KR20190021211A - 인터루킨 10의 항-염증 효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
인터루킨 10의 항-염증 효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인터루킨 10(IL-10) 펩티드 이외에 IL-10 수용체 유형 1(IL-10R1) 펩티드를 발현함으로써 인터루킨 10(IL-10)의 용량-의존적 하향 조절을 극복하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 방법은 비제한적으로, 신경병성 또는 만성 통증; 다발성 경화증, 척수 상해, ALS, 신경 염증, 관절염 및 관절의 기타 질환과 관련된 증상 및 생리학적 손상; 및 자가면역 질환을 포함하는 다양한 질환 및 증상을 치료하는데 이용된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
이 국제 PCT 출원은 2016년 4월 22일 출원된 US 특허 가출원 번호 62/326,082에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 인터루킨 10(IL-10) 펩티드 이외에 IL-10 수용체 타입 1(IL-10R1) 펩티드를 발현함으로써 염증 신호전달의 탈활성화를 약화시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이 방법은 신경병성 통증; 다발성 경화증, 척수 손상, ALS, 신경 염증, 관절염 및 관절의 다른 질병과 관련된 증상뿐만 아니라 자가면역 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 질환의 치료에서의 용도를 갖는다.
다음의 논의에서 배경 및 소개 목적을 위해 특정 물품 및 방법이 설명될 것이다. 여기에 포함된 어떤 것도 선행 기술의 "승인"으로 해석되서는 안된다. 출원인은 본원에 언급된 물품 및 방법이 해당 법 규정에 따라 선행 기술을 구성하지 않는다는 것을 적절한 경우 입증할 수 있는 권리를 특별히 유보한다.
염증은 통증을 증가시키는 전염증 사이토킨 및 라디칼 예컨대, H2O2 및 NO의 방출과 관련된다. 염증과 손상을 제한하기 위해, 인터루킨-10과 같은 항-염증 사이토킨이 또한 방출된다; 예를 들어, 염증 조직에서, IL-10은 과도한 염증을 막기에 충분한 농도로 상승한다. 이전 연구에서 자연 발생(개) 또는 외과적으로 유도된(말) 골관절염(OA)(Chavez, et al., USSN 14/905,915 참조)을 가진 큰 동물에서 관절내로 주입되는 경우뿐만 아니라 신경병성 통증(Watkins, USSN 14/066,581 참조) 및 다발성 경화증(MS)(Watkins, et al., USSN 14/370,724 참조)의 설치류 모델에서 척수강내로 주입되는 경우 인간 인터루킨-10(hIL-10)의 플라스미드-지시된 발현이 항-이질통임을 보여주었다. 지난 수년에 걸쳐 실시된 IND를 가능하게 하는 연구는 만성 통증의 치료에 대한 이러한 접근법이 인간에게 안전하고도 효과적일 것이라는 확실한 증거를 제공하였다. 그러나, 이러한 연구 과정에서, IL-10은 1 ng/ml 미만의 농도로 존재하는 경우 최대 신호전달 효율을 불러 일으키며, IL-10의 농도 증가는 역설적으로 IL-10의 하향 조절을 초래한다는 것이 분명해졌다. 용량-의존적이지 않은 염증의 보다 강력한 IL-10-매개된 억제를 달성하기 위해 IL-10 신호전달의 하향-조절을 극복할 수 있는 방법 및 조성물이 당업계에 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 다룬다.
발명의 개요
본 발명은 항원-제시 세포에서 인터루킨 10(IL-10) 펩티드 이외에 IL-10 수용체 타입 1(IL-10R1) 펩티드(본원에서 "IL-10/IL-10R1 발현 벡터")를 발현시킴으로써 IL-10의 용량-독립적 하향-조절을 극복하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이 방법은 만성 또는 신경병성 통증; 다발성 경화증, 척수 손상, 신경 염증, ALS, 및 관절염 및 다른 관절 질환과 관련된 증상 및 생리학적 손상; 뿐만아니라 자가면역 질환 치료에 이용된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 대상체의 항원-제시 세포에서 인터루킨 10(IL-10) 펩티드 및 인터루킨 10 타입 1 수용체(IL-10R1) 펩티드를 하나 이상의 박테리아, 바이러스, 파아지, 코스미드 또는 인공 염색체 벡터로부터 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 염증을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이 구체예의 일부 양태에서, 항원-제시 세포에서 발현된 IL-10 펩티드는 IL-10 펩티드의 힌지 영역에서 돌연변이를 포함하며, 일부 양태에서, IL-10 펩티드는 IL-10 야생형 서열의 129번 위치에서 페닐알라닌이 세린, 트레오닌, 알라닌 또는 시스테인으로 치환된 돌연변이를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 야생형 서열의 129번 위치에서 페닐알라닌은 세린으로 치환되었다.
일부 구체예에서, IL-10 및 IL-10R1 펩티드는 단일 벡터로부터 발현되고, 일부 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이거나, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터이거나, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열은 단일 mRNA로서 전사되고, 벡터는 IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위에 대한 코딩 서열 또는 IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열 사이에 자가-절단 2a 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 염증은 신경병성 또는 만성 통증에 의해 야기되고, 하나 이상의 벡터는 척수강내 주사에 의해 전달된다. 또 다른 구체예에서, 염증은 MS에 의해 야기되고, 하나 이상의 벡터는 척수강내 주사에 의해 전달된다. 또 다른 구체예에서, 염증은 자가면역 질환에 의해 야기되고, 하나 이상의 벡터는 척수강내 주사에 의해 전달된다. 추가의 구체예에서, 염증은 관절에 위치하고, 하나 이상의 벡터는 관절내 주사에 의해 전달된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 염증은 신경 염증이다.
일부 구체예에서, 항원-제시 세포는 단핵모세포, 단핵구, 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 포말 세포, 림프모세포, 및 B 림프구의 군으로부터 선택된다. 이 구체예의 일부 양태에서, 항원-제시 세포는 처리될 대상체로부터 분리되고, 시험관내에서 하나 이상의 벡터로 형질도입되고, 다시 대상체로 투여되며; 그러나, 일부 양태에서, 항원-제시 세포는 하나 이상의 벡터로 안정하게 형질전환되며, 배양물에서 유지된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 인터루킨 10 (IL-10) 및 인터루킨 10 타입 1 수용체(IL-10R1)에 대한 코딩 영역을 포함하는 단일 바이러스 또는 박테리아 발현 벡터를 제공한다. 이 구체예의 일부 양태에서, 벡터는 IL-10 및 IL-10R1 펩티드의 전사를 추진하는 단일 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터이고, IL-10 펩티드의 코딩 영역과 IL-10R1 펩티드의 코딩 영역 사이에 위치하는 자가-절단 2a 펩티드를 추가로 포함한다.
본 발명의 이러한 및 다른 양태 및 용도는 상세한 설명에서 기술될 것이다.
도 1은 신경병성 통증의 만성 협착 상해 모델에서 AAV-9-hIL-IO를 래트에 주사함으로써 획득된 결과에 대한 절대 역치(g) 대 주사 후 일의 플롯이다.
도 2는 신경병성 통증의 만성 협착 상해 모델에서 AAV9-hIL-10 및 AAV9-hIL10R1의 1:1 혼합물을 래트에 주사함으로써 얻어진 결과에 대한 절대 역치 (g) 대 주사 후 일의 플롯이다.
도 3은 재발-완화 EAE 래트에서 PLGA 미세입자에 캡슐화된 IL-10(원)을 래트에 척수강내 주사함으로써 얻어진 결과에 대한 운동 스코어 대 운동 증상의 발생 후 시간(일)의 플롯이다. 운동 스코어 : 0 = 정상; 1 = 꼬리 끝 마비; 2 = 완전한 꼬리 마비; 3 = 약한 뒷다리; 4 = 뒷다리 마비; 5 = 완전한 뒷다리 마비; 6 - 부분적인 앞다리 마비. 군당 N = 6.
도 4는 정상 마우스 및 다운 증후군의 염증 마우스 모델(Dp16)의 뇌에 IL-10 플라스미드를 미세주입한 결과를 보여준다.
도 2는 신경병성 통증의 만성 협착 상해 모델에서 AAV9-hIL-10 및 AAV9-hIL10R1의 1:1 혼합물을 래트에 주사함으로써 얻어진 결과에 대한 절대 역치 (g) 대 주사 후 일의 플롯이다.
도 3은 재발-완화 EAE 래트에서 PLGA 미세입자에 캡슐화된 IL-10(원)을 래트에 척수강내 주사함으로써 얻어진 결과에 대한 운동 스코어 대 운동 증상의 발생 후 시간(일)의 플롯이다. 운동 스코어 : 0 = 정상; 1 = 꼬리 끝 마비; 2 = 완전한 꼬리 마비; 3 = 약한 뒷다리; 4 = 뒷다리 마비; 5 = 완전한 뒷다리 마비; 6 - 부분적인 앞다리 마비. 군당 N = 6.
도 4는 정상 마우스 및 다운 증후군의 염증 마우스 모델(Dp16)의 뇌에 IL-10 플라스미드를 미세주입한 결과를 보여준다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 공개된 특허 출원 및 특허는 여기에 기재된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 디바이스, 동물 모델, 제형 및 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 그 전체가 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원-제시 세포"는 주요 조직적합성 클래스 II 복합체(MHC)와 복합된 항원을 그 표면에 나타내고(항원 제시), IL-10 수용체 타입 2(IL-10R2)를 발현하는 다양한 세포 중 어느 한 세포를 나타낸다. 본 발명의 항원-제시 세포는 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포 및 이들의 전구체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "항-염증"은 신경, 뉴런, 아교 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 근육, 면역 세포 또는 다른 세포 유형에 의해 생성된 하나 이상의 전염증 사이토킨의 작용 또는 생성을 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항-염증 사이토킨"은 신경, 뉴런, 아교 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 근육, 면역 세포 또는 다른 세포 유형에 의해 생성된 하나 이상의 전염증 사이토킨 또는 단백질의 작용 또는 생성을 감소시키는 단백질을 지칭한다. 염증 사이토킨 및 단백질은 인터루킨-1 베타(IL-1β), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 관심 항-염증 사이토킨은 인터루킨-10(IL-10), IL-10의 전장 분자 및 단편뿐만 아니라, 항-염증 사이토킨이 치료학적으로 효과적인 한 천연 서열에 대한 결실, 첨가 및 치환(사실상 보존적 또는 비보존적)을 갖는 것을 포함하는 변형된 IL-10 펩티드이다. 변형은 부위-지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 통해 의도적으로 이루어지거나, PCR 증폭으로 인한 오차 또는 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통해서와 같이 우연히 일어날 수 있다. 따라서, 활성 단백질은 전형적으로 모 서열에 실질적으로 상동성이며, 예를 들어, 단백질은 전형적으로 모 서열과 70% 넘게 동일하다.
본원에 사용된 용어 "자가면역 질환"은 신체에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 신체의 비정상적인 면역 반응으로부터 발생하는 병리학적 상태를 나타낸다.
본원에서 사용된 "만성 통증"은 특정 유형의 손상 또는 질병 과정과 관련된 자연 치유의 일시적인 경과보다 오래 지속되는 통증을 나타낸다.
용어 DNA "조절 서열"은 수령 세포에서 코팅 서열의 복제, 전사 및 번역을 종합적으로 제공하는, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서 등을 종합적으로 나타낸다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이러한 유형의 조절 서열이 모두 존재해야할 필요는 없다.
예를 들어, IL-10 또는 IL-10R1의 "코딩 서열" 또는 IL-10 또는 IL-10R1을 "인코딩"하는 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓이게 되는 경우 생체내에서 폴리펩티드로 전사(DNA의 경우) 및 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 아미노 말단에서 개시 코돈에 상응하는 뉴클레오티드 및 카르복시-말단에서 번역 중지 코돈에 상응하는 뉴클레오티드에 의해 결정된다.
본 발명의 방법에 사용되는 치료적 미세입자 조성물의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이란 용어는 비독성이나, 원하는 반응 예컨대, 통증 감소, 염증의 감소, 염증 질환에 의해 야기된 증상의 경감 및/또는 염증 질환으로 인한 생리적 손상의 진행 방지 및/또는 예를 들어, MS, 만성 통증, 관절 염증, 신경 염증 및 자가면역에 의해 야기되는 증상의 경감을 제공하기에 충분한 양의 치료적 미세입자 조성물을 나타낸다. 필요한 본 발명의 치료적 항-염증 조성물의 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 및 일반적인 상태, 치료할 질환의 중증도 및 전달될 특정 IL-10/IL-10R1 발현 벡터, 투여 모드, 기타 등등에 따라 대상체 마다 상이할 것이다. 본 방법에 대한 투여량 파라미터가 본 명세서에서 제공된다; 그러나, 임의의 개별 경우에서 적절한 "유효한" 양의 최적화는 본원에 제시된 방법 및 일상적인 실험을 통해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
용어 "부형제"는 치료적 미세입자 조성물의 투여를 추가로 촉진하기 위해 본 발명의 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 나타낸다. 부형제의 비제한적인 예는 염수, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 계면활성제와 임의적으로 제형화된 히알루론산, 플루로닉 F-68, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
용어 "시험관내"는 유기체 내에서 보다는 인공 환경, 예를 들어, 시험 튜브 또는 반응 용기, 세포 배양물, 등에서 발생하는 사건을 나타낸다.
용어 "관절"은 뼈를 서로 연결하는 인대, 근육을 뼈에 부착시키는 힘줄, 관절 캡슐, 부르사 및 활막을 포함하여 두 개의 뼈가 만나는 해부학적 구조체를 지칭한다. 본원의 방법으로 처리될 수 있는 관절은 고정식, 경첩형, 피봇형 또는 볼-및-소켓 관절을 포함한다.
용어 "관절 염증" 또는 "관절 통증"은 류마티스 관절염, 골관절염이 가장 흔한 염증에 의해 야기되는 모든 유형의 관절염뿐만 아니라 건염, 활액낭염, 인대의 염증, 활액막염, 통풍 및 전신성 홍반성 루푸스를 포함하는 관절의 염증에 의해 야기된 다른 질환의 모든 유형을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다발성 경화증" 또는 "MS"는 중추 신경계의 진행성의 신경퇴행성 질환을 나타내며, 이는 탈수초화 기간에 이어서 기능 회복 기간이 뒤따르는 재발/완화 형태로 가장 자주 발생한다. 회복 단계는 희소돌기아교세포 전구체 세포 또는 희소돌기아교세포 전구 세포의 이동 및 성숙을 통한 재수초화를 포함한다. 그러나, 질병이 진행됨에 따라, 재수초화는 점진적인 기능 손실로 실패한다. 무손상 축삭의 재수초화 실패에 대한 가능한 설명은 탈수초화 부위로의 희소돌기아교세포 전구체 세포 모집의 결핍 또는 수초화 희소돌기아교세포로의 희소돌기아교세포 전구체 세포 분화의 결함을 포함한다. 비록 연구는 희소돌기아교세포 전구체 세포 생물학의 두 양태 모두가 MS에서 변경됨을 나타내지만, 성체 중추 신경계 내에서 이러한 과정을 조율하는 분자 기작은 불완전하게 이해되지만 염증을 포함하는 것으로 알려져있다.
용어 "핵 표적화 서열"은 세포에서 항-염증 사이토킨의 발현 효율을 개선시키는 기능을 하는 핵산 서열을 나타낸다.
"작동 가능하게 연결된"은 기술된 바와 같은 구성 요소가 그들의 통상적인 기능을 수행하도록 구성되는 구성 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 조절 서열은 이들이 이들의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 비번역되었으나 전사된 개입 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
"프로모터"라는 용어는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 나타내는 것으로 이의 통상적인 의미로 본원에서 사용되며, 여기에서 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있으며, 다운스트림 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터"(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨), "억제성 프로모터"(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨) 및 "구성적 프로모터"를 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐 특정 핵산 분자에서 뉴클레오티드 서열의 상대적 위치를 설명하기 위해, 예컨대, 특정 뉴클레오티드 서열이 또 다른 서열에 대해 "업스트림", "다운스트림", "3 프라임(3')" 또는 "5 프라임(5')"에 위치하는 것으로 기재되는 경우, 이는 당업계에 통상적인 것으로서 언급되는 DNA 분자의 "센스" 또는 "코딩" 가닥에서 서열의 위치인 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "연구 도구"는 다른 약학적 및/또는 생물학적 치료법의 개발을 포함하는, 사실상 학술적 또는 상업적 성질의 과학적 조사를 위해 치료적 미세입자 조성물을 사용하는 본 발명의 임의의 방법을 나타낸다. 본 발명의 연구 도구는 치료 목적이거나 규제 당국의 승인을 받기 위한 것이 아니며; 그 보다는, 본 발명의 연구 도구는 규제 의뢰를 지원하기 위한 정보를 생산하려는 의도로 수행된 임의의 활동을 포함하는 그러한 개발 활동에 대한 연구 및 지원을 용이하게 하기 위해 의도된 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택가능한 마커"는 세포 특히, 본 발명과 관련하여 인공적 선택에 적합한 형질을 부여하는 배양물 중의 세포 내로 도입된 유전자를 나타낸다. 일반적 사용 선택가능한 마커는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 척추동물, 바람직하게는 포유류를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 조성물" 또는 "치료적 항-염증 조성물"은 염증 사이토킨의 농도 및/또는 염증 작용을 감소시키는 능력을 갖는 IL-10/IL-10R1 발현 벡터 조성물을 나타낸다. 본 발명의 치료 조성물은 임의의 공지된 동물 모델에서 측정되는 바와 같이 또는 인간에서 수행된 평가에 의해 예를 들어, MS, 만성 통증, 관절 염증, 신경 염증 및 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다.
염증의 "치료" 또는 "치료하기"는 (1) 아직 증상을 경험하거나 나타내지 않았으나 염증 성향이 있을 수 있는 대상체에서 염증이 약한 강도로 발생하게 하거나 염증을 감소시키는 것, (2) 염증을 억제하는 것 즉, 염증으로 인한 증상 또는 생리학적 손상을 역전시키거나 이의 전개를 저지하는 것, 또는 (3) 염증으로 인한 생리학적 손상을 감소시키거나 역전시키는 것을 포함한다.
"벡터"는 다른 이종성 DNA 절편이 삽입될 수 있는 플라스미드, 파아지, 바이러스 작제물, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 인간-유래 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체와 같은 레플리콘이다. 본원의 벡터는 IL-10 및 IL-10R1 펩티드를 형질도입하고 발현시키는데 사용된다.
본원에 기재된 기술의 실행은, 달리 명시되지 않는 한, 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학 및 서열 결정 기술의 통상적인 기술 및 설명을 이용할 수 있으며, 이는 당업계에서 활동하는 자의 기량에 속한다. 적절한 기술의 특정 예시는 본원의 실시예를 참고로 할 수 있다. 그러나, 물론 동등한 통상적인 다른 절차가 또한 이용될 수 있다. 이러한 통상적인 기술과 설명은 표준 실험실 메뉴얼 예컨대, [LeDoux (Ed.) (2005), Animal Models of Movement Disorders (Academic Press)]; [Chow, et al. (2008), Using Animal Models in Biomedical Research (World Scientific Publishing Co.)]; [Weir and Blackwell (Eds.), Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (Blackwell Scientific Publications)]; [Creighton (1993), Proteins : Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company)]; [Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual]; 및 [Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (both from Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Stryer, L. (1995) Biochemistry, Fourth Ed. (W.H. Freeman)]; [Gait (1984), "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (IRL Press)]; [Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry, Third Ed. (W. H. Freeman)]; 및 [Berg et al. (2002) Biochemistry, Fifth Ed. (W.H. Freeman)]에서 찾아볼 수 있으며; 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함함을 주지하라.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각 개재 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한, 명시된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계 둘 모두를 배제한 범위 또한 본 발명에 포함된다.
하기 설명에서, 본 발명의 더욱 완전한 이해를 제공하기 위해 많은 특정 세부 내용이 제시된다. 그러나, 당업자에게는 본 발명이 하나 이상의 이러한 특정 세부 내용 없이 실시될 수 있음이 자명할 것이다. 다른 경우, 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해, 당업자에게 잘 알려진 공지의 특징 및 절차는 기술하지 않았다.
발명의 방법
본 발명은 인터루킨-10(IL-10) 코딩 서열 및 인터루킨-10 수용체 타입 1(IL-10R1) 코딩 서열을 발현하는 벡터를 대상체에 투여함으로써 염증과 관련된 질병 및 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, IL-10 및 IL-10R1 펩티드는 단일 발현 벡터로부터 발현된다; 그러나, 대안적인 구체예에서, IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열은 상이한 발현 벡터로부터 발현된다. 일부 구체예에서, IL-10/IL-10R1 발현 벡터(들)는 예를 들어, 척수강내 투여(예를 들어, 만성 통증, 신경 염증, MS 또는 자가면역 질환의 치료를 위함) 또는 관절내 주사(관절 염증의 치료를 위함)를 통해 대상체에 투여된다. 또 다른 구체예에서, IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 세포 요법을 통해 대상체에 투여된다; 즉, 먼저 IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 사용하여 -대상체로부터 취해진 항원-제시 세포를 포함하는- 항원-제시 세포를 형질전환 또는 형질도입시킨 후, 항원-제시 세포를 대상체에 투여한다. 본 발명의 방법은 만성 통증, MS, 자가면역 질환, 신경 염증 및 관절 염증을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 질병 또는 질환과 관련된 염증에 의해 야기된 생리학적 손상 및 염증을 치료하는데 사용될 수 있다.
광범위한 염증 매개체의 현저한 억제가 항-염증 사이토킨 인터루킨 10(IL-10)의 작용을 통해 달성될 수 있음이 밝혀졌다. IL-10은 별아교세포와 미세아교세포 둘 모두의 천연 생성물이며, 이들 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하여, 이들 세포에 의해 생성된 국소 염증 반응의 자가분비 조절을 일으킨다. 염증의 복잡성으로 인해, 정상적인 미세아교세포 기능을 재확립시키는 능력을 갖는 임의의 제제는 많은 상이한 하위 시스템을 동시에 표적으로 할 수 있어야 한다. IL-10은 2개의 수용체 IL-10R1 및 IL-10R2와의 3부(tripartite) 복합물을 형성하며; 주로 IL-10R1에 결합하며(Ding et al., J. Immunol., 167(12):6884-92 (2001)), 그 후, 이 복합물은 IL-10R2와 맞물린다. IL-10R2는 IL-22 및 이의 주요 수용체와 또한 복합되는 IL-10R1보다 더 풍부하고 혼잡한 신호전달 서브유닛이다(Kotenko et al., J. Biol. Chem., 276(4):2725-32 (2001)). IL-10R1은 항원-제시 세포의 세포 막에서 낮은 수준으로 존재하며, IL-10 신호 전달 및 LPS와 같은 염증 매개체에 의해 상향조절된다(Ledeboer et al., Eur. J. Neurosci., 16 (7):1175 -85 (2002)). 이러한 상향 조절은 JAK1, TYK2 및 STAT 1 및 STAT 3과 같은 다운스트림 이펙터 분자를 활성화시키는 IL-10R2 수용체를 통한 신호 전달을 향상시키고, PI3K-AKT를 통해 간접적으로 신호 전달을 향상시킨다. 이러한 조정된 신호 전달은 대식세포 및 T-세포와 같은 항원-제시 세포에서의 항원 제시를 하향조정한 반면, IL-10의 항-염증 효과는 물론 IgG 생성 및 B-세포 증식을 자극하는 이의 능력에 기여한다. IL-10이 표적 세포를 과잉-자극할 때, 사이토킨 신호전달 억제제(Suppressor of Cytokine Signaling(SOCS))로 불리는 8가지 단백질 부류 중 두 구성원이 유도된다(Ding et al., J. Immunol., 170(3):1383-91 (2003), Kazi et al., Cell Mol. Life Sci., 71(17):3297-3310 (2014)). SOCS1과 SOCS3는 농도-의존적 방식으로 IL-10에 의해 유도되지만, SOCS1은 IL-10 신호 전달을 특이적으로 억제하고(Ding et al 2003, 상기 참조), IL-10R1은 E3 유비퀴틴 리가아제인 SOCS3에 의해 유비퀴틴화되어, 프로테아좀 표적화에 의해 막-결합 IL-10R1을 하향-조절한다(Wei et al., J. Interferon Cytokine Res., 26(5):281-90 (2006)). 본 발명자들은 약 0.5 ng/ml를 초과하는 농도에서 IL-10이 역설적으로 그 자신의 활성을 억제한다는 것을 발견하였다. 어떤 이론에 구속되지 않으면서, 이러한 억제는 바이러스-매개된 IL-10 발현이 항시적이지만 비교적 빨리 사라지는 신경병증성 통증에 대해 초기 치료 효과를 갖는 반면, 척수강내 플라스미드 IL-10은 12주까지 효과를 제공하는 이유를 설명할 수 있다. 즉, 이러한 현상은 IL-10 플라스미드 주사 후 관찰된 훨씬 낮은 농도의 뇌척수액 IL-10(~150 pg/mL)으로부터의 통증에 대한 더 큰 효과와 대조적으로 매우 높은 수준의 아데노바이러스-유래된 뇌척수액 IL-10 농도(~10 ng/mL)가 통증에 대한 치료 효과의 결핍을 초래하는 이유를 설명한다. 따라서, 본 발명은 항원-제시(IL-10R2-양성) 세포에 대한 항시적 자가분비 신호전달을 달성하기 위해 이의 주요 수용체 IL-10R1과 IL-10을 공동-발현시킴으로써 IL-10의 치료 범위를 극적으로 확대시키는 2세대 치료법을 제공한다.
본 발명은 일반적으로, 염증 질환과 관련된 증상 및 생리적 손상뿐만 아니라 염증 질환 및 질병을 치료하기 위한 방법 및 치료적 항-염증 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 염증 질환의 연구에서 본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물을 사용하기 위해 제공되며, 상기 조성물은 본 발명의 치료학적 조성물과의 "칵테일" 중에서 함께 사용될 수 있는 식별용 약제, 소분자 및/또는 생물(biology)을 포함한다. 방법은 IL-10 코딩 서열 및 IL-10R1 코딩 서열을 포함하는 IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 일반적으로 희석액에 현탁되어 치료 조성물을 형성한다. 항-염증 치료 조성물은 IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열 둘 모두를 발현할 수 있으며, 대상체에서 항원-제시 세포를 형질전환 또는 형질도입시킬 수 있는 단일 "네이키드" 박테리아 벡터 또는 바이러스 벡터, 하나의 벡터는 IL-10 펩티드를 인코딩하며, 벡터는 IL-10R1 펩티드를 인코딩하는 2개의 박테리아 또는 바이러스 벡터, 캡슐화된 벡터, 또는 IL-10 및 IL-10R1을 발현하는 형질도입된 항원-제시 세포로 구성될 수 있다.
벡터 및 벡터 구성 요소
본 발명의 방법의 일부 구체예에 사용된 IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 박테리아 백본(플라스미드 DNA) 또는 바이러스 백본; IL-10 코딩 서열; IL-10R1 코딩 서열; 임의적으로 적어도 하나의 핵 표적화 서열 5'(업스트림), 3'(다운스트림) 또는 IL-10 코딩 서열 및/또는 IL-10R1 코딩 서열 둘 모두; 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 자가-절단 펩티드; 및 적어도 하나의 프로모터 및 하나 이상의 다른 DNA 대조군 서열을 포함한다. IL-10 및 IL-10R1 펩티드가 단일 벡터로부터 발현되는 구체예가 바람직하고, 본 명세서에 상세히 설명된 구체예이지만, IL-10 펩티드 및 IL-10R1 펩티드가 별도의 벡터에서 인코딩되고 대상체에 직접적으로 공동-전달되거나 수령체 항원 제시-세포에 공동-전달된 후 대상체에 전달될 수 있음을 이해해야 한다. 임의적으로, IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 또한, IL-10/IL-10R1 발현 벡터의 제조 동안 또는 수령체 항원-제시 세포로의 전달 후 형질전환된 세포의 선택을 허용하기 위해 하나 이상의 마커 서열을 포함한다.
IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 적어도 하나의 IL-10 코딩 서열을 포함한다. IL-10은 야생형으로 사용될 수 있거나, IL-10은 돌연변이 IL-10일 수 있다. 특히 관심있는 한 돌연변이 IL-10은 IL-10 단백질의 "힌지" 영역에서 야생형 IL-10과 비교하여 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 인간 IL-10 단백질은 호모다이머이며, 여기에서 각 단량체는 6개의 알파 헬릭스 A→F를 포함하며, 이의 길이는 각각 21, 8, 19, 20, 12 및 23개 아미노산이다. 한 단량체의 헬릭스 A→D는 제2 단량체의 헬릭스 E 및 F와 비-공유적으로 상호작용하여, 비-공유적 V-형상 호모다이머를 형성한다. 본 발명에 따른 돌연변이를 표적으로 하는 "힌지" 영역은 야생형 IL-10의 단량체 하나 또는 두 단량체 모두에서 D 및 E 알파 헬릭스 사이에 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 야생형 서열의 129번 위치의 페닐알라닌이 세린 잔기로 치환된 돌연변이 래트 및 인간 IL-10 단백질이 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Sommer, et al., WO2006/130580] 및 [Milligan, et al., Pain, 126:294-308 (2006)] 참조). 생성된 돌연변이 IL-10은 IL-10F129S로 지칭된다. 아미노산 위치 129번에서 야생형 페닐알라닌에 대한 다른 치환은 예를 들어, 트레오닌, 알라닌 또는 시스테인일 수 있다. 따라서, 또 다른 추가의 양태에서 본 발명은 IL-10 단백질의 힌지 영역 내의 아미노산 위치 129번 또는 또 다른 아미노산에서 하나 이상의 치환을 포함한다.
IL-10R1(인간에 대한 NCBI 참조 서열: NP_001549.2)은 특정 세포 유형, 주로 항원-제시 세포의 표면 상에 발현된 단일 막횡단 도메인을 갖는 당단백질이다. IL-10R1은 IL-10에 결합하고 IL-10의 생물학적 활성에 필수적이다. IL-10의 이의 세포 표면 수용체로의 결합은 JAK-STAT 신호 형질도입 경로를 활성화시킨다. 리간드-수용체 상호작용 후, 수용체-회합된 Janus 티로신 키나제(JAK) 패밀리의 구성원인 Jakl(IL-10R1와 회합됨) 및 Tyk2(IL-10R2와 회합됨)가 인산화된다. IL-10R1은 SOCS3에 의한 유비퀴틴화 후 프로테아좀 분해를 겪는다.
일부 구체예에서, 벡터는 박테리아, 파아지 또는 코스미드 벡터일 수 있다. 박테리아 벡터는 당업자에게 공지된 임의의 박테리아 백본을 이용할 수 있다. 통상적으로 선택된 백본은 예를 들어, 클로닝을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 효소가 함유되거나 결여되고, 용이하게 생성 및 단리될 수 있고, 면역원성이 아니며, 기타 등등의 특성을 갖는 백본이다. 사용될 수 있는 예시적인 벡터는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로부터 유래된 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 및 M13 mp 계열의 벡터와 같은 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 박테리오파아지 벡터는 λgt10, λgt11, λgt18-23, λZAP/R 및 EMBL 시리즈의 박테리오파아지 벡터를 포함할 수 있다. 활용될 수 있는 코스미드 벡터는 비제한적으로, pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 및 카로마이드 9 계열의 벡터를 포함한다. 추가적인 벡터로는 기능적인 생식능 플라스미드 (F-플라스미드)에 기초한 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 및 PI 박테리오파아지(PACS)의 DNA로부터 유래된 DNA 작제물을 포함한다.
대안적 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일반적으로, 유전자 요법에 사용된 바이러스 시스템의 가장 일반적으로 사용된 5가지 부류는 이들의 게놈이 숙주 세포 크로마틴에 통합되는지(온코레트로바이러스 및 렌티바이러스) 또는 염색체외 에피솜으로서 주로 세포 핵에 존속하는지(아데노-관련 바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스)의 여부에 따라 두 군으로 분류될 수 있다.
본 발명의 IL-10 발현 작제물에 유용한 하나의 바이러스 전달 시스템은 레트로바이러스과(family Retroviridae)로부터의 바이러스에 기초한 시스템이다. 레트로바이러스는 두 가지 독특한 특성을 특징으로 하는 단일-가닥 RNA 동물 바이러스를 포함한다. 첫 번째, 레트로바이러스의 게놈은 2개의 RNA 복사체로 구성된 이배체이다. 두 번째, 이러한 RNA는 비리온-관련된 효소 역전사 효소에 의해 이중-가닥 DNA로 전사된다. 그 후, 이러한 이중-가닥 DNA 또는 프로바이러스는 숙주 게놈에 통합되고, 숙주 게놈의 안정적으로 통합된 구성 요소로서 부모 세포에서 자손 세포로 전달될 수 있다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스는 본 발명에 특히, 형질도입된 항원-제시 세포가 대상체에 투여되는 치료적 항-염증 조성물인 구체예에 사용하기 위한 레트로바이러스 계열의 바람직한 구성원이다. 렌티바이러스 벡터는 종종 소수포 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑되고, 인간의 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 병인인 인간 면역결핍 바이러스(HIV); 양에서 뇌염(Visna) 또는 폐렴을 일으키는 비시나 매디 바이러스(Visna Maedi virus); 말에서 자가면역 용혈성 빈혈 및 뇌증을 일으키는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이에서 면역 결핍을 일으키는 고양이 면역 결핍 바이러스(FIV); 소에서 림프절 병증 및 림프구 증가증을 유발하는 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 비인간 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 유발하는 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV)로부터 유래되었다. HIV에 기반한 벡터는 일반적으로 부모 게놈의 5% 미만을 보유하고, 게놈의 25% 미만은 패키징 작제물에 혼입되어, 복귀하는 복제-가능 HIV의 생성 가능성을 최소화시킨다. 생물안전은 다운스트림 긴-말단-반복 서열에서 조절 요소가 결실되어 벡터 동원에 필요한 패키징 신호의 전사를 제거하는 자가-불활성화 벡터의 개발에 의해 더욱 증가되었다. 렌티바이러스 벡터 사용에 대한 주요 이점은 유전자 전달이 대부분의 조직 또는 세포 유형에서 지속된다는 점이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 파르보바이러스과(Parvoviridae family)로부터의 바이러스가 이용된다. 파르보바이러스과(Parvoviridae)는 약 5000개의 뉴클레오티드 길이의 게놈을 갖는 작은 단일-가닥의 비-외피형 DNA 바이러스 계열을 포함한다. 이러한 계열의 구성원에는 생산적 감염 사이클을 개시하고 유지하기 위해 또 다른 바이러스(전형적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로의 공동-감염을 분명히 필요로 하는 의존적 파르보바이러스인 아데노-관련 바이러스(AAV)이다. 이러한 헬퍼 바이러스의 부재하에서, AAV는 여전히 수용체-매개 결합 및 내재화에 의해 표적 세포를 감염 또는 형질도입시킬 수 있는 능력이 있어, 비-분열 및 분열 세포 둘 모두에서 핵에 침투한다.
아데노바이러스(Ad)는 50개가 넘는 혈청형을 포함하는 비교적 잘 특징화된 상동 그룹의 바이러스이다. 예를 들어, 국제 PCT 출원 번호 WO 95/27071 참조. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중-가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간-크기(90-100 nm)의 비외피형(외부 지질 이중층이 없음) 이십면체 바이러스이다. 인간에는 57개 혈청형이 있으며, 이는 어린이의 상기도 감염 및 마찬가지로 성인의 많은 감염의 5-10%에 대한 원인이다. 이들은 볼티모어(Baltimore) 분류 체계에 따라, 이들의 게놈이 이중-가닥 DNA로 구성되며, 가장 큰 비-외피형 바이러스를 의미하는 군 I로서 분류된다. 이들의 큰 크기 때문에, 이들은 엔도솜을 통해 수송될 수 있다(즉, 외피 융합이 불필요하다). 비리온은 또한, 숙주 세포의 표면 상의 콕사키-아데노바이러스 수용체를 통해 숙주 세포에 부착하는 것을 돕는 캡시드의 각 펜톤 염기와 관련된 독특한 "스파이크" 또는 섬유를 갖는다. 아데노바이러스 게놈은 26 내지 45 kb 사이여서, 바이러스가 이론적으로 22 내지 40개 유전자의 수반을 허용하는 선형의 비분절된 이중-가닥(ds) DNA이다. 이는 이의 볼티모어 군의 다른 바이러스보다 현저하게 크기 때문에, 이는 여전히 매우 단순한 바이러스이며, 생존 및 복제를 위해 숙주 세포에 크게 의존한다. 일단 바이러스가 숙주 세포 내로 유입되면, 엔도솜은 산성화되며, 이는 캡시드 구성 요소가 해리되게 함으로써 바이러스 토폴로지를 변경시킨다. 세포 미세소관의 도움으로, 바이러스는 핵막공 복합체에 수송되며, 여기에서 아데노바이러스 입자가 해체된다. 그 후, 바이러스 DNA가 방출되며, 이는 핵막공을 통해 핵으로 진입될 수 있다. 이 후에, DNA는 히스톤 분자와 회합한다. 따라서, 바이러스 유전자 발현이 발생할 수 있으며, 새로운 바이러스 입자가 생성될 수 있다.
렌티바이러스와 달리, 아데노바이러스 DNA는 게놈에 통합되지 않으며 세포 분열 동안 복제되지 않는다. 재조합 아데노바이러스-유래된 벡터, 특히 야생형 바이러스의 생성 및 재조합에 대한 가능성을 감소시키는 벡터가 또한 작제되었다. 국제 PCT 출원 번호 WO 95/00655 및 WO 95/11984 참조.
당업자에게 공지된 다른 바이러스 또는 비-바이러스 시스템은 또한, 대상체에 본 발명의 IL-10/IL-10R1 발현 벡터로서, 비제한적으로 숙주 세포 내로의 통합을 통해 생체내에서 바이러스-인코딩된 전이유전자를 안정하게 유지시키는 유전자-결실된 아데노바이러스-트랜스포손 벡터(문헌 [Yant, et al., Nature Biotech. 20:999-1004 (2002)]참조); 신드비스 바이러스 또는 셈리키 포레스트 바이러스로부터 유래된 시스템(문헌 [Perri, et al., J. Virol. 74(20):9802-07 (2002)] 참조); 뉴캐슬병 바이러스 또는 센다이 바이러스로부터 유래된 시스템; 또는 박테리아 DNA 서열이 회피된 미니-써클 DNA 벡터(문헌 [Chen, et al., Molecular Therapy. 8(3):495-500 (2003)] 참조)를 포함하는 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 미국 특허 공개 번호 2004/0214329에 기술된 바와 같은 미니-써클 DNA는 지속적으로 높은 수준의 핵산 전사를 제공하는 벡터를 기술한다.
IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열에 추가하여, 핵 표적화 서열이 본 발명의 IL-10/IL-10R1 발현 벡터에 존재할 수 있다. 핵 표적화 서열은 IL-10 코딩 서열 및 IL-10R1 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 촉진시키는 서열이다. 예를 들어, 한 양태에서, 핵 표적화 서열은 핵 수송 샤프론 단백질에 결합하여, 세포 핵에 의해 플라스미드 DNA의 흡수를 촉진할 수 있다. 이러한 서열은 비제한적으로, 산재된 (또는 분산된) DNA 반복부 또는 반복 서열 예컨대, 수송가능한 요소, SV40과 같은 레트로바이러스 게놈 상의 측면 인접 또는 말단 반복부 예컨대, 장 말단 반복부(LTR), 탠덤 반복부, 및 아데노-연관 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스 게놈의 역전된 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 다른 양태에서, 핵 표적화 서열은 핵 예컨대, 인핸서 서열 내로의 도입을 위해 전사 인자에 결합하도록 작용하는 서열이다.
벡터 백본, IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열 및 임의적으로, 하나 이상의 핵 표적화 서열 이외에, 본 발명의 IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 하나 이상의 DNA 조절 서열 예컨대, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종료 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위 및 기타 등등을 포함하며, 이는 수령 세포에서 IL-10/IL-10R1 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 종합적으로 제공한다. IL-10/IL-10R1 코딩 서열이 적절한 숙주 세포 내에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 조절 서열이 모두 존재할 필요는 없다.
특히, 본 발명의 IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열의 전사를 추진하는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이 프로모터는 구성적인 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 사용되는 경우 용어 "구성적"은 프로모터가 특정 자극(예를 들어, 열충격, 화학 물질, 빛 등)의 부재하에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시함을 의미한다. 전형적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있다. IL-10/IL-10R1 펩티드를 전사하는데 사용되는 프로모터는 바람직하게는, 구성적 프로모터 예컨대, RNA 폴리머라제 II에 의해 제어되는, 유비퀴틴, CMV, β-액틴, 히스톤 H4, EF-1α 또는 PGK 유전자에 대한 프로모터, 또는 RNA 폴리머라제 I에 의해 제어되는 프로모터 요소이다. 바람직한 구체예에서, U6 프로모터(예를 들어, U6-1, U6-8, U6-9), HI 프로모터, 7SL 프로모터, 인간 Y 프로모터(hY1, hY3, hY4 및 hY5), 인간 MRP-7-2 프로모터, 아데노바이러스 VA1 프로모터, 인간 tRNA 프로모터, 5s 리보솜 RNA 프로모터, 뿐만아니라 기능성 하이브리드 및 이들 프로모터 중 임의의 조합물과 같은, RNA 폴리머라제 III에 의해 제어된 프로모터 요소가 사용된다.
대안적인 구체예에서, IL-10/IL-10R1 코딩 서열은 항생제 테트라사이클린 또는 이의 유도체 예컨대, 독시사이클린의 존재하에 전사가 가역적으로 턴 온(Tet-On) 또는 오프(Tet-On)되는 테트라사이클린-제어된 전사 활성화와 같은 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. Tet-Off 시스템에서, 테트라사이클린 반응 요소-제어된 유전자의 발현은 테트라사이클린 및 이의 유도체에 의해 억제될 수 있다. 테트라사이클린은 테트라사이클린 전사활성인자 단백질에 결합하여, 이를 테트라사이클린 반응 요소 서열에 결합할 수 없게 하고, 테트라사이클린 반응 요소-제어된 유전자의 전사활성화를 방지한다. 다른 한편, Tet-On 시스템에서, 테트라사이클린 전사활성인자 단백질은 테트라사이클린에 의해 결합된 경우에만 발현을 개시시킬 수 있다; 따라서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 도입은 IL-10/IL-10R1 펩티드의 전사를 개시한다. 당업계에 공지된 또 다른 유도성 프로모터 시스템은 에스트로겐 수용체 조건 유전자 발현 시스템이다. Tet 시스템과 비교하여, 에스트로겐 수용체 시스템은 엄격하게는 제어되지 않으며; 그러나, Tet 시스템은 표적 유전자의 전사 및 후속 번역에 의존적이기 때문에, Tet 시스템은 에스트로겐 수용체 시스템만큼 빠르게 작용하지 않는다.
본 발명의 방법은 동일한 항원-제시 세포에서 IL-10 및 IL-10R1 펩티드의 공동-발현을 유도한다. 이를 달성하기 위해, 당업자는 2개 또는 그 초과의 플라스미드의 공동-형질감염, 다중 또는 양방향 프로모터의 사용, 또는 바람직하게는, 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 벡터의 생성을 포함하는 많은 기술을 이용할 수 있다. 발현되는 각 유전자에 대해 독특한 mRNA 전사체를 생성하는 프로모터와 달리, 멀티시스트로닉 벡터는 동일한 mRNA로부터 두 개 이상의 별도의 펩티드 - 이 경우, IL-10 및 IL-10R1 펩티드-를 동시에 발현한다. 진핵생물에서의 번역은 일반적으로 5' 캡에서 시작되므로, 각 mRNA에 대해 단일의 번역 사건만 발생한다. 그러나, 일부 바이시스트로닉 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)로 불리는 요소를 이용하여 mRNA의 내부 영역으로부터의 번역의 개시를 허용한다.
대안적으로, "자가-절단" 2A 펩티드는 멀티시스트로닉 벡터에서 IRES 요소 대신에 이용될 수 있다. 자가-절단 펩티드는 짧으며(약 20개 아미노산), 동일한 단일 mRNA로부터 등몰 수준의 다중 유전자를 생성한다. "절단"은 2개의 상이한 펩티드의 코딩 영역 사이에 위치한 자가-절단 펩티드의 C-말단에서 발견된 글리신과 프롤린 잔기 사이에 발생한다. 공통적인 2A 자가-절단 펩티드는 펩티드 T2A, P2A, E2A 및 F2A를 포함한다.
임의적으로, 본 발명의 벡터는 또한, 항생제 내성을 코딩하는 것과 같은 선택 마커 유전자를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 마커 유전자는 비제한적으로, 인간 신경 성장 인자 수용체(미국 특허 번호 6,365,373에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체(MAb)로 검출됨); 절두된 인간 성장 인자 수용체(MAb로 검출됨); 돌연변이 인간 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR; 형광 MTX 기질 이용가능); 분비된 알칼리 포스파타제(SEAP; 형광 기질 이용가능); 인간 티미딜레이트 신타아제(TS; 항암제 플루오로데옥시우리딘에 대한 내성 부여); 인간 글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파(GSTA1; 글루타티온을 줄기 세포 선택적 알킬레이터 부술판에 컨쥬게이션시킴; CD34+ 세포에서 화학보호성 선택 마커); 조혈모 줄기 세포에서 CD24 세포 표면 항원; N-포스폰아세틸-L-아스파르테이트(PALA)에 대한 내성을 부여하기 위한 인간 CAD 유전자; 인간 다중-약물 내성-1(MDR-1; 증가된 약물 내성에 의해 선택가능하거나 FACS에 의해 풍부화된 P-당단백질 표면 단백질); 인간 CD25(IL-2α; MAb-FITC에 의해 검출가능); 메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT; 카르무스틴에 의해 선택가능); 및 시티딘 데아미나제(CD; Ara-C에 의해 선택가능)를 포함한다. 약물 선택 마커 예컨대, 푸로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘, G418, 테트라사이클린이 또한 사용될 수 있다. 또한, FAC 분류법을 이용하여, 화학발광 마커(예를 들어, 할로태그(Halotag)) 등과 같은 임의의 형광 마커 유전자가 양성 선별에 사용될 수 있다.
척수강내 또는 관절내 주사를 통해 대상체에 직접적으로 IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 전달하는 것이 고려되는 경우, IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 바람직하게는, 상기 기술된 바와 같이 바이러스-기반이다. 그러나, 형질전환된 또는 형질도입된 항원-제시 세포가 하기 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 대상체에 투여되는 구체예에서, 선택된 항원-제시 세포는 IL-10 및 IL-10R1 펩티드를 발현하는 인간 인공 염색체를 생성하도록 조작될 수 있음이 또한 고려된다. 완전히-기능적인 인간 인공 염색체는 바이러스-기반 절단 시스템에 비해, 증가된 페이로드(payload) 크기, 염색체외 유지가 숙주-세포 파괴를 피하고, 도입된 유전자의 전사 침묵 및 가능한 면역학적 합병증이 회피된다는 점을 포함하는 몇 가지 이점을 제공한다. 현재, "하향식(top dowm)" 방법, "상향식(bottom up)" 방법, 미니염색체 생성, 및 유도된 데노보 염색체 생성을 포함하는, 여러 개의 인간 인공 염색체 조작 방법이 존재한다. 인공 염색체 형성의 "상향식" 접근법은 텔로머 및 게놈 DNA의 존재 또는 부재하에, 전형적인 숙주 세포-적합한 동원체 및 선택 마커 유전자(들)를 포함하는 클로닝된 α-위성 서열로의 허용 세포주의 형질감염 후 세포-매개된 데노보 염색체 형성에 의존적이다. (이들 방법의 프로토콜 및 상세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Henning, et al., PNAS USA, 96:592-97 (1999)]; [Grimes, et al., EMBO Rep. 2:910-14 (2001)]; [Mejia, et al., Genomics, 79:297-304 (2002)]; 및 [Grimes, et al., Mol. Ther., 5:798-805 (2002)] 참조.) 인공 염색체를 생성하는 "하향식" 접근법은 동원체, 텔로머, 및 DNA 복제 기점을 포함하는 축소된(pared down) 인공 염색체를 발생시키기 위해 이미 존재하는 염색체 암의 무작위 및/또는 표적화된 절두의 연속 라운드를 포함한다. (이러한 방법에 대한 프로토콜 및 자세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Choo, Trends Mol. Med., 7:235-37 (2001)]; [Barnett, et al., Nuc. Ac. Res., 21:27-36 (1993)]; 및 [Katoh, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 321:280-90 (2004)]참조). "하향식" 인공 염색체는 자연-발생 발현 유전자가 없도록 최적으로 작제되며, 예를 들어, 부위-특이적 DNA 인테그라제에 의해 매개되는 절두 염색체 상으로의 표적 DNA 서열의 부위-특이적 인테그레이션을 허용하는 DNA 서열을 함유하도록 조작된다.
당업계에 공지된 인공 염색체를 생성하는 세 번째 방법은 자연 발생 미니염색체의 조작이다. 이러한 생성 방법은 전형적으로, 기능적인 예를 들어, 동원체 기능을 갖고 있으나 α-위성 DNA 서열이 결여되고 비-필수 DNA를 포함하지 않도록 조작된 인간 신생-동원체를 함유하는 염색체의 조사-유도된 단편화를 포함한다. (이러한 방법의 프로토콜 및 상세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Auriche, et al., EMBO Rep. 2:102-07 (2001)]; [Moralli, et al., Cytogenet. Cell Genet, 94:113-20 (2001)]; 및 [Carine, et al., Somat. Cell Mol. Genet., 15:445-460 (1989)] 참조). 인공 염색체를 생성하는 다른 방법과 마찬가지로, 조작된 미니-염색체는 IL-10 및 IL-10R1 서열과 같은 표적 DNA 서열의 부위-특이적 인테그레이션을 허용하는 DNA 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 인공 염색체 생성을 위한 네 번째 접근법은 특정 염색체 분절의 표적 증폭에 의해 유도된 데노보 염색체 생성을 포함한다. 이러한 접근법은 끝곁매듭 염색체에 위치한 함동원체(peri-centromeric)/리보좀 DNA 영역의 대규모 증폭을 포함한다. 증폭은 예를 들어, IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열의 부위-특이적 인테그레이션을 허용하는 DNA 서열 및 또한, 염색체의 함동원체 영역으로 인테그레이션되는 약물 선택 마커와 함께, 리보솜 RNA와 같은 염색체의 함동원체 영역에 특이적인 과량의 DNA를 공동-형질감염시킴으로써 촉발된다. (이러한 방법에 대한 프로토콜 및 자세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Csonka, et al., J. Cell Sci 113:3207-16 (2002)]; [Hadlaczky, et al., Curr. Opini. Mol. Ther., 3:125-32 (2001)]; 및 [Lindenbaum and Perkins, et al., Nuc. Ac. Res., 32(21):el72 (2004)] 참조). 이러한 공정 동안, 공동-형질감염된 DNA를 갖는 말단부동원체 염색체의 함동원체 영역에 대한 표적화는 대규모 염색체 DNA 증폭, 동원체 서열의 중복/활성화, 및 쌍동원체 염색체의 후속 파괴 및 분해를 유도하여, 다중 부위-특이적 인테그레이션 부위를 함유하는 "분리" 위성 DNA-기반 인공 염색체를 발생시킨다.
전달
IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 생체내 또는 시험관내(또한, 생체외로도 불림)에서 대상체 내로 도입될 수 있다. 생체내 도입은 대상체로 IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 직접적으로 투여하는 것을 포함하며, 시험관내 도입은 IL-10 및 IL-10R1을 공동-발현하도록 조작된 항원-제시 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
관절 염증을 치료하기 위한 바람직한 전달 방법은 관절 주사(관절내 주사)이며, 여기에서 피하주사 바늘이 이환 관절 내로 주사되어 본 발명의 치료적 항-염증 조성물의 용량을 전달한다. 만성 또는 신경병성 통증, MS, 신경 염증, 또는 자가면역 질환의 치료에서, 척수강내 투여가 바람직하다. 척수강내 주사는 치료적 항-염증 조성물을 척수관 또는 거미막밑 공간으로 주사하여 뇌척수액에 도달하게 하는 것을 포함한다.
대안적으로, 시험관내에서 형질도입되는 경우, 바람직하게는, 요망되는 항원-제시 수령체 세포를 대상체로부터 분리하고, IL-10/IL-10R1 발현 벡터로 형질전환 또는 형질도입시키고, 대상체에 재도입시킨다 (즉, 항원-제시 세포는 자가이다). 그러나, 대안적으로, 동계 또는 이종 항원-제시 세포(예컨대, IL-10/IL-10R1 발현 벡터로 안정하게 형질전환된 확립된 항원-제시 세포주로부터)가 대상체에서 전달을 위해 형질전환 또는 형질도입될 수 있다. 형질전환되거나 형질도입될 수 있는 항원-제시 세포 또는 이의 전구체는 단핵모세포, 단핵구, 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 포말 세포, 림프모세포, 및 B 림프구를 포함하는 단핵구 패밀리로부터의 임의의 세포를 포함한다. 전구체 항원-제시 세포는 미분화 상태에서 형질도입되고 배양되며, 그 후, 대상체로의 전달 전에 시험관내에서 분화될 수 있다.
IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 조작될 항원-제시 세포로 전달될 수 있다. 용어 형질감염 및 형질전환은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는지의 여부와 무관하게 숙주 세포에 의한 외인성 핵산 예를 들어, 발현 벡터의 흡수를 나타낸다. 많은 형질감염 방법 예를 들어, 아그로박테리움-매개된 형질전환, 프로토플라스트 형질전환(폴리에틸렌 글리콜(PEG)-매개된 형질전환, 전기천공, 프로토플라스트 융합, 및 마이크로셀 융합 포함), 지질-매개된 전달, 리포솜, 전기천공, 초음파천공, 미세주입, 유전자 총(particle bombardment) 및 탄화규소 위스커-매개된 형질전환 및 이들의 조합; 칼슘 포스페이트를 사용한 직접 흡수; 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-매개된 DNA 흡수; 리포펙션; 마이크로셀 융합; 지질-매개된 담체 시스템; 또는 기타 적합한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 성공적인 형질감염은 일반적으로, 형질감염된 세포 내에서 IL-10/IL-10R1 유전자 전사체 또는 IL-10/IL-10R1 펩티드의 존재를 검출함으로써 인식된다.
바이러스 벡터가 본 발명의 바람직한 구체예이기 때문에, 항원-제시 세포는 바람직하게는, 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입된다. 바이러스 감염의 사용은 바이러스 유전자 물질을 세포 내로 도입하는 바이러스 자연 발생 수단을 이용하여 관심 핵산 분자를 세포 내로 전달한다는 점에서 독특하다. 상기 논의된 바와 같이, 변형되고 이러한 기술에 적용된 바이러스의 예는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 레트로바이러스를 포함한다. 일반적으로, 관심 핵산 분자는 바이러스 게놈 내로 클로닝될 수 있다. 바이러스 게놈의 복제 및 패키징시, 생성된 바이러스 입자는 바이러스 진입 기작을 통해 관심 핵산을 세포 내로 전달할 수 있다. 일반적으로, 바이러스 게놈은 관심 핵산의 첨가 전에 핵산 조작에 의해 먼저 복제 결핍된다. 생성된 바이러스 게놈, 또는 바이러스 벡터는 세포로부터 바이러스 입자 어셈블리 및 방출을 완료하기 위해 헬퍼 바이러스 또는 패키징 시스템의 사용을 필요로 한다.
IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 예를 들어, 척수강내 또는 관절내 주사를 통해 직접적으로 대상체에 투여하고자 하는 경우, 발현 벡터는 임의적으로 전달을 위해 캡슐화될 수 있다. IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 캡슐화하기 위한 기술은 사용된 미세입자의 유형에 따라 달라지며, 이러한 기술은 예를 들어, 샤베즈(Chavez) 등의 USSN. 14/905,915에 기재되어 있다. 미세입자는 임의의 생분해성 폴리머로 이루어질 수 있다. 본 발명의 제어된 약물 전달 제형에서 생분해성 폴리머로서 성공적으로 사용되기 위해, 물질은 화학적으로 불활성이며, 침출가능한 불순물을 함유하지 않아야 한다. 이상적으로, 폴리머는 또한, 바람직하지 않은 노화를 최소화하면서 적절한 물리적 구조를 가지며, 용이하게 가공가능하다. 일부 물질은 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리(아크릴산), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 및 폴리(메타크릴산)을 포함한다. 본 발명에서 특히 사용되는 생분해성 폴리머는 폴리락티드(PLA), 폴리글리콜리드(PGA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 폴리-3-하이드록시부티레이트 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 이러한 생분해성 폴리머는 광범위하게 특성 규명되었으며, 당업계에 공지된 바와 같이 원하는 분해 특성을 나타내도록 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Edlund & Albertsson, Degradable Aliphatic Polesters, pp.67-112 (2002), Barman, et al. J.of of Controlled Release, 69:337-344 (2000)]; [Cohen, et al., Pharmaceutical Res., (8):713-720 (1991)] 참조).
본 발명의 한 특정 구체예에서, 폴리머는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA)를 포함한다. PLGA는 이의 생분해성 및 생체적합성으로 인해 FDA 승인된 치료 기기의 호스트에 사용되는 코폴리머이다. 중합에 사용되는 락티드 대 글리콜리드의 비율에 따라, 다양한 형태의 PLGA가 수득될 수 있다: 이는 사용된 모노머 비율과 관련하여 일반적으로 식별된다(예를 들어, PLGA 75:25는 조성이 75%(몰 퍼센트) 락트산 및 25%(몰 퍼센트) 글리콜산인 코폴리머로 식별된다). PLGA는 물의 존재하에 이의 에스테르 결합의 가수분해에 의해 분해된다. PLGA 분해에 필요한 시간은 생산에 사용된 모노머 비율과 관련이 있음이 입증되었다: 글리콜리드 단위체의 함량이 높을수록, 분해에 필요한 시간은 더 짧다. 이 규칙의 예외는 더 빠른 분해를 나타내는 (약 2개월) 50:50 모노머 비율을 갖는 코폴리머이다. 또한, (자유 카르복실산과 반대되는) 에스테르로 말단 캡핑된 폴리머는 더 긴 분해 반감기를 나타낸다. 대안적으로, IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 상이한 방출 프로파일을 갖는 미세입자의 배치(batch)에서 캡슐화될 수 있으며; 예를 들어, 전달될 발현 벡터의 10%는 예를 들어, 1일 내지 4주 방출 프로파일을 갖는 미세입자에서 캡슐화될 수 있으며; 전달될 발현 벡터의 30%는 예를 들어, 3주 내지 6주 방출 프로파일을 갖는 미세입자에서 캡슐화될 수 있으며; 전달될 발현 벡터의 30%는 예를 들어, 6주 내지 10주 방출 프로파일을 갖는 미세입자에서 캡슐화될 수 있으며; 전달될 발현 벡터의 30%는 예를 들어, 8주 내지 12주 방출 프로파일을 갖는 미세입자에서 캡슐화될 수 있다. 이러한 구체예에서, 단일 유형의 생분해성 폴리머가 사용될 수 있으나, 상이한 방출 프로파일을 갖는 제형에 사용될 수 있으며; 대안적으로, 상이한 방출 특징을 갖는 상이한 생분해성 폴리머가 사용될 수 있다.
미세입자가 일단 수득되면, 이들을 허용가능한 희석제에 현탁하여 동물로의 투여를 위한 치료 조성물을 형성시킨다. 이러한 희석제(또는 부형제)는 그 자체는 조성물을 수여 받은 개체에 해로운 항체 생성을 유도하지 않으며, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 약학적으로 허용되는 희석제는 소르비톨, 명반, 덱스트란, 설페이트, 대형 폴리머 음이온, 임의의 다양한 TWEEN 화합물, 및 지질 예컨대, 물, 염수, 글리세롤 또는 에탄올, 오일 및 물 에멀젼, 또는 프로인트 애쥬번트와 같은 애쥬번트를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물은 대상체에서 면역 반응 또는 용량 내성을 현저하게 유도하지 않기 때문에, 치료 효과를 위해 필요에 따라 사용될 수 있고/거나 투여될 수 있다. 즉, 치료적 항-염증 조성물은 단기 요법에 대한 치료 효과를 위해 필요에 따라 대략 30-90일마다 (또는 예를 들어, 벡터 유형(박테리아, 바이러스(통합형 또는 비통합형), 인공 염색체) 및 생분해성 폴리머의 분해 프로파일에 따라 요구되는 바와 같이) 전달될 수 있다. 예를 들어, 장기 치료법이 요망되는 경우, 치료 조성물은 1년 넘게 동안; 및 필요한 경우, 대상체의 수명 동안 치료 효과를 위해 필요에 따라 대략 90일마다 전달될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 치료적 항-염증 조성물의 투여량 범위는 대상체의 종, 연령, 및 일반적인 상태, 치료되는 질환의 중증도 및 전달될 특정 IL-10/IL-10R1 발현 벡터, 투여 모드, 기타 등등에 따라 대상체마다 다르다. 예를 들어, 투여량 범위는 요망되는 기간 및 해부학적 주사 위치에 따라 kg 당 10-1000 μg 벡터 DNA, kg 당 20-500 μg 벡터 DNA, kg 당 25-250 μg 벡터 DNA, 또는 kg 당 50-100 μg 벡터 DNA의 치료학적 유효량을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 IL-10/IL-10R1 발현 벡터 또는 IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 함유하는 미세입자는 비제한적으로, 글루코코르티코이드; 메토트렉세이트; 하이드록시클롤퀸; 설파살라진; 레프노미드; 항-TNF 제제 예컨대, 에타너셉트(etanercept), 인플릭시맙 및 아달리무맙; 아바타셉트; 비스테로이드 항-염증 약물(NSAID); 글라티라머 아세테이트 및 인터페론 B, 미톡산트론(Mitoxantrone) 및 나탈리주맙(Natalizumab)을 포함하는 염증 치료에 유용한 다른 치료제와의 "칵테일"로 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 사용된 IL-10/IL-10R1 발현 벡터는 IL-10/IL-10R1 발현 벡터를 발현하도록 생체공학 조작된 줄기 세포와 같은 세포와 공동-투여될 수 있다. 일반적으로, 임상 및 표현형 지표 둘 모두를 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방법이 인간 치료의 성공을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
치료할 질환
본 발명의 조성물 및 치료적 항-염증 조성물은 IL-10의 하향-조절을 극복하여 염증의 강력한 IL-10-매개된 억제를 달성하기 때문에, 이들은 다수의 질병 및 질환을 치료하는데 효과적이다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물은 다발성 경화증(MS)에 의해 유발된 증상 및 손상을 치료하는데 사용될 수 있다. MS는 만성적이고 종종 쇠약하게 되는 중추 신경계의 자가면역 질환이다. 전 세계적으로 약 250만 내지 300만명, 및 미국에서는 ~400K명이 이 질환으로 고통받고 있으며, 주 당 200명이 진단되고 있다. 발병시, 환자의 ~85%는 재발 완화형 질환(RRMS)을 나타내며, 10%는 일차 진행성 질환(PPMS)을 나타내며, 5%는 진행성 재발 질환(PRMS)을 나타낸다. 일반적으로, 완전한 신경학적 회복은 RRMS의 일차 사건 이후에 발생하나, 10년 기간에 걸쳐 이들 환자 중 ~50%는 후속 재발시 지속적인 신경학적 결함을 점점 축적시키고, 점점 무력화되는 질환의 이차 진행성 단계로 전환될 것이다. MS의 임상 증상은 환자마다 매우 가변적이다. 증상 목록으로는 인지, 기능 손상, 시력 상실, 쇠약, 경직, 협응 결핍, 불균형, 피로, 성기능 장애, 배변 기능 장애, 방광 기능 장애, 감각 이상 및 통증을 포함한다. 이들의 질환 과정에서 환자의 65% 만큼 많은 환자가 임상적으로 유의한 통증을 겪으며, 인지되고 빈번히 부적절하게 처리되는 증상들을 겪지만 이러한 통증은 가장 장애가 되는 것 중 하나를 나타낸다. 통증은 대개 신경병성이며, 사실상 관련된 손상 뉴런에 따라 달라질 수 있다. 또한, 통증은 현재의 치료법으로 잘 치료가 되지 않는 현저한 MS 증상임을 주지해야 한다.
MS 이외에, 미엘린의 손실에 의해 매개된 다른 질환이 본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물을 사용하여 치료될 수 있다. 이러한 질환은 신경 염증(즉, 삼중염색체 21에 의해 초래된 신경 염증), 허혈성 탈수초 질환, 염증 탈수초 질환, 소아 백질이영양증, 뮤코다당질축적증, 주산기 배아기 기질 출혈, 뇌성 마비, 뇌실주위 백질연화증, 방사선-유발성 질환, 및 다양한 병인으로 인한 겉질밑 백질뇌병증뿐만 아니라, 정신 분열과 같은 정신 질환을 포함한다. 허혈성 탈수초 질환은 겉질 뇌졸중(cortical stroke), 열공성 뇌경색, 저산소후 백질뇌병증, 당뇨성 백질뇌병증, 및 고혈압성 백질뇌병증을 포함한다. 염증 탈수초 질환은 다발성 경화증, 쉴더 병(Schilder 's Disease), 횡단성 척수염, 시신경염, 예방접종 후 뇌척수염 및 감염 후 뇌척수염을 포함한다. 소아 백질이영양증 질환은 리소좀 축적병(예를 들어, 테이-삭스병(Tay-Sachs Disease)), 카나반 병(Canavan's Disease), 펠리자우스-메르츠바허 병(Pelizaeus-Merzbacher Disease), 크랩 글로보이드 바디 백질이영향증(Crabbe's Globoid body leukodystrophy)을 포함한다. 뮤코다당질축적증의 예로는 슬리 병(Sly's Disease)이 있다. 방사선-유발성 질환은 방사선-유발성 백질뇌병 및 방사선-유발성 척수염을 포함한다. 겉질밑 백질뇌병을 초래하는 병인은 HIV/AIDS, 두부 외상, 및 다발-경색 상태를 포함한다.
추가로, 본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물은 또한, 무릎, 팔꿈치, 손목, 발목, 둔부, 어깨 또는 척추에서 관절 염증을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 방법 및 치료적 항-염증 조성물에 의해 치료 가능한 질환은 류마티스 관절염 및 골관절염뿐만 아니라, 건염, 활액낭염, 인대 염증, 활막염, 통풍 및 전신성 홍반성 루프스를 포함한다.
본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물의 또 다른 추가의 용도는 자가면역 질환의 치료이다. 자가면역 질환은 숙주 면역계에 의한 숙주 조직의 특정 표적에 대한 공격으로, 기능 및 병리학적 증상의 중대한 상실을 초래한다. 이러한 현상의 고전적인 예는 중증 근무력증 환자에서 신경근 접합부에 존재하는 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 항체의 존재이다. 이 수용체는 운동 뉴런으로부터 근육으로 신호를 전달하는데 매우 중요하기 때문에, 이러한 항체는 부분 마비 및 기타 신경근 결함을 초래한다. 이러한 자가-항체가 왜 발생하는지는 확실하지 않지만, 임의의 효능을 갖는 유일한 치료법은 혈장제거요법이다; 즉, 병리학적 항체의 순환 농도를 감소시키기 위한 혈액의 혈장 분획을 대체하는 것이다. 많은 경우에, 특정 질환 병상을 설명하는 우세한 항체가 확인되었으나, 이러한 질환을 치료하는데 있어서 실질적인 진전은 없었다. 이는 부분적으로, 연구가가 내성 실패로서 자가면역 질환을 생각하기 보다는 병원성 항체 및 이들의 효과에 지속적으로 집중하는 이유일 수 있다.
면역 내성은 항원에 대한 항체에 있어서 이미 혈청반응 양성인 동물에서 그 항원의 투여에 대한 감소된 반응으로서 정의된다. 적응 면역계는 동물을 증가하는 용량의 항원에 노출시킴으로써 주어진 항원을 무시하도록 배울 수 있다. 이를 탈감작화라고 부르며, 이는 다양한 종류의 알레르기, 예를 들어, 땅콩 알레르기를 치료하기 위해 주로 인간에서 이용된다. 그러나, 이는 느리고, 불확실한 과정이며 종종 비효과적이다. 면역계가 특정 항원에 반응하는 방법은 반응성, 세포독성 B- & T-림프구 및 더욱 최근에 발견된 조절 B- & T-세포 간의 균형에 의해 부분적으로 추진된다. IL-10으로의 이들 세포의 자극은 세포독성으로부터 내성 표현형으로의 전환을 유도한다. 실제로, 이러한 전환은 조절 B- 및 T-세포로 불리는 이들 동일한 세포로부터의 IL-10의 분비를 유도한다. 따라서, 외인성 IL-10으로의 T- 및 B-세포의 노출은 항원에 대한 내성을 유도하는 것으로 예측된다. 그러나, 실제로, 이러한 전이를 달성하기 위한 정확한 농도의 외인성 IL-10의 농도를 얻는 것이 어렵다. 이들 세포에서 조합된 IL-10 및 IL-10R1 발현은 IL-10 농도에 다소 독립적인 표현형 전환을 유도하는 것으로 예측된다.
본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물로 치료되거나 개선될 수 있는 자가면역 질환은 비제한적으로, 심근염, 루푸스 신장염 및 다른 루프스 장애, 간질성 방광염, 자가면역 간염, 원형 탈모증, 후천성 표피 수포증, 애디슨병, 1형 당뇨병, 그레이브스병, 셀리악병, 크론병, 궤양성 대장염, 재생불량성 빈혈 및 기타 빈혈, 강직성 척추염, 펠티 증후군, 건선 관절염, 전신성 루프스, 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome), 섬유 근육통, 중증 근무력증, 길랭-바레 증후군, 램버튼-이튼 근무력증 증후군, 자가면역 망막병증, 코간 증후군, 그레이브스 안구병증, 공막염, 메니에르 병, 척-스트라우스 증후군, 가와사키 병, 류마티스 혈관염 및 결절성 다발동맥염을 포함한다. 또한, 만성 피로 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 호산구성 식도염, 위염, POEMS 증후군, 레이노 증후군, 원발성 면역결핍증, 및 괴저성 농피증과 같은 자가면역 질환에 공통적인 병태는 본 발명의 방법 및 치료적 항-염증 조성물로 치료될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 신규한 특징은 하기 실시예를 검토함으로써 당업자에게 자명해질 것이며, 이들 실시예는 제한하고자 하는 것은 아니다. 실시예에서, 실시를 위해 구조적으로 축소된 절차는 현재 시제로 기술되어 있으며, 실험실에서 수행된 절차는 과거 시제로 제시되었다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 이들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하거나, 하기 실험이 수행된 실험 전부이거나 유일하게 수행된 실험임을 나타내거나 내포하고자 하지 않는다. 광범위하게 기술된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 특정 구체예에서 보여준 바와 같이 많은 변형 및/또는 변경이 본 발명에 대해 이루어질 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 따라서, 본 구체예는 모든 면에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도, 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부는 중량 부, 분자량은 중량 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
실시예
1 - 발현 벡터
XT-250은, 단순히 rIL-10이 인간 IL-10(hIL-10)보다 상당히 우수하게 래트 IL-10R1 수용체와 결합하기 때문에 이들 연구에 사용되는 래트 IL-10 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드이다. XT-250은 이의 hIL-10 대응물-XT-150과 마찬가지로 D-만노오스 중의 DNA 용액이다. 종에 관계없이, 사용된 모든 IL-10 cDNA는 통증 모델에서 유의하게 더 긴 효능 기간을 나타내는 것으로 밝혀진 아미노산 변화 F129S를 생성하는 점 돌연변이를 함유한다(Milligan et al., Pain, 126(1-3):294-308 (2006)). 플라스미드 백본은 카나마이신 내성 유전자, CMV 프로모터, β-글로빈 인트론, 성장 호르몬 폴리A 및 2개의 AAV2 ITR을 함유한다. 이 플라스미드는 또한 AAV9 벡터를 만드는데 사용되었다.
LV02는 hIL-10R1 코딩 서열, 이어서 2a, 자가-절단 펩티드 및 hIL-10 코딩 서열로 구성되는 CMV 프로모터의 다운스트림에 cDNA를 갖는 상기 조절 요소를 함유하는 발현 플라스미드이다. HT-1080 세포의 시험 형질감염은 IL-10R1의 표면 발현 및 IL-10의 배지(2.1 ng/mL)로의 분비를 나타냈다.
실시예
2 - 지지 데이터
IL-10은 종-특이성 측면에서 몇몇 특이질(idiosyncrasy)을 나타냄을 주지해야 한다. 예를 들어, 인간 IL-10이 마우스 IL-10 수용체에 결합하고 래트 IL-10 수용체와 약하게 결합하지만, 마우스 IL-10은 인간 IL-10 수용체와 상호작용하지 않는다. 이러한 이유로, 래트 IL-10(rIL-10)은 일반적으로 래트 실험에 사용되었으며, 인간 IL-10(hIL-10)은 마우스, 개 및 말 연구에 사용되었다. hIL-10이 고농도에서만 래트 IL-10 수용체를 활성화시킨다는 점은 매우 유용한 특징인데, 왜냐하면 표적 래트 조직에서 인간 IL-10R1의 공동-발현은 인간 IL-10에 대한 완전 반응을 발생시키기 때문이다. 전달을 단순화하기 위해, rIL-10, hIL-10, 또는 hIL-10R1을 인코딩하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 작제하였다. 혈청형 9를 선택하였는데, 왜냐하면 AAV9는 척수강내 주사되는 경우 매우 잘 분포되고, 그 자체가 IL-10R1을 발현하는 별아교세포와 같은 항원-제시 세포를 포함하는 광범위한 세포를 형질도입시키기 때문이다. 도 1에 도시된 바와 같이, AAV9-hIL-10은 신경병성 통증의 래트 만성 수축 상해 (CCI) 모델에서 항-이질통이나, 그 효과는 사라진다. 그러나, AAV9-hIL-10과 AAV9-L10R1의 1:1 혼합물은 이 모델에서 이질통의 안정적인 제거를 지시하며(도 2), 조합된 IL-10과 IL-10R1 발현이 더 높은 척수강내 투여를 허용하여 척수 및 백색질관 전반에 걸쳐 염증을 광범위하게 억제한다는 가설과 일치한다. 백색 원 = AAV9-L-10R1; 흑색 원 = AAV9-L-10 + XR-101; 흑색 사각형 = AAV9-hIL-10Ra + AAV9-L-10.
2개의 cDNA의 투여를 단순화시키기 위해, EFIα 프로모터가 hIL-10R1 및 hIL-10의 발현을 지시하는 바이시스트로닉 벡터를 작제하였다. 일차 번역 생성물은 2a 자가-절단 펩티드를 함유한다. 이러한 플라스미드가 HT-180 세포내로 일시적으로 형질감염되었을 때, hIL-10은 대략 2 ng/mL로 ELISA (R&D System)에 의해 배지에서 용이하게 검출되었다. 또한, 표면 IL-10R1은 형질감염된 세포에서 면역형광에 의해 검출되었으나, 대조군 세포에서는 검출되지 않았다.
재발-완화 EAE 래트에서 IL-10의 플라스미드-기반 유전자 전달은 효과적인 것으로 밝혀졌다(Sloane et al., Brain, Behavior and Immunity, 23(1):92-100 (2009)). 이 연구에서, PLGA 미세입자에 캡슐화된 플라스미드를 꼬리 마비가 이미 발생했을 때 한 번에 척수강내 주사하였다(도 3). 놀랍게도, IL-10은 꼬리 마비를 역전시켰으며, MS-유사 병상을 제거하였다. 운동 스코어 : 0 = 정상; 1 = 꼬리 끝 마비; 2 = 완전한 꼬리 마비; 3 = 약한 뒷다리; 4 = 뒷다리 마비; 5 = 완전한 뒷다리 마비; 6 - 부분적인 앞다리 마비. 군당 N = 6.
실시예
3 - 운동 장애를 평가하기 위한 IL-10/IL-
10R1
발현 벡터로의 처리
경미한 재발-완화 MS-유사 병상을 유도하기 위해 MOG로 처리된 래트에 꼬리 마비와 같은 증상이 보일 때 이 모델에서 이미 효과적인 것으로 입증된(Sloane et al. 2009) 용량의 IL-10 플라스미드를 한 번에 척수강내 주사한다. IL-10 플라스미드 이외에, 별도의 래트 집단에 IL-10 cDNA가 LV02로 명명된 IL-10/IL-10R1 카세트로 대체된 거의 동일한 플라스미드를 동일한 양으로 투여한다. 이러한 30-일 실험의 목표는 LV02가 더 높은 용량의 XT-250(단지 IL-10 발현)보다 우수하게 작용하는지의 여부를 확립하는 것이다. 낮은 플라스미드 용량(3 μg)에서, 두 제형간의 차이는 거의 없을 것으로 예상된다. 그러나, XT-250 효능 손실이 관찰되는 높은 용량 (~100 μg)에서 LV02의 계속된 효능이 예상된다.
성체 수컷 다크 아고티(Dark Agouti) 래트(250-300 g; Envigo)는 불완전한 프로인트 애쥬번트(1:1 비율)에서 에멀젼화된 0.01 M Na-아세테이트(pH 3.0) 중의 35 μg MOG의 피내 주사를 통해 EAE를 유도하는데 사용될 수 있다. 주사 후 대략 1주째에, 래트는 꼬리 마비(운동 스코어 = 1)로 시작하여 궁극적으로는 안락사되는 스코어 7에 이르는 진행성 운동 장애 (및 이질통)를 나타낸다. 그러나, 중간 기간에 동물들은 재발전에 자연적으로 호전된다. 래트(군 당 N=5)가 꼬리 마비를 나타낼 때 래트에 대략 40μL의 용적의 XT-250 또는 LV02를 척수강내(요추 4/5를 통해; L4/5)로 주사한다. 5마리 래트 군에 PBS(대조군) DNA(1, 3, 7, 10, 30 또는 100 μg) XT-250 또는 LV02를 주사한다. 동물을 다음 30일에 걸쳐 운동 장애에 대해 스코어링한다.
실시예
4 -
척추위
병변의 감소를 평가하기 위한 IL-10/IL-
10R1
발현 벡터로의 처리
운동 결핍에 관한 효능은 유지되나, 척추위 병변은 현저하게 감소되고(H&E), 탈수초가 감소되는(Luxol Fast Blue) LV02 용량을 달성하는 용량-범위 실험이 수행된다. LV02, XT-250 또는 PBS를 실시예 3에서 수행된 실험에서 효과가 있는 것으로 밝혀진 가장 높은 용량으로 EAE 래트(군당 N = 5)에 척수강내 주사한다. 이 실험의 생전 페이스(in-life phase)는 동물이 일반적으로 <2 주에 0(정상) 스코어로 돌아올 경우 끝난다. CSF의 샘플은 순수 동물, 동일 동물로부터 LV02 투여 시점, 및 동일 동물로부터 관류/고정 직전에 취한다. 동물을 PBS 이어서 PBS/4% 파라포름알데하이드로 관류시킨다. 척수 및 뇌는 절편화 전에 동결보호제(PBS 중 30% 수크로스)로 옮긴다. 척수(종단형) 및 뇌(관형)의 절편(40 미크론)은 병변 및 림프구 침윤을 확인하기 위해 헤마톡실렌-에오신(H&E)으로 염색한다. 인접 절편은 탈수초 구역을 확인하기 위해 룩솔 블루(Luxol Blue)로 염색한다. 또한, 절편은 인간 IL-10R1(Millipore # 06-1067), Ibal(미세아교세포), GFAP(별아교세포), 및 NeuN(뉴런)으로 염색한다. MHC-II 항체로의 공동-염색은 항원-제시 세포의 활성화를 확인시켜준다. 척수(요추, 흉부, 경추)의 각 수준에서, 장단형 절편에서 H&E에 의해 확인된 병변을 계수한다. 유사하게는, 뇌간, 소뇌, 후두 피질 및 전두 피질로부터의 절편은 H&E에 의해 병변의 존재에 대해 스코어링한다. PBS 대조군과 비교하여 병변에서의 유의한(언페어드 t-테스트) 감소가 척수의 XT-250 및 LV02 둘 모두에서 예상된다. LV02가 뇌간 및 피질백색질관에서 XT-250보다 우수하게 작용하는 경우, 절편 당 병변에서 유의한 차이가 검출될 것이다.
실시예
5 - 생체분포를 평가하기 위한 IL-10/IL-
10R1
발현 벡터로의 처리
LV02의 다양한 용량에서 뇌 전반에 걸쳐 플라스미드 DNA의 생체분포를 평가한다. 이러한 실험은 시간에 걸쳐 백색질관 및 척수 전반에 걸쳐 플라스미드가 어떻게 분포하는지 이해하기 위해 설계된다. LV02의 가장 높은 가능한 용량(300 μg)을 순수 래트의 L4/5를 통해 척수강내로 주사한다(시점당 N=3). 조직은 주사 후 4h, 7 및 30일에 척수(요추, 흉부, 경추), 뇌간, 후두 피질 및 전두 피질로부터 분리한다. DNA를 이들 조직으로부터 추출하고 정량적 PCR을 실시한다. 이러한 실험은 LV02가 뇌를 통해 어떻게 분포되는지, 연장된 기간에 걸쳐 지속되는지의 여부를 밝혀낸다.
실시예
6 - 통계학적 분석
운동 결핍 스코어 및 면역-조직화학 분석 데이터의 모든 통계학적 비교를 통계학적 소프트웨어로 계산하였다. 운동 결핍 스코어는 비-파라미터 윌콕슨 순위 합 테스트를 통해 분석한다. 반복 측정 ANOVA 통계는 실험 전반에 걸쳐 평가된 시점에 걸친 군의 효과를 검사한다. 면역조직화학 마커는 2-테일드 t-테스트 통계에 의해 분석될 것이다.
실시예
7: 다운 증후군 모델 마우스에서 신경 염증의 검출
또 다른 예(도 4)에서, 정상 마우스 및 다운 증후군(dp 16)을 모방하도록 조작된 마우스의 뇌로의 마우스 IL-10F129S를 인코딩하는 발현 플라스미드의 주입은, 발명자들의 실험실 및 공개된 발견 둘 모두로부터의 다른 데이터의 지지하에, IL-10의 과-발현이 IL-10R1 mRNA의 발현을 극적으로 감소시켰음을 보여주었다(예를 들어, 문헌 [Ding, et al., J Immunol 167(12): 6884-6892 (2001)] 참조). 도 2는 IL-10의 신호전달 수용체(IL-10R1)에 대한 mRNA의 수준을 보여준다. 미주입 대조군과 비교하여, pDNA-IL10 처리는 야생형 및 다운 증후군 마우스 뇌 둘 모두에서 IL-10R1의 유전자 발현을 극적으로 억제하였다.
앞의 설명은 단지 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이다. 당업자는 본원에 명시적으로 기재되거나 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하며, 그 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 방식을 고안할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 여기에 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 발명자가 기술을 발전시키는데 기여한 개념을 이해하도록 돕기 위해 의도된 것이며, 이러한 특별히 언급된 예 및 조건부를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 양태 및 구체예뿐만 아니라 의의 특정 예를 기재한 모든 언급은 이의 구조적 및 기능적 균등물 모두를 포함하도록 의도된다. 또한, 이러한 균등물은 현재 알려진 균등물 및 미래에 개발되는 균등물, 즉 구조와 무관하게 동일한 기능을 수행하는 임의의 개발된 요소 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 예시적인 구체예에 한정되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다. 다음의 청구 범위에서, "수단"이라는 용어가 사용되지 않는 한, 여기에 언급된 특징 또는 요소는 
에 의한 수단-플러스-기능 제한으로서 해석되어서는 안된다.
Claims (21)
- 대상체의 항원-제시 세포에서 인터루킨 10(IL-10) 펩티드 및 인터루킨 10 타입 1 수용체(IL-10R1) 펩티드를 하나 이상의 박테리아, 바이러스, 파아지, 코스미드 또는 인공 염색체 벡터로부터 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 염증을 치료하기 위한 방법.
- 제1항에 있어서, 항원-제시 세포에서 발현된 IL-10 펩티드가 IL-10 펩티드의 힌지 영역에서 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, IL-10 펩티드가, IL-10 야생형 서열의 129번 위치의 페닐알라닌이 세린, 트레오닌, 알라닌 또는 시스테인으로 치환된 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 야생형 서열의 129번 위치에서 페닐알라닌이 세린으로 대체되는 방법.
- 제1항에 있어서, IL-10 및 IL-10R1이 단일 벡터로부터 발현되는 방법.
- 제5항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
- 제6항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스 벡터인 방법.
- 제6항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 방법.
- 제5항에 있어서, IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열이 단일 mRNA로서 전사되는 방법.
- 제9항에 있어서, 벡터가 IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위에 대한 코딩 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 벡터가 IL-10 및 IL-10R1 코딩 서열 사이에 자가-절단 2a 펩티드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 염증이 신경병성 또는 만성 통증에 의해 야기되고, 하나 이상의 벡터는 척수강내 주사에 의해 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 염증이 MS에 의해 야기되고, 하나 이상의 벡터는 척수강내 주사에 의해 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 염증이 자가면역 질환에 의해 야기되고, 하나 이상의 벡터는 척수강내 주사에 의해 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 염증이 관절에 위치하며, 하나 이상의 벡터는 관절내 주사에 의해 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 염증이 신경 염증인 방법
- 제1항에 있어서, 항원-제시 세포가 단핵모세포, 단핵구, 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 포말 세포, 림프모세포, 및 B 림프구의 군으로부터 선택되는 방법.
- 제17항에 있어서, 항원-제시 세포가 치료할 대상체로부터 분리되고, 시험관 내에서 하나 이상의 벡터로 형질도입되고, 다시 대상체에 투여되는 방법.
- 제17항에 있어서, 항원-제시 세포가 하나 이상의 벡터로 안정하게 형질전환되고, 배양물에서 유지되는 방법.
- 인터루킨 10(IL-10) 및 인터루킨 10 타입 1 수용체(IL-10R1)에 대한 코딩 영역을 포함하는 단일 바이러스 또는 박테리아 발현 벡터.
- 제20항에 있어서, 벡터가 IL-10 및 IL-10R1 펩티드의 전사를 추진하는 단일 프로모터를 포함하고, IL-10 펩티드의 코딩 영역과 IL-10R1 펩티드의 코딩 영역 사이에 위치하는 자가-절단 2a 펩티드를 추가로 포함하는 바이러스 벡터인 단일 발현 벡터.
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