimide Esters in Affinity Chromatography and Protein Immobilization1'", BIOCHEMISTRY, vol. 26, no. 141, 1 January 1987 (1987-01-01), pages 2155 - 2161, XP093023921, ISSN: 0006-2960 *

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