WO2023229282A1 - 락토바실러스 쿤케이 nchbl-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 쿤케이 nchbl-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 Download PDF

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WO2023229282A1
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nchbl
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metabolic diseases
lactobacillus
culture medium
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PCT/KR2023/006632
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박종환
고홍범
허주영
정도헌
송은정
마은비
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Industry Foundation of Chonnam National University
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism

Definitions

  • This invention was made under the support of the Ministry of Education under project identification number 1320213639 and detailed task number 2021-3639.
  • the research management agency for the project is the National Research Foundation of Korea, the research project name is "Korea Creative Asset Commercialization Support Project”, and the research project name is "Animal effectiveness evaluation of the body fat suppression and blood sugar lowering effects of honey bee-derived lactic acid bacteria", the host organization is Chonnam National University Industry-Academic Cooperation Foundation, and the research period is 2021.10.01 ⁇ 2022.01.31.
  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or improving metabolic diseases comprising the Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or its culture, and more specifically, the culture or live cells of the Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 strain.
  • This relates to technology used to prevent, treat, or improve metabolic diseases such as obesity, diabetes, and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • Non-alcoholic fatty liver disease accounts for 70-90% of the causes of chronic hepatitis.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • obesity treatments mainly act directly on the brain to induce satiety and suppress appetite, and obesity treatments such as orlistat induce weight loss by reducing fat absorption.
  • obesity treatments that induce a feeling of satiety, they are designated and managed as psychotropic drugs due to dependence and tolerance. They may induce a feeling of satiety by increasing the concentration of these neurotransmitters at the nerve junction of norepinephrine or serotonin, and may induce satiety by activating serotonin receptors or adrenergic receptors. It can also be triggered by stimulation.
  • microorganisms in the Lactobacillus genus are lactic acid bacilli that undergo homotypic or heterotypic fermentation, and are commonly found in the fermentation process of dairy products or vegetables, and are mostly classified as beneficial bacteria.
  • probiotics such as Lactobacillus or Bifidobacterium, which are beneficial intestinal bacteria
  • effects such as weight loss, improvement of fatty liver and fatty tissue inflammation, and alleviation of intestinal microbial imbalance in obesity induced by a high-fat diet. It has been reported that it represents .
  • Lactobacillus kunkeei derived from honey bees, has excellent effects on inhibiting adipocyte differentiation and improving obesity.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases containing Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or its culture medium.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for improving metabolic diseases containing Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or its culture medium.
  • Another object of the present invention relates to the use of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or its culture medium to prevent, treat, or improve metabolic diseases.
  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or improving metabolic diseases containing Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 strain or a culture medium thereof.
  • the composition according to the present invention inhibits adipocyte differentiation and inhibits weight gain. In addition, it has a blood sugar lowering effect.
  • the present inventors used live cells or culture media of Lactobacillus kunkei derived from honey bees to suppress adipocyte differentiation from preadipocytes, and showed a weight gain inhibitory effect and a blood sugar lowering effect in a mouse model of obesity induced by a high-fat diet. confirmed.
  • One aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases containing Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or a culture medium thereof.
  • the strain may be deposited under the accession number KCTC14908BP.
  • the strain may be live, dead, or a mixture thereof, for example, may be live, but is not limited thereto.
  • the composition may contain the strain at a concentration of 5 x 10 5 to 5 x 10 11 CFU/ml, preferably 5 x 10 5 to 5 x 10 9 CFU/ml, 5 x 10 It may include a concentration of 5 to 5 x 10 7 CFU/ml, or 5 x 10 7 to 5 x 10 11 CFU/ml, for example, a concentration of 5 x 10 7 to 5 x 10 9 CFU/ml. It may include, but is not limited to this.
  • the culture medium may be obtained by culturing the strain for more than 12 hours, preferably 12 to 30 hours, 12 to 28 hours, 12 to 26 hours, 12 to 24 hours, 18 to 30 hours, 18 to 30 hours. It may be obtained by culturing for 28 hours, 18 to 26 hours, 18 to 24 hours, 24 to 30 hours, or 24 to 28 hours, for example, it may be obtained by culturing for 24 to 26 hours. It is not limited.
  • the culture medium may have a pH of 6.5 to 8.5, preferably pH 6.5 to 8.0, pH 6.5 to 7.5, pH 7.0 to 8.5, or pH 7.0 to 8.0, for example, pH 7.0. It may be from 7.5 to 7.5, but is not limited thereto.
  • lactic acid bacteria grow in the culture medium, they produce metabolites such as lactic acid and may become acidic, which corresponds to a pH range that is not appropriate for cell culture. Based on this, the most appropriate pH value for cell culture is 7.4.
  • the culture medium may contain 20.0 to 100.0% (v/v) of the total composition, preferably 20.0 to 90.0%, 20.0 to 80.0%, 20.0 to 70.0%, 20.0 to 60.0%, 20.0 to 20.0%. 50.0%, 30.0 to 100.0%, 30.0 to 90.0%, 30.0 to 80.0%, 30.0 to 70.0%, 30.0 to 60.0%, 30.0 to 50.0%, 40.0 to 100.0%, 40.0 to 90.0%, 40.0 to 80 .0%, 40.0 to It may be contained in 70.0% or 40.0 to 60.0%, for example, may be contained in 40.0 to 50.0%, but is not limited thereto.
  • the culture medium may be a culture supernatant obtained by culturing the strain and then removing the strain, a concentrate thereof, a fraction thereof, or a freeze-dried product thereof.
  • it may be a culture supernatant. It is not limited.
  • the metabolic disease includes obesity, diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), high blood pressure, hyperlipidemia, cardiovascular disease, and high insulin. It may be one or more types selected from the group consisting of blood pressure.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically effective amount of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or its culture medium and/or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the Lactobacillus sakei CVL-001 strain culture medium described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Includes, but is limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. It doesn't work.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to mammals, including humans, through various routes.
  • the administration method may be any commonly used method, for example, oral, dermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc. administration, and is preferably administered orally.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. Usually, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, capsule, or gel (e.g., hydrogel), and may additionally contain a dispersant or stabilizer. .
  • Another aspect of the present invention is a health functional food composition for improving metabolic diseases containing Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or its culture medium.
  • the strain may be deposited under the accession number KCTC14908BP.
  • the strain may be live, dead, or a mixture thereof, for example, may be live, but is not limited thereto.
  • the composition may contain the strain at a concentration of 5 x 10 5 to 5 x 10 11 CFU/ml, preferably 5 x 10 5 to 5 x 10 9 CFU/ml, 5 x 10 It may include a concentration of 5 to 5 x 10 7 CFU/ml, or 5 x 10 7 to 5 x 10 11 CFU/ml, for example, a concentration of 5 x 10 7 to 5 x 10 9 CFU/ml. It may include, but is not limited to this.
  • the culture medium may be obtained by culturing the strain for more than 12 hours, preferably 12 to 30 hours, 12 to 28 hours, 12 to 26 hours, 12 to 24 hours, 18 to 30 hours, 18 to 30 hours. It may be obtained by culturing for 28 hours, 18 to 26 hours, 18 to 24 hours, 24 to 30 hours, or 24 to 28 hours, for example, it may be obtained by culturing for 24 to 26 hours. It is not limited.
  • the culture medium may have a pH of 6.5 to 8.5, preferably pH 6.5 to 8.0, pH 6.5 to 7.5, pH 7.0 to 8.5, or pH 7.0 to 8.0, for example, pH 7.0. It may be from 7.5 to 7.5, but is not limited thereto.
  • the culture medium may contain 20.0 to 100.0% (v/v) of the total composition, preferably 20.0 to 90.0%, 20.0 to 80.0%, 20.0 to 70.0%, 20.0 to 60.0%, 20.0 to 20.0%. 50.0%, 30.0 to 100.0%, 30.0 to 90.0%, 30.0 to 80.0%, 30.0 to 70.0%, 30.0 to 60.0%, 30.0 to 50.0%, 40.0 to 100.0%, 40.0 to 90.0%, 40.0 to 80 .0%, 40.0 to It may be contained in 70.0% or 40.0 to 60.0%, for example, may be contained in 40.0 to 50.0%, but is not limited thereto.
  • the culture medium may be a culture supernatant obtained by culturing the strain and then removing the strain, a concentrate thereof, a fraction thereof, or a freeze-dried product thereof.
  • it may be a culture supernatant. It is not limited.
  • the metabolic disease may be one or more selected from the group consisting of obesity, diabetes, non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, hypertension, hyperlipidemia, cardiovascular disease, and hyperinsulinemia.
  • the health functional food composition of the present invention When using the health functional food composition of the present invention as a food additive, the health functional food composition may be added as is or used together with other foods or food ingredients, and may be used appropriately according to conventional methods. In general, when manufacturing food or beverages, the food composition of the present invention may be added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw materials.
  • foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, etc. These include alcoholic beverages and vitamin complexes, and include all foods in the conventional sense.
  • the beverage may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • the above-mentioned natural carbohydrates may include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame. .
  • the ratio of the natural carbohydrates can be appropriately determined by the selection of a person skilled in the art.
  • the health functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, and glycerin. , alcohol, and carbonating agents used in carbonated beverages.
  • the health functional food composition of the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks. These ingredients can be used independently or in combination. The proportions of these additives can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or improving metabolic diseases containing Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 strain or a culture medium thereof, wherein the composition not only inhibits adipocyte differentiation and weight gain. Since it has a blood sugar lowering effect, it can be effectively used to prevent, treat, or improve metabolic diseases.
  • Figure 1 shows the culture supernatant of Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 from 3T3-L1 preadipocyte cells according to an embodiment of the present invention. This is a graph showing the cytotoxicity of .
  • Figure 2a is a graph showing the inhibitory effect on adipocyte differentiation of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 culture supernatant in preadipocytes according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2b is a photograph showing the inhibitory effect on adipocyte differentiation of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 culture supernatant in preadipocytes according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a photograph showing the expression level of transcription factors related to adipocyte differentiation by Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 culture supernatant in preadipocytes according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a is a graph showing the effect of suppressing body weight gain by Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4b is a graph showing the effect of suppressing body weight gain by Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a is a graph showing the blood sugar lowering effect of a glucose tolerance test using live Lactobacillus kunkei NCHBL-003 bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5b is a graph showing the blood sugar lowering effect of the glucose tolerance test using Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5c is a graph showing the area under the blood sugar drop graph of the glucose tolerance test using Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5d is a graph showing the area under the blood sugar drop graph of the glucose tolerance test using Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a is a graph showing the blood sugar lowering effect of the insulin tolerance test using live Lactobacillus kunkei NCHBL-003 bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b is a graph showing the blood sugar lowering effect of the insulin tolerance test using Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6c is a graph showing the area under the blood sugar drop graph of the insulin tolerance test using Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6d is a graph showing the area under the blood sugar drop graph of the insulin tolerance test by Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a is a graph showing the effect of reducing liver weight by Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7b is a graph showing the effect of reducing subcutaneous fat weight by Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8a shows non-alcoholic fatty liver disease (Non-alcoholic fatty liver disease; This is a photograph showing the results of histological clinical symptoms of NAFLD.
  • Figure 8b shows the results of histological clinical symptoms of non-alcoholic fatty liver disease caused by live bacteria Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention. It's a graph.
  • Figure 9a is a photograph showing the size of adipocytes in adipose tissue by live bacteria Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9b is a graph showing the size of adipocytes in adipose tissue caused by live Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live cells in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a graph showing the expression level of metabolism-related genes in adipose tissue by Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live cells in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a graph showing the expression level of genes related to adipocyte differentiation in adipose tissue by Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live cells in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 is a graph showing the expression level of inflammation-related genes in adipose tissue by Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria in an obesity-induced mouse animal model according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases containing Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 strain or its culture medium.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance means (weight/volume)% for solid/solid, (weight/volume)% for solid/liquid, and Liquid/liquid is (volume/volume)%.
  • Example 1 Preparation of cultures of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 strains isolated from honey bees
  • target insects were first collected in the Gwangju area in early June, placed in sterilized collection containers, refrigerated for 10 minutes for each individual, then taken out and cut into the gastrointestinal tract using a microsurgical instrument on a green bench. It was extracted aseptically.
  • the intestinal microbial community of honey bees was collected from the extracted gastrointestinal contents in 0.1% peptone physiological saline (0.9% w/v NaCl, 0.1% w/v Tween 80, 0.1% w/v peptone) supplemented with 10 ml of sterilized Tween 80. It was secured by suspension.
  • lactic acid bacteria 500 ul of suspension of internal organs was appropriately diluted sequentially using liquid medium (Difco TM Lactobacilli MRS Broth, BD, USA) and then spread on solid medium (BBL TM LBS Agar, BD, USA) using platinum. BD GasPak TM EZdp was added and cultured at 37°C until bacterial colonies were confirmed. The bacterial colony identified on the LBS solid medium was identified as Lactobacillus through the Gram positive result of Gram staining and the catalase negative reaction confirmed by mixing with 3% hydrogen peroxide solution. The isolated field isolate Lactobacillus was stored at -20°C in MRS medium containing 15% glycerol and used in the next experiment.
  • liquid medium Disifco TM Lactobacilli MRS Broth, BD, USA
  • solid medium BBL TM LBS Agar, BD, USA
  • BD GasPak TM EZdp was added and cultured at 37°C until bacterial colonies were confirmed.
  • phylogenetic identification of Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 was performed through nucleotide sequence analysis of the 16S rRNA gene, using the PHYDIT program. Based on the similarity of the primary and secondary structures of the 16S rRNA gene, it was compared with the 16S rRNA gene of Lactobacillus strains.
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 (1*10 8 CFU/ml), which are lactic acid bacteria isolated from the inside of the bee intestine, were cultured in DMEM (high glucose) medium for 24 hours and centrifuged. After separation, the supernatant was separated. The supernatant was adjusted to pH 7.4, sterilized using a syringe filter (0.2 ⁇ m), and stored.
  • Cytotoxicity can be assessed by measuring LDH (Lactate dehydrogenase) released from dead cells.
  • 3T3-L1 preadipocyte cells purchased from the Korean Cell Line Bank were maintained by subculture in DMEM medium with the addition of 10% BCS (Bovine calf serum) and 1% PS (penicillin). Cells were seeded at a density of 1x10 5 cells/ml in a 48 well plate (0.2 ml each) with medium supplemented with 10% FBS and 1% PS. After inoculating the plate, designate Day-2 when the density reaches 100% and culture for 2 more days to ensure that all cells in the cultured plate are in cell cycle arrest at the G1 stage. induced.
  • BCS Bovine calf serum
  • PS penicillin
  • adipocyte differentiation was induced by adding MDI (IBMX, Dexamethasone, Insulin) to medium supplemented with 10% FBS (Fetal bovine serum).
  • MDI IBMX, Dexamethasone, Insulin
  • FBS Fetal bovine serum
  • Cytotoxicity was evaluated by calculating the percentage of LDH released from Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 cultures (0, 12.5, 25, 50%).
  • 3T3-L1 was inoculated into a 12-well plate at a density of 1x10 5 cells/ml with 1 ml of medium supplemented with 10% FBS and 1% PS. On Day 0, 2 days after the cells were grown at a density of 100%, culture medium (0, 12.5, 25, 50%) and MDI, a differentiation inducing substance, were treated.
  • fat cells were stained for 20 minutes using a dye mixed with Oil red O staining reagent and distilled water (D.W) in a 6:4 ratio. After washing twice with distilled water, observing and photographing under a microscope, Oil Red O staining was extracted by treatment with 100% isopropanol, and the degree of differentiation was quantitatively analyzed by measuring absorbance at 510 nm.
  • D.W Oil red O staining reagent and distilled water
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 culture medium inhibits differentiation into adipocytes.
  • lipid biosynthesis is achieved through major transcription factors such as SREBP1c (sterol regulatroy element binding protein 1c), PPAR ⁇ (peroxisome proliferator-activated receptor- ⁇ ), and C/EBP ⁇ (CCAAT-enhancer binding protein ⁇ ).
  • SREBP1c sterol regulatroy element binding protein 1c
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor- ⁇
  • C/EBP ⁇ C/EBP ⁇
  • 3T3-L1 cells inoculated in a 12-well plate at a density of 1x10 5 cells/ml were cultured until Day 8 along with treatment with lactic acid bacteria culture medium according to the experimental method described above.
  • Cells from each group were collected with a cell scraper, and proteins were separated using a protein lysis buffer containing protease inhibitors.
  • each protein was loaded on an SDS-PAGE gel, separated according to protein molecular weight and size, and then transferred to a PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane.
  • the transferred membrane was stained with primary antibodies SREBP1c (#ab28481, Abcam), PPAR ⁇ (#2443S, Cell Signaling Technology), C/EBP ⁇ (#8178T, Cell Signaling Technology), and ⁇ -actin (#sc-47778, Santa cruz Biotechnology). ) was reacted at 4°C for 18 hours and then washed with TBST buffer.
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 culture medium inhibits adipocyte differentiation through a decrease in the expression level of transcription factors.
  • Example 3 Live cell preparation of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria (1*10 8 CFU/ml) were grown on solid medium (MRS agar) for 30 hours for 24 hours. Cultured under °C conditions. A single colony was collected and pre-cultured in liquid medium (MRS borth). Pre-culture was performed in 5 ml medium at 150 rpm at 30°C for 24 hours, then diluted 10-fold and main culture was performed for 3 hours under the same conditions.
  • the concentration was adjusted with PBS using a spectrophotometer to obtain an OD value of 0.6 at an absorbance of 600 nm.
  • the Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain was confirmed to be present at 1.57*10 9 CFU/ml
  • the Lactobacillus Plantarum NCHBL-004 strain was found to be present at 1.48*10 9 CFU/ml.
  • centrifugation was performed at 3,000 rpm for 15 minutes to form a viable cell medium. was manufactured.
  • mice Seven-week-old C57BL/6 male mice were administered a normal diet or a high-fat diet along with live bacterial medium. Two weeks after administration of the regular diet or high-fat diet, body weight was measured and the weights for each group were equalized. Body weight was measured at weekly intervals starting 3 weeks after administration of the regular diet or high-fat diet. A glucose tolerance test was performed at 10 weeks, an insulin tolerance test was performed at 15 weeks, and an autopsy was performed at 16 weeks to measure organ weights.
  • the group's information is as follows. The number of mice in all groups was set to 10.
  • G1 Normal diet feeding phosphate buffered saline (PBS) G2 high fat diet PBS G3 high fat diet Lactobacillus kunkei NCHBL-003 1*10 7 CFU/mouse G4 high fat diet Lactobacillus kunkei NCHBL-003 1*10 9 CFU/mouse G5 high fat diet Lactobacillus Plantarum NCHBL-004 1*10 7 CFU/mouse G6 high fat diet Lactobacillus Plantarum NCHBL-004 1*10 9 CFU/mouse
  • PBS phosphate buffered saline
  • G1 G2 G3 G4 G5 G6 Weight (g, Week 16) 34.25 44.25 42.64 39.21 40.4 40.73
  • the group (G4) administered Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria at a concentration of 1*10 9 CFU along with a high-fat diet also showed a significant decrease in body weight compared to G2.
  • the group (G3) administered low concentration of Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria at a concentration of 1*10 7 CFU body weight decreased on average, but it was not significant.
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live bacteria induce a weight loss effect.
  • mice of each group prepared in Example 4-1 were fasted for 12 hours from 9 PM the day before the experiment to 9 AM the next day and then used for a glucose tolerance test.
  • the mice were returned to the cage, blood was collected from the tail, and blood sugar levels were measured every 0, 15, 30, 60, 90, and 120 minutes.
  • Glycemic load blood sugar (mg/dL) G1 G2 G3 G4 G5 G6 0 min 115.3 175 160.3 195.2 159.3 160.7 15min 263.5 400.3 356.2 372.2 383 378.7 30min 238.8 341.7 312.2 325.5 298.7 293.8 60min 188.8 260.7 234.8 223.2 207.8 207.2 90min 131.8 215.3 180.8 192.8 167.5 154.8 120min 98.5 187.7 160.3 168.5 140.5 152.5
  • the AUC results calculated by calculating the area under the glucose tolerance test graph showed a significant decrease in the group (G3) fed with Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria at a concentration of 1*10 7 CFU compared to G2. did. In the two groups (G3 and 4) administered Lactobacillus Plantarum NCHBL-004 live bacteria at concentrations of 1*10 7 and 1*10 9 CFU, respectively, it was observed that the level was significantly reduced compared to G2.
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus Plantarum NCHBL-004 have a blood sugar lowering effect in an obesity model induced by a high-fat diet.
  • mice of each group prepared in Example 4-1 were fasted for 4 hours from 9 a.m. to 1 p.m. and then used for an insulin tolerance test.
  • Insulin Insulin in PBS
  • the mouse was returned to the cage, blood was collected from the tail, and blood glucose levels were measured every 0, 15, 30, 60, 90, 120, and 150 minutes.
  • the G2 group administered a high-fat diet was observed to maintain significantly higher blood sugar levels compared to the group G1 administered a normal diet.
  • Lactobacillus kunkei NCHBL-003 and Lactobacillus plantarum NCHBL-004 have a blood sugar lowering effect in an obesity model induced by a high-fat diet.
  • a mouse model in which obesity was induced by a high-fat diet was autopsied at 16 weeks, and organ weights were measured and compared.
  • the liver and adipose tissue fixed in 10% formalin solution were embedded in paraffin and then sliced to a thickness of 3 ⁇ m to create section slides.
  • the nucleus and cytoplasm were stained using H&E dye consisting of hematoxylin and eosin, and then developed at 100x magnification using an optical microscope and a digital camera mounted on the microscope.
  • H&E dye consisting of hematoxylin and eosin
  • the following criteria were established and evaluated: Steatosis (0-3), Hepatocellular ballooning (0-3), and inflammatory cells in the liver.
  • Infiltration Libular inflammasome cell infiltration
  • the size of adipocytes in adipose tissue was measured using the Image J program.
  • Both liver weight and subcutaneous fat weight in group G2 fed the high-fat diet increased compared to group G1 in the normal diet group.
  • the product amplified by real-time PCR was quantified using the Ct (comparative cycle threshold) method, and the expression level of each sample was corrected using 18S rRNA, a housekeeping gene, as an internal control.
  • the primer sequences for each gene used in PCR are shown in Table 6.
  • sequence number designation order 2 18S rRNA forward primer AGGAGCTGAAGGGCCACGGG 3 18S rRNA reverse primer TGGGAACAGTGACGCGGGTC
  • the average size of adipocytes decreased in the group (G4) fed with Lactobacillus kunkei NCHBL-003 live bacteria at a concentration of 1*10 9 CFU along with a high-fat diet.
  • the average size of fat cells decreased, and the decrease was significant in the group (G6) fed live bacteria at a concentration of 1*10 9 CFU. was confirmed.
  • Adiponectin is mostly produced in fat cells and is well known to regulate sugar and lipid metabolism, increase insulin sensitivity, and decrease in metabolic syndrome.
  • GLUT4 (glucose transporter type 4) plays a role in mediating intracellular glucose uptake in peripheral tissues by insulin stimulation, and when insulin resistance occurs, GLUT4 translocation from the cytoplasm to the cell membrane is inhibited.
  • HSL Hormone-sensitive lipase
  • ATGL adipse triglycerde lipase
  • CPT1A Carnitine Palmitoyltransferase 1A plays a role in promoting fatty acid beta oxidation in mitochondria.
  • mice in which obesity was induced with a high-fat diet were autopsied at week 16, and RNA was extracted from epididymal fat to evaluate the expression levels of genes related to adipocyte differentiation and genes related to inflammation.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor- ⁇
  • C/EBP ⁇ CCAAT-enhancer binding protein
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • MCP1 monocyte chemoattractant protein-1
  • Lactobacillus plantarum NCHBL-004 live cells regulates the expression of genes related to adipocyte differentiation and inflammation in adipose tissue.
  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or improving metabolic diseases comprising the Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or a culture medium thereof, and more specifically, to a composition for the prevention, treatment or improvement of metabolic diseases containing the Lactobacillus kunkei NCHBL-003 strain or live cells.
  • This relates to technology used to prevent, treat, or improve metabolic diseases such as obesity, diabetes, and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 지방 세포 분화를 억제하고 체중 증가를 억제할 뿐만 아니라, 혈당 강하 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 대사성 질환의 예방, 치료 또는 개선 용도에 이용할 수 있다.

Description

락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물
본 발명은 교육부의 지원 하에서 과제고유번호 1320213639, 세부과제번호 2021-3639에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "대한창의적자산실용화지원사업", 연구과제명은 "꿀벌유래 유산균의 체지방 억제 및 혈당강하 효과에 대한 동물 유효성 평가", 주관기관은 전남대학교 산학협력단, 연구기간은 2021.10.01 ~ 2022.01.31이다.
본 특허출원은 2022년 5월 25일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0064153호에 대하여 우선권을 주장하고, 2022년 10월 6일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0128062호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주의 배양액 또는 생균을 이용하여 비만, 당뇨, 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 등의 대사성 질환에 대한 예방, 치료 또는 개선 용도로 사용하는 기술에 관한 것이다.
최근, 식생활의 서구화와 더불어 유전적, 환경적 요인 등으로 인한 비만 및 당뇨 등의 성인병 발생률이 증가하고 있는 추세이다. 대한비만학회에 따르면 국내 고도비만율은 2009년 3.5%에서 2018년 6.01%로 10년간 약 72%나 증가하였다. 이와 같은 상승세라면 2030년에는 국민 10명 중 1명이 고도 비만에 해당할 것이라는 전 망이다.
이에 따른 사회적 비용도 무시할 수 없다. 2008년 한 해 국내에서 비만 치료에 쓰인 비용은 1조 7,923억원으로 매해 그 비용이 증가하고 있는 실정이다. 이를 예방 및 치료할 수 있는 물질들에 대한 연구들이 진행되고 있는 가운데 최근 다양한 건강 기능성 식품 개발이 시도되고 있다. 비만은 단순히 살이 찐 상태가 아닌, 각종 질환을 유발하며 생명까지 위협할 수 있는 질병으로 명백하게 분류된다. 과체중으로 인한 골관절염, 수면무호흡증과 같은 동반 질환뿐 아니라 비알콜성 지방간, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증 등 대사 관련 합병증 및 중증 심혈관질환이나 암 등과 같은 심각한 질환까지도 이환될 수 있다.
비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 만성 간염의 원인 중 70-90%를 차지하며 산화 스트레스가 증가하거나 인슐린 저항성이 심해지면 간에서 염증 반응이 일어나고, 결국 중증 지방간 또는 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)으로 악화될 수 있다. 지방간염으로 진행된 경우 간경변, 간부전 및 간세포암으로 발전할 위험이 높아지며 심혈관 질병을 비롯한 또다른 만성질환으로 이어져 사망에 이를 수 있기 때문에 이러한 연결고리를 끊는 것이 중요하다.
국내외 여러 제약회사들이 NASH 치료제 개발에 뛰어들고 있지만 아직 허가당국으로 승인받은 제품은 없는 실정이다. 현재 사용하고 있는 비만 치료제는 주로 뇌에 직접 작용하여 포만감을 유도, 식욕을 억제시키고, 오르리스타트(orlistat)와 같은 비만 치료제는 지방의 흡수를 저하시켜 체중 감소를 유도한다. 포만감을 유도하는 비만 치료제의 경우 의존성 및 내성 때문에 향정신성 의약품으로 지정, 관리 받게 되는데 노르에피네프린 혹은 세로토닌의 신경 접합부에서 이러한 신경전달물질의 농도를 증가시켜 포만감을 유발하기도 하고, 세로토닌 수용체나 아드레날린성 수용체를 자극하여 유발하기도 한다.
이러한 약물들은 3개월 이상 복용 시 피로, 우울증, 환청, 수면장애와 같은 부작용이 나타나기 때문에 약물 중독 위험성에 주의하여야 한다. 때문에 비만으로 발생하는 대사증후군 치료에 있어서, 항비만 효과 및 대사질환 개선 효과는 높고 부작용은 적은 소재의 새로운 작용기전을 가진 치료 전략이 대두되고 있다.
한편, 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로서, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있으며 대부분 유익균으로 분류되고 있다. 최근 많은 연구에서 장내 유익균인 락토바실러스 균, 또는 비피도박테리움 균 즉 프로바이오틱스를 투여함으로서 고지방 식이로 유도된 비만 상황에서 체중 감소, 지방간과 지방 조직의 염증의 개선, 장내 미생물 불균형의 완화 등의 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다.
이에 본 발명자들은 꿀벌에서 유래한 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei)의 지방세포 분화 억제와 비만 개선 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액의 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 지방 세포 분화를 억제하고 체중 증가를 억제할 뿐만 아니라, 혈당 강하 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 꿀벌에서 유래한 락토바실러스 쿤케이의 생균 또는 배양액을 이용하여 지방전구세포로부터 지방 세포 분화를 억제하고, 고지방식이로 유도된 비만 유도 마우스 모델에서 체중 증가 억제 효과 및 혈당 강하 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 균주는 수탁번호 KCTC14908BP로 기탁된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 균주는 생균, 사균, 또는 이의 혼합물인 것일 수 있고, 예를 들어, 생균인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 상기 균주를 5 x 105 내지 5 x 1011 CFU/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 5 x 105 내지 5 x 109 CFU/ml, 5 x 105 내지 5 x 107 CFU/ml, 또는 5 x 107 내지 5 x 1011 CFU/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 5 x 107 내지 5 x 109 CFU/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 균주를 12시간 이상 배양하여 수득한 것일 수 있고, 바람직하게는 12 내지 30시간, 12 내지 28시간, 12 내지 26시간, 12 내지 24시간, 18 내지 30시간, 18 내지 28시간, 18 내지 26시간, 18 내지 24시간, 24 내지 30시간, 또는 24 내지 28시간 동안 배양하여 수득한 것일 수 있고, 예를 들어, 24 내지 26시간 동안 배양하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 pH 6.5 내지 8.5인 것일 수 있고, 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.0, pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 8.5, 또는 pH 7.0 내지 8.0인 것일 수 있고, 예를 들어, pH 7.0 내지 7.5인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양액에서는 유산균이 자라면서 젖산 등의 대사체를 생산하게 되어 산성화될 수 있고, 이는 세포 배양에 적절하지 않은 pH 범위에 해당한다. 이러한 점에 근거하여, 세포 배양에 있어서 가장 적절한 pH 값은 7.4이다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 전체 조성물 대비 20.0 내지 100.0%(v/v) 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 20.0 내지 90.0%, 20.0 내지 80.0%, 20.0 내지 70.0%, 20.0 내지 60.0%, 20.0 내지 50.0%, 30.0 내지 100.0%, 30.0 내지 90.0%, 30.0 내지 80.0%, 30.0 내지 70.0%, 30.0 내지 60.0%, 30.0 내지 50.0%, 40.0 내지 100.0%, 40.0 내지 90.0%, 40.0 내지 80.0%, 40.0 내지 70.0% 또는 40.0 내지 60.0% 포함되는 것일 수 있고, 예를 들어, 40.0 내지 50.0% 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 균주를 배양한 후 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있고, 예를 들어, 배양 상층액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨, 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH), 고혈압, 고지혈증, 심혈관질환 및 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액의 약학적 유효량 및/또는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 상술한 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주 배양액의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 균주는 수탁번호 KCTC14908BP로 기탁된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 균주는 생균, 사균, 또는 이의 혼합물인 것일 수 있고, 예를 들어, 생균인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 상기 균주를 5 x 105 내지 5 x 1011 CFU/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 5 x 105 내지 5 x 109 CFU/ml, 5 x 105 내지 5 x 107 CFU/ml, 또는 5 x 107 내지 5 x 1011 CFU/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 5 x 107 내지 5 x 109 CFU/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 균주를 12시간 이상 배양하여 수득한 것일 수 있고, 바람직하게는 12 내지 30시간, 12 내지 28시간, 12 내지 26시간, 12 내지 24시간, 18 내지 30시간, 18 내지 28시간, 18 내지 26시간, 18 내지 24시간, 24 내지 30시간, 또는 24 내지 28시간 동안 배양하여 수득한 것일 수 있고, 예를 들어, 24 내지 26시간 동안 배양하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 pH 6.5 내지 8.5인 것일 수 있고, 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.0, pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 8.5, 또는 pH 7.0 내지 8.0인 것일 수 있고, 예를 들어, pH 7.0 내지 7.5인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 전체 조성물 대비 20.0 내지 100.0%(v/v) 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 20.0 내지 90.0%, 20.0 내지 80.0%, 20.0 내지 70.0%, 20.0 내지 60.0%, 20.0 내지 50.0%, 30.0 내지 100.0%, 30.0 내지 90.0%, 30.0 내지 80.0%, 30.0 내지 70.0%, 30.0 내지 60.0%, 30.0 내지 50.0%, 40.0 내지 100.0%, 40.0 내지 90.0%, 40.0 내지 80.0%, 40.0 내지 70.0% 또는 40.0 내지 60.0% 포함되는 것일 수 있고, 예를 들어, 40.0 내지 50.0% 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양액은 균주를 배양한 후 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있고, 예를 들어, 배양 상층액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨, 비알콜성 지방간, 비알콜성 지방간염, 고혈압, 고지혈증, 심혈관질환 및 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 음료는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 지방 세포 분화를 억제하고 체중 증가를 억제할 뿐만 아니라, 혈당 강하 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 대사성 질환의 예방, 치료 또는 개선 용도에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3T3-L1 지방전구세포(preadipocyte cell)에서의 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NCHBL-004 배양액 상층액의 세포 독성 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 지방전구세포에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 배양액 상층액의 지방세포 분화 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 지방전구세포에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 배양액 상층액의 지방세포 분화 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방전구세포에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 배양액 상층액에 의한 지방세포 분화 관련 전사인자 발현량을 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균에 의한 증체 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 증체 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균에 의한 당부하 검사의 혈당 강하 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 당부하 검사의 혈당 강하 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균에 의한 당부하 검사의 혈당 강하 그래프 아래 면적을 나타낸 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 당부하 검사의 혈당 강하 그래프 아래 면적을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균에 의한 인슐린부하 검사의 혈당 강하 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 인슐린부하 검사의 혈당 강하 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균에 의한 인슐린부하 검사의 혈당 강하 그래프 아래 면적을 나타낸 그래프이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 인슐린부하 검사의 혈당 강하 그래프 아래 면적을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 간 무게 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 피하지방 무게 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)의 조직학적 임상증상 결과를 나타낸 사진이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 비알콜성 지방간의 조직학적 임상증상 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 지방 조직의 지방 세포 크기를 나타낸 사진이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 지방 조직의 지방 세포 크기를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균에 의한 지방 조직에서의 대사 관련 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 지방 조직에서의 지방 세포 분화 관련 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 유도 마우스 동물 모델에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균에 의한 지방 조직에서의 염증 관련 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 꿀벌로부터 분리된 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 및 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 균주 배양액의 제조
1-1. 유산균의 분리
꿀벌의 장내 미생물군으로부터 유산균을 분리하기 위하여 먼저 대상 곤충을 6월 초순 광주지역에서 채집 후 멸균된 채집용기에 담아 개체별로 10분 동안 냉장보관 후 꺼내어 그린벤치 내에서 미세 외과기구를 사용하여 위장관을 무균적으로 적출하였다. 꿀벌의 장내 미생물 군집은 적출된 위장관 내용물에서 10 ml의 멸균된 Tween 80이 첨가된 0.1% 펩톤 생리적 식염수(0.9% w/v NaCl, 0.1% w/v Tween 80, 0.1% w/v peptone)에 현탁하여 확보하였다.
유산균은 내장 분쇄물의 현탁액 500 ul를 액체배지(DifcoTM Lactobacilli MRS Broth, BD, USA)를 이용해 연속적으로 적당히 희석한 후 백금이를 이용하여 고형 배지(BBLTM LBS Agar, BD, USA)에 도말하여 BD GasPak TM EZdp를 넣어서 37℃에서 배양하면서 세균의 집락이 확인될 때까지 배양하였다. LBS 고형배지에서 확인된 세균의 집락은 그람염색의 그람 양성 결과와 3% 과산화수소수와 섞어서 확인된 카탈라제 음성반응을 통해 락토바실러스(Lactobacillus)인 것으로 동정하였다. 분리된 야외 분리주 락토바실러스는 15% 글리세롤(glycerol)이 포함된 MRS배지에 넣어 -20℃에 보관하여 다음 실험에 사용하였다.
분리된 균주 중 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NCHBL-004의 계통학적 동정은 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 수행하였으며, PHYDIT program을 이용하여 16S rRNA 유전자의 1차 및 2차 구조의 유사성에 기초하여 락토바실러스 속 균주들의 16S rRNA 유전자와 비교하였다.
서열번호 명칭 서열
1 Lactobacillus kunkeei NCHBL-003 16S rRNA TGCAGTCGAACGAGCTCTCCCAAATTGATTTTATGCTTGCATAAATGATTTTTGGATTCGGAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCCGAAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAAGTGCTAATACCGCATAATTAGTTGGAACCGCATGGTTCCAACTTGAAAGATGGCTCTGCTATCACTTTGGGATGGACCCGCGCCGTATTAGTTAGTTGGTGAGATAAAAGCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACAAGTGTTAGAGTAACTGTTAACACTTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTCTGCTGTGAAAGCCCTCAGCTCAACTGAGGAAGTGCAGTGGAAACTACAAAACTTGAGTACAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTTACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGTGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCTACGCGAAGAACCTTACCAGCTCTTGACATCTTTCTGCCAACC
1-2. 균주 배양액의 제조
DMEM(high glucose) 배지에 꿀벌의 장 내부로부터 분리된 유산균인 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균과 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균(1*108 CFU/ml)을 24시간 동안 배양하여 원심분리 후 상층액을 분리하였다. 상층액을 pH 7.4로 맞춘 후 시린지 필터(syringe filter, 0.2 ㎛)를 사용하여 멸균 후 보관하였다.
실시예 2: 지방세포 분화 억제 효과에 대한 실험 (in vitro)
2-1. 세포 독성 평가
세포 독성은 죽은 세포로부터 유리되는 LDH(Lactate dehydrogenase)를 측정하여 평가할 수 있다. 한국세포주 은행에서 구입한 3T3-L1 지방전구세포(preadipocyte cell)는 DMEM 배지에 10% BCS(Bovine calf serum) 및 1% PS(penicillin)를 첨가하여 계대배양하여 유지하였다. 세포는 48 웰 플레이트(well plate)에 1x105 cells/ml의 밀도로 10% FBS, 1% PS가 첨가된 배지와 함께 0.2 ml씩 접종(seeding)하였다. 플레이트(plate)에 접종한 후 밀도가 100%에 도달했을 때를 Day-2로 지정하고 2일 동안 더 배양하면서 배양된 플레이트 내의 모든 세포가 G1 단계에서 세포주기정지(cell cycle arrest) 상태가 되도록 유도하였다.
자발성(spontaneous) LDH를 측정하기 위하여 대조군으로는 아무것도 처리하지 않는 웰(well)을 준비하였다. 구체적으로, 3T3-L1 지방전구세포의 Day 0부터 10% FBS(Fetal bovine serum)가 첨가된 배지에 MDI(IBMX, 덱사메타손(Dexamethasone), 인슐린(Insulin))를 첨가하여 지방세포 분화를 유도하였다. Day 2에는 인슐린만 포함된 배지로 교체하였다. Day 4부터는 2일 간격으로 배지를 교체하며 분화될 때(Day 8)까지 배양하였다.
최대(maximum) LDH를 측정하기 위하여 실험군으로는 배양액을 처리한 웰을 준비하였다. 상기 대조군과 동일하게 준비하되, 3T3-L1 지방전구세포가 100%의 밀도로 성장한 지점에서 2일 후인 Day 0에 배양액(12.5, 25, 50%)을 처리하였다. 배양액 희석은 DMEM 배지를 이용하여 수행하였다.
상기 세포들을 24시간 동안 배양한 후, LDH 분석(LDH assay)을 진행하여 세포 독성을 평가하였다. triton X-100 용액을 첨가한 웰을 준비한 후 LDH 기질 믹스(substrate mixture)를 첨가하고 흡광도를 측정하여 독성의 백분율을 구하였다.
락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 배양액 (0, 12.5, 25, 50%)으로부터 유리된 LDH를 백분율로 계산하여 세포 독성을 평가하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 3T3-L1에 배양액을 처리하였던 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다.
2-2. 지방 세포 분화에 대한 억제 평가
3T3-L1은 12 웰 플레이트에 1x105 cells/ml의 밀도로 10% FBS, 1% PS가 첨가된 배지와 함께 1 ml씩 접종하였다. 100%의 밀도로 세포가 자란 지점에서 2일 후인 Day 0에 배양액(0, 12.5, 25, 50%)과 분화 유도 물질인 MDI를 처리하였다.
Day 2에 배지를 교체하면서 배양액(0, 12.5, 25, 50%)과 인슐린을 처리하였고, Day 4에 배지를 교체하면서 배양액(0, 12.5, 25, 50%)을 처리하였으며, 분화가 진행될 때까지 이를 2일 간격으로 반복하였다. 분화된 지방세포가 관찰되면 지방구 염색을 위해 배지를 4% 포르말린으로 교체하여 20분 동안 세포를 고정한 후 증류수로 2번 세척하였다.
이후 오일 레드 O(Oil red O) 염색 시약과 증류수(D.W)를 6:4 비율로 혼합한 염색약을 사용하여 20분 동안 지방 세포를 염색하였다. 증류수로 2번 세척한 후 현미경으로 관찰 및 촬영한 뒤, 100% 이소프로판올(isopropanol)을 처리하여 오일 레드 O 염색을 추출하였고 510 nm 흡광도에서 측정하여 분화 정도를 정량적으로 분석하였다.
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, 3T3-L1 세포에 MDI를 처리했을 때 지방 세포로의 분화가 증가하였으며 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 배양액 처리에 의해서 농도 의존적으로 지방 세포의 수가 현저히 감소하였다. 그러나 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 배양액 처리에 의해서는 지방 세포의 수가 감소하지 않았다.
이로부터 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 배양액은 지방 세포로의 분화를 억제함을 확인할 수 있었다.
2-3. 지방세포 분화 관련 전사인자 억제 평가
지방 조직 안에서 발생하는 지방 형성 과정에서 SREBP1c(sterol regulatroy element binding protein 1c), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ), C/EBPα(CCAAT-enhancer binding protein α)와 같은 주요 전사인자들을 통해 지질 생합성, 지방 방울(lipid droplet) 생성 및 지질 축적 등이 증가한다. 이에 따라 지방 세포로 분화한 3T3-L1 세포에서 유산균 배양액 처리의 유무에 따라 앞서 설명한 전사인자의 단백질 발현량을 웨스턴 블로팅(Western blotting) 방법으로 측정하였다.
구체적으로, 12 웰 플레이트에 1x105 cells/ml의 밀도로 접종된 3T3-L1 세포를 앞서 설명한 실험 방법대로 유산균 배양액 처리와 더불어 Day 8까지 배양하였다. 각 군별 세포들을 셀 스크래퍼(cell scraper)로 수거한 뒤 프로테이즈 억제제(protease inhibitor)를 포함한 단백질 용해 버퍼(protein lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하였다.
각 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 겔(gel)에 로딩하여 단백질 분자량 크기(size)대로 분리한 후 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 멤브레인(membrane)으로 전이(transfer)시켰다. 전이된 멤브레인은 1차 항체 SREBP1c(#ab28481, Abcam), PPAR γ(#2443S, Cell Signaling Technology), C/EBPα(#8178T, Cell Signaling Technology), β-actin(#sc-47778, Santa cruz Biotechnology)를 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후 TBST 버퍼로 세척하였다.
2차 항체 Anti-Rabbit IgG, Anti-Mouse IgG, HRP-linked Secondary Antibody (#31640, Invitrogen)을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 TBST로 세척하였다. 검출 시약(Detection Reagent)를 멤브레인에 처리하고 사진을 현상하여 표적 단백질의 발현량을 측정하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, MDI 처리를 통해 지방 세포 분화를 유도했을 시 관련 전사인자들의 단백질 발현량이 증가하였으며 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 배양액 처리에 의해서 농도 의존적으로 전사인자의 발현량이 현저히 감소하였다. 그러나 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 배양액 처리에 의해서는 전사인자의 발현량이 감소하지 않았다.
이로부터 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 배양액은 전사인자 발현량의 감소를 통해 지방 세포 분화를 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 및 락토바셀러스 플란타룸 NCHBL-004의 생균 준비
마우스에 급이하기 위한 생균을 제조하기 위하여 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균과 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균(1*108 CFU/ml)을 고체 배지(MRS agar)에서 24시간 동안 30℃ 조건으로 배양하였다. 단일 콜로니(single colony)를 채취하여 액체 배지(MRS borth)에서 전배양을 진행하였다. 전배양은 5 ㎖ 배지에서 150 rpm으로 30℃ 조건에서 24시간 동안 수행하였으며 이후 10배로 희석하여 동일한 조건에서 3시간 동안 본배양을 수행하였다.
균수를 맞춰주기 위해 흡광도 600 ㎚에서 O.D값 0.6이 나오도록 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 PBS로 농도를 맞추었다. 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주는 이 조건에서 1.57*109 CFU/㎖ 만큼, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 균주는 1.48*109 CFU/㎖ 만큼 존재하는 것으로 확인되었다. 마우스 개체마다 1일 주기로 0.2 ㎖씩 균주별로 각각 1*107 CFU/mouse, 1*109 CFU/mouse의 농도로 급이될 것을 고려하여 3,000 rpm에 15분 조건으로 원심분리를 수행함으로써 생균 배지를 제조하였다.
실시예 4: 비만 개선 효과에 대한 실험 (in vivo)
4-1. 비만 유도 마우스의 체중 변화 측정
60%가 지방으로 구성된 고지방식이(High Fat diet)를 마우스에 투여하면 일반식이(Normal diet)를 투여한 마우스에 비해 체중이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 고지방식이 투여로 유도된 비만 마우스 동물 모델은 비만 질환 연구에 많이 이용되고 있다.
7주령의 C57BL/6 수컷 마우스에 생균 배지 투여와 함께 일반식이 또는 고지방식이를 투여하였다. 일반식이 또는 고지방식이 투여 2주 후 체중을 측정하여 그룹별 체중의 무게를 동일하게 맞추었다. 일반식이 또는 고지방식이 투여 3주 후부터 1주 간격으로 체중을 측정하였다. 10주째에 당부하 검사를 실시하였고, 15주째에 인슐린부하 검사를 실시하였으며, 16주째에 부검하여 장기 무게를 측정하였다.
그룹의 정보는 다음과 같다. 모든 그룹의 마우스 숫자는 10마리로 설정하였다.
그룹명 식이 경구투여
G1 일반식이 급이 PBS(phosphate buffered saline)
G2 고지방식이 급이 PBS
G3 고지방식이 급이 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 1*107 CFU/mouse
G4 고지방식이 급이 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 1*109 CFU/mouse
G5 고지방식이 급이 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 1*107 CFU/mouse
G6 고지방식이 급이 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 1*109 CFU/mouse
표 2에 따라 수행한 결과, 고지방식이를 먹인 그룹(G2)에서 일반식이를 먹인 그룹(G1)에 비해 유의적으로 체중이 증가되는 것으로 관찰되었다.
G1 G2 G3 G4 G5 G6
체중 (g, Week 16) 34.25 44.25 42.64 39.21 40.4 40.73
표 3 및 도 4a에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 1*109 CFU 농도로 투여한 그룹(G4)에서도 G2보다 유의적으로 체중이 감소한 것으로 나타났다. 저농도인 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 1*107 CFU 농도로 투여한 그룹(G3)에서는 체중이 평균적으로 감소하였지만 유의적인 수준은 아니었다.
표 2 및 도 4b에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*107 과 1*109 CFU 농도로 각각 먹인 두 그룹(G5, G6)에서 G2 대비 체중이 유의적으로 감소하였다.
이로부터 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균이 체중 감소 효과를 유도하는 것으로 확인되었다.
4-2. 비만 유도 마우스의 당부하 혈당 평가
마우스에 글루코스(Glucose)를 경구로 투여하였을 경우 혈당이 일시적으로 상승하지만 체내 정상 인슐린 분비에 의해 혈당이 다시 감소하는 경향이 나타난다. 그러나 고지방식이를 먹인 마우스 동물 모델에서는 혈당이 지속적으로 높게 유지되는 것으로 알려져 있다.
상기 실시예 4-1에서 준비된 그룹별 마우스는 실험 전날 오후 9시부터 다음 날 9시까지 12시간 공복 유지 후 당부하 검사에 활용되었다. 0.2 ㎛ 여과(filteration)로 멸균시킨 10% 글루코스(Glucose in PBS) 용액을 준비하여 각 개체마다 2 mg(glucose/g, volume(㎕)=body weight(g) x 20)씩 경구 투여를 수행하였다. 마우스를 케이지에 다시 넣고 꼬리에서 채혈하여 혈당 수치를 0, 15, 30, 60, 90, 120분마다 측정하였다.
본 연구에서 고지방식이를 먹인 G2 그룹은 일반식이 먹인 그룹 G1에 비해 혈당 수치가 상당히 높게 유지되는 것으로 관찰되었다.
당부하 혈당 (mg/dL) G1 G2 G3 G4 G5 G6
0 min 115.3 175 160.3 195.2 159.3 160.7
15 min 263.5 400.3 356.2 372.2 383 378.7
30 min 238.8 341.7 312.2 325.5 298.7 293.8
60 min 188.8 260.7 234.8 223.2 207.8 207.2
90 min 131.8 215.3 180.8 192.8 167.5 154.8
120 min 98.5 187.7 160.3 168.5 140.5 152.5
표 4, 도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 먹인 그룹(G3-6)에서 G2 대비 혈당 수치가 감소되었다. 특히 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004의 경우 혈당을 측정한 각각의 시각에서도 유의미한 수준으로 감소하였다.
도 5c 및 5d에서 확인할 수 있듯이, 당부하 검사 그래프의 아래 면적을 계산한 AUC 결과에서 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 1*107 CFU 농도로 먹인 그룹(G3)에서 G2 대비 유의적으로 감소하였다. 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*107, 1*109 CFU 농도로 각각 투여한 두 그룹(G3, 4)에서 G2 대비 유의적으로 감소한 수준임을 관찰하였다.
즉 당부하검사를 통해 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004는 고지방식이로 유도한 비만 모델에서 혈당 강하 효과가 있음을 확인하였다.
4-3. 비만 유도 마우스의 인슐린부하 혈당 평가
고지방식이를 먹인 마우스 동물 모델에서는 혈당이 매우 높게 유지되는 것으로 알려져 있다. 이러한 마우스 동물 모델에 인슐린을 복강 투여했을 경우 혈당이 일시적으로 감소하지만, 고지방식이를 먹인 마우스 동물 모델에서는 혈당의 감소가 비교적 덜하다.
상기 실시예 4-1에서 준비된 그룹별 마우스는 오전 9시부터 오후 1시까지 4시간 공복 유지 후 인슐린부하 검사에 활용되었다. 0.2 ㎛ 여과로 멸균시킨 인슐린(Insulin in PBS) 용액을 준비하여 각 개체마다 0.5 IU/kg(BW. Vol = 20 ㎕)씩 복강 투여(27-gauge sterile needle)를 수행하였다. 마우스를 케이지에 다시 넣고 꼬리에서 채혈하여 혈당 수치를 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150분마다 측정하였다.
본 연구에서 고지방식이를 투여한 G2 그룹은 일반 식이를 투여한 그룹 G1 대비 혈당 수치가 상당히 높게 유지되는 것으로 관찰되었다.
인슐린부하 혈당 (mg/dL) G1 G2 G3 G4 G5 G6
0 min 150.0 185.1 204.4 207.2 193.4 186.0
15 min 104.0 211.3 226.1 186.9 171.8 173.7
30 min 67.6 160.1 146.7 145.9 103.7 111.6
60 min 65.9 147.3 129.3 120.0 94.9 100.7
90 min 76.8 163.8 133.1 129.4 104.6 111.8
120 min 83.7 160.9 133.5 143.0 115.4 126.3
150 min 94.1 169.4 140.0 138.9 116.6 132.5
표 5, 도 6a 및 6b에서 확인할 수 있듯이, 특히 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 먹인 그룹(G3-6)에서 G2 대비 혈당 수치가 감소하였다. 특히 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004의 경우 혈당을 측정한 각각의 시각에서도 유의미하게 감소하였다.
도 6c 및 6d에서 확인할 수 있듯이, 인슐린부하검사 그래프의 아래 면적을 계산한 AUC 결과에서 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003(G3, 4)의 경우 G2 대비 혈당 수치가 감소하였지만 유의적인 수준은 아니었다. AUC 결과에서 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*107, 1*109 CFU 농도로 각각 투여한 두 그룹(G5, 6)에서 G2 대비 유의적으로 감소한 수준임을 확인하였다.
즉 인슐린부하 검사를 통해 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004는 고지방식이로 유도한 비만 모델에서 혈당 강하 효과가 있음을 확인하였다.
4-4. 비만 유도 마우스의 장기 무게 측정
고지방식이로 비만을 유도한 마우스 동물 모델에 대하여 16주차에 부검을 실시하였고 장기 무게를 측정하여 비교하였다.
조직화학적 분석을 위해 10% 포르말린(formalin) 용액에 고정시켜 둔 간과 지방 조직은 파라핀으로 포매한 후, 3 um 두께로 박절하여 절편 슬라이드를 만들었다. 헤마톡실린과 에오신으로 구성된 H&E 염색약을 사용하여 핵과 세포질을 염색한 후 광학현미경과 현미경에 장착된 디지털 카메라를 이용하여 100배 배율에서 현상하였다. 비알콜성 지방간의 조직학적 임상 증상 평가를 위해 다음과 같은 기준을 세우고 평가를 실시하였다: 지방증(Steatosis)(0-3), 간세포성 팽창(Hepatocellular ballooning)(0-3), 간 내 염증세포 침윤(Lobular inflammatroy cell infiltration)(0-2). 지방조직의 지방세포 크기는 Image J 프로그램을 이용하여 측정하였다.
간 무게와 피하지방 무게 모두 고지방식이를 먹인 그룹 G2가 정상식이 그룹 G1보다 증가되었다.
도 7a에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 1*109 CFU 농도로 먹인 그룹 G4에서 간 무게의 감소가 관찰되었지만 유의적인 수준은 아니었음을 확인하였다. 고지방식이와 함께 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 먹인 그룹(G5, 6)에서 간 무게의 감소가 나타났으며 1*109 CFU 농도로 먹인 그룹인 G6에서 감소가 유의적인 수준임을 확인하였다.
도 7b에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 먹인 그룹(G3, 4)에서 피하지방 무게의 감소가 나타났으며 1*109 CFU 농도로 투여한 그룹(G4)에서 감소가 유의적인 수준임을 확인하였다. 고지방식이와 함께 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 먹인 그룹(G5, 6)에서 피하지방 무게의 감소가 나타났으며 1*107 CFU 농도로 투여한 그룹(G5)에서 감소가 유의적인 수준임을 확인하였다.
4-5. 비만 유도 마우스에서의 지방간 임상증상 평가
고지방식이를 먹인 마우스 동물 모델에서는 간 조직 내 지질이 축적되어 비알콜성 지방간의 임상증상이 나타난다고 알려져 있다.
지방 조직은 TRIzol 시약(reagent) 용액을 사용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA를 Nanodrop 분광광도계를 이용하여 정량하였고, 역전사 반응은 TOPscript RT DryMIX(Enzynomics, Korea)를 사용하여 RNA에서 cDNA를 합성하여 분석하였다. 합성된 cDNA를 주형(template)으로 사용하여 각각의 프라이머(primer)와 키트(TOPreal SYBR Green PCR kit, Enzynomics, Korea)를 첨가하고 real-time PCR (Rotor-Gene Q, QIAGEN) 기기를 이용하여 증폭시킨 후 정량소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
real-time PCR로 증폭된 생성물은 Ct(comparative cycle threshold)법을 이용하여 정량하였으며 각 시료는 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 18S rRNA를 내부 통제요인(internal control)으로 사용하여 발현량을 보정하였다. PCR에 사용한 각 유전자의 프라이머 서열은 표 6에 제시하였다.
서열번호 명칭 서열
2 18S rRNA forward primer AGGAGCTGAAGGGCCACGGG
3 18S rRNA reverse primer TGGGAACAGTGACGCGGGTC
도 8a 및 8b에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이를 16주 동안 급이한 결과 간 조직내 지방증(steatosis), 간세포성 팽창(hepatocellular ballooning), 간내 염증세포 침윤(lobular inflammatory cell infiltration)이 발생했음을 확인하였다. 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 급이한 결과 이러한 임상 증상이 감소했으며 1*109 CFU 농도로 먹인 그룹(G4)에서 유의적인 감소가 나타났다. 고지방식이와 함께 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 급이한 두 그룹(G5, 6) 모두 임상 증상이 감소하였으며 이는 고지방식이만을 먹인 G2 대비 유의적인 수준임을 확인하였다.
4-6. 비만 유도 마우스에서의 지방 조직의 조직학적 평가
고지방식이를 먹인 마우스 동물 모델에서는 지방 조직의 지질 축적이 증가하면서 지방 세포의 크기 또한 증가한다고 알려져 있다.
도 9a 및 9b에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 1*109 CFU 농도로 급이한 그룹에서(G4) 지방세포의 크기의 평균이 감소하였다. 고지방식이와 함께 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 급이한 결과 지방 세포의 크기의 평균이 감소하였으며 생균을 1*109 CFU 농도로 급이한 그룹(G6)에서 유의미한 수준으로 감소하였음을 확인하였다.
4-7. 비만 유도 마우스에서의 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003에 의한 부고환지방조직의 유전자 발현 평가
상기 실시예 4-1에서 준비된 그룹별 마우스에 대하여 16주차에 부검을 실시하였고 부고환지방에서 RNA를 추출하여 대사 관련 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 발현량 평가에 사용된 프라이머는 하기 표 7과 같다.
서열번호 명칭 서열
4 Adiponectin forward primer AGGAGCTGAAGGGCCACGGG
5 Adiponectin reverse primer TGGGAACAGTGACGCGGGTC
6 GLUT4 forward primer ACATACCTGACAGGGCAAGG
7 GLUT4 reverse primer CGCCCTTAGTTGGTCAGAAG
8 HSL forward primer TGGGGAGCTCCAGTCGGAAGAGG
9 HSL reverse primer CATTAGACAGCCGCCGTGCTG
10 ATGL forward primer CTCATTCGCTGGCTGCGGCT
11 ATGL reverse primer CCCCAGTGACCAGCGCTGTG
12 CPT1a forward primer ACCACTGGCCGCATGTCAAG
13 CPT1a reverse primer AGCGAGTAGCGCATAGTCAT
아디포넥틴(adiponectin)은 지방 세포에서 대부분 생성되며 당과 지질대사의 조절 및 인슐린 감수성을 증가시키며 대사증후군에서 감소하는 것으로 잘 알려져 있다. GLUT4(glucose transporter type 4)는 인슐린 자극에 의해 말초조직의 세포 내 포도당 흡수를 매개하는 역할을 하며 인슐린 저항성이 생기면 세포질로부터 세포막으로의 GLUT4 전좌(translocation)가 저해된다.
지질대사에서 중요한 호르몬 민감성 지방분해효소(Hormone-sensitive liase, HSL)와 중성지방 분해효소(Adipse triglycerde lipase, ATGL)는 지방조직에서 주로 활성화되고 중성지방을 분해하는 작용을 하며 카르니틴 팔미토일 전환효소(Carnitine Palmitoyltransferase 1A, CPT1A)는 미토콘드리아의 지방산 베타 산화를 촉진시키는 역할을 한다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균을 급이한 결과 부고환지방에서 상기 유전자들의 발현이 유의적인 수준으로 증가함을 확인하였다. 단, 1*107 CFU 농도로 투여한 그룹(G3)에서의 GLUT4 유전자 발현 증가 정도와 G3, G4 두 군에서의 CPT1α 유전자 발현 증가 정도는 유의적인 수준은 아니었다. 이를 통해 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 생균 투여 시 지방조직 내 대사 관련 유전자 발현을 조절한다는 사실을 확인하였다.
4-8. 비만 유도 마우스에서의 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004에 의한 부고환지방조직의 유전자 발현 평가
고지방식이로 비만을 유도한 마우스에 대하여 16주차에 부검을 실시하였고 부고환지방에서 RNA를 추출하여 지방세포 분화 관련 유전자와 염증관련 유전자의 발현 정도를 평가하였다.
서열번호 명칭 서열
14 C/EBPα forward primer GAACAGCAACGAGTACCGGGTA
15 C/EBPα reverse primer CCATGGCCTTGACCAAGGAG
16 PPARγ forward primer GGTGAAACTCTGGGAGATTC
17 PPARγ reverse primer CAACCATTGGGTCAGCTCTT
18 aP2 forward primer ACATGATCATCAGCGTAAATGGG
19 aP2 reverse primer TCATAACACATTCCACCACCAGC
20 TNF-α forward primer CGTCAGCCGATTTGCTATCT
21 TNF-α reverse primer CGGACTCCGCAAAGTCTAAG
22 Caspase1 forward primer AGGAATTCTGGAGCTTCAATCAG
23 Caspase1 reverse primer TGGAAATGTGCCATCTTCTTT
지방세포 분화에 작용하는 전사인자인 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ), C/EBPα(CCAAT-enhancer binding protein)는 각각의 표적 유전자의 발현을 조절하여 지방세포 분화를 촉진하며, aP2(adipocyte protein 2)는 성숙된 지방세포에서 발견되는 유전자이다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이와 함께 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*107 CFU 농도로 투여한 결과(G5) 상기 유전자의 발현이 감소했으며 C/EBPα와 aP2의 경우 유의적인 수준으로 감소하였다. 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*109 CFU 농도로 투여한 경우(G6), PPARγ와 aP2의 유전자 발현이 감소하였지만 유의적인 수준은 아니었다.
대사 질환 발생에 있어서 염증반응은 만성적으로 낮은 수준으로 나타나고 있으며 인슐린 저항성을 유도하고 비만에 의한 대사질환의 병태생리학적 기전으로 제시되고 있다. 지방세포에서 염증관련 유전자인 TNFα(tumor necrosis factor α), MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)은 지방세포에서 주로 분비되는 염증성 사이토카인이며 caspase-1은 지방조직에서 대식세포 유래 염증에 주요한 기능을 한다고 알려져 있다.
도 12에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*107 CFU 농도로 투여한 결과(G5) 상기 유전자들의 발현이 모두 유의적인 수준으로 감소하였고, 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균을 1*109 CFU 농도로 투여한 경우(G6) 상기 유전자들의 발현이 감소하였으며, 특히 caspase-1 에서의 발현 감소가 유의적인 수준이었다.
이로부터 락토바실러스 플란타룸 NCHBL-004 생균 투여 시 지방 조직에서 지방 세포 분화 관련, 염증 관련 유전자 발현을 조절한다는 사실을 확인하였다.
본 발명은 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 락토바실러스 쿤케이 NCHBL-003 균주의 배양액 또는 생균을 이용하여 비만, 당뇨, 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 등의 대사성 질환에 대한 예방, 치료 또는 개선 용도로 사용하는 기술에 관한 것이다.
Figure PCTKR2023006632-appb-img-000001

Claims (16)

  1. 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC14908BP로 기탁된 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 생균, 사균, 또는 이의 혼합물인 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 균주를 5 x 105 내지 5 x 1011 CFU/ml의 농도로 포함하는 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 12시간 이상 배양하여 수득한 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양액은 pH 6.5 내지 8.5인 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양한 후 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨, 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH), 고혈압, 고지혈증, 심혈관질환 및 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 락토바실러스 쿤케이(Lactobacillus kunkeei) NCHBL-003 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC14908BP로 기탁된 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 균주는 생균, 사균, 또는 이의 혼합물인 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 상기 균주를 5 x 105 내지 5 x 1011 CFU/ml의 농도로 포함하는 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 12시간 이상 배양하여 수득한 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 배양액은 pH 6.5 내지 8.5인 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양한 후 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨, 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH), 고혈압, 고지혈증, 심혈관질환 및 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 대사성 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
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