WO2023277560A1 - 인터루킨-4를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
인터루킨-4를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating neuropathic pain.
- Neuropathic pain can be caused by nerve damage or disease of the somatosensory organs. About 7% of the population suffers from the disease, but there are no breakthrough treatments yet. Steroids and morphine-based drugs are used as drugs to reduce pain, but they have various side effects such as infection, vasodilation and itching, and cannot be fundamentally treated. Therefore, it is essential to develop high-efficiency drugs that can overcome neuropathic pain.
- Microglial cells in spinal cord tissue are important cells in the development of neuropathic pain. After nerve injury, spinal cord microglial cells secrete inflammatory cytokines, and excessive activation occurs, which induces pain sensitization at the spinal cord level, resulting in chronic pain. Therefore, in order to fundamentally treat neuropathic pain, it is necessary to regulate the activation of microglia.
- One embodiment of the present invention is for preventing or treating neuropathic pain, including a gene encoding Interleukin-4 (IL-4), or a vector containing the same, and nanoparticles containing a biodegradable polymer. It relates to pharmaceutical compositions.
- IL-4 Interleukin-4
- Another example of the present invention is the step of administering a pharmaceutical composition comprising a gene encoding Interleukin-4 (IL-4) or a vector containing the same, and nanoparticles comprising a biodegradable polymer. It is to provide a method for preventing or treating neuropathic pain, including.
- IL-4 Interleukin-4
- Another example of the present invention includes loading a gene encoding Interleukin-4 (IL-4), or a vector containing the gene, into nanoparticles together with a biodegradable polymer, It is to provide a method of increasing the duration of pain.
- IL-4 Interleukin-4
- Another example of the present invention is for increasing the duration of pain, including a gene encoding Interleukin-4 (IL-4) or a vector containing the gene, and nanoparticles containing a biodegradable polymer. to provide a composition.
- IL-4 Interleukin-4
- One embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating neuropathic pain, including nanoparticles containing a gene encoding interleukin-4 (IL-4) and a biodegradable polymer. .
- IL-4 interleukin-4
- Neuropathic pain is a generic term for pain caused by damage to nerve cells or abnormalities in the nervous system, and includes allodynia, which is a painful response to harmless stimuli that do not particularly cause pain, and nociception, which is a more sensitive response to painful stimuli. Hypersensitivity, also clinically characteristic of a burning sensation in the absence of stimulation.
- Neuropathic pain can result from major lesions, dysfunctions, or dysfunctions of the peripheral or central nervous system. Unlike nociceptive pain, which serves a defensive biological function, neuropathic pain has no defensive function, can develop days or months after an injury or disease condition has resolved, and is often lingering and chronic. to be.
- Neuropathic pain according to one embodiment of the present invention may be chronic neuropathic pain, and the composition according to one embodiment of the present invention may have an analgesic effect on chronic neuropathic pain.
- an analgesic effect was shown for chronic neuropathic pain.
- Neuropathic pain according to an embodiment of the present invention may be neuropathic pain due to a peripheral nervous system abnormality.
- neuropathic pain according to an embodiment of the present invention may be neuropathic pain caused by hyperactivation of microglia.
- neuropathic pain according to an embodiment of the present invention may be neuropathic pain caused by hyperactivation of microglia due to peripheral nervous system abnormalities.
- Neuropathic pain according to an embodiment of the present invention may not be neuropathic pain caused by chronic constriction injury.
- neuropathic pain according to an embodiment of the present invention may not be neuropathic pain caused by CCR5 overexpression.
- neuropathic pain according to an embodiment of the present invention may not be neuropathic pain caused by overexpression of CCR5 due to chronic constriction injury.
- Interleukin-4 is secreted by activated T cells, mast cells, and basophils that regulate a broad spectrum of cell functions in hematopoietic and non-hematopoietic cells. It is a glycoprotein that becomes IL-4 plays an important role in inducing and regulating the synthesis of IgE, and plays an important role in the growth and differentiation of B cells.
- the term "gene” is a portion of DNA related to polypeptide production, and may include exons, introns, transcription or translation of gene products, and regions before and after coding regions related to transcription or translation control.
- a gene is specified herein by its name, for example, by a gene name such as IL-4, IL-10, TNF- ⁇ , IL-6, etc.
- a gene is a naturally occurring variant or Mutants may be included.
- IL-4 gene is at least 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more of the cDNA shown in GenBank.
- Variants having a homology of at least 99.9% or more may be included.
- An exemplary amino acid sequence of human IL-4 protein is set forth in SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, wherein the IL-4 gene comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, or SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22 It may encode a protein consisting of an amino acid sequence of.
- the sequence of the IL-4 mouse gene can be found in GenBank Accession No. AB174765, and the cDNA sequence of the IL-4 human gene is GenBank Accession No. NM_000589 or JX878389, etc., and an exemplary cDNA sequence of the human IL-4 gene is described in SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.
- a nucleic acid molecule encoding IL-4 which can be used as a gene encoding IL-4 in the present invention, is a functional equivalent of a nucleic acid molecule constituting it, for example, a partial base of a nucleic acid molecule encoding IL-4.
- the sequence has been modified by deletion, substitution or insertion, it may contain variants that are functionally equivalent to the nucleic acid molecule encoding IL-4.
- the IL-4 gene may be introduced into various vectors and carried in nanoparticles, and the IL-4 gene may be included in an expression vector for intracellular delivery.
- the vector is, for example, pCMV series (eg, pCMV-tag 1, 2, 3, 4, 5, pCMV-3tag-1,2,3,4,5,6,7,8,9, pCMV6, etc.) , pEF1a series, pAAV series (eg, pAAV-EF1a-MCS, pAAV-CMV-MCS, pAAV-CAG-MCS, etc.), pcDNA series (eg, pcDNA3, 3.1, 4, 5, 6, 6.2, etc.), pLenti, pLVX, pRetro, or pHSV.
- the vector may include a Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) sequence.
- WPRE Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element
- IL-4 may be a wild-type protein encoded by the IL-4 gene, and includes functional equivalents of the protein.
- the wild-type protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, or may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22.
- the "functional equivalent” is 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more of the wild-type IL-4 protein.
- the "equivalent physiological activity” means a physiological activity that equally exhibits anti-inflammatory activity, anti-inflammatory activity of microglia, M2 type activity promoting activity of microglia, or improvement, prevention or treatment activity of neuropathic pain.
- the functional equivalent is an amino acid composition for altering the stability, storage, volatility or solubility of a protein while maintaining the activity of improving, preventing or treating neuropathic pain in a backbone having a wild-type IL-4 protein sequence.
- Derivatives in which some chemical structures are modified may be included.
- the gene encoding IL-4 may be carried in nanoparticles.
- the "nanoparticle” refers to a particle formed by forming a polymer coating layer around a drug, and the nanoparticle may be a biodegradable nanoparticle or a nanoparticle containing a biodegradable polymer.
- the biodegradable polymer is, for example, polylactide, poly(lactide-co-glycolide), poly(styrene-co-ethylene glycol), poly(ethylenimine-co-ethylene glycol), poly( Phosphagen-co-ethylene glycol), poly(lactide-co-ethylene glycol), poly(lactide-co-glycolide-co-ethylene glycol), poly(caprolactone-co-ethylene glycol), poly(annol) hydride-co-ethylene glycol), poly(malic acid-co-ethylene glycol) and its derivatives, poly(alkylcyanoacrylate-co-ethylene glycol), poly(hydroxybutyrate-co-ethylene glycol), Poly(carbonate-co-ethylene glycol) and poly(orthoester-co-ethylene glycol), polyethylene glycol, poly-(L-lysine-co-ethylene glycol), poly(glycolide-co-ethylene glycol) , poly(methyl methacrylate-co-ethylene glycol), poly(vin
- Nanoparticles according to an example of the present invention may have a size in the nano range and pass through the spinal cord.
- the microglia target activity by the nanoparticles of the present application was confirmed, and the nanoparticles of the present application are incorporated into microglial cells and not incorporated into astrocytes or neurons, and have the effect of passing through the spinal cord to microglia. .
- the size of the nanoparticles is 1 to 999 nm, 1 to 950 nm, 1 to 900 nm, 1 to 800 nm, 1 to 700 nm, 1 to 600 nm, 1 to 500 nm, 1 to 400 nm, 1 to 350 nm , 1 to 300 nm, 10 to 999 nm, 10 to 950 nm, 10 to 900 nm, 10 to 800 nm, 10 to 700 nm, 10 to 600 nm, 10 to 500 nm, 10 to 400 nm, 10 to 350 nm , 10 to 300 nm, 50 to 999 nm, 50 to 950 nm, 50 to 900 nm, 50 to 800 nm, 50 to 700 nm, 50 to 600 nm, 50 to 500 nm, 50 to 400 nm, 50 to 350 nm , 50 to 300 nm, 100 to 999 nm, 50 to 950 nm, 50 to 400 nm,
- the surface potential of the nanoparticles is -100 to -1 mV, -100 to -5 mV, -100 to -10 mV, -50 to -1 mV, -50 to -5 mV, -50 to -10 mV, - 25 to -1 mV, -25 to -5 mV, -25 to -10 mV, -10 to -1 mV, or -10 to -5 mV.
- IL-4 or a gene encoding the same can be delivered to microglia in the spinal cord using nanoparticles, thereby inducing an analgesic effect.
- the analgesic effect may be an analgesic effect for the neuropathic pain. It was confirmed in the present invention that the nanoparticles have gene transfer ability to cells in vitro and in vivo, and can significantly increase IL-4 expression in spinal cord tissue.
- Naked DNA is delivered into cells using various delivery means, and for example, it is difficult to enter cells when gene is delivered to microglial cells using cationic lipid (lipofectamine, etc.).
- DNA delivery is possible using the nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
- anti-inflammatory activity was exhibited when the IL-4 gene was transfected into microglial cell line BV2 by electroporation, but transfection using electricity is not possible in vivo. . Therefore, it is preferable to use the nanoparticle according to one embodiment of the present invention to transfer the IL-4 gene in vivo.
- the nanoparticles according to one embodiment of the present invention are slowly degraded in cells, continuous gene expression is possible and thus the analgesic effect can be maintained for a long time. Therefore, when IL-4 DNA is delivered to microglial cells using naked or other delivery means, the effect is insignificant because the influx into the cells is small, but when IL-4 DNA is delivered using nanoparticles according to an embodiment of the present invention It is more preferable because an excellent and lasting analgesic effect can be achieved.
- the composition according to one embodiment of the present invention has high durability of analgesia, and as a result of confirming the durability of the analgesic effect using the neuropathic pain model in the present example, the analgesic effect lasted for 7 days or more, indicating a remarkably high durability.
- the composition according to one embodiment of the present invention has a duration of an analgesic effect of 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days or more, 11 days or more, 12 days or more, 13 days or more, 14 days or more , 15 days or more, 20 days or more, 21 days or more, 25 days or more, 28 days or more, 30 days or more, 35 days or more, or 40 days or more.
- the upper limit of the duration is 100 days or less. , 90 days or less, 80 days or less, 70 days or less, 60 days or less, 50 days or less, or 40 days or less.
- nanoparticles containing IL-4, a gene encoding the same, or a vector containing the gene, together with a biodegradable polymer, for example, PLGA nanoparticles have excellent pain lasting properties, particularly Compared to IL-10, it showed significantly higher analgesic effect and analgesic persistence.
- the composition according to one embodiment of the present invention is more than 1-fold, 1.1-fold or more, 1.2-fold, 1.3-fold or more, 1.4-fold or more compared to the analgesic effect of IL-10, a gene encoding the same, or a vector containing the gene. It may exhibit an analgesic effect of at least 1.5 times, or at least 1.55 times.
- composition according to one embodiment of the present invention may have improved pain relief compared to IL-4 protein.
- IL-4 recombinant protein shows a short-term analgesic effect, but according to the examples herein, the analgesia lasts only about 1 day, so daily injection of the drug is necessary to relieve or treat neuropathic pain, but side effects of intrathecal injection this can happen
- continuous drug administration is required through surgical pump insertion, but there are problems such as complications of pump implantation and difficulty in controlling drug release. It remains a technical challenge.
- the nanoparticle may extend the analgesic effect of interleukin-4, a gene encoding the same, or a vector containing the gene.
- the nanoparticles may be nanoparticles for prolonging the analgesic effect of a vector containing a gene encoding interleukin-4.
- the nanoparticles can prolong the analgesic effect of interleukin-4 for a particularly long period.
- a composition according to one embodiment of the present invention may target microglia.
- the nanoparticles other than one example of the present invention specifically target microglia through tissue immunostaining and flow cytometry.
- the expression levels of inflammatory cytokines TNF- ⁇ and IL-6 were significantly reduced, and the expression of microglia M2 type activity markers Arg-1 and Ym-1 was increased.
- the composition according to one embodiment of the present invention promotes anti-inflammatory activity and M2 type activity by targeting microglial cells.
- composition according to one embodiment of the present invention may be administered orally or parenterally, and may be injected, for example, into the spinal cavity.
- the composition according to one embodiment of the present invention may be administered by intrathecal injection, the preventive or therapeutic effect of neuropathic pain is equal to or greater than that of direct intrathecal injection.
- the composition according to one embodiment of the present invention may be a composition for intrathecal injection.
- intravenous infusion intramuscular infusion, intra-articular infusion, intra-synovial infusion, intrathecal infusion, intrahepatic infusion, intralesional infusion, or It can be administered by intracranial injection or the like.
- a suitable dosage of the composition may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity.
- Another example of the present invention is a method for increasing the duration of pain, including the step of loading a gene encoding Interleukin-4 (IL-4) or a vector containing the gene into nanoparticles. It is about.
- IL-4 Interleukin-4
- Another embodiment of the present invention relates to a composition for increasing the duration of pain, including nanoparticles containing a gene encoding interleukin-4 (IL-4) or a vector containing the gene. .
- IL-4 interleukin-4
- Another example of the present invention is to prepare a gene encoding interleukin-4 (IL-4) or a vector containing the gene; It relates to a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating neuropathic pain or a composition for increasing the duration of pain, comprising loading the gene or the vector into biodegradable nanoparticles.
- IL-4 interleukin-4
- Another embodiment of the present invention relates to a method for preventing or treating neuropathic pain, including administering IL-4 (Interleukin-4) or a gene encoding the same.
- IL-4 Interleukin-4
- the neuropathic pain, the IL-4, the gene encoding the IL-4, and the like are as described above.
- the administering step may be administered to animals other than humans.
- the administering may be administered to the spinal cord or intrathecal cavity of the animal.
- the present invention can inhibit inflammatory cytokine secretion and excessive activity of microglial cells and promote analgesic effect, and transfer the IL-4 gene to microglia in the spinal cord using microglia-specific nanoparticles to treat neuropathic pain. It can provide an analgesic effect on
- the present invention provides an effect of preventing, alleviating or treating neuropathic pain by reducing the expression of inflammation-related factors in microglial cells and promoting M2 type activity by the gene encoding IL-4 carried in nanoparticles.
- FIG. 1 is a diagram showing the structures of an IL-4 expression plasmid and an IL-10 expression plasmid according to an embodiment of the present invention.
- FIGS. 2a and 2b are views confirming that the transformed microglia prepared according to an embodiment of the present invention express IL-4 or IL-10 genes.
- Figure 2c is a diagram confirming that the expression of inflammatory cytokines significantly decreased when IL-4 was introduced into microglia according to an example of the present invention.
- Figure 2d is a view confirming that the expression of inflammatory cytokines significantly decreased by the supernatant of microglia expressing IL-4.
- FIG. 3 is a view confirming that M2 type activity of microglia is promoted by the supernatant of microglia expressing IL-4.
- FIG. 4 is a view showing the results of characterization of nanoparticles carrying an expression vector according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 5 is a view showing the results of measuring the cytotoxicity of the nanoparticles carrying the expression vector according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 6 is a view confirming the intracellular gene transfer ability of the nanoparticle carrying the expression vector according to an example of the present invention.
- FIG. 7 is a view confirming the in vivo gene transfer ability of nanoparticles carrying an expression vector according to an embodiment of the present invention.
- Figure 8a is a diagram showing the results of tissue immunostaining confirming that the nanoparticles according to an example of the present invention target microglia.
- Figure 8b is a view showing the results of confirming by flow cytometry that the nanoparticles according to an embodiment of the present invention target microglia.
- 9a and 9b are diagrams confirming the effect of reducing neuropathic pain by nanoparticles carrying an expression vector according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 10 is a view confirming the persistence of pain relief of nanoparticles according to an example of the present invention.
- FIG. 11 is a diagram comparing the persistence of analgesia of nanoparticles according to an embodiment of the present invention with IL-4 recombinant protein.
- 12a and 12b are views confirming the analgesic effect of nanoparticles according to an embodiment of the present invention on chronic neuropathic pain.
- An IL-4 overexpression plasmid was prepared using a pair of primers (5'-GAATTCTGAGCCACCATGGGTCTCAACCCCCAGCTAG-3' (SEQ ID NO: 1); 5'-GTCGACCTACGAGTAATCCATTTGCATG-3' (SEQ ID NO: 2)) adapted with EcoRI or SalI restriction enzyme sequences.
- the IL-10 overexpression plasmid was prepared using a pair of primers (5′-TCT AGAATGCCTGGCTCAGCACTGCTATG-3′ (SEQ ID NO: 3); 5′-GTCGACTCAGCTCTTCATCTTGATCATC-3′ (SEQ ID NO: 4)) adapting the XbaI or SalI restriction enzyme sequence. .
- the sequences of the mouse IL-4 and IL-10 genes were obtained from primary cultured mouse microglia by RT-PCR and subcloned into the plasmid pAAV-EF1a-MCS-IRES-EGFP to obtain IL-4 and EGFP, or Plasmids pAAV-EF1a-mIL-4-IRES-EGFP and pAAV-EF1a-mIL-10-IRES-EGFP expressing IL-10 and EGFP were constructed.
- the structure of the prepared plasmid IL-4 (FIG. 1A) and plasmid IL-10 (FIG. 1B) is shown in FIG. 1, and the size of each vector was 7072 bp or 7210 bp.
- Microglial cell line BV2 was transfected with IL-4 and IL-10 expression vectors by electroporation, respectively, to express IL-4 or IL-10 and EGFP.
- EGFP expression in each transfected cell group was confirmed by fluorescence microscopy and shown in FIG. 2a, and it was confirmed at the RNA level that the IL-4 or IL-10 gene was expressed in microglial cells (FIG. 2b).
- WT BV2, IL-4 expressing BV2, and IL-10 expressing BV2 cells were treated with LPS to induce an inflammatory response, and then SYBR Green PCR Master Mix and QuantStudio 3 Real-time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City , CA, USA) to confirm the expression levels of TNF- ⁇ and IL-6 by performing real-time RT-PCR.
- the primer sequences used were as follows:
- TNF- ⁇ forward 5′-AGCAAACCACCAAGTGGAGGA-3′ (SEQ ID NO: 5);
- TNF- ⁇ reverse 5′-GCTGGCACCACTAGTTGGTTG-3′ (SEQ ID NO: 6);
- IL-6 reverse 5′-TCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3′ (SEQ ID NO: 8).
- the supernatant (Conditioned media, CM) of the transfected IL-4-expressing BV2 cells was treated, and the response at the RNA level was confirmed. .
- FIG. 2d it was confirmed that the expression of TNF- ⁇ and/or IL-6 was significantly reduced when the supernatant of BV2 cells expressing IL-4 was treated.
- CM conditioned media
- IL-4 plasmid DNA or IL-10 plasmid DNA prepared in Example 1 was dissolved in 200 ⁇ l of TE 8.0 solution, respectively, and dropwise dropped into 1 ml of dichloromethane (DCM) in which 20 mg of PLGA was dissolved.
- the mixed solution was emulsified using a tip-type ultrasonic device (40 W, 1 min; Vibra-CellTM VCX 130; Sonics, Newtown, CT, USA). 2 ml of 1% PVA solution was added and sonicated for 2 minutes to stabilize the dispersion of nanoparticles. After adding 6 ml of 1% PVA solution, the DCM solution was evaporated by stirring at room temperature for 3 hours. The remaining solution was washed twice with distilled water through centrifugation (15,000 ⁇ g, 15 min, 4 ° C), and lyophilized to obtain vector-loaded PLGA nanoparticles in a solvent-free state.
- FIG. 4 The results of characterization of PLGA nanoparticles loaded with IL-4 or IL-10 expression vectors are shown in FIG. 4 .
- the size of IL-4 nanoparticles was 286.9 ⁇ 10.56 nm (mean ⁇ SEM), the surface potential was -10.58 ⁇ 0.5645 mV (mean ⁇ SEM), and the size of IL-10 nanoparticles was 311.0 ⁇ 8.961 nm (mean ⁇ SEM), and the surface potential was -14.70 ⁇ 0.1155 mV (mean ⁇ SEM).
- PLGA nanoparticles loaded with the IL-4 expression vector were named PLGA/IL-4
- PLGA nanoparticles loaded with the IL-10 expression vector were named PLGA/IL-10.
- mice 1-day-old C57BL/6 mice were anesthetized with cold, and brain tissues were taken out. After peeling off the membrane and removing the cerebellum and midbrain parts, they were released into single cells by pipetting.
- Dulbecco's Modified Eagle's medium containing 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulfonic acid, fetal bovine serum, L-glutamine, NEAA, and antibiotic/antimycotic was used in a 37 o C, 5% CO 2 incubator. cultured in.
- Example 2 After culturing the primary mixed glial cells in a 96 well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well, the nanoparticles prepared in Example 2 were treated. After adding 20 ⁇ l of MTS solution (Promega) per well, it was reacted in a 37 o C incubator for 1 hour. MTS tetrazolium compounds reduced by living cells yield formazan. The amount of this substance can be measured by the degree of absorption at a wavelength of 492 nm. Absorbance was quantified using EMax® Plus Microplate Reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).
- HEK293T cells were treated with PLGA/IL-4 or PLGA/IL-10 prepared in Example 4 at 200 ⁇ g/well (24 well-plate), and EGFP expression was confirmed at 24 and 48 hours, as shown in FIG. 6 .
- FIG. 6 As shown in Figure 6, after 24 hours of treatment, some cells expressed EGFP fluorescence, and after 48 hours, it was confirmed that more cells expressed EGFP fluorescence, indicating that the PLGA nanoparticles according to the present invention have gene transfer ability. confirmed.
- Example 7 IL-4 gene transfer of PLGA nanoparticles (in vivo) and microglia M2 type activity promoting activity
- mice were C57BL/6 male mice between 8 and 10 weeks of age, and the breeding and management of the animals followed the guidelines presented by the Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee (SNU IACUC). Mice were anesthetized with 2% avertin and their back hair was shaved. 200 ⁇ g/10 ⁇ l of the PLGA/IL-4 or PLGA/IL-10 nanoparticles prepared in Example 4 was injected into the spinal cord using a 10 ⁇ l Hamilton syringe and sacrificed on the 5th day after intrathecal injection of 200 ⁇ g/10 ⁇ l. Anesthetized with 2% avertin and perfused with cold saline. mRNA was extracted from lumbar 4-6 of spinal cord tissue.
- SNU IACUC Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee
- BV2, HEK293T, and primary mixed glial cells were cultured in 2 ⁇ 10 5 cells/well, 12 well-plate, respectively. After 3 hours or 8 hours of treatment with LPS or conditioned media, cells were thawed with Trizol solution (Thermo Fisher Scientific) and collected. Real-time RT-PCR was performed using SYBR Green PCR Master Mix and QuantStudio 3 Real-time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
- the level of mRNA expression of each gene was normalized to the level of GAPDH gene expression. 2- The fold induction was calculated and presented by the ⁇ CT method.
- RNA amounts of Arg-1 and Ym-1 increased on day 5 after intrathecal injection of PLGA/IL-4 or PLGA/IL-10.
- Arg-1 increased by about 3.2 times and Ym-1 by about 4.5 times
- PLGA/IL-10 about 1.5 times and about 2.0 times, respectively.
- Statistically significantly higher microglia M2 type activity was induced more than 2 times compared to -10.
- Microglia marker rabbit-anti-Iba1 (1:1000; Wako, Osaka, Japan), astrocyte marker rabbit-anti-GFAP (1:1000; Dako, Agilent, CA, USA) or neuron marker rabbit-anti-MAP2 ( 1:400; Millipore, MA, USA) and reacted at 4°C for 18 hours.
- Cy3-conjugated secondary antibody (1:200; Jackson ImmunoResearch, PA, USA) was attached and mounted with VectaShield medium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Fluorescence images were confirmed with a confocal microscope (LSM800; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Cell-specific delivery was confirmed by the degree of overlap between the fluorescent FITC signal of the nanoparticles and the cellular fluorescent Cy3.
- FIG. 8a As a result of immunostaining, it was confirmed that the fluorescence of the nanoparticles mainly overlapped with Iba-1-expressing microglia.
- FIG. 8B when quantified through flow cytometry, it was confirmed that cervical;4.9, thracic;11,8, lumbar;25.5, and sacral;35.8% of CD11b-expressing microglial cells were nanoparticle-containing cells.
- ACSA-2-expressing astrocytes or Thy-1-expressing neurons less than 1% of cells in cervical, thoracic, and lumbar regions and less than 3% in sacral regions were confirmed to be nanoparticle-containing cells.
- Mean fluorescence intensity is an indicator of how many nanoparticles are contained in each cell.
- CD11b-expressing microglia showed intensity values of cervical;1025, thracic;1852, lumbar;3902, sacral;7129, and ACSA-2-expressing astrocytes showed less than 1000 in cervical, thoracic, and lumbar and 1160 in sacral.
- Thy-1 expressing neurons showed values less than 500 in all areas. Therefore, most of the nanoparticles were incorporated into microglia, and only a few nanoparticles were incorporated into astrocytes or neurons.
- the animals used were C57BL/6 male mice between 8 and 10 weeks of age, and the breeding and management of the animals followed the guidelines presented by the Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee (SNU IACUC).
- mice were anesthetized with 2% avertin, the skin on the right pelvic area was cut open, and the muscles between the pelvis and the vertebrae were cut 0.5 cm, and then the L5 nerve inside was cut. After disinfecting the surgical site with 10% povidone-iodine, it was sutured with a surgical clip.
- the negative control group was operated by cutting only the skin and muscle.
- mice with neuropathic pain induced through SNT surgery After preparing mice with neuropathic pain induced through SNT surgery, a pain behavior experiment was conducted on the 7th day to confirm that pain was sufficiently induced. Mice with neuropathic pain were anesthetized with 2% avertin, and their back hair was shaved. Then, 200 ⁇ g/10 ⁇ l of the nanoparticles prepared in Example 4 was injected into the spinal canal.
- the pain level was measured by the up-down method using a Von Frey filament (0.02-4g, Stoelting, IL, USA).
- the mice were placed on the mesh and the soles of the feet were stimulated with Von Frey filaments to check whether they felt pain, such as quick avoidance and sole licking.
- a 50% withdrwal threshold was calculated and quantified.
- a neuropathic pain model was prepared in substantially the same manner as in Example 9, and the PLGA/IL-4 nanoparticles (IL-4 nanoparticles prepared in Example 4) were prepared. 4 genes) was administered at a concentration of 200 ⁇ g/10 ⁇ l.
- a neuropathic pain model was prepared in substantially the same manner as in Example 9, and PLGA/IL-4 nanoparticles (including IL-4 gene) or IL-4 recombinant protein prepared in Example 4 were prepared on the 7th day after SNT. Administered intrathecally.
- IL-4 recombinant protein recombinant mouse IL-4 protein from R&D Systems was purchased and used. Protein was administered once intrathecally at 200 ng/mouse on the 7th day after SNT.
- the degree of pain was measured in substantially the same manner as in Example 10 at 1 hour and 1, 3, 5, 7, 10, and 14 days after administration of PLGA/IL-4 and IL-4 RP, and is shown in FIG. 11 .
- the threshold was recovered to 3.15 g at 1 hour immediately after injection, but no analgesic effect was seen from the next day until the measurement was completed.
- the analgesic effect was lower than the IL-4 RP treatment group at the beginning of administration, but the threshold recovered to about 3.3, 3.9, and 3.3 g on the 7th, 10th, and 14th days after administration, respectively. showed significant analgesic effect. Therefore, the nanoparticles according to an embodiment of the present invention had higher pain pain persistence than the recombinant protein over a long period of time.
- Neuropathic pain is a chronic disease that requires long-term treatment, and compared to recombinant proteins that require daily injection of a drug or continuous administration by inserting a pump, the composition according to one embodiment of the present invention can be administered for 5 weeks or more with one administration. Since it can exhibit analgesic effect, convenience is high, and side effects caused by intrathecal injection can be reduced.
- Example 12 Analgesic effect on chronic neuropathic pain
- a neuropathic pain model was prepared in the same manner as in Example 9, and 200 ⁇ g/10 ⁇ l of the nanoparticles prepared in Example 4 was administered intrathecally on the 7th day or 1 month after surgery when the neuropathic pain became chronic pain. And, the results of performing the pain behavior experiment are shown in FIGS. 12a and 12b. As shown in FIGS. 12A and 12B, an example of the present invention was observed on the 7th day or 1 month after surgery when neuropathic pain became chronic, which coincides with the time of drug administration to a patient with actual chronic pain in clinical practice. When the composition according to was administered, an analgesic effect was observed.
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Abstract
본 발명은 신경병증성 통증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경병증성 통증은 신경손상이나 체성감각기관의 질병에 의해 발생할 수 있다. 인구의 약 7%가 고통 받고 있는 질병이지만 아직 획기적인 치료법이 없다. 통증을 줄이는 약물로 스테로이드 및 모르핀 계역의 약물이 사용되고 있지만 감염증, 혈관 확장증 및 가려움증 등 여러 부작용이 있고 근본적이 치료책이 될 수 없다. 따라서 신경병증성 통증을 타개할 수 있는 고효능 약물의 개발이 필수적이다.
척수 조직 내 소교세포는 신경병증성 통증의 발생에 중요한 세포이다. 신경 손상 이후 척수 소교세포는 염즘성 사이토카인을 분비하는 등 과도한 활성화가 일어나는데 이로 인해 척수 수준의 통증 민감화가 유도되어 만성 통증이 일어나게 된다. 따라서 근본적으로 신경병증성 통증을 치료하기 위해서는 소교세포의 활성화 조절이 필요하다.
본 발명의 일 예는 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 이를 포함하는 벡터와, 생분해성 고분자를 포함하는 나노입자를 포함하는, 신경병증성 통증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터와, 생분해성 고분자를 포함하는 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 신경병증성 통증 예방 또는 치료방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를, 생분해성 고분자와 함께 나노입자에 탑재하는 단계를 포함하는, 진통 지속성을 증가시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터와, 생분해성 고분자를 함유하는 나노입자를 포함하는, 진통 지속성 증가용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 예는 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노입자를 포함하는, 신경병증성 통증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경병증성 통증 (neuropathic pain)은 신경세포의 손상이나 신경계의 이상으로 생기는 통증을 총칭하며, 이는 특별히 통증을 유발하지 않는 무해한 자극에도 통증 반응을 보이는 이질통, 통증 자극에 대해 더욱 민감한 반응을 보이는 통각 과민, 또한 자극이 없는 상태에서 타는 듯한 감각의 임상적 특성을 보인다.
신경병증성 통증은 말초 또는 중추 신경계의 주요 병변, 기능 부전 또는 기능 장애로 인해 발생할 수 있다. 방어 생물학적 기능을 제공하는 통각수용기성 통증 (nociceptive pain)과는 달리, 신경병증성 통증은 방어 기능은 없고, 상해 또는 질병 상태가 해소된 뒤 수일 또는 수개월 후에 발병될 수 있으며, 종종 오래 지속되고 만성적이다.
본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 만성 신경병증성 통증인 것일 수 있으며, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 만성화된 신경병증성 통증에 대한 진통 효과가 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 본원 실시예에서 신경병증성 통증 모델을 제조하고, 신경병증성 통증이 만성화된 뒤 본 발명의 일 예에 따른 조성물을 투여한 결과, 만성 신경병증성 통증에 대하여 진통 효과가 나타났다.
본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 말초신경계 이상으로 인한 신경병증성 통증일 수 있다. 또는, 본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 소교세포 과활성화에 의한 신경병증성 통증인 것일 수 있다. 또는, 본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 말초신경계 이상으로 인한 소교세포 과활성화에 의한 신경병증성 통증인 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 만성 수축 손상 (chronic constriction injury)에 의한 신경병증성 통증이 아닌 것일 수 있다. 또는, 본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 CCR5 과발현에 의한 신경병증성 통증이 아닌 것일 수 있다. 또는, 본 발명의 일 예에 따른 신경병증성 통증은 만성 수축 손상 (chronic constriction injury)에 의한 CCR5 과발현에 의한 신경병증성 통증이 아닌 것일 수 있다.
인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)는 조혈 세포 및 비조혈 세포에서 광범위한 스펙트럼의 세포 기능을 조절하는 활성화된 T 세포, 비만세포 (mast cell), 및 호염기성백혈구 (basophil) 등에 의해 분비되는 당단백질이다. IL-4는 IgE의 합성을 유도하고 조절하는데 중요한 역할을 하며, B세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 한다.
본 명세서에서 용어 "유전자(gene)"는 폴리펩티드 생산과 관련된 DNA 부분이며, 엑손, 인트론과 더불어 유전자 산물의 전사 또는 번역, 전사 또는 번역의 조절과 관련된 코딩 영역 전후의 영역을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 유전자가 그의 이름으로 특정될 때, 예를 들어 IL-4, IL-10, TNF-α, IL-6 등의 유전자 이름으로 특정될 때, 유전자는 해당 유전자의 자연적으로 발생하는 변이체 또는 돌연변이체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 “IL-4 유전자”는 GenBank에 나타난 cDNA와 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 인간 IL-4 단백질의 예시적인 아미노산 서열이 서열번호 21 또는 서열번호 22에 기재되어 있으며, 상기 IL-4 유전자는 서열번호 21 또는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 21 또는 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것일 수 있다.
예를 들어, IL-4 마우스 유전자의 서열은 GenBank Accession No. AB174765에 기재되어 있고, IL-4 인간 유전자의 cDNA 서열은 GenBank Accession No. NM_000589 또는 JX878389 등에 기재되어 있으며, 인간 IL-4 유전자의 예시적인 cDNA 서열이 서열번호 19 또는 서열번호 20에 기재되어 있다. 또한, 본 발명에서 IL-4를 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 IL-4를 코딩하는 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, IL-4를 코딩하는 핵산분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, IL-4를 암호화하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에서, IL-4 유전자는 다양한 벡터에 도입되어 나노입자에 담지될 수 있으며, IL-4 유전자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공되는 것일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 pCMV series (일 예로, pCMV-tag 1, 2, 3, 4, 5, pCMV-3tag-1,2,3,4,5,6,7,8,9, pCMV6 등), pEF1a series, pAAV series (일 예로, pAAV-EF1a-MCS, pAAV-CMV-MCS, pAAV-CAG-MCS 등), pcDNA series (일 예로, pcDNA3, 3.1, 4, 5, 6, 6.2 등), pLenti, pLVX, pRetro, 또는 pHSV 일 수 있다. 상기 벡터는 WPRE (Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element) 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에서 IL-4는 상기 IL-4 유전자에 의해 암호화되는 야생형 단백질일 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 예를 들어, 상기 야생형 단백질은 서열번호 21 또는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 21 또는 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 “기능적 동등물”은 야생형 IL-4 단백질과 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 야생형 IL-4 단백질과 동등한 생리활성을 나타내는 펩타이드를 포함한다. 상기 “동등한 생리 활성”은 항염증 활성, 소교세포의 항염증 활성, 소교세포의 M2 type 활성 촉진 활성, 또는 신경병증성 통증의 개선, 예방 또는 치료 활성 등을 동등하게 나타내는 생리 활성을 의미한다. 또한, 상기 기능적 동등물은 야생형 IL-4 단백질 서열을 가지는 기본골격에 신경병증성 통증의 개선, 예방 또는 치료 활성을 유지하면서 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등의 변경을 위해 구성되는 아미노산의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 IL-4를 암호화하는 유전자는 나노입자에 담지된 것일 수 있다. 상기 “나노입자”는 약물을 중심으로 하여 고분자의 코팅층이 형성되어 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 생분해성 나노입자, 또는 생분해성 고분자를 포함하는 나노입자인 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자 (biodegradable polymer)는 예를 들어 폴리락티드, 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리(스티렌-코-에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌이민-코-에틸렌글리콜), 폴리(포스파겐-코-에틸렌글리콜), 폴리(락타이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(락티드-코-글리콜라이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(카프로락톤-코-에틸렌글리콜), 폴리(안하이드라이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(말릭산-코-에틸렌글리콜) 및 이의 유도체, 폴리(알킬시아노아크릴레이트-코-에틸렌글리콜), 폴리(하이드로옥시부틸레이트-코-에틸렌글리콜), 폴리(카르보네이트-코-에틸렌글리콜) 및 폴리(오르소에스테르-코-에틸렌글리콜), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-(L-라이신-코-에틸렌글리콜), 폴리(글리콜라이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(메틸메타아크릴레이트-코-에틸렌글리콜), 폴리(비닐피롤리돈-코-에틸렌글리콜) 및 이의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 일 예로, 상기 나노입자는 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 나노입자는 나노 범위의 크기를 가져 척수를 통과하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본원 실시예에서 본원 나노입자에 의한 소교세포 표적 활성을 확인하였으며, 본원 나노입자는 소교세포에 함입되고 성상세포나 뉴런에는 함입되지 않아, 척수를 통과하여 소교세포로 전달하는 효과가 있다.
상기 나노입자의 크기는 1 내지 999 nm, 1 내지 950 nm, 1 내지 900 nm, 1 내지 800 nm, 1 내지 700 nm, 1 내지 600 nm, 1 내지 500 nm, 1 내지 400 nm, 1 내지 350 nm, 1 내지 300 nm, 10 내지 999 nm, 10 내지 950 nm, 10 내지 900 nm, 10 내지 800 nm, 10 내지 700 nm, 10 내지 600 nm, 10 내지 500 nm, 10 내지 400 nm, 10 내지 350 nm, 10 내지 300 nm, 50 내지 999 nm, 50 내지 950 nm, 50 내지 900 nm, 50 내지 800 nm, 50 내지 700 nm, 50 내지 600 nm, 50 내지 500 nm, 50 내지 400 nm, 50 내지 350 nm, 50 내지 300 nm, 100 내지 999 nm, 100 내지 950 nm, 100 내지 900 nm, 100 내지 800 nm, 100 내지 700 nm, 100 내지 600 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 400 nm, 100 내지 350 nm, 100 내지 300 nm, 200 내지 999 nm, 200 내지 950 nm, 200 내지 900 nm, 200 내지 800 nm, 200 내지 700 nm, 200 내지 600 nm, 200 내지 500 nm, 200 내지 400 nm, 200 내지 350 nm, 200 내지 300 nm, 250 내지 999 nm, 250 내지 950 nm, 250 내지 900 nm, 250 내지 800 nm, 250 내지 700 nm, 250 내지 600 nm, 250 내지 500 nm, 250 내지 400 nm, 250 내지 350 nm, 250 내지 300 nm, 300 내지 999 nm, 300 내지 950 nm, 300 내지 900 nm, 300 내지 800 nm, 300 내지 700 nm, 300 내지 600 nm, 300 내지 500 nm, 300 내지 400 nm, 또는 300 내지 350 nm 일 수 있다.
상기 나노입자의 표면전위는 -100 내지 -1 mV, -100 내지 -5 mV, -100 내지 -10 mV, -50 내지 -1 mV, -50 내지 -5 mV, -50 내지 -10 mV, -25 내지 -1 mV, -25 내지 -5 mV, -25 내지 -10 mV, -10 내지 -1 mV, 또는 -10 내지 -5 mV 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 IL-4 또는 이를 암호화하는 유전자, 예를 들어 IL-4 발현 벡터를 나노입자를 이용하여 척수 내 소교세포로 전달하여, 진통 효과를 유도할 수 있다. 상기 진통 효과는 상기 신경병증성 통증에 대한 진통 효과인 것일 수 있다. 상기 나노입자는 in vitro 및 in vivo 세포에 유전자 전달 능력이 있음을 본원 발명에서 확인하였고, 척수 조직 내에 IL-4 발현을 현저히 증가시킬 수 있다.
Naked DNA는 다양한 전달수단을 이용하여 세포내로 전달하며, 예를 들면 Cationic lipid (lipofectamine 등)을 이용하여 소교세포에 유전자 전달 시 세포내 유입이 어려운 특성이 있다. 반면, 본 발명의 일 예에 따른 나노입자를 이용하면 효과적으로 DNA 전달이 가능함을 본원 실시예에서 확인하였다. 구체적으로, 본원 실시예에서 소교세포주 BV2에 전기 천공법 (Electroporation)으로 IL-4 유전자를 형질주입(transfection)할 경우 항염증 활성이 나타남을 확인하였으나, in vivo에서는 전기를 이용한 형질주입이 불가능하다. 따라서, IL-4 유전자를 in vivo에서 전달하기 위해 본 발명의 일 예에 따른 나노입자를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 나노입자는 세포 내에서 천천히 분해되기 때문에, 지속적인 유전자 발현이 가능하여 진통 효과를 길게 지속시킬 수 있다. 따라서, IL-4 DNA 를 naked 혹은 다른 전달수단을 이용하여 소교세포에 전달할 경우 세포 내 유입 자체가 적으므로 효과가 미미하나, 본 발명의 일 예에 따른 나노입자를 이용하여 IL-4 DNA를 전달할 경우 우수하고 지속적인 진통 효과를 달성할 수 있어 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 진통 지속성이 높으며, 본원 실시예에서 신경병증성 통증 모델을 이용하여 진통효과의 지속성을 확인한 결과, 진통 효과가 7일 이상 지속되어 현저히 높은 지속성을 나타냈다. 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 진통 효과의 지속 시간이 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 25일 이상, 28일 이상, 30일 이상, 35일 이상, 또는 40일 이상일 수 있다. 이 때, 상기 지속 시간의 상한값이 특정되지 않더라도, 통상의 기술자가 신경병증성 통증을 완화 또는 치료하기 위해 본 발명을 명확하게 실시할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 지속 시간의 상한값은 100일 이하, 90일 이하, 80일 이하, 70일 이하, 60일 이하, 50일 이하, 또는 40일 이하인 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 IL-4, 이를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터가, 생분해성 고분자와 함께 함유된 나노입자, 일 예로 PLGA 나노입자는, 진통 지속성이 우수하며, 특히 IL-10와 비교하여 현저히 높은 진통 효과 및 진통 지속성을 나타냈다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은, IL-10, 이를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터의 진통 효과 대비 1배 초과, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 또는 1.55배 이상의 진통 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 IL-4 단백질과 비교하여 진통 지속성이 향상된 것일 수 있다. IL-4 재조합 단백질은 단기적인 진통 효과를 나타내나, 본원 실시예에 의하면 진통 지속성이 약 1일에 불과하여, 신경병증성 통증 완화 또는 치료를 위해서는 약물을 매일 주사하는 것이 필요하나, 척수강 주사의 부작용이 발생할 수 있다. 또는, IL-4 재조합 단백질의 경우 외과적 수술을 통한 펌프 삽입을 통해 지속적인 약물 투여가 필요하나, 펌프 이식의 합병증, 약물 방출 조절의 어려움 등의 문제점이 있어, 진통 지속성을 늘리는 것이 해당 기술분야의 기술적 과제로 남아있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 나노입자는 인터루킨-4, 이를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터의 진통 효과를 연장하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노입자는 인터루킨-4를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터의 진통 효과 연장용 나노입자인 것일 수 있다. 상기 나노입자는 인터루킨-4의 진통 효과를 특히 길게 연장할 수 있으며, 예를 들어 상기 나노입자는 인터루킨-4를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 담지하여, 인터루킨-4 단백질의 진통 효과의 1배 초과, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상, 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.6배 이상, 2.7배 이상, 2.8배 이상, 2.9배 이상, 3배 이상, 3.1배 이상, 3.2배 이상, 3.3배 이상, 3.4배 이상, 3.5배 이상, 3.6배 이상, 3.7배 이상, 3.8배 이상, 3.9배 이상, 4배 이상, 4.1배 이상, 4.2배 이상, 4.3배 이상, 4.4배 이상, 4.5배 이상, 4.6배 이상, 4.7배 이상, 4.8배 이상, 4.9배 이상, 5배 이상, 5.1배 이상, 5.2배 이상, 5.3배 이상, 5.4배 이상, 5.5배 이상, 5.6배 이상, 5.7배 이상, 5.8배 이상, 5.9배 이상, 6배 이상, 6.1배 이상, 6.2배 이상, 6.3배 이상, 6.4배 이상, 6.5배 이상, 6.6배 이상, 6.7배 이상, 6.8배 이상, 6.9배 이상, 7배 이상, 7.1배 이상, 7.2배 이상, 7.3배 이상, 7.4배 이상, 7.5배 이상, 7.6배 이상, 7.7배 이상, 7.8배 이상, 7.9배 이상, 8배 이상, 8.1배 이상, 8.2배 이상, 8.3배 이상, 8.4배 이상, 8.5배 이상, 8.6배 이상, 8.7배 이상, 8.8배 이상, 8.9배 이상, 9배 이상, 9.1배 이상, 9.2배 이상, 9.3배 이상, 9.4배 이상, 9.5배 이상, 9.6배 이상, 9.7배 이상, 9.8배 이상, 9.9배 이상, 또는 10배 이상으로 진통 효과를 연장하는 것일 수 있다. 진통 효과의 지속성은 통증 행동실험에서 통증 정도 (예를 들어 50% withdrwal threshold)의 회복이 중단되기까지 소요되는 시간으로 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 소교세포를 타겟하는 것일 수 있다. 본원 실시예에서 조직면역염색 및 유세포 분석을 통해 본 발명의 일 예에 다른 나노입자가 소교세포를 특이적으로 표적하는 것을 확인하였다. 또한, 본원 실시예에서 IL-4를 소교세포에 처리하였을 때 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현량이 현저히 감소하고, 소교세포 M2 type 활성 마커인 Arg-1 및 Ym-1의 발현이 현저히 증가하여, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 소교세포를 타겟하여 항염증 활성 및 M2 type 활성을 촉진하는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 척수강에 주사될 수 있다. 척수 내 직접 주사할 경우 척수 조직이 주사에 의해 손상될 위험성이 있으며, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 척수강 주사로 투여하여도 척수 내 직접 주사한 경우와 동등 이상의 신경병증성 통증 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 이에, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 척수강 주사용 조성물인 것일 수 있다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두 개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 나노입자에 탑재하는 단계를 포함하는, 진통 지속성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 나노입자를 포함하는, 진통 지속성 증가용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 준비하는 단계; 생분해성 나노입자에 상기 유전자 또는 상기 벡터를 탑재하는 단계를 포함하는, 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 진통 지속성 증가용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 IL-4 (Interleukin-4) 또는 이를 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 신경병증성 통증 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 상기 신경병증성 통증, 상기 IL-4, 상기 IL-4를 암호화하는 유전자 등은 전술한 바와 같다.
상기 투여하는 단계는 인간을 제외한 동물에 투입되는 것일 수 있다.
상기 투여하는 단계는 동물의 척수 또는 척수강에 투여되는 것일 수 있다.
본 발명은 소교세포의 염증성 사이토카인 분비 및 과도한 활성을 저해하고 진통효과를 도모할 수 있으며, 소교세포 특이적 나노입자를 이용하여 IL-4 유전자를 척수 내 소교세포로 전달하여 신경병증성 통증에 대한 진통 효과를 제공할 수 있다.
본 발명은 나노입자에 담지된 IL-4를 암호화하는 유전자가 소교세포의 염증관련 인자의 발현을 감소시키고, M2 type 활성을 촉진하여, 신경병증성 통증을 예방, 완화 또는 치료하는 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 IL-4 발현 플라스미드 및 IL-10 발현 플라스미드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 예에 따라 제조된 형질전환 소교세포가 IL-4 또는 IL-10 유전자를 발현하는 것을 확인한 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 예에 따라 소교세포에 IL-4 도입 시 염증성 사이토카인 발현이 현저히 감소한 것을 확인한 도면이다.
도 2d는 IL-4를 발현하는 소교세포의 상층액에 의해 염증성 사이토카인 발현이 현저히 감소한 것을 확인한 도면이다.
도 3은 IL-4를 발현하는 소교세포의 상층액에 의해 소교세포의 M2 type 활성이 촉진되는 것을 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 발현 벡터가 담지된 나노입자의 특성 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 발현 벡터가 담지된 나노입자의 세포 독성 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 발현 벡터가 담지된 나노입자의 세포 내 유전자 전달 능력을 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 발현 벡터가 담지된 나노입자의 생체 내 유전자 전달 능력을 확인한 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 예에 따른 나노입자가 소교세포을 표적하는 것을 조직면역염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 본 발명의 일 예에 따른 나노입자가 소교세포을 표적하는 것을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 예에 따른 발현 벡터가 담지된 나노입자에 의한 신경병증성 통증 경감 효과를 확인한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 예에 따른 나노입자의 진통 지속성을 확인한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 예에 따른 나노입자의 진통 지속성을 IL-4 재조합 단백질과 비교한 도면이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 일 예에 따른 나노입자의 만성화된 신경병증성 통증에 대한 진통 효과를 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 플라스미드 제작
IL-4 과발현 플라스미드는 EcoRI 또는 SalI 제한 효소 서열을 적응한 프라이머 쌍 (5’-GAATTCTGAGCCACCATGGGTCTCAACCCCCAGCTAG-3’(서열번호 1); 5’-GTCGACCTACGAGTAATCCATTTGCATG-3’(서열번호 2))을 이용하여 제조하였다. IL-10 과발현 플라스미드는 XbaI 또는 SalI 제한 효소 서열을 적응한 프라이머 쌍 (5’-TCT AGAATGCCTGGCTCAGCACTGCTATG-3’(서열번호 3); 5’-GTCGACTCAGCTCTTCATCTTGATCATC-3’(서열번호 4))을 이용하여 제조하였다. RT-PCR을 통해 일차배양 마우스 미세아교세포 (microglia)로부터 마우스 IL-4 및 IL-10 유전자의 서열을 수득하여 플라스미드 pAAV-EF1a-MCS-IRES-EGFP 에 서브클로닝하여 IL-4 및 EGFP, 또는 IL-10 및 EGFP를 발현하는 플라스미드 pAAV-EF1a-mIL-4-IRES-EGFP 및 pAAV-EF1a-mIL-10-IRES-EGFP 를 제작하였다. 제조된 플라스미드 IL-4 (도 1의 A) 및 플라스미드 IL-10 (도 1의 B)의 구조를 도 1에 나타내었고, 각 벡터의 크기는 7072bp, 또는 7210 bp 이었다.
실시예 2. 소교세포 항염증 활성 확인
(1) 형질전환을 통한 소교세포 항염증 활성 확인
소교세포 주 BV2에 IL-4, IL-10 발현 벡터를 각각 전기 천공법 (Electroporation)으로 형질주입하여 IL-4 또는 IL-10 및 EGFP를 발현하도록 하였다. 형질 주입한 각 세포 군에서 EGFP 발현을 형광현미경으로 확인하여 도 2a에 나타냈으며, 소교세포에서 IL-4 혹은 IL-10 유전자가 발현되고 있음을 RNA 수준에서 확인하였다 (도 2b).
WT BV2, IL-4 발현 BV2, 및 IL-10 발현 BV2 각각의 세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도 후, SYBR Green PCR Master Mix와 QuantStudio 3 Real-time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를 이용하여 Real-time RT-PCR 을 수행하여 TNF-α 및 IL-6 발현량을 확인하였다. 사용한 프라이머 시퀀스는 다음과 같다:
TNF-α forward, 5′-AGCAAACCACCAAGTGGAGGA-3′(서열번호 5);
TNF-α reverse, 5′-GCTGGCACCACTAGTTGGTTG-3′(서열번호 6);
IL-6 forward, 5′-CCACGATTTCCCAGAGAACAT-3′(서열번호 7);
IL-6 reverse, 5′-TCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3′(서열번호 8).
도 2c에 나타난 바와 같이, LPS를 처리하여 염증반응을 유도하였을 때 IL-4 형질주입 시 소교세포의 활성을 조절하여 소교세포의 염증성 사이토카인 생산이 현저히 줄어들었으며, IL-10와 비교하여 IL-4에 의한 항염증 활성이 현저히 높았다.
(2) 상층액에 의한 항염증 활성 확인
wild type BV2 혹은 일차배양 혼합 교세포에 LPS를 처리하여 염증반응 유도 후, 상기 형질전환된 IL-4를 발현하는 BV2 세포의 상층액 (Conditioned media, CM)을 처리한 후 RNA 수준의 반응을 확인하였다. 도 2d에 나타난 바와 같이, IL-4를 발현하는 BV2 세포의 상층액 처리 시 TNF-α 및/또는 IL-6의 발현이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.
실시예 3. 소교세포의 M2 type 활성 촉진 활성 확인
IL-4 혹은 IL-10 를 발현하는 BV2 세포의 상층액(Conditioned media, CM)을 wild type BV2 혹은 일차배양 혼합 교세포에 처리한 후 RNA 수준의 반응을 확인하였다 (도 3).
도 3에 나타난 바와 같이, IL-4를 발현하는 세포의 상층액 처리로 소교세포 M2 type 활성마커인 Arg-1, Ym-1 의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, IL-10을 발현하는 세포의 상층액을 처리한 경우 Arg-1, Ym-1 의 발현이 유의하게 증가하지 않았다.
실시예 4. 벡터가 담지된 PLGA 나노입자 제조
실시예 1에서 제조한 100 μg 의 IL-4 plasmid DNA 또는 IL-10 plasmid DNA를 각각 200 μl TE 8.0 용액에 녹인 후 PLGA 20 mg 이 녹아 있는 dichloromethane (DCM) 1 ml 에 방울방울 떨어트렸다. 팁 형태의 초음파 기기 (40 W, 1 min; Vibra-Cell™ VCX 130; Sonics, Newtown, CT, USA)를 이용하여 혼합용액을 에멀전화 하였다. 2 ml 의 1% PVA 용액을 넣고 2분간 초음파 처리를 하여 나노단위 입자의 분산을 안정화시켰다. 6 ml 의 1% PVA 용액을 추가 후 3시간, 상온에서 교반하여 DCM 용액을 증발시켰다. 남은 용액은 원심분리 (15,000 ×g, 15 분, 4oC)를 통해 증류수로 2번 씻어 준 후 동결건조하여 용매가 없는 상태의 벡터가 담지된 PLGA 나노입자를 얻었다.
각 나노입자를 증류수에 녹인 후 1 분간 초음파 처리 후 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하여 나노입자의 표면 전위와 크기를 측정하였다 (도 4의 A 및 B). 또한, 전자현미경 이미지를 이용하여 나노입자 크기를 다시 한 번 확인하였다 (도 4의 D 및 E).
IL-4 혹은 IL-10 발현 벡터가 담지된 PLGA 나노입자의 특성 분석 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4에 나타난 바와 같이, IL-4 나노입자의 크기는 286.9 ± 10.56 nm (mean ± SEM), 표면전위는 -10.58 ± 0.5645 mV (mean ± SEM) 였으며, IL-10 나노입자의 크기는 311.0 ± 8.961 nm (mean ± SEM), 표면전위는 -14.70 ± 0.1155 mV (mean ± SEM) 이었다. IL-4 발현 벡터가 담지된 PLGA 나노입자를 PLGA/IL-4, IL-10 발현 벡터가 담지된 PLGA 나노입자를 PLGA/IL-10로 명명하였다.
실시예 5. 세포 독성 측정 (MTS)
(1) 일차 혼합 교세포 배양
C57BL/6 생쥐 1일령을 냉마취 한 후 뇌 조직을 꺼냈다. 막을 벗겨 소뇌, 중뇌 부분을 제거한 후 파이펫팅을 이용하여 단일 세포로 풀어주었다. Dulbecco’s Modified Eagle’s medium 에 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazine ethane sulfonic acid, fetal bovine serum, L-glutamine, NEAA, and antibiotic/antimycotic를 첨가한 배지를 이용하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
(2) 세포 독성 측정 (MTS)
96 well plate 에 일차 혼합 교세포를 3×104 세포/well 로 배양한 후, 실시예 2에서 제조한 나노입자를 처리하였다. Well 당 MTS 용액 (Promega) 20 μl를 추가한 후 37oC 인큐베이터에서 1시간 반응시켰다. 살아있는 세포에 의해 환원된 MTS tetrazolium 화합물은 formazan을 생성시킨다. 이 물질은 492 nm 파장에서 흡광정도로 그 양을 측정할 수 있다. EMax® Plus Microplate Reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 정량하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, PLGA/IL-4 또는 PLGA/IL-10 나노입자를 0, 200, 400, 800 μg/ml 로 일차배양 혼합교세포에 처리 시 독성이 없는 것을 확인하였다.
실시예 6. PLGA 나노입자의 IL-4 유전자 전달 (in vitro)
실시예 4에서 제조한 PLGA/IL-4 혹은 PLGA/IL-10을 HEK293T 세포에 200 μg/well(24 well-plate)로 처리하고 24, 48시간 째 EGFP 발현을 확인하여 도 6에 나타냈다. 도 6에 나타난 바와 같이, 처리 24시간 후 일부 세포에서 EGFP 형광을 발현했고, 48시간 후에는 더 많은 세포에서 EGFP 형광을 발현하는 것을 확인하여, 본 발명에 따른 PLGA 나노입자가 유전자 전달 능력이 있음을 확인하였다.
실시예 7. PLGA 나노입자의 IL-4 유전자 전달 (in vivo) 및 소교세포 M2 type 활성 촉진 활성
사용한 동물은 8~10주령 사이의 C57BL/6 수컷 생쥐이며, 동물의 사육과 관리는 Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee (SNU IACUC)에서 제시하는 지침을 따랐다. 생쥐를 2% avertin 으로 마취 한 후 등 쪽 털을 밀어주었다. 10 μl Hamilton syringe를 이용하여 척수 강 내로 실시예 4에서 제조한 PLGA/IL-4 혹은 PLGA/IL-10 나노입자를 생쥐에 척수강 주사로 200 μg/10 μl 주사 후 5일 째 희생시켰다. 2% avertin 으로 마취하고 차가운 식염수로 perfusion 하였다. 척수 조직 중 lumbar 4-6 에서 mRNA를 추출하였다. 세포의 경우 BV2, HEK293T, 일차 혼합 교세포를 각각 2×105 세포/well, 12 well-plate 에 배양하였다. LPS 혹은 conditioned media 를 처리하고 3시간 혹은 8시간 후에 Trizol solution (Thermo Fisher Scientific)으로 세포를 녹여 모았다. SYBR Green PCR Master Mix와 QuantStudio 3 Real-time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를 이용하여 Real-time RT-PCR 을 수행하였다.
사용한 프라이머 시퀀스는 다음과 같다:
GAPDH forward, 5′-AGG TCA TCC CAG AGC TGA ACG-3′(서열번호 9);
GAPDH reverse, 5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC GTA-3′(서열번호 10);
IL-4 forward, 5′-CCT CAC AGC AAC GAA GAA CA-3′(서열번호 11);
IL-4 reverse, 5′-ATC GAA AAG CCC GAA AGA GT-3′(서열번호 12);
IL-10 forward, 5′- TGA ATT CCC TGG GTG AGA AG-3′(서열번호 13);
IL-10 reverse, 5′-TGG CCT TGT AGA CAC CTT GG-3′(서열번호 14);
Arg-1 froward, 5’- TCA CCT GAG CTT TGA TGT CG-3’ (서열번호 15);
Arg-1 reverse, 5’- TTC CCA AGA GTT GGG TTC AC-3’ (서열번호 16);
Ym-1 froward, 5’- ACT TTG ATG GCC TCA ACC TG-3’ (서열번호 17);
Ym-1 reverse, 5’-AAT GAT TCC TGC TCC TGT GG-3’ (서열번호 18).
각 유전자의 mRNA 발현 정도는 GAPDH 유전자 발현 정도로 normalize 하였다. 2-ΔΔCT method로 fold induction 을 계산하여 제시하였다.
도 7의 A 및 B에 나타난 바와 같이, Saline 주사 그룹에 비해 IL-4, IL-10 발현이 각각 약 2500배, 150배 증가함을 확인하였다. 또한, 도 7의 C 및 D 에 나타난 바와 같이 PLGA/IL-4 혹은 PLGA/IL-10 의 척수강 주입 후 5일차에 Arg-1, Ym-1 의 RNA 양이 증가한 것을 확인하였다. PLGA/IL-4 의 경우 Arg-1 약 3.2배, Ym-1 약 4.5 배 증가하였고, PLGA/IL-10의 경우 각각 약 1.5배, 약 2.0배 증가하여, PLGA/IL-4가 PLGA/IL-10 대비 2배 이상의 통계적으로 유의하게 높은 소교세포 M2 type 활성을 유도하였다.
실시예 8. 나노입자의 소교세포 표적 활성 확인
(1) 조직면역염색
PLGA-FITC 나노입자를 척수강 주사로 주입 후 3시간 째 마취 하여 perfusion 및 4% PFA 로 고정시켜 샘플을 얻었다. L4-L6 척수 조직을 4% PFA 로 18시간 후 고정한 후 30% sucrose 로 2일간 dehydration 시켰다. 이후 16 um 로 section 하여 샘플 슬라이드를 얻었다. 조직 슬라이스를 5% normal donkey serum, 2% bovine serum albumin, 0.1% TritonX-100 이 포함된 블로킹용액을 1시간 동안 처리했다. 소교세포 마커 rabbit-anti-Iba1(1:1000; Wako, Osaka, Japan), 성상세포 마커 rabbit-anti-GFAP (1:1000; Dako, Agilent, CA,USA) 혹은 뉴런 마커 rabbit-anti-MAP2 (1:400; Millipore, MA, USA)를 각각 처리하여 18시간 4°C에서 반응시켰다. 0.1M PBS로 3번 씻어낸 후 Cy3-결합 2차 항체(1:200; Jackson ImmunoResearch, PA, USA)를 붙이고 VectaShield medium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA)으로 마운팅했다. 형광 이미지는 공초점 현미경 (LSM800; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 확인하였다. 나노입자의 형광 FITC 신호와 세포 형광 Cy3 의 겹치는 정도로 세포 특이적 전달을 확인하였다.
(2) 유세포 분석
PLGA-FITC 나노입자를 척수강 주사로 주입 후 24시간 째 척수 조직을 cervical, thoracic, lumbar, sacral 각각 얻어 단일 세포로 만들기 위해 조각 낸 후 100 μm strainer로 거른다. 세포는 2% FBS 가 있는 차가운 PBS로 씻어냈다. FcBlockerTM (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)을 이용해 블로킹 한 후 각각 소교세포, 성상세포, 신경세포의 마커 CD11b-APC (Biolegend Inc., San Diego, CA, USA), ACSA-2-PE (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), Thy-1.2 violet(Biolegend Inc.)를 이용하여 염색하였다. BD FACSVERSE flow cytometer (BD Bioscience)를 이용하여 각 세포마다 보이는 형광의 정도를 확인하였다.
(3) 소교세포 표적 활성
도 8a에 나타난 바와 같이, 면역염색 결과 나노입자의 형광이 주로 Iba-1 발현 소교세포와 겹쳐지는 것을 확인하였다. 또한, 도 8b에 나타난 바와 같이, 유세포 분석을 통하여 정량하였을 때, CD11b 발현 소교세포 중 cervical;4.9, thracic;11,8, lumbar;25.5, sacral;35.8%가 나노입자 함유 세포임을 확인하였다. 반면 ACSA-2 발현 성상세포나 Thy-1 발현 뉴런에서는 cervical, thoracic, lumbar 에서 1% 미만, sacral 에서 3% 미만의 세포만 나노입자 함유 세포임을 확인하였다. Mean fluorescence intensity는 각 세포에서 얼마나 많은 나노입자를 함유하고 있는지 알 수 있는 지표이다. CD11b 발현 소교세포의 경우 cervical;1025, thracic;1852, lumbar;3902, sacral;7129 의 intensity 값을 보였고 ACSA-2 발현 성상세포는 cervical, thoracic, lumbar 에서 1000 미만, sacral 에서 1160의 값을 나타내었다. Thy-1 발현 뉴런은 모든 영역에서 500미만의 값을 보였다. 따라서 대부분의 나노입자는 소교세포에 함입되고 성상세포나 뉴런에는 극히 일부의 나노입자만이 함입될 수 있었다.
실시예 9. 신경병증성 통증 모델에서 진통 효과 확인
(1) 신경병증성 통증 모델 제조
사용한 동물은 8~10주령 사이의 C57BL/6 수컷 생쥐이며, 동물의 사육과 관리는 Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee (SNU IACUC)에서 제시하는 지침을 따랐다.
생쥐를 2% avertin 으로 마취한 후 오른쪽 골반 부분의 피부를 잘라서 벌리고, 골반과 척추 뼈 사이의 근육을 0.5 cm 자른 후 내부의 L5 신경을 찾아 잘랐다. 10% povidone-iodine으로 수술부위를 소독한 후 수술용 클립으로 봉합하였다. 음성대조군은 피부와 근육만 절단하는 방법으로 수술하였다.
(2) PLGA 나노입자 투여
SNT 수술을 통해 신경병증성 통증을 유도한 생쥐를 준비한 후 7일 차에 통증행동 실험을 진행하여 통증이 충분히 유도된 것을 확인하였다. 신경병증성 통증이 유도된 생쥐를 2% avertin 으로 마취 한 후 등 쪽 털을 밀어주었다. 이후 실시예 4에서 제조한 나노입자를 척수강으로 200 μg/10 μl 주입하였다.
(3) 통증 행동실험
Von Frey 필라멘트 (0.02-4g, Stoelting, IL, USA)를 이용하여 up-down method로 통증정도를 측정하였다. 메쉬 위에 생쥐를 올려두고 발 바닥을 Von Frey 필라멘트로 자극하여 빠른 회피, 발바닥 핥기 등 통증을 느끼는 행동여부를 확인하였다. 50% withdrwal threshold를 계산하여 수치화하였다.
이후 2주 더 행동실험을 진행하여 통증경감효과를 측정하였다. PLGA/IL-4 나노입자 주입 이후 3일차부터 통증이 경감되는 경향이 있었고, 5일차부터 확실한 효과를 나타내었으며 2주동안 유지가 되는 것을 확인하였다. IL-10 나노입자를 주입한 실험군에서는 3, 5, 7일째 약간의 통증겸감 경향을 보였으나, 나노입자 주입 후 14일째에서 IL-4 나노입자 주입 실험군이 IL-10 나노입자 주입 실험군에 비해 월등한 통증경감 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 9a). 도 9a에서 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. SNT+Saline, #
p < 0.05 vs. SNT+PLGA/IL-4 이다.
도 9a 그래프의 아래 면적 (area under the curve; AUC) 를 계산하여 전반적인 통증 반응 정도를 나타내 보았을 때. IL-4 나노입자 주입 실험군에서 Saline 양성 대조군에 비해 유의미한 면적 증가가 있었고, IL-4 나노입자를 주입한 실험군이 IL-10 나노입자 주입 실험군보다 AUC 기준으로 약 1.55배 이상의 통증 경감 효과를 보였다 (도 9b).
(4) 통계분석
그룹 간 통계분석은 one-way ANOVA를 진행한 후 Tukey’s multiple comparison test를 하였다. p값이 0.05 이하인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 표시하였다. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)
실시예 10. 진통 지속성 확인
PLGA/IL-4 나노입자에 의한 진통 지속성을 확인하기 위해, 실시예 9와 실질적으로 동일한 방법으로 신경병증성 통증 모델을 제조하고, 실시예 4에서 제조한 PLGA/IL-4 나노입자 (IL-4 유전자 포함)를 200 μg/10 μl 농도로 투여하였다.
실시예 9에서 제조한 신경병증성 통증 모델에서, electrical von Frey를 이용하여 통증 강도를 측정하였다. Dynamic plantar aesthesiometer (Ugo Basile, Milan, Italy) 장비를 사용하여 1초에 0.5g씩 증가되는 무게로 발바닥을 누르고 통증반응이 나타나는 시점의 무게를 기록하였다. 3번 반복하여 그 평균값을 withdrawal threshold 로 계산하였다. 통증 행동실험 결과를 도 10에 나타냈다.
도 10에 나타난 바와 같이, PLGA/IL-4 나노입자 투여 후 5, 7, 10, 14 일까지 진통 효과의 확실한 경향성을 확인하였으며, threshold 가 약 3.1, 2.8, 3.8, 3.4 g으로 강력한 진통효과를 보였다. 투여 후 3, 5주차에서도 threshold가 약 3.4 g으로 대조군 대비 높은 진통효과를 유지했다.
실시예 11. IL-4 재조합 단백질과 진통 지속성 비교
본 발명의 일 예에 따른 PLGA/IL-4 나노입자(IL-4 유전자를 포함)과, 비교군으로서 IL-4 재조합 단백질 (IL-4 recombinant protein; IL-4 RP)의 진통 지속성을 비교실험하였다.
실시예 9와 실질적으로 동일한 방법으로 신경병증성 통증 모델을 제조하고, SNT 이후 7일차에 실시예 4에서 제조한 PLGA/IL-4 나노입자(IL-4 유전자 포함) 또는 IL-4 재조합 단백질을 척수강으로 투여하였다. IL-4 재조합 단백질은 R&D systems 사의 recombinant mouse IL-4 protein 을 구매하여 사용하였다. 단백질은 200 ng/mouse 로 SNT 이후 7일차에 척수강으로 1회 투여하였다.
PLGA/IL-4 및 IL-4 RP 투여 후 1시간째 및 1, 3, 5, 7, 10, 14 일차에 실시예 10과 실질적으로 동일한 방법으로 통증정도를 측정하여 도 11에 나타냈다. IL-4 RP 처리한 그룹에서는 주사 직후인 1시간째에 threshold 를 3.15 g까지 회복하였으나, 다음날부터 측정이 종료되는 날까지 진통효과를 보이지 않았다.
반면에 PLGA/IL-4 투여 그룹의 경우, 투여 초기에는 IL-4 RP 처리군보다 진통 효과가 낮았으나, 투여 후 7, 10, 14일차에 각각 threshold가 약 3.3, 3.9, 3.3 g까지 회복하여 현저한 진통 효과를 보였다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 나노입자는 재조합 단백질보다 장기적으로 진통 지속성이 높았다. 신경병증성 통증은 만성적인 질환으로서 장기적인 치료가 필요하며, 약물을 매일 주사하거나 펌프를 삽입하여 계속적인 투여가 필요한 재조합 단백질에 비해, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 한번의 투여로 5주 이상의 진통효과를 나타낼 수 있어, 편리성이 높고, 척수강 주사에 따른 부작용을 줄일 수 있다.
실시예 12. 만성화된 신경병증성 통증에 대한 진통 효과
실시예 9와 동일한 방법으로 신경병증성 통증 모델을 제조하고, 신경병증성 통증이 만성 통증화된 수술 후 7일차 또는 1달차에 실시예 4에서 제조한 나노입자를 척수강으로 200 μg/10 μl 투여하고, 통증 행동실험을 수행한 결과를 도 12a 및 도 12b에 나타냈다. 도 12a 및 도 12b에 나타난 바와 같이, 임상에서 실제 만성 통증을 가진 환자에게 약물을 투여하는 시기와 부합되는 시점인 신경병증성 통증이 만성화된 수술 7일 차 또는 1달 차에 본 발명의 일 예에 따른 조성물을 투여한 경우 진통 효과가 나타났다.
Claims (14)
- 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터; 및 생분해성 고분자;를 함유하는 나노입자를 포함하는,신경병증성 통증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 만성 신경병증성 통증인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 하기 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 갖는 것인, 조성물:(1) 소교세포의 과활성화를 억제,(2) 소교세포의 항염 활성을 증가,(3) 염증성 사이토카인 발현을 억제, 및(4) 소교세포의 M2 type 활성을 촉진.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 소교세포(microglial cell)내로 전달되는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 척수강 주사용인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 진통효과가 7일 내지 100일 지속되는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 상기 벡터의 진통 효과 연장용 나노입자인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 생분해성 나노입자는 폴리락티드, 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리(스티렌-코-에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌이민-코-에틸렌글리콜), 폴리(포스파겐-코-에틸렌글리콜), 폴리(락타이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(락티드-코-글리콜라이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(카프로락톤-코-에틸렌글리콜), 폴리(안하이드라이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(말릭산-코-에틸렌글리콜) 및 이의 유도체, 폴리(알킬시아노아크릴레이트-코-에틸렌글리콜), 폴리(하이드로옥시부틸레이트-코-에틸렌글리콜), 폴리(카르보네이트-코-에틸렌글리콜) 및 폴리(오르소에스테르-코-에틸렌글리콜), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-(L-라이신-코-에틸렌글리콜), 폴리(글리콜라이드-코-에틸렌글리콜), 폴리(메틸메타아크릴레이트-코-에틸렌글리콜), 폴리(비닐피롤리돈-코-에틸렌글리콜) 및 이의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생분해성 고분자를 포함하는 것인, 조성물
- 제8항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)인, 조성물.
- 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 생분해성 나노입자에 탑재하는 단계를 포함하는, 진통 지속성을 증가시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 진통은 신경병증성 통증에 대한 진통인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 진통은 7일 내지 100일 지속되는 것인, 방법.
- 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 생분해성 나노입자를 포함하는, 진통 지속성 증가용 조성물.
- 인터루킨-4 (Interleukin-4, IL-4)를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 준비하는 단계;생분해성 나노입자에 상기 유전자 또는 상기 벡터를 탑재하는 단계를 포함하는, 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
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| PARK JONGHYUCK, DECKER JOSEPH T., SMITH DOMINIQUE R., CUMMINGS BRIAN J., ANDERSON AILEEN J., SHEA LONNIE D.: "Reducing inflammation through delivery of lentivirus encoding for anti-inflammatory cytokines attenuates neuropathic pain after spinal cord injury", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 290, 1 November 2018 (2018-11-01), AMSTERDAM, NL , pages 88 - 101, XP093018107, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/j.jconrel.2018.10.003 * |
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